JP2010248200A - 新規なmhc分子構築物、ならびに診断および処置のためにこれらの構築物を用いる方法、ならびにmhc分子の使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】可溶性媒体に可溶性の形態であるか、または固体もしくは半固体支持体上に固定化されたMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、1つより多くの結合実体が結合したデキストランキャリア分子を含んでなり、該1つより多くの結合実体の各々には、2〜4つのMHC分子が結合しており、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子を含む、MHC分子構築物。
【選択図】なし
Description
リガンドが標的細胞表面の対抗レセプターに特異的に連結することにより、ヒト生物における多くの重要な応答が制御される。ペプチドホルモンに対するレセプター(例えば、インスリンレセプター(IR))にリガンドが結合することの生理学的意味が何十年にわたって知られている。ペプチドホルモンが1つの器官から分泌されて、その作用を局所的に発揮することがあるか、あるいは遠位に様々な細胞タイプまたは組織に血液によって分配されることがある。様々なレセプターに関連する生物学的機能の我々の今日の理解が、生理学的応答のリガンド結合およびシグナル伝達および他の測定の詳細な研究からもたらされている。
〔1〕可溶性媒体に可溶性の形態であるか、または固体もしくは半固体支持体上に固定化されたMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、1つより多くの結合実体が結合したデキストランキャリア分子を含んでなり、該1つより多くの結合実体の各々には、2〜4つのMHC分子が結合しており、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子を含む、MHC分子構築物、
〔2〕可溶性媒体に可溶性の形態であるか、または固体もしくは半固体支持体上に固定化されたMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、1つより多くのストレプトアビジンが結合した多糖類キャリア分子を含んでなり、該1つより多くのストレプトアビジンの各々には、2〜4つのMHC分子が結合しており、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子を含む、MHC分子構築物、
〔3〕可溶性媒体に可溶性の形態であるMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、1つより多くの結合実体が結合した多糖類キャリア分子を含んでなり、該1つより多くの結合実体の各々には、2〜4つのMHC分子が結合しており、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子を含む、MHC分子構築物、
〔4〕可溶性媒体に可溶性の形態であるか、または固体もしくは半固体支持体上に固定化されたMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子に結合した可溶性多糖類キャリア分子を含んでなり、該MHC分子は、該多糖類キャリア分子に直接結合しており、該MHC分子構築物は、1つ以上の標識を含む、MHC分子構築物、
〔5〕MHC分子が、ペプチド非含有MHC分子であるかまたはペプチド充填MHC分子である〔1〕〜〔4〕いずれか記載のMHC分子構築物、
〔6〕MHC分子が同一であるかまたは少なくとも2つのMHC分子が異なるものである〔1〕〜〔5〕いずれか記載のMHC分子構築物、
〔7〕MHC分子により収容されるペプチドが同一であるかまたはMHC分子によって収容される少なくとも2つのペプチドが異なるものである〔1〕〜〔6〕いずれか記載のMHC分子構築物、
〔8〕1つ以上の生物学的に活性な分子をさらに含んでなる〔1〕〜〔7〕いずれか記載のMHC分子構築物、
〔9〕生物学的に活性な分子が、
(a)MIC A、MIC B、CD1d、HLA E、HLA F、HLA G、HLA H、ULBP-1、ULBP-2、およびULBP-3等のMHCクラスI様タンパク質の群に由来するタンパク質、
(b)Tおよび/またはNK細胞上に発現されるCD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134、CD137、CD147、CDw150、CD152、CD153、CD40L、NKG2D、ICOS、HVEM、HLAクラスII、PD-1、Fas、およびFasL、ならびにAPCおよび/または腫瘍細胞上に発現されるCD40、CD48、CD58、CD70、CD72、B7.1、B7.2、B7RP-1、B7-H3、PD-L1、PD-L2、CD134L、CD137L、ICOSL、およびLIGHTの群に由来する共刺激分子、
(c)NK細胞上に発現されるCD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、2B4、KIR、LIR、CD94/NKG2A、およびCD94/NKG2C、ならびにIFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、コロニー刺激因子、ビタミンD3、IL-2毒素、シクロスポリン、FK-506、ラパマイシン、TGF-β、クロトリマゾール、ニトレンジピン、およびカリブドトキシンの群に由来する細胞調節分子、
(d)LFA-1、CD11a/18、CD54、CD106、およびCD49a、b、c、d、e、f/CD29の群に由来するアクセサリー分子、
(e)ICAM-1、ICAM-2、GlyCAM-1、CD34、抗-LFA-1、抗-CD44、抗-β7、ケモカイン、CXCR4、CCR5、抗セレクチンL、抗セレクチンE、および抗セレクチンPの群に由来する接着分子、
(f)シクロホスファミド、メトトレキセート(methrotrexate)、アザチオプリン、ミゾリビン、15-デオキシスペルグアリン(deoxuspergualin)、ネオマイシン、スタウロスポリン、ゲネスタイン、ハービマイシンA、シュードモナスエキソトキシンA、サポリン、リタキサン、リシン、ゲムツズマブオゾオガミチン、志賀毒素、重金属、無機水銀、有機水銀、FN18-CRM9、放射性同位体、ヨウ素の取り込まれた同位体、コバルトの取り込まれた同位体、セレンの取り込まれた同位体、トリチウムの取り込まれた同位体、リンの取り込まれた同位体、ハプテン、DNP、およびジゴキシゲニンの群に由来する毒性分子、
ならびに(a)〜(f)のいずれかの分子に対する抗体、該抗体の誘導体、および該抗体の断片、ならびにそれらの組み合わせ、ならびに
(g)タンパク質、共刺激分子、細胞調節分子、レセプター、アクセサリー分子、接着分子、天然のリガンド、および毒性分子、ならびにそれらに対する抗体および組換え結合分子、ならびにそれらの組み合わせ
から選ばれるものである〔8〕記載のMHC分子構築物、
〔10〕1つ以上の標識化合物をさらに含んでなる〔1〕〜〔9〕いずれか記載のMHC分子構築物、
〔11〕1つ以上の標識化合物が、キャリア分子および/または1つ以上の結合実体および/またはストレプトアビジンおよび/または1つ以上のMHC分子に結合している〔10〕記載のMHC分子構築物、
〔12〕標識化合物が、
(a)5-および6-カルボキシフルオレセイン、5-または6-カルボキシフルオレセイン、6-フルオレセイン-5-および6-カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、色素、Cy2、Cy3、Cy5、任意に置換されたクマリン、AMCA、PerCP、フィコビリンタンパク質、R-フィコエリトリン、アロフィコエリトリン、テキサスレッド、プリンストンレッド、グリーン蛍光タンパク質、およびそれらのアナログ、R-フィコエリトリンのコンジュゲート、アロフィコエリトリンおよびCy5またはテキサスレッドのコンジュゲート、半導体ナノ結晶に基づく無機蛍光標識、量子ドット、ならびにランタニドに基づく時間分解蛍光標識、Eu3+に基づく時間分解蛍光標識、およびSm3+に基づく時間分解蛍光標識の群に由来する蛍光標識から選ばれる、
(b)DNP、ビオチン、およびジゴキシゲニンの群に由来するハプテンから選ばれる、
(c)セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼの群に由来する酵素標識から選ばれる、
(d)ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタンおよびピリドピリダジンの群に由来する発光標識から選ばれる、および
(e)ヨウ素の取り込まれた同位体、コバルトの取り込まれた同位体、セレンの取り込まれた同位体、トリチウムの取り込まれた同位体、およびリンの取り込まれた同位体の群に由来する放射能標識から選ばれる、および
(f)蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、金属粒子、ハプテン、抗体および色素から選択される
〔10〕または〔11〕記載のMHC分子構築物、
〔13〕キャリア分子が、
(a)多糖類、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デキストランポリアルデヒド、カルボキシメチルデキストランラクトン、およびシクロデキストリン、プルラン、シゾフィラン、スクレログルカン、キサンタン、ジェラン、O-エチルアミノグアラン、6-O-カルボキシメチルキチンおよびN-カルボキシメチルキトサンを含むキチンおよびキトサン、
(b)誘導体化セロロジクス(cellolosics)、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、6-アミノ-6-デオキシセルロースおよびO-エチルアミンセルロース、
(c)ヒドロキシル化デンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラゲナン、アルギン酸塩、およびアガロース、ならびに
(d)合成多糖類、フィコールおよびカルボキシメチル化フィコール
からなる群より選ばれるものである〔2〕〜〔12〕いずれか記載のMHC分子構築物、
〔14〕固体または半固体支持体に固定化された〔1〕〜〔13〕いずれか記載のMHC分子構築物、
〔15〕固体または半固体支持体に直接固定化された、あるいはリンカー、スペーサー、または抗体、その抗体誘導体もしくは断片を介して固体または半固体支持体に固定化された〔14〕記載のMHC分子構築物、
〔16〕支持体が、粒子、ビーズ、生分解性粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、ナイロン膜、繊維、毛細管、針、マイクロタイター条片、チューブ、プレートまたはウェル、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイ、チップおよびスライドからなる群より選ばれるものであり、該ビーズまたは粒子が、ポリマービーズ、ポリマー粒子、磁性ビーズ、磁性粒子、超磁性ビーズ、または超磁性粒子である〔14〕または〔15〕記載のMHC分子構築物、
〔17〕フローサイトメトリー法、組織学的方法または細胞学的方法において使用するための〔1〕〜〔16〕いずれか記載のMHC分子構築物、
〔18〕〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物を含有してなる組成物、
〔19〕可溶化媒体中における〔18〕記載の組成物、
〔20〕MHC分子構築物が、ペプチド充填MHC分子またはペプチド非含有MHC分子を含んでなり、ペプチド非含有MHC分子を充填するためのペプチド、およびペプチド非含有分子を含むMHC分子構築物が、別々に提供される〔18〕または〔19〕記載の組成物、
〔21〕〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物を含んでなる治療用組成物、
〔22〕1つ以上の生物学的に活性な分子および/または賦形剤をさらに含んでなる〔21〕記載の治療用組成物、
〔23〕MHC認識細胞に関与する疾患の治療、予防、安定化、または軽減における使用のための、〔21〕または〔22〕記載の治療用組成物、
〔24〕疾患が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系性、異種性、移植片対宿主起源、もしくは宿主対移植片起源の疾患であるか、あるいは慢性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患である〔21〕〜〔23〕いずれか記載の治療用組成物、
〔25〕インビボ療法またはエキソビボ療法における使用のための〔21〕〜〔23〕いずれか記載の治療用組成物、
〔26〕免疫応答をアップレギュレート、ダウンレギュレート、もしくは調節するための、細胞のアネルギーを誘導するための、または養子免疫療法のための医薬の製造における〔21〕〜〔25〕いずれか記載の治療用組成物の使用、
〔27〕〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物を提供する工程、
治療用物質に適切な媒体中にMHC分子構築物を溶解または分散させる工程、および
任意に他の賦形剤を添加する工程
を含む〔21〕〜〔25〕いずれか記載の治療用組成物の製造方法、
〔28〕〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物を用いてMHC認識細胞を得る工程、
かかるMHC認識細胞を臨床的に関連する数に増殖する工程、
投与に適した媒体中で得られた細胞を製剤化する工程、および
任意に賦形剤を添加する工程
を含む〔21〕〜〔25〕いずれか記載の治療用組成物の製造方法、
〔29〕(a)MHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルと〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物を接触させる工程、および
(b)MHC分子構築物の任意の結合を測定し、それによりMHC認識細胞に関与する疾患の予後を確立し、該疾患の状態を決定し、または該疾患を診断する工程
を含むMHC認識細胞に関与する疾患の予後の確立、該疾患の状態の決定、または該疾患の診断のための方法、
〔30〕(a)医薬での処置を受けた被験体由来のサンプルと〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物を接触させる工程、および
(b)MHC分子構築物の任意の結合を測定し、それにより医薬の有効性を決定する工程、
を含むMHC認識細胞に関与する疾患に対する医薬の有効性を決定するための方法、
〔31〕(a)MHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物を接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の任意の結合を測定し、それによりMHC認識細胞をモニターする工程
を含むMHC認識細胞のモニターまたは検出のための方法、
〔32〕MHC認識細胞が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系性、異種性、移植片対宿主起源、または宿主対移植片起源の疾患、あるいは慢性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、子宮頸癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患に関与している〔27〕〜〔31〕いずれか記載の方法、
〔33〕サンプルが、組織学的材料、細胞学的材料、原発腫瘍、二次器官転移物、細針吸引物、脾臓組織、骨髄検体、細胞スメア、剥脱性細胞検体、接触調製物、口腔スワブ、喉頭スワブ、膣スワブ、気管支洗浄物、胃洗浄物、臍帯サンプル、体液サンプル、血液サンプル、血液から単離された末梢血液単核細胞集団由来のサンプル、血液由来調製物由来のサンプル、白血球搬出産物由来のサンプル、痰サンプル、喀出物、気管支吸引液、生検、および生検の切片からなる群より選ばれるものである〔27〕〜〔32〕いずれか記載の方法、
〔34〕結合の測定が、顕微鏡での検査、光、蛍光、電子透過、またはフローサイトメトリーにより行われる〔27〕〜〔33〕いずれか記載の方法、
〔35〕サンプルが、支持体、固体もしくは半固体の支持体上に、またはガラススライド、1つ以上のウェルを有するマイクロタイタープレート、ビーズ、粒子、膜、フィルター、フィルター膜、ポリマースライド、ポリマー膜、チャンバースライド、皿、もしくはペトリ皿上にマウントされる〔27〕〜〔34〕いずれか記載の方法、
〔36〕(i)少なくとも5つのMHC分子を提供する工程;
(ii) キャリア分子を提供する工程;
(iii)1つより多くのストレプトアビジンまたは1つより多くの結合実体を提供する工程;
(iv)該キャリア分子に、該1つより多くのストレプトアビジンまたは該1つより多くの結合実体を介して、該少なくとも5つのMHC分子を結合させる工程、ここで、結合により、各ストレプトアビジンまたは各結合実体は、2〜4つのMHC分子に結合される;
(v)任意に、該キャリア分子に、直接にまたは該1つより多くのストレプトアビジンもしくは該1つより多くの結合実体を介して、1つ以上の生物学的に活性な分子を結合させる工程;
(vi)任意に、1つ以上の標識化合物を、該キャリア分子に、該1つより多くのストレプトアビジンの1つ以上に、または該少なくとも5つのMHC分子の1つ以上に結合させる工程、および
それによって〔21〕〜〔25〕いずれか記載の治療用組成物を製造する工程
を含む、〔21〕〜〔25〕いずれか記載の治療用組成物の製造方法、
〔37〕〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物を使用する工程を含む、MHC認識細胞を得るための方法、
〔38〕MHC認識細胞が、
MHC認識細胞を含有する被験体に由来するサンプルを〔1〕〜〔17〕いずれか記載のMHC分子構築物の1つ以上と接触させ、それによりMHC認識細胞がMHC分子構築物に結合する工程、
結合MHC分子構築物およびMHC認識細胞を単離する工程、および
任意に、かかるMHC認識細胞を臨床的に関連する数にエキソビボ増殖する工程により得られるものである〔37〕記載の方法であって、該単離されたMHC認識細胞は、増殖の前にMHC分子構築物から遊離される、方法、
〔39〕該方法が、磁場を印加することまたはフローサイトメトリーによるMHC認識細胞の単離を含む〔37〕または〔38〕記載の方法、
〔40〕MHC分子構築物が、サンプルとの接触の前または後に、固体または半固体支持体に固定化される〔37〕〜〔39〕いずれか記載の方法、
〔41〕増殖が、1つ以上のMHC分子構築物、任意に1つ以上の生物学的に活性な分子および任意に樹状細胞または他のフィーダー細胞等のフィーダー細胞の存在下で行われる〔37〕〜〔40〕いずれか記載の方法
に関する。
多価MHC化合物の実際の潜在的可能性を利用するために、新規なMHC分子構築物が作製された。これらは、数多くの長所を有することが示されており、従って、これらの新規な構築物に対する期待は大きい。本発明の構築物は、十分に明らかにされたTCR特異的リガンドである非常に多数のMHC分子(ポリリガンド)を潜在的に発現させることができる。
本発明をより十分に説明するために、免疫系およびMHC分子の重要な特徴のいくつかが下記に記載される。
免疫系は自然の主要な生物情報系の1つとして考えることができる。免疫系により、内部の環境に進入するすべての物質が評価され、そしてその性質が明らかにされ、そしてそれに対する行動を起こすべきかどうかが決定される。タンパク質およびペプチドが、そのような免疫情報を得て、伝える最も重要な手段である。この観点から、MHC分子は、免疫原性抗原の認識のために必要とされる最も本質的な分子群をコードする。MHC分子は、ペプチド情報のためにタンパク質代謝全体をサンプル抽出しており、この情報を免疫系の中心的な認識ユニット(T細胞)のために利用できるようにする。しかし、これらのエフェクター細胞は、MHC分子とTCRとの間での実質的な相互作用を必要とする。このような相互作用により、少なくとも2つのシグナルがナイーブT細胞の活性化のために必要であることが裏づけられる:1つのシグナルがMHC分子とTCRとの分子相互作用によって現れ、これに対して、もう1つのシグナルは、共刺激リガンド(例えば、B7-1)とそれらの対抗レセプター(例えば、CD28)との結合から得られる。他の分子(例えば、NKレセプター)がT細胞の活性化閾値を調節し得ることもまた示されている。従って、T細胞および他の免疫適格エフェクター細胞の完全な活性化には、多数のリガンドの協奏した作用が必要である。すなわち、免疫応答はポリリガンド化合物の制御下にあると言うことができる。
免疫系の細胞には、下記の細胞が含まれる:リンパ球は、血液中および身体の多くの他の部分において見出される一種の白血球である。様々なタイプのリンパ球には、B細胞、T細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。
B細胞およびT細胞は、その標的を認識するために全く異なる機構を使用する。B細胞は可溶性の抗原を認識する。B細胞は、そのレセプターを抗体として分泌することができるので、細胞外空間の液相の至るところで抗原と潜在的に相互作用することができる。著しく対照的に、T細胞のレセプターは常に膜に結合しており、抗原提示細胞(APC)の膜に提示される抗原を認識するだけである。すなわち、T細胞の認識は、2つの細胞(すなわち、T細胞およびAPC)の直接的な物理的相互作用を伴う。B細胞およびT細胞はまた、それらが認識するものに関しても異なる。B細胞はほとんどすべての種類の有機物質を認識することができ、これに対して、T細胞は主としてタンパク質を認識する(生物学的標的として、タンパク質は、全生涯の構造的および機能的な基礎を構成するので、特に重要である)。B細胞は、未変性タンパク質と変性タンパク質とを識別することができることによって例示されるように、タンパク質の三次元構造を認識する。対照的に、T細胞は未変性タンパク質と変性タンパク質とを識別することができない。今日、T細胞は、APCの表面においてMHC分子と一緒に提示された抗原性ペプチドを認識するだけであることが知られている。一般に、細胞傷害性T細胞は短いペプチド(一般には8残基〜11残基に対応する)を認識し、そのアミノ末端およびカルボキシ末端がMHCクラスI分子内に深く埋め込まれている(すなわち、ペプチドの長さには制限がある)。これに対して、ヘルパーT細胞は、アミノ末端およびカルボキシル末端がMHCクラスII分子から突き出ているより長いペプチド(一般には13残基〜30残基に対応する)を認識する傾向がある。
T細胞は、B細胞の活性を含む適応免疫系の反応性および特異性を決定する。従って、これらの細胞に注目することは適切である。T細胞は、所与の抗原が特定のMHC分子に関連して提示されたときにその所与の抗原を認識するだけである。T細胞は個体発生時に「教育」され、そして特定の抗原-MHC分子の組合せに対して特異的なレセプターを有するT細胞を発達させることを目的とするプロセスにおける最初の抗原刺激のときにさらに活性化される。これらのT細胞は、その後、同じ抗原-MHC分子の組合せを認識することができるだけである。この現象は、「MHC拘束」として知られている。別の免疫現象、すなわち、「レスポンダー状態」の現象もまた、MHC分子によって決定される。1つのMHCハプロタイプを有する個体は、いくつかの抗原に対して応答するが、他の抗原には応答しない。別のMHCハプロタイプを有する他の個体は異なる応答を示す。これらの2つの現象は、何らかの合理的な免疫操作のためには明らかに重要である。述べられたように、現在、我々は、様々なMHC分子がそれらの両方を制御していることを知っている。これらの分子は、抗原提示のために特異的に進化させられてきた。抗原提示の我々の現在の理解は下記のようにまとめることができる。第1に、外来物質(すなわち、抗原)はAPCによって取り込まれる。抗原性ペプチドの細胞内プールが、細胞にとって利用可能なタンパク質すべてのタンパク質分解的断片化によって作製される(これには、正常な細胞タンパク質(「自己タンパク質」)と、感染性生物由来の抗原(「非自己タンパク質」)との両方が含まれることがある)。
細胞のこのネットワークを制御することに関連するいくつかのリガンドレセプター相互作用は、単純なホルモン-レセプター相互作用(例えば、インスリンおよびIR)を含むより「通常的」なリガンドレセプターモデルと比較して複雑である。
ヒトMHC遺伝子座(HLA遺伝子座)に存在する遺伝子は、1組の非常に多型の膜タンパク質をコードしており、それらは細胞内区画においてペプチドをサンプル抽出し、抗原提示細胞(APC)の表面でそのようなペプチドエピトープを精査T細胞に提示する。MHC遺伝子座の甚だしい遺伝子多型は、個体における免疫系の特徴的な遺伝子的指紋に対する背景であり、そのような遺伝子多型により、ヒト集団が認識し、応答することができる抗原性ペプチドエピトープのレパートリーが規定される。
NK細胞は最近まで謎であった。これらの細胞は、先行する刺激の非存在下である種の腫瘍を溶解するその能力によって定義される。しかし、最近の報告では、NK細胞の活性は、MHC分子を含む多数のリガンドによって調節されることが示されている(参考文献5)。NK細胞は、阻害シグナルを送達する表面レセプターを介してMHCクラスI分子を認識する。従って、NK細胞は、MHC分子の発現を失った標的細胞を溶解することができる。腫瘍細胞は、MHC分子に関連した腫瘍関連抗原(ペプチド)を認識する細胞傷害性T細胞からの選択圧のためであると考えられているが、多くの場合、MHC分子のその発現を低下させているか、または失っていることが広く知られている。この場合、NK細胞が正常な細胞と腫瘍細胞とを識別する能力は、Ljunggren他(参考文献6)による「ミシングセルフ(missing-self)仮説」によって説明される。しかし、NK細胞は、広範囲のMHC分子を認識するレセプターを単に備えているだけではない。NKレセプターが複雑であることはまた、一部が活性化しつつあり、これに対して、他が阻害性である種々のイソ型が発現していることによって反映される。興味深いことに、5%〜10%の(αβ)T細胞もまた、阻害レセプタースーパーファミリーに属する、KIR、ILTまたはCD94/NKG2などの異なるNKレセプターを発現している。そのようなレセプターは、細胞性免疫応答に対する活性化閾値を上げるように作用し得る(参考文献7)。
T細胞レセプターは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、それぞれが2つの細胞外ドメインを含む、約30,000のMWを有する2つの非共有結合的に会合した膜貫通糖タンパク質(「α」鎖および「β」鎖)から構成される。これらの2つの鎖は二量体を形成し、そしてより大きいタンパク質複合体のCD3と会合する。MHCクラスI分子と会合したTCRの詳細な構造がX線結晶学レベルで解明されている。可溶性TCRの組換え形態(これは細胞外ドメインから構成される)が細菌および真核生物細胞において製造されている。
適応免疫応答には、2つのシグナルが最初の活性化のために必要である:抗原提示細胞(APC)上のペプチド-MHCがT細胞レセプター(TCR)に結合することによってもたらされる1つのシグナル、そして共刺激と呼ばれる抗原非依存性のもう1つのシグナル。CD28は、T細胞が、CD28のリガンド(B7-1(CD80)またはB7-2(CD86))を発現するAPCと遭遇したときに共刺激機能をもたらすT細胞表面の膜レセプターである。CD28の機能は、主として、TCRによって開始されるシグナルを変化させることであり、これにより、増殖、サイトカイン産生および細胞生存を生じさせる一連の事象において定性的および定量的な変化がもたらされる。共刺激シグナルを伴わないナイーブT細胞の誘発は、T細胞を機能的に非応答性(アネルギー、アポトーシス)にすることがある。CD28は、CD8+T細胞と比較して、CD4+T細胞のより大きい増殖を誘導する。誘導型共刺激因子(ICOS)などを含む、CD28免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの他のメンバーは、活性化されたCD4+T細胞およびCD8+T細胞において共刺激シグナルを提供し、その増殖を高める。
上記に述べられたように、様々なサイトカインが細胞間の連絡において重要な役割を果たしている。サイトカインの群には下記が含まれる:
生物学的治療(免疫療法、生物療法または生物学的応答調節物質療法)は、比較的新しいタイプの処置であり、ヒト免疫系の活性化の基礎となる細胞的および分子的な機構の知識に基づいている。例えば、免疫系は、体内の健康な細胞と癌細胞との違いを認識し、癌になる細胞を除去するように機能する。生物学的治療では、癌と戦うために、またはいくつかの癌処置によって引き起こされ得る副作用を少なくするために、直接的または間接的のいずれかで身体の免疫系を使用する。そのような免疫療法の重要な目的は、T細胞などの適切なエフェクター細胞を刺激することによって免疫系細胞の殺傷能を高めることである。
上記から明かであるように、MHC分子は非常に重要な役割を果たしており、従って、MHC分子を認識する細胞の検出は非常に重要であり、有益である。同様に、いくつかの試みが、制御可能な効率的かつ一貫した方法で免疫系を操作するために行われている。しかし、その成功は限られている。従って、実際に効き目がある免疫治療のための物質を見出すことは、現在治療法がない多数の重篤な疾患に対する戦いに向けた大きなステップであると考えられる。
本発明のMHC分子構築物の長所の1つは、明らかに、MHC分子構築物がモノマーリガンドおよび対抗レセプターの低い固有的親和性を克服しているということである。しかし、そのようなMHC分子構築物は、標的細胞表面の高親和性レセプター(例えば、インスリンに対するホルモンペプチドレセプター)を標的化することを含む非常に様々な適用を有し得ることに留意しなければならない。まとめると、標的細胞に対するポリリガンドの結合は、直ちに商業的に注目される実用的な臨床的および科学的な用途を有する。
従って、有益なMHC分子構築物の例として、下記のようなMHC分子構築物がある:
MHC分子の少なくとも2つが異なるMHC分子構築物、
MHC分子が同じであるMHC分子構築物、
MHC分子によって包囲(harbour)されるペプチドの少なくとも2つが異なるMHC分子構築物、
MHC分子によって包囲されるペプチドが同じであるMHC分子構築物、
MHC分子によって包囲されるペプチドが、非天然アミノ酸を含有するように、または親水基もしくは疎水基を含有するように化学修飾または化学合成されているMHC分子構築物、
MHCクラスI分子によって包囲されるペプチドが可動性リンカーによってMHCクラスI重鎖に連結されているMHC分子構築物、
MHCクラスI分子によって包囲されるペプチドが可動性リンカーによってMHCクラスI軽鎖(β2m)に連結されているMHC分子構築物、
ペプチドが、可動性リンカーによって軽鎖(β2m)と結合したMHCクラスI重鎖を含むMHCクラスI分子によって包囲されているMHC分子構築物、
MHCクラスII分子によって包囲されるペプチドが可動性リンカーによってα鎖に連結されているMHC分子構築物、
MHCクラスII分子によって包囲されるペプチドが可動性リンカーによってβ鎖に連結されているMHC分子構築物、
MHCクラスI分子が変異しているMHC分子構築物、
MHCクラスII分子が変異しているMHC分子構築物。
共刺激分子、例えば、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD147、CDw150(SLAM)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30L)、CD40L(CD154)、NKG2D、ICOS、HVEM、HLAクラスII、PD-1、Fas(CD95)、T細胞および/またはNK細胞において発現するFasL、CD40、CD48、CD58、CD70、CD72、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、B7RP-1、B7-H3、PD-L1、PD-L2、CD134L、CD137L、ICOSL、APC細胞および/または腫瘍細胞において発現するLIGHTなど、
細胞調節分子、例えば、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、2B4、KIR、LIR、CD94/NKG2A、NK細胞において発現するCD94/NKG2C、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、CSF(コロニー刺激因子)、ビタミンD3、IL-2トキシン、シクロスポリン、FK-506、ラパマイシン、TGF-β、クロトリマゾール、ニトレンジピンおよびカリブドトキシンなど、
アクセサリー分子、例えば、LFA-1、CD11a/18、CD54(ICAM-1)、CD106(VCAM)、およびCD49a、b、c、d、e、f/CD29(VLA-4)など、
接着分子、例えば、ICAM-1、ICAM-2、GlyCAM-1、CD34、抗LFA-1、抗CD44、抗β7、ケモカイン、CXCR4、CCR5、抗セレクチンL、抗セレクチンEおよび抗セレクチンPなど、
トキシン、酵素、抗体、放射性同位体、化学発光物質、生物発光物質、ポリマー、金属粒子およびハプテンから選択される毒性分子、例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、ミゾリビン、15-デオクススペルグアリン、ネオマイシン、スタウロスポリン、ゲネステイン、ヘルビマイシンA、シュードモナスのエンドトキシンA、サポリン、リツキサン、リシン、ゲムツズマブ・オゾガミシン、志賀トキシン、無機水銀剤および有機水銀剤のような重金属、ならびにFN18-CRM9、放射性同位体(ヨウ化物、コバルト、セレン、トリチウムおよびリンの取り込まれた同位体など)、ならびにDNPなどのハプテン、ならびにジゴキシギニンなど、
そして、前記のいずれかの組合せ、ならびに、関連する場合には、前記に対する抗体(モノクローナル、ポリクローナルおよび組換え)。抗体誘導体またはそのフラグメントもまた使用することができる。
1つ以上の標識化合物がキャリア分子に結合され得、あるいは
1つ以上の標識化合物が1つ以上の結合実体に結合され得、あるいは
1つ以上の標識化合物が1つ以上のMHC分子に結合され得、あるいは
1つ以上の標識化合物がキャリア分子および/または1つ以上の結合実体および/または1つ以上のMHC分子に結合され得、あるいは
1つ以上の標識化合物がMHC分子によって包囲されるペプチドに結合され得る。
本発明のMHC分子構築物は、広範囲のインビトロ方法またはエクスビボ方法における有力なツールである。
(b)サンプルを上記に規定されるようなMHC分子構築物と接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の何らかの結合を測定する工程で、そのような結合により、MHC認識細胞の存在が示される工程。
(b)サンプルを上記に規定されるようなMHC分子構築物と接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の何らかの結合を測定し、それによりMHC認識細胞をモニターする工程。
(b)サンプルを上記に規定されるようなMHC分子構築物と接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の何らかの結合を測定し、それによりMHC認識細胞に関与する疾患の予後を確立する工程。
(b)サンプルを上記に規定されるようなMHC分子構築物と接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の何らかの結合を測定し、それによりMHC認識細胞に関与する疾患の状態を測定する工程。
(b)サンプルを上記に規定されるようなMHC分子構築物と接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の何らかの結合を測定し、それによりMHC認識細胞に関与する疾患を診断する工程。
(b)サンプルを上記に規定されるようなMHC分子構築物と接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の何らかの結合を測定し、それによりMHC分子構築物の結合を細胞の形態と相関させる工程。
(b)サンプルを本明細書中に規定されるようなMHC分子構築物と接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の何らかの結合を測定し、それにより医薬品の有効性を明らかにする工程。
(b)サンプルを、上記に規定されるような固体の支持体に固定化されたMHC分子構築物と接触させる工程、
(c)関連するMHC認識細胞を単離する工程、および
(d)さらなる操作を用いて、または用いることなく、かかる細胞を臨床的に関連する数にまで拡大する工程。
本明細書中に記載される方法は、細胞学的方法および組織学的方法(サンプルマウント方法)として実施され得る。
本発明のMHC分子構築物は、好適には、フローサイトメトリーによってMHC認識細胞を同定するために標識化された試薬として使用される。これによりさらに、例えば、CD8、CD4、CD3、CD94/NKG2-A/CおよびKIRによって表される抗体エピトープのようなさらなる表面マーカーの分析が可能になる。
また、本発明のMHC分子構築物は、好適には、いわゆる「フリーフローティング」技術において適用され得ると考えられる。
MHC分子構築物を含有する組成物(キット)もまた、本発明の重要な態様である。かかる組成物は、病院および研究室においてそれらをすぐに使える様式で製剤化され得る。かかる組成物はまた、使用者が所望するように改変または使用することが可能であるように製剤化され得る。
本明細書中において、MHC分子の製造ならびになかでも、好適なT細胞レセプターおよびNK細胞レセプターを発現する免疫適格標的細胞(MHC認識細胞)へのMHC分子の特異的な結合を達成するための、キャリア分子(MHC分子構築物)上のポリリガンド化合物として組織化された十分に規定されたMHC分子の使用が記載される。
いくつかのMHC分子は、細胞性生合成のとき、望ましくないペプチドの混入または事前に占有されている(pre-occupied)ので、天然の供給源(すなわち、真核生物細胞)から得ることは非常に難しいことが判明している。
MHC分子を満たすためのペプチド(またはペプチド抗原)は任意の長さであり得る。ペプチドは、MHCクラスI分子に結合するとき、少なくとも8〜10アミノ酸残基の長さでなければならない。MHCクラスII分子に結合するペプチドの長さは、通常、MHCクラスI分子に結合するペプチドよりも長く、例えば、50個ものアミノ酸残基であり得るが、通常的には約20アミノ酸残基よりも短く、例えば、約17アミノ酸残基よりも短い。しかし、上記に示された長さは例としてであり、従って、限定されるべきでないことが理解されるべきである。
本発明によって、低親和性の可溶性MHC分子をその特異的な対レセプターに安定に結合させることが可能である。これを可能にするプロセスが下記に記載され、MHC分子をキャリア分子(これは、意図される使用に依存して、可溶性または不溶性であるように選択され得る)に結合させ、従って、ポリリガンド(すなわち多価)化合物であるMHC分子構築物を形成する工程を含む。
(b)MHC分子またはMHC分子サブユニットを、本明細書中に記載されるような好適なキャリア分子、または本明細書中に記載されるような好適なキャリア分子および好適な結合実体に結合させ、それによりMHC分子構築物を得る工程。
(b)遺伝子が発現される条件のもとで細胞を培養する工程、
(c)細胞によって生成されたMHC分子またはMHC分子サブユニットのその後の精製を可能にする条件のもとで、MHC分子またはMHCサブユニットを細胞から単離する工程、および、
(d)任意に、単離されたMHC分子サブユニットを、本明細書中に記載されるようなキャリア分子、または本明細書中に記載されるような結合実体およびキャリア分子に結合させるプロセス前または中に折り畳み処理に供し、それによりMHC分子構築物を得る工程。
上記に述べられるように、本発明は、一般的に治療分野に関する。本発明のMHC分子構築物は様々な治療的適用における有力なツールである。特に、本発明のMHC分子構築物は、下記から明らかであるように、インビボおよびエクスビボでの治療的適用において適用され得る。
1つの局面において、本発明は本明細書に規定するMHC分子構築物を有効成分として含む治療用組成物に関する。
本明細書中に規定するMHC分子構築物にMHC認識細胞を含む対象由来のサンプルを接触させ、それにより、MHC分子構築物にMHC認識細胞を結合させること、
結合したMHC分子構築物およびMHC認識細胞を単離すること、ならびに、
該MHC認識細胞を臨床上適する数量にまで増殖させること、
により得ることができる。
本明細書においては「アジュバント」という用語は免疫学的アジュバントを指すものとする。これは該当成分への免疫系の応答を増強または促進し、これにより被験体において免疫応答または一連の免疫応答を誘発する能力を有する化合物を指す。アジュバントはデポ剤(成分の半減期を延長するもの)を形成することにより治療用組成物の効果を促進し、別のT細胞を与え、そして、サイトカインの産生を刺激し得る。アジュバントによる抗原生存性の促進および非特異的刺激は、いくつかのケースにおいてMHC分子エピトープが免疫系により認識される治療用組成物中の唯一の特徴である場合には必要となり得る。
炎症性/自己免疫起源のもの、例えば、喘息、高血圧性肺炎、間質性肺疾患、サルコイドーシス、特発性肺線維症、クローン病または潰瘍性大腸炎またはホイップル病に関わる間質性肺疾患、ウエーゲナー肉芽腫症または高血圧性血管炎に関わる間質性肺疾患、
血管炎症候群、ヘノッホ-シェーンライン紫斑病、グッドパスチヤー症候群、ウエーゲナー肉芽腫症、
腎疾患、例えば急性糸球体腎炎の際の抗体媒介糸球体症、全身エリテマトーデスに関わる腎炎、他の全身疾患、例えばウエーゲナー肉芽腫症およびグッドパスチヤー症候群および混合結合組織疾患に関わる腎炎、慢性間質性腎炎、慢性糸球体腎炎、
胃腸疾患、例えばクローン病、潰瘍性大腸炎、腹腔疾患、ホイップル病、コラーゲン蓄積大腸炎、好酸球性大腸炎、リンパ性大腸炎、
肝臓胆管疾患、例えば自己免疫肝炎、アルコール誘発肝炎、門脈周囲線維症、原発性胆管肝硬変、硬化性胆管炎、
中枢または末梢神経系の障害、例えば脱ミエリン疾患、例えば多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、亜急性硬化性全脳炎、
皮膚疾患、例えば乾癬、アトピー性皮膚炎、湿疹、アレルギー性皮膚疾患、進行性全身性硬皮症(硬皮症)、剥脱性皮膚炎、尋常性疱瘡、
関節疾患、例えば慢性関節リューマチ、強直性脊髄炎、乾癬または炎症性腸疾患に関わる関節炎、
筋骨格疾患、例えば重症筋無力症、多発性筋炎、
内分泌性疾患、例えばインシュリン依存性真性糖尿病、自己免疫性甲状腺炎(橋本病)、甲状腺中毒症、グレーブス病、
造血系の疾患、例えば自己免疫性貧血、自己免疫性血小板減少症、
心臓血管系の疾患、例えば心筋症、血管炎、全身性エリテマトーデスのような全身性疾患に関わる心臓血管系の疾患、結節性多発性関節炎、慢性関節リューマチ、硬皮症、サルコイドーシス、
癌起源の疾患、例えば悪性黒皮症、セザリー症候群、皮膚T細胞リンパ腫、腎細胞癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、肝癌、肺癌および肉腫、
アレルギー起源の疾患、障害または症状、
である。
使用するMHC分子構築物のMHC分子の少なくとも2つは異なっており、
使用するMHC分子構築物のMHC分子は同じであり、
使用するMHC分子構築物の複数のMHC分子により捕獲されるペプチドの少なくとも2つは異なっており、
使用するMHC分子構築物のMHC分子により捕獲されるペプチドは同じであり、
使用するMHC分子構築物のMHC分子により捕獲されるペプチドは天然アミノ酸、親水性または疎水性の基を含まないように化学的に修飾されるか合成されており、
使用するMHC分子構築物のMHCクラスI分子により捕獲されるペプチドは可撓性のリンカーによりMHCクラスI重鎖に連結されており、
使用するMHC分子構築物のMHCクラスI分子により捕獲されるペプチドは可撓性のリンカーによりMHCクラスI軽鎖(β2m)に連結されており、
ペプチドは可撓性のリンカーにより軽鎖(β2m)と結合したMHCクラスI重鎖を有する使用するMHC分子構築物のMHCクラスI分子により捕獲され、
使用するMHC分子構築物のMHCクラスII分子により捕獲されるペプチドは可撓性のリンカーによりα鎖に連結されており、
使用するMHC分子構築物のMHCクラスII分子により捕獲されるペプチドは可撓性のリンカーによりβ鎖に連結されており、
使用するMHC分子構築物のMHCクラスI分子は突然変異されており、
使用するMHC分子構築物のMHCクラスII分子は突然変異されており、
使用するMHC分子構築物のMHC分子はペプチド非含有MHC分子である、
という点である。
上記のように、本発明の治療用組成物はインビボ療法に適する。
インビボ療法のための治療用組成物は1〜10種の異なるMHC分子構築物を適宜含有してよい。即ち、2、3、4、5、6、またはより多くの種類の異なるMHC分子構築物の含有物を意図しており、それは場合により好都合なものと考えられている。さらにまた異なるペプチドを捕獲しているMHC分子を担持したMHC分子構築物を含むことも好都合である場合がある。各MHC分子構築物の量は該当するMHC分子構築物またはMHC分子構築物の組み合わせに依存する。さらにまた、MHC分子の親和性も考慮されるべきである。高親和性ならびに低親和性のペプチドをMHC分子により捕獲させてよい。しかしながらこれは、所望の応答を得るために必要な量および所望の応答の強度に影響してくると予測される。全身免疫応答を誘発するために必要なMHC分子構築物の量は典型的には0.0001〜10000mg/kg/用量、例えば0.01〜1000mg/kg/用量、0.1〜100mg/kg/用量、または1〜10mg/kg/用量の範囲である。一般的に、使用するMHC分子は異種反応の危険性を回避ないしは最小限とするためには投与対象と共同的作用を示すものであるべきである。
本明細書に記載したMHC分子構築物を提供する工程、および、
治療用物質に適する媒体中にMHC分子構築物を溶解または分散させる工程、および、
場合により他のアジュバントおよび/または賦形剤を添加する工程、
を包含する。
上記のように、本発明の組成物はエクスビボ療法に適している。
即ち、本発明は特にMHC認識細胞の有効量を有効成分として含有する治療用組成物に関し、該MHC認識細胞は下記工程:
本明細書に記載したMHC分子構築物を用いて被験体からMHC認識細胞を単離する工程、および、
該MHC認識細胞を臨床的に適切な数量まで増殖させる工程、
により得られる。
1)本明細書において定義した1つ以上のMHC分子構築物を被験体由来のサンプルと接触させ、これによりMHC分子構築物をサンプル中のMHC認識細胞に結合させる。次にMHC分子構築物をサンプルから回収し、その後、MHC認識細胞をMHC分子構築物から遊離させ、その後、増殖させ得る。
2)1つ以上の本明細書において定義したMHC分子構築物を被験体由来のサンプルと接触させ、これによりMHC分子構築物をサンプル中のMHC認識細胞に結合させる。次にMHC分子構築物をサンプルから回収し、その後、MHC認識細胞をMHC分子構築物から遊離させ、その後、1つ以上の他のMHC分子構築物存在下で増殖させ得る。
3)本明細書において定義した固体または半固体の支持体上に固定化された本明細書において定義した1つ以上のMHC分子構築物を被験体由来のサンプルと接触させ、これによりMHC分子構築物をサンプル中のMHC認識細胞に結合させる。次にMHC分子構築物をサンプルから回収し、その後、MHC認識細胞をMHC分子構築物から遊離させ、その後、増殖させ得る。
4)本明細書において定義した固体または半固体の支持体上に固定化された本明細書において定義した1つ以上のMHC分子構築物を被験体由来のサンプルと接触させ、これによりMHC分子構築物をサンプル中のMHC認識細胞に結合させる。次にMHC分子構築物をサンプルから回収し、その後、MHC認識細胞をMHC分子構築物から遊離させ、その後、1つ以上の他のMHC分子構築物の存在下で増殖させ得る。
5)本明細書において定義した固体または半固体の支持体上に固定化された本明細書において定義した標識された1つ以上のMHC分子構築物を被験体由来のサンプルと接触させ、これによりMHC分子構築物をサンプル中のMHC認識細胞に結合させる。次にMHC分子構築物をサンプルから回収し、その後、MHC認識細胞をMHC分子構築物から遊離させ、その後増殖させ得る。
6)本明細書において定義した固体または半固体の支持体上に固定化された本明細書において定義した標識された1つ以上のMHC分子構築物を被験体由来のサンプルと接触させ、これによりMHC分子構築物をサンプル中のMHC認識細胞に結合させる。次にMHC分子構築物をサンプルから回収し、その後、MHC認識細胞をMHC分子構築物から遊離させ、その後、1つ以上の他のMHC分子構築物の存在下で増殖させ得る。
7)本明細書において定義した1つ以上のMHC分子構築物を被験体由来のサンプルと接触させ、これによりMHC分子構築物をサンプル中のMHC認識細胞に結合させる。次に、MHC分子構築物を結合したMHC認識細胞を含有するサンプルをMHC認識細胞またはMHC分子構築物のいずれかの部分に結合する能力を有する1つ以上の分子を自らに固定させてある本明細書において定義した固体または半固体の支持体と接触させることにより、結合したMHC認識細胞を有するMHC分子構築物を支持体に結合させる。MHC認識細胞を有するこのようにして結合されたMHC分子構築物を次にサンプルから回収し、その後、MHC認識細胞をMHC分子構築物から遊離させ、その後、増殖させ得る。
8)本明細書において定義した標識された1つ以上のMHC分子構築物を被験体由来のサンプルと接触させ、これによりMHC分子構築物をサンプル中のMHC認識細胞に結合させる。次に、MHC分子構築物を結合したMHC認識細胞を含有するサンプルをMHC認識細胞またはMHC分子構築物の任意の部分に結合する能力を有する1つ以上の分子を自らに固定させてある本明細書において定義した固体または半固体の支持体と接触させることにより、結合したMHC認識細胞を有するMHC分子構築物を支持体に結合させる。MHC認識細胞を有するこのようにして結合されたMHC分子構築物を次にサンプルから回収し、その後、MHC認識細胞をMHC分子構築物から遊離させ、その後、1つ以上の他のMHC分子構築物の存在下で増殖させる。
「サンプル」とは上記において定義した意味を有することは認識される。特にサンプルは末梢血の単核細胞(PBMC)または他の血液由来の調製物、例えば白血球搬出法による産物、または骨髄、脾臓または臍帯であってよい。サンプルはそのまま使用するか、または種々の精製、脱汚染、濾過、または濃縮法、および/あるいは免疫磁性的分離のようなサンプルの一部を単離または除去する方法に付してよい。
細胞の増殖は上記定義した1つ以上のMHC分子構築物の存在下に行なってよいことは理解されるべきである。このように使用されるMHC分子構築物はMHC認識細胞の捕獲のために用いたものと同じであっても異なっていてもよい。これは上記定義に従って、1つ以上の生物学的に活性な分子を含んでよい。このような生物学的に活性な分子はさらに、MHC認識細胞上のTCRおよび同時刺激分子との複数の相互作用をさらに促進し、MHC認識細胞の効率的なエクスビボの刺激をもたらす。例えば同時刺激分子およびそのリガンドの結合親和性はMHC分子ペプチド複合体とTCRの結合親和性と同じ範囲にある(10mM範囲)。このような生物学的に活性な分子の含有により増殖中の刺激抗体のかわりとして天然の分子の使用が促進されるが、その理由は複数の結合相互作用を導入することによりそれらが低親和性を補っているためである。特にMHC認識細胞は、1)対象となるMHC認識細胞クローンよりも他のMHC認識細胞クローンを、ならびに、2)対象となるMHC認識細胞クローンを、刺激、アップレギュレート、ダウンレギュレート、抑制または増強するために、MHC分子は結合していないが生物学的に活性な分子が結合した、1つ以上のMHC分子構築物の存在下に増殖させてよい。増殖はまた、樹状細胞または間質細胞のような支持細胞の存在下に行なってよい。
本明細書において記載したMHC分子構築物を、MHC分子構築物にMHC認識細胞が結合するような条件下で、MHC認識細胞を含有することが疑われるサンプルと接触させる工程、および、結合したMHC分子構築物およびMHC認識細胞を単離する工程、
を包含する。
上記のMHC分子構築物を用いてMHC認識細胞を得る工程、
該MHC認識細胞を臨床的に適する数量まで増殖させる工程、
得られた細胞を投与に適する媒体中で製剤する工程、および、
場合によりアジュバントおよび/または賦形剤を添加する工程、
を包含する。
特定の局面において、本発明は、
組織学的方法におけるMHC分子の使用、および、
細胞学的方法におけるMHC分子の使用、
に関する。
重鎖、β2mと組み合わせられた重鎖、ペプチドと組み合わせられた重鎖、および、ペプチドを有する重鎖/β2m二量体よりなる群から選択されるMHCクラスI分子;
またはα/β二量体、ペプチドを有するα/β二量体、親和性タグを介して組み合わせられたα/β二量体、および、ペプチドを有する親和性タグを介して組み合わせられたα/β二量体よりなる群から選択されるMHCクラスII分子;
あるいは、MHCクラスI様分子、または、MHCクラスII様分子、
である。
使用されるMHC分子はペプチドを含まないMHC分子またはペプチドで満たされたMHC分子であることができる。
5-(および6)-カルボキシフルオレセイン、5-または6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5-(および6)-カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、および、染料類、例えばCy2、Cy3およびCy5、場合により置換されたクマリン、例えばAMCA、PerCP、フィコビリタンパク質、例えばR-フィコエリスリン(RPE)およびアロフィコエリスリン(APC)、テキサスレッド、プリンセストンレッド、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびその類縁体、およびR-フィコエリスリンまたはアロフィコエリスリンと例えばCy5またはテキサスレッドとの結合体、および、半導体ナノ結晶系の無機の蛍光標識(例えば量子ドットおよびQdot(登録商標)ナノ結晶)およびEu3+およびSm3+のようなランタニド系の経時的分割蛍光標識、
ハプテン類、例えばDNP、ビオチンおよびジゴキシギニンから選択されるか、あるいは、
酵素標識、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、ベータガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6‐ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ベータ-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ(GO)から選択されるか、あるいは、
発光標識、例えばルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル類、1,2-ジオキセタン類およびピリドピリダジン類から選択されるか、あるいは、
放射性標識、例えばヨウ素、コバルト、セレン、トリチウムおよびリンの結合同位体から選択される。
(a)支持体上に搭載されたMHC認識細胞を有することが疑われるサンプルを準備する工程、
(b)明細書に記載したMHC分子にサンプルを接触させる工程、および、
(c)結合がMHC認識細胞の存在を示すようなMHC分子の任意の結合を測定する工程、
を包含するサンプル中のMHC認識細胞の存在を検出するための方法に関する。
(a)支持体上に搭載されたMHC認識細胞を有することが疑われるサンプルを準備する工程、
(b)明細書に記載したMHC分子にサンプルを接触させる工程、および、
(c)MHC分子の任意の結合を測定することによりMHC認識細胞をモニタリングする工程、
を包含するMHC認識細胞をモニタリングするための方法に関する。
(a)支持体上に搭載されたMHC認識細胞を有することが疑われるサンプルを準備する工程、
(b)明細書に記載したMHC分子にサンプルを接触させる工程、および、
(c)MHC分子の任意の結合を測定することによりMHC認識細胞が関与する疾患の予後を明らかにする工程、
を包含するMHC認識細胞の関与する疾患の予後を明らかにするための方法に関する。
(a)支持体上に搭載されたMHC認識細胞を有することが疑われるサンプルを準備する工程、
(b)明細書に記載したMHC分子にサンプルを接触させる工程、および、
(c)MHC分子の任意の結合を測定することにより分子認識細胞の関与する疾患の状態を測定する工程、
を包含するMHC認識細胞の関与する疾患の状態を測定するための方法に関する。
(a)支持体上に搭載されたMHC認識細胞を有することが疑われるサンプルを準備する工程、
(b)明細書に記載したMHC分子にサンプルを接触させる工程、および、
(c)MHC分子の任意の結合を測定することにより細胞の形態にMHC分子構築物の結合を相関づける工程、
を包含するサンプル中のMHC認識細胞の存在に細胞の形態を相関づける方法に関する。
(a)支持体上に搭載されたMHC認識細胞を有することが疑われるサンプルを準備する工程、
(b)明細書に記載したMHC分子にサンプルを接触させる工程、および、
(c)MHC分子の任意の結合を測定することによりMHC認識細胞の関与する疾患を診断する工程、
を包含するMHC認識細胞の関与する疾患を診断するための方法に関する。
(a)支持体上に搭載された医薬品による治療を受けている被検体に由来するサンプルを準備する工程、
(b)明細書に記載したMHC分子にサンプルを接触させる工程、および、
(c)MHC分子の任意の結合を測定することにより医薬品の有効性を測定する工程、を包含するMHC認識細胞の関与する疾患に対する医薬品の有効性を測定するための方法に関する。
1.乳癌における本発明の利用可能性
MHC分子構築物を使用する本発明の方法の有用性の1つの例は乳癌の診断ならびに特定の型の乳癌を治療するための適切な治療様式の選択である。
治療物質を投与されている癌患者から採取したサンプルを正しいMHC対立遺伝子に負荷された本発明のMHC分子構築物で染色し、その際、MHC分子は、癌組織サンプル中の特定の抗原および浸潤CTLを認識するペプチドを負荷される。CTLの染色陽性(結合あり)は、特定の投与されている治療用組成物の有効性を示しており、その理由は、誘導されたCTLが癌の実際の部位において同定されるからである。二重染色法により、特定の、そして全てのCTLを染色することができる。これにより処方の有効性に関する更なる情報が得られる。例えば、1つの特異的ペプチドを用いた場合の染色陽性は相当するペプチドが治療用組成物の成分として特に有効となることを示している。即ち治療用組成物は、癌組織中の特定の浸潤CTLの同定(結合)に基づいて患者の応答に従って調節/変更することができる。
本発明はまた移植を受けた患者における特定のウィルスに対するT細胞の応答を追跡するために用いることもできる。移植患者は移植片の拒絶反応を回避するために必要な免疫抑制療法によりウィルスの攻撃に対して感受性がある場合が多い。発生中のウィルスを支援するウィルス特異的T細胞の移植後の発生をモニタリングすることにより、免疫抑制治療または他の予防的医薬品を患者の免疫状態に適合するように調節することができる。これはMHC分子構築物を用いて行なうことができるが、その際、MHC分子には進行中の感染症から発生する上記T細胞により認識されるペプチドを負荷する。医師がモニタリングを望むウィルスの例はCMV(サイトメガロウィルス)およびEBV(エプスタイン-バーウィルス)である。
本発明は複合的な疾患、例えばインフルエンザ、結核、マラリア、単純疱疹およびクラミジアとの関わりにおいてT細胞の応答(またはより正しくは、特異的T細胞レセプター)を検出し、モニタリングするために用いることができる。MHC分子が適切なペプチドを負荷されたMHC分子構築物を検出およびモニタリングに適用することができる。
結合成分として複数のストレプトアビジン(SA)に連結して保有するポリアクリル酸アミドの担体分子を以下の操作法に従って調製する。
デキストラン(500kDa、Pharmacia BioTech、T-500、カタログ番号17-0320-2)またはプルラン(Sigma, カタログ番号70051、分子量 400kDa、ポリディスパリティーMW/MN=1.38)を水に溶解し、氷上で冷却し、水酸化カリウムおよびモノクロロ酢酸(Fluka, カタログ番号24510)を添加する(合計、1.0mgデキストランまたはプルラン/ml、0.58mgモノクロロ酢酸/ml、氷冷、4時間攪拌)。氷浴上で冷却攪拌しながら、希塩酸をゆっくり添加することにより反応溶液のpHをpH7に合わせる。溶液を水に対して過剰に透析する(100倍過剰容量、室温、10kDaのMwCO、24時間で6回交換)。希釈溶液を採取し、数日間凍結乾燥し、完全に乾燥した粉末を得る。カルボキシルメチル活性化の程度は炭水化物骨格の積分値と4.2ppmにおけるメチル基の積分値を比較することによりプロトンNMR分析により測定する。乾燥粉末は室温でデシケーター中に保存する。
ウサギ抗ビオチン抗体またはSAである結合成分の多くに結合して保有するカルボキシル修飾デキストランまたはカルボキシル修飾プルランである担体分子を以下の方法で調製することができる。カルボキシル修飾デキストランまたはカルボキシル修飾プルランを溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド(Aldrich、カタログ番号13067-2)および塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC、Aldrich、カタログ番号E6383、191.7)を添加し(2.0 mgカルボキシル修飾炭水化物/ml、1.42mg NHS-OH/ml、0.59mg EDAC/ml、50mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(「MES」、 Aldrich、カタログ番号M8250)、100mM NaCl、pH6.0)、その後1時間室温で攪拌する。透析された結合タンパク質、fab2親和性精製ウサギ抗ビオチン抗体またはSAを添加する(総量で1.06mg活性化カルボキシル修飾炭水化物/ml、5.3mgウサギ抗ビオチン/mL、または6.4mgストレプトアビジン/mL、50mM MES、100mM NaCl、pH6.0)。室温で一晩放置後、残存する反応基はすべてエタノールアミン含有緩衝液(110mMエタノールアミン、50mM HEPES、0.1M NaCl、pH7.0)の1/10容量の反応混合物を添加することによりクエンチングし、30℃で30分間攪拌する。結合成分を共役した担体分子を含有する溶液を20myのポリスルホンフィルターを通して濾過し、その後、ゲル濾過により未結合のタンパク質から精製する(FPLC、Pharmacia、S-500、0.1M HEPES、0.1M NaCl、pH7.2)。遊離のストレプトアビジンから明らかに分離され、第1の除外ピークには含まれない画分のみを共役体画分として採取する。担体分子上の抗体またはSAの結合の程度を278nmにおけるUV吸光度から計算することができる。結合成分が共役した担体分子を約3.0mg抗体またはタンパク質/mlまで濃縮する。次に後述する通り、共役体を複数の標識化合物、例えばFITCまたはAlexaで標識する。
ここでは担体分子はN-ビニルピロリドン/N-アクリルオキシスクシンイミド共重合体であり、結合成分はSAである。
上記分子5〜8からMHC分子構築物を調製するために、PBS緩衝液中の共役体にビオチニル化MHC分子を添加することにより結合成分が共役した担体分子にMHC分子を結合することができる。MHC分子は所望に応じて選択してよい(例えばHLAまたは種々のHLA対立遺伝子)。MHC分子は所望によりペプチドで満たされているかまたはペプチドを含まない場合もある。
以下の例は穏やかな条件下、500kDaのデキストランである活性化重合体担体分子に直接MHC分子を結合する場合を説明するものである。
以下の例は担体分子に直接複数のMHC分子と複数の標識化合物が結合しているMHC分子構築物の結合(共役)を説明するものである。担体分子はデキストランであり、標識化合物はAPである。
ポリリガンドMHC分子および四量体の製造
A.結合成分を有する担体分子の製造
ビニルスルホン活性化デキストラン
種々の分子サイズのデキストラン(Pharmacosmosから150および270kDaのもの、Pharmaciaから500kDaのもの)をA.LihmeおよびT.Boenischの記載(「Water soluble, polymer based reagents and conjugates comprising moieties derived from divinely sulfone(ジビニルスルホン由来の部分を有する水溶性重合体系試薬および結合体)」、WO93/01498、参考文献22)に従ってジビニルスルホン(Aldrich)で活性化し、モノマー単位約25%のビニルスルホン活性化の水準を得た。
ストレプトアビジン(SA、Genzyme)を一晩透析した(5ml中100mg、0.10M NaCl 1000mlに対して透析、2〜4℃、10kDaのMwCO、3回交換)。
セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP、Fairzyme)およびストレプトアビジン(SA、Genzyme)を一晩透析(5ml中100mg、0.10M NaCl 1000mlに対して透析、2〜4℃、10kDaのMwCO、3回交換)した後に濃縮した。結合は活性化デキストランにHRPとストレプトアビジンを逐次的に添加することにより行なった。
以下の標準的操作法に従ってE.coli菌株(BL21(DE3),Novagen(Novagen,Inc,Madison,WI,USA)からHKAクラスI重鎖および軽鎖(β2m)を作成し、封入体として部分的に精製した。
ペプチドを含まないMHCクラスIは、官能性モノビオチニル化MHCクラスI複合体(実施例1B参照)を先ず尿素(8M)またはグアニジン(6M)の添加により変性する工程において製造した。カオトロピック緩衝液はクラスI複合体から構造的分子サブユニットを解離させ、生化学的精製に用いることができる遊離の可溶性ビオチニル化重鎖および遊離の可溶性β2m分子を生じさせる。重鎖分子は定法に従ってG75サイズ排除クロマトグラフィーにより解離β2mおよびペプチドから除去された。精製された重鎖分子は自発的に、過剰なβ2mを含有する折りたたみ緩衝液中で重鎖および軽鎖よりなるペプチド受容性ヘテロ二量体複合体を形成する(上記実施例1:B参照)。ペプチドを含まないHLAクラスI二量体は過剰のβ2M中では安定なままであり、ストレプトアビジンと連結して本発明のペプチドを含まない構築物またはペプチドを含まない四量体を形成し得た。目的のペプチド(1mM)を可溶性またはSA結合デキストランとの連結の工程の間またはその後に添加することにより、本発明のMHC分子構築物またはMHC分子四量体の形態のTCR結合MHC分子が得られる。
種々の分子サイズのSA結合デキストランの調製品を、SA分子当たり2個のビオチニル化HLAクラスI分子の比率に相当する量のHLA複合体と混合した。HLA分子は、直接SA結合デキストランの溶液に添加した。即ち、MHC分子構築物は下記:
(1)担体分子は500kDaのデキストランであり、そこに連結させて27.2個のビオチニル化HLAクラスI分子(MHC分子)を約13.6個のFITC標識SA(結合成分)を介して保有(SA当たり平均で2個のHLAクラスI分子)し、各SAは平均で2.7個のFITCにより標識されている、
(2)担体分子は270kDaのデキストランであり、そこに連結させて約13.8個のビオチニル化HLAクラスI分子(MHC分子)を約6.9個のFITC標識SA(結合成分)を介して保有(SA当たり平均で2個のHLAクラスI分子)し、各SAは平均で2.6個のFITCにより標識されている、
(3)担体分子は150kDaのデキストランであり、そこに連結させて約8.8個のビオチニル化HLAクラスI分子(MHC分子)を約4.4個のFITC標識SA(結合成分)を介して保有(SA当たり平均で2個のHLAクラスI分子)し、各SAは平均で2.7個のFITCにより標識されている、
(4)担体分子は70kDaのデキストランであり、そこに連結させて約6.0個のビオチニル化HLAクラスI分子(MHC分子)を約3.0個のSA(結合成分)を介して保有(SA当たり平均で2個のHLAクラスI分子)し、各デキストランは平均で2.3個のHRP酵素により標識されている、
(5)担体分子は270kDaのデキストランであり、そこに連結させて約10.8個のビオチニル化HLAクラスI分子(MHC分子)を約5.4個のSA(結合成分)を介して保有(SA当たり平均で2個のHLAクラスI分子)し、各デキストランは平均で3.7個のHRP酵素により標識されている、
(6)担体分子は270kDaのデキストランであり、そこに連結させて約16.0個のビオチニル化HLAクラスI分子(MHC分子)を約8.0個のSA(結合成分)を介して保有(SA当たり平均で2個のHLAクラスI分子)し、各デキストランは平均で5.3個のHRP酵素により標識されている、という組成となるよう形成した。
270kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて13.8個のビオチニル化HLA A0201分子を、MART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびβ2mとの複合体として、6.9個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.6個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物2)、
150kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて8.8個のビオチニル化HLA A0201分子を、MART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびβ2mとの複合体として、4.4個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.7個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物3)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて27.2個のビオチニル化HLA A0201を、インフルエンザマトリックスタンパク質のアミノ酸58〜66(GILGFVFTL)およびβ2mとの複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.7個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物4)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて27.2個のビオチニル化HLA A0201を、野生型P53ペプチドR9V(RMPEAAPPV)およびβ2mとの複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.7個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物5)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて27.2個のビオチニル化HLA A0201を、野生型P53ペプチドG11V(GLAPPQHLIRV)およびβ2mとの複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.7個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物6)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて27.2個のビオチニル化ペプチドを含まないHLA A0201を、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.7個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物7)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて27.2個のビオチニル化HLA A0201を、gp100ペプチドKTWGQYWOVおよびβ2mとの複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.7個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物8)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて27.2個のHLA A0201重鎖を、MART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびヨウ素化β2mとの複合体として、13.6個のSAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、放射能100000cpm/サンプルを有する)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物9)、
270kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて16.0個のビオチニル化HLA A0201を、Mart-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびβ2mとの複合体として、8個のSAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子)し、デキストランに対し5.3個のHRP酵素を保有しているMHC分子構築物(MHC分子構築物10)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて27.2個のビオチニル化HLA A0201を、sur1/M2ペプチドアナログ(LMLGEFLKL)およびβ2mとの複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.7個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物11)、
150kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて10.8個のビオチニル化HLA A0201を、MART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびβ2mとの複合体として、5.4個のSAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子)し、デキストランに対し3.7個のHRP酵素を保有しているMHC分子構築物(MHC分子構築物12)、
70kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて16.0個のビオチニル化HLA A0201を、MART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびβ2mとの複合体として、3.0個のSAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子)し、デキストランに対し2.3個のHRP酵素を保有しているMHC分子構築物(MHC分子構築物13)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて27.2個のビオチニル化HLA A0201を、MAGE-3ペプチド(FLWGPRALV)およびβ2mとの複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で2個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2.7個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物14)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて14.1個のビオチニル化HLA A0201を、MART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびβ2mとの複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で1個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物15)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて14.1個のビオチニル化HLA A0201を、MART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびβ2mおよび7.1個のMIC A分子との複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で1個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物16)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて14.1個のビオチニル化HLA A0201を、gp100ペプチドKTWGQYWOVおよびβ2mとの複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で1個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物17)、
500kDaのデキストラン担体分子を有し、そこに連結させて14.1個のビオチニル化HLA A0201を、gp100ペプチドKTWGQYWOVおよびβ2mおよび7.1個のMIC A分子との複合体として、13.6個のFITC標識SAを介して保有(SA当たり平均で1個のHLA A0201分子、そして、SA当たり平均で2個のFITC)しているMHC分子構築物(MHC分子構築物18)。
MHC分子四量体の製造
四量体に使用するペプチドエピトープ特異的HLA分子は実施例1のBに記載の通り作製した。四量体は少量のPE結合SA(Molecular Probes, Holland)をビオチニル化HLA複合体の溶液に順次添加することにより形成した。混合物中のHLA複合体の最終的な量は、飽和を確実にするためにはSAの量の4倍で無ければならない(SA複合体あたり4個のビオチン結合部位)。
4個のビオチニル化HLA A0201を、gp100ペプチド(KTWGQYWOV)およびβ2mとの複合体として保有するPE標識四量体(四量体2)、
4個のビオチニル化HLA A0201を、インフルエンザマトリックスタンパク質のアミノ酸58〜66(GILGFVFTL)との複合体として保有するPE標識四量体(四量体3)、
4個のビオチニル化HLA A0201を、野生型P53ペプチドR9V(RMPEAAPPV)との複合体として保有するPE標識四量体(四量体4)、
4個のビオチニル化HLA A0201を、野生型P53ペプチドG11V(GLAPPQHLIRV)との複合体として保有するPE標識四量体(四量体5)、
P4個のPE標識ペプチドを含まないHLA A0201を保有する、E標識ペプチドを含まない四量体(四量体6)。
MHC分子四量体と比較してT細胞に対する本発明のMHC分子構築物の用量依存的結合はペプチド特異的である
この実験においては、確立されたT細胞クローンへの本発明のペプチドエピトープ特異的MHC分子構築物およびMHC分子四量体の結合を調べた。
MHC分子構築物1、
MHC分子構築物2、
MHC分子構築物3。
四量体1、
四量体2。
インフルエンザ特異的T細胞株への本発明のMHC分子構築物および四量体の結合
本実験においては、HLA A0201分子に関する提示される従来の非自己ペプチドを認識するT細胞株への本発明のペプチド特異的構築物および四量体の結合を調べた。
MHC分子構築物4、
MHC分子構築物5、
MHC分子構築物6。
四量体3、
四量体4、
四量体5。
MHC分子構築物と四量体の結合の時間依存性
本実験においては、本発明のMHC分子構築物の結合が時間依存的であることがわかった。得られた結果を図27に示す。比較のために、使用した本発明のMHC分子構築物と同じペプチドを提示するPE標識四量体を平行アッセイで試験した。
MHC分子構築物1
四量体1。
本発明の細胞結合構築物の解離
本実験においては、本発明の細胞結合構築物の解離を調べた。
MHC分子構築物1。
本発明の構築物の結合:抗体の影響
本実験においては、本発明の構築物の細胞表面結合が、ペプチド結合部位の近接部においてHLAクラスIエピトープと反応するHLAクラスI特異的モノクローナル抗体により影響を受けることが示された。
MHC分子構築物1。
BB7.2(HLA A0201特異的)、W6/32(HLA A、B、C汎特異的)、BBM1(ヒトβ2m特異的)およびマウス抗ヒトT細胞、CD8クローンDK25(DAKOコード番号M0707)(CD8-特異的抗体)。
本発明の構築物の結合:連結工程の間のHLAクラスI:デキストランの比率の影響
本実験においては、本発明のMHC分子構築物の最大細胞結合に必要なデキストラン担体分子当たりのHLAクラスI分子のより最適な数を分析した。
MHC分子構築物1、以下に示すような種々の量のHLA A0201を有するもの、
MHC分子構築物2、以下に示すような種々の量のHLA A0201を有するもの、
MHC分子構築物3、以下に示すような種々の量のHLA A0201を有するもの。
T細胞小集団へのMHC分子構築物および四量体の結合
本実験においては、本発明のMHC分子構築物の結合は四量体と比較して特定のT細胞のより小さい集団の改善された検出をもたらすことを示した。
MHC分子構築物1。
四量体1。
予め形成させたペプチドを含まないMHC分子構築物の適切なペプチド負荷後の特定のT細胞への結合
混合細胞サンプルにおける小さいT細胞特異性の検出(実施例9参照)における本発明のMHC分子構築物の意外にも高感度な能力をさらに、約1%のT細胞クローン5/127(「高親和性T細胞クローン」、図25参照)および1%の5/130(「低親和性T細胞クローン」、図25参照)を含有するサンプルを用いて検討した。1%の選択理由は種々の試験において増殖中のT細胞のサブ集団は、多くの場合、血液サンプル中のT細胞の総数の約1%を含み、免疫応答患者において0.1〜10%の範囲にあることが解かっているためである。
MHC分子構築物7。
四量体6。
MART-1ペプチドを提示する放射標識MHC分子構築物の結合
本実験においては、放射標識された本発明のMHC分子構築物の細胞結合を調べた。分子構築物はMHC分子としてヨウ素化β2mの存在下で折りたたまれたHLA/ペプチド複合体を含有した。構築物は実施例1に従って調製したが、ここではヨウ素化β2mの存在下で折りたたみを起こさせた。
500kDaのデキストラン担体分子を有し、これはそこに連結させて27.2個のHLA A0201重鎖を、MART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)およびヨウ素化β2mとの複合体として、13.6個のSAを介して保有しているMHC分子構築物。
腫瘍特異的T細胞の染色
本実施例においては、乳癌患部における特異的なT細胞を標識するポリリガンドMHC分子構築物の能力を試験した。試験はスライド上に搭載されたヒトの皮膚、リンパ節および腫瘍幹部にそれぞれ由来するアセトン固定化された凍結生検サンプルに対して行なった。
MHC分子構築物8、
MHC分子構築物11。
SUR1M2ポリリガンドMHC分子構築物を用いたメラノーマおよびリンパ節組織のインサイチュ染色
本実施例においてはHLA-A2陽性患者の材料に由来するメラノーマおよびリンパ節組織中のT細胞を特異的に染色するポリリガンドMHC分子構築物の能力を試験した。
MHC分子構築物11
MART-1ペプチド提示ポリリガンドMHC分子構築物を用いたメラノーマ組織中のCD8+T細胞のインサイチュ染色
本実施例においてはA2-MART-1 MHC分子構築物によるHLA-A0201陽性患者由来のメラノーマ組織の特異的染色を調べた。
MHC分子構築物1
MART-1およびMAGE-3ペプチド提示ポリリガンドMHC分子構築物を用いた注射部位由来の皮膚生検サンプル中のBV12反応性および非反応性T細胞のインサイチュ染色
治癒力のある免疫療法を開発する試みには、可溶性ペプチド候補、例えばSUR1M2および/またはペプチドもしくは腫瘍溶解液を負荷した樹状細胞(DC)を患者のどこに注射するかが解決策の一部を構成する。細胞免疫応答はT細胞と抗原提示細胞、例えば二次リンパ臓器中のDCの相互作用により開始されるが、治療上のワクチン接種は別のシナリオ、即ち、抗原特異的T細胞の局所的増殖および蓄積をもたらすと考えられる。腫瘍関連ペプチドを提示するポリリガンドMHC分子構築物を用いて、ペプチド特異的T細胞が注射部位において過剰出現するかどうかを調べた。
MHC分子構築物1
MHC分子構築物14
gp-100およびMAGE-3ペプチド提示ポリリガンドMHC分子構築物を用いた注射部位由来皮膚生検サンプル中のCD8反応性T細胞のインサイチュ染色
本実験においては、ペプチド抗原特異的T細胞の蓄積を実施例15に記載したのと同様の方法を用いてさらに検討した。
MHC分子構築物8
MHC分子構築物14
MART-1ペプチド提示ポリリガンドMHC分子構築物によるメラノーマ組織中のCD8+T細胞の色原体インサイチュ染色
HLA A0201陽性メラノーマ患者由来の患部のCD8T細胞へのMART-1ペプチドアナログ(ELAGIGILTV)を提示するポリリガンドMHC分子構築物の特異的結合が、2種の異なる過酸化物ブロッキング法を用いてHRP媒介色原体染色により可視化できるかどうか調べた。
MHC分子構築物13
MHC分子構築物により誘発されるT細胞の活性化:同時刺激分子の影響
本実験においては、MHC構築物とともにインキュベートしたT細胞クローンの活性化が、NKRの活性化イソ型に結合するMHC分子構築物に結合した同時刺激分子の存在により影響を受けることが解かった。
MHC分子構築物15、
MHC分子構築物16、
MHC分子構築物17、
MHC分子構築物18。
複数の結合成分を連結して保有する担体分子の調製
複数の結合成分(例えばストレプトアビジン(SA))を自らに連結して保有する種々の担体分子(例えばそれぞれ150、270および500kDaのデキストラン)を以下に記載する操作法に従って調製した。MHC分子および/または生物活性化合物をその後連結した。各SAに対するカップリング部位の理論数は4であり、このことは各SAデキストラン分子の負荷許容量は22.4(4x5.6)、41.2(4x10.3)および68(4x17.0)であることを意味している。さらにまた、MHC分子/生物活性化合物を直接デキストラン分子に結合させることができ、即ち、より大きい負荷許容量を得ることができる。
ストレプトアビジン(SA、Genzyme)を一晩透析した(5ml中100mg、0.10M NaCl 1000mlに対して透析、2〜4℃、10kDaのMwCO、3回交換)。UV吸光度の測定の後、濃度を計算した。
複数の標識結合成分を連結して保有する担体分子の調製
以下に記載する操作法により、複数の標識化合物(例えばAlexa 647)で標識した複数の結合成分(例えばストレプトアビジン(SA))を自らに連結して保有する種々の担体分子(例えばそれぞれ150、270および500kDaのデキストラン)を調製した。MHC分子および/または生物活性化合物をその後連結した。各SAに対するカップリング部位の理論数は4であり、このことは各SAデキストラン分子の負荷許容量は22.4(4×5.6)、41.2(4×10.3)および68(4×17.0)であることを意味している。さらにまた、MHC分子/生物活性化合物を直接デキストラン分子に結合させることができ、即ち、より大きい負荷許容量を得ることができる。
実施例19で得たSAデキストラン分子をAlexa Fluor 647 Protein標識キット(Molecular Proves,製品番号A-20173)の製造元の指示書に従ってAlexa 647で標識した。反応条件は1バイアルのAlexa 647、2.0mg SA/mL、0.10M NaCl、50mM炭酸塩、pH 8.0、総量0.500mL、30℃暗所1時間とした。残存する反応基は全てエタノールアミン含有緩衝液(110mMエタノールアミン、50mM HEPES、0.1M NaCl、pH7.0)の0.050mL容量の反応混合物を添加することによりクエンチングし、30℃で30分間攪拌した。得られた蛍光標識重合体分子は透析により未結合の染料から精製した(1000mlの0.10M NaClに対して透析、2〜4℃、10kDa MwCO、3回交換、0.1M HEPES、0.1M NaCl、pH7.2)。
複数の結合成分を自らに連結して保有する担体分子の調製
以下に記載する方法により、複数の結合成分(例えばウサギ抗ビオチン抗体)を自らに連結して保有する種々の担体分子(例えばそれぞれ150、270および500kDaのデキストラン)を調製した。MHC分子および/または生物活性化合物をその後所望に応じて連結しうる。
ウサギ抗ビオチン抗体(アフィニティー精製、Fab2、約100kDa、DAKOコード番号DM0069)を一晩透析した(5ml中100mg抗体、0.10M NaCl 1000mLに対して透析、2〜4℃、10kDaのMwCO、3回交換)。UV吸光度の測定の後、濃度を計算した。抗体溶液を150、270または500kDaのビニルスルホン活性化デキストラン(約25%活性化)の溶液にそれぞれ添加し(総量で0.680mL、1.07mgビニルスルホンデキストラン/ml、15.25mg抗体/ml、0.1M NaCl、25mM炭酸塩緩衝液、pH8.5)、18時間30℃で攪拌した。残存する反応基は全てエタノールアミン含有緩衝液(110mMエタノールアミン、50mM HEPES、0.1M NaCl、pH7.0)の1/10容量の反応混合物を添加することによりクエンチングし、30℃で30分間攪拌した。得られた重合体分子はゲル濾過(FPLC、Pharmacia、S-200、0.1M HEPES、0.1M NaCl、pH7.2)により未結合の抗体から精製した。
複数の標識結合成分を自らに連結して保有する担体分子の調製
以下に記載する操作法により、複数の標識化合物(例えばAlexa 532またはAlexa 647)で標識した複数の結合成分(例えばウサギ抗ビオチン抗体)を自らに連結して保有する種々の担体分子(例えばそれぞれ150および270kDaのデキストラン)を調製した。MHC分子および/または生物活性化合物をその後所望により連結しうる。
実施例21で得たウサギ抗ビオチンデキストラン分子をAlexa Fluor 532Protein標識キット(Molecular Probes,製品番号A-10236)またはAlexa Fluor 647Protein標識キット(Molecular Probes,製品番号A-20173)の製造元の指示書に従ってAlexa 532またはAlexa 647で標識した。反応条件は1バイアルのAlexa染料、2.0mg抗体/mLの等量、0.10M NaCl、50mM炭酸塩、pH 8.0、総量0.500mL、30℃暗所1時間とした。残存する反応基は全てエタノールアミン含有緩衝液(110mMエタノールアミン、50mM HEPES、0.1M NaCl、pH7.0)の0.050mL容量の反応混合物を添加することによりクエンチングし、30℃で30分間攪拌した。4種の異なるように蛍光標識された重合体分子は透析により未結合の染料から精製した(1000mlの0.10M NaClに対して透析、2〜4℃、暗所、10kDa MwCO、3回交換)、0.1M HEPES、0.1M NaCl、pH7.2)。
複数の標識結合成分を自らに連結して保有する担体分子の調製
以下に記載する操作法により、複数の標識化合物(例えばFITC)で標識した複数の結合成分(例えばウサギ抗ビオチン抗体)を自らに連結して保有する種々の担体分子(例えばそれぞれ150および270kDaのデキストラン)を調製した。MHC分子および/または生物活性化合物をその後所望により連結しうる。
実施例21で得たウサギ抗ビオチンデキストラン(150kDaおよび270kDaのデキストラン)をFITC標識に用いた。冷凍庫に保存したFITCバイアル(FITC(フルオレセインイソチオシアネート)、Molecular Probes、製品番号F-1906)を開封前1時間室温で放置した。FITC溶液(10.1mg/ml NMP)をウサギ抗ビオチンデキストラン分子の攪拌混合物に添加した(総量で0.750ml、分子濃度は1.5mg抗体/mlに等量、0.0487mgFITC/ml、抗体当たり約8.3個のFITCに等量、0.1M NaCl、200mM炭酸塩緩衝液、pH8.5、30℃、1時間暗所)。残存する反応基は全てエタノールアミン含有緩衝液(110mMエタノールアミン、50mM HEPES、0.1M NaCl、pH7.0)の1/10容量の反応混合物を添加することによりクエンチングし、30℃で30分間攪拌した。2種の異なるようにFITC標識されたウサギ抗ビオチン重合体分子はフロート・ア・ライザー中で透析することにより未結合のフルオレセインから精製した(500mlの0.10MのNaClに対して透析、2〜4℃、暗所、10kDa MwCO、3回交換、0.1M HEPES、0.1M NaCl、pH7.2)。
免疫磁性的分離方法におけるMHC分子を用いたCTLの単離
本実験においては、抗原反応性細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が磁性ビーズ上に固定化したMHC分子の使用によりHLA-A0201陽性患者のリンパ節サンプルから単離できることが示された。
[1]そこに結合した1つ以上のMHC分子を有するキャリア分子を含有してなり、該MHC分子が直接的にまたは1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合しているMHC分子構築物。
[2]MHC分子が、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシまたはトリ分子等の脊椎動物MHC分子である[1]記載のMHC分子構築物。
[3]MHC分子がヒトMHC分子である[1]または[2]記載のMHC分子構築物。
[4]MHC分子が、
重鎖、β2mと結合した重鎖、ペプチドと結合した重鎖、およびペプチドを有する重鎖/β2mダイマーからなる群より選ばれたMHCクラスI分子;
またはα/βダイマー、ペプチドを有するα/βダイマー、アフィニティタグを介して結合したα/βダイマーおよびペプチドを有するアフィニティタグを介して結合したα/βダイマーからなる群より選ばれたMHCクラスII分子;
またはMHCクラスI様分子もしくはMHCクラスII様分子
である[1]〜[3]いずれか記載のMHC分子構築物。
[5]MHC分子がペプチド非含有MHC分子である[1]〜[4]いずれか記載のMHC分子構築物。
[6]少なくとも2つのMHC分子が異なるものである[1]〜[5]いずれか記載のMHC分子構築物。
[7]MHC分子が同一である[1]〜[5]いずれか記載のMHC分子構築物。
[8]MHC分子によって包囲される少なくとも2つのペプチドが異なるものである[1]〜[7]いずれか記載のMHC分子構築物。
[9]MHC分子により包囲されるペプチドが同一である[1]〜[7]いずれか記載のMHC分子構築物。
[10]MHC分子がキャリア分子に直接結合している[1]〜[9]いずれか記載のMHC分子構築物。
[11]MHC分子が1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合している[1]〜[9]いずれか記載のMHC分子。
[12]各結合実体が、そこに結合した1〜10個のMHC分子を有してなる[11]記載のMHC分子構築物。
[13]各結合実体が、そこに結合した1〜8個のMHC分子を有してなる[11]記載のMHC分子構築物。
[14]各結合実体が、そこに結合した1〜6個のMHC分子を有してなる[11]記載のMHC分子構築物。
[15]各結合実体が、そこに結合した1〜4個のMHC分子を有してなる[11]記載のMHC分子構築物。
[16]各結合実体が、そこに結合した1〜3個のMHC分子を有してなる[11]記載のMHC分子構築物。
[17]各結合実体が、そこに結合した1または2個のMHC分子を有してなる[11]記載のMHC分子構築物。
[18]前記構築物のMHC分子の総数が1〜100個である[1]〜[17]いずれか記載のMHC分子構築物。
[19]前記構築物のMHC分子の総数が1〜50個である[1]〜[17]いずれか記載のMHC分子構築物。
[20]前記構築物のMHC分子の総数が1〜25個である[1]〜[17]いずれか記載のMHC分子構築物。
[21]結合実体が、ストレプトアビジン(SA)およびアビジンならびにその誘導体、ビオチン、免疫グロブリン、抗体(モノクローナル、ポリクローナル、および組換え)、その抗体断片および誘導体、AP-1のロイシンジッパードメイン(junおよびfos)、ヘキサ-his(金属キレート成分)、ヘキサ-hat GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)グルタチオンアフィニティ、カルモジュリン-結合ペプチド(CBP)、Strep-タグ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、S-ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫反応性エピトープ、エピトープタグ、E2タグ、HAエピトープタグ、Mycエピトープ、FLAGエピトープ、AU1およびAU5エピトープ、Glu-Gluエピトープ、KT3エピトープ、IRSエピトープ、Bタグエピトープ、プロテインキナーゼ-Cエピトープ、VSVエピトープ、炭水化物、脂質およびタンパク質を含む多様な化合物への結合を媒介するレクチン、例えば、ConA(Canavalia ensiformis)またはWGA(コムギ麦芽凝集素)ならびにテトラネクチンまたはプロテインAもしくはG(抗体アフィニティ)から選ばれるものである[1]記載のMHC分子構築物。
[22]1つ以上の生物学的に活性な分子をさらに含有してなる[1]〜[21]いずれか記載のMHC分子構築物。
[23]生物学的に活性な分子が、タンパク質、共刺激分子、細胞調節分子、レセプター、アクセサリー分子、接着分子、天然のリガンド、および毒性分子、ならびにそれらに対する抗体および組換え結合分子、ならびにその組み合わせから選ばれるものである[22]記載のMHC分子構築物。
[24]生物学的に活性な分子が、直接的にまたは1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合している[22]または[23]記載のMHC分子構築物。
[25]生物学的に活性な分子が、
MIC A、MIC B、CD1d、HLA E、HLA F、HLA G、HLA H、ULBP-1、ULBP-2、およびULBP-3等のMHCクラスI様タンパク質等のタンパク質、
Tおよび/またはNK細胞上に発現されるCD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD147、CDw150(SLAM)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30L)、CD40L(CD154)、NKG2D、ICOS、HVEM、HLAクラスII、PD-1、Fas(CD95)、FasL、APCおよび/または腫瘍細胞上に発現されるCD40、CD48、CD58、CD70、CD72、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、B7RP-1、B7-H3、PD-L1、PD-L2、CD134L、CD137L、ICOSL、LIGHT等の共刺激分子、
NK細胞上に発現されるCD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、2B4、KIR、LIR、CD94/NKG2A、CD94/NKG2C、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、CSF(コロニー刺激因子)、ビタミンD3、IL-2毒素、シクロスポリン、FK-506、ラパマイシン、TGF-β、クロトリマゾール、ニトレンジピン、およびカリブドトキシン等の細胞調節分子、
LFA-1、CD11a/18、CD54(ICAM-1)、CD106(VCAM)、およびCD49a、b、c、d、e、f/CD29(VLA-4)等のアクセサリー分子、
ICAM-1、ICAM-2、GlyCAM-1、CD34、抗-LFA-1、抗-CD44、抗-β7、ケモカイン、CXCR4、CCR5、抗セレクチンL、抗セレクチンE、および抗セレクチンP等の接着分子、
シクロホスファミド、メトロトレキセート(methrotrexate)、アザチオプリン、ミゾリビン、15-ジオキシスペルグアリン(deoxuspergualin)、ネオマイシン、スタウロスポリン、ゲネスタイン、ハービマイシンA、シュードモナスエキソトキシンA、サポリン、リタキサン、リシン、ゲムツズマブオゾオガミチン、志賀毒素、無機および有機水銀、および
FN18-CRM9等の重金属、ヨウ素、コバルト、セレン、トリチウム、およびリン光体が取り込まれた同位体等の放射性同位体、ならびにDNP、およびジゴキシゲニン等のハプテン等の毒性分子、
ならびにそれに対する抗体、またはその抗体誘導体もしくは断片、およびその組み合わせから選ばれるものである[22]〜[24]いずれか記載のMHC分子構築物。
[26]1つ以上の標識化合物をさらに含有してなる[1]〜[25]いずれか記載のMHC分子構築物。
[27]1つ以上の標識化合物がキャリア分子に結合している[26]記載のMHC分子構築物。
[28]1つ以上の標識化合物が1つ以上の結合実体に結合している[26]記載のMHC分子構築物。
[29]1つ以上の標識化合物が1つ以上のMHC分子に結合している[26]記載のMHC分子構築物。
[30]1つ以上の標識化合物がキャリア分子および/または1つ以上の結合実体および/または1つ以上のMHC分子に結合している[26]記載のMHC分子構築物。
[31]標識化合物が直接的または間接的に検出可能である[26]〜[30]いずれか記載のMHC分子構築物。
[32]標識化合物が、蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、金属粒子、ハプテン、抗体、または色素である[26]〜[31]いずれか記載のMHC分子構築物。
[33]標識化合物が、
5-(および6)-カルボキシフルオレセイン、5-または6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5-(および6)-カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート(F)TC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、およびCy2、Cy3、およびCy5等の色素、AMCA、PerCPを含む任意に置換されたクマリン、R-フィコエリトリン(RPE)およびアロフィコエリトリン(APC)を含むフィコビリンタンパク質、テキサスレッド、プリンストンレッド、グリーン蛍光タンパク質(GFP)およびそのアナログ、ならびにR-フィコエリトリンまたはアロフィコエリトリンおよび例えば、Cy5もしくはテキサスレッドのコンジュゲート、および半導体ナノ結晶(量子ドットおよびQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、ならびにEu3+およびSm3+のようなランタニドに基づく時間分解蛍光標識から選ばれるか、
DNP、ビオチン、およびジゴキシゲニン等のハプテンから選ばれるか、または
セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、β-ガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ(GO)等の酵素標識から選ばれるか、またはルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタンおよびピリドピリダジン等の発光標識から選ばれるか、または
ヨウ素、コバルト、セレン、トリチウム、およびリン光体が取り込まれた同位体等の放射能標識から選ばれる、
[26]〜[32]いずれか記載のMHC分子構築物。
[34]キャリア分子が、
デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デキストランポリアルデヒド、カルボキシメチルデキストランラクトン、およびシクロデキストリンを含む多糖類、
プルラン、シゾフィラン、スクレログルカン、キサンタン、ジェラン、O-エチルアミノグアラン、6-O-カルボキシメチルキチンおよびN-カルボキシメチルキトサンを含むキチンならびにキトサン、
カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、6-アミノ-6-デオキシセルロースおよびO-エチル-アミンセルロースを含む誘導体化セロロジクス(cellolosics)、
ヒドロキシル化デンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラゲナン、アルギン酸塩、およびアガロース、
フィコールおよびカルボキシメチル化フィコールを含む合成多糖類、
ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アクリル酸エステル)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(マレイン酸)、ポリ(無水マレイン酸)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(エチル-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアルコール-コ-ビニルクロロアセテート)、アミノ化ポリ(ビニルアルコール)、およびそのコブロックポリマーを含むビニルポリマー、
ポリエチレングリコール(PEG)あるいはポリプロピレングリコールもしくは直鎖、コーム形またはStarBurstTMデンドリマーを含むポリマー骨格を含むポリ(エチレンオキシド-コ-プロピレンオキシド)、
ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリウレタン、ポリ(エチレンイミン)、プルリオールを含むポリアミノ酸、
アルブミン、免疫グロブリン、およびウイルス様タンパク質(VLP)を含むタンパク質、ならびに
ポリヌクレオチド、DNA、PNA、LNA、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドデンドリマー構築物、
から選ばれるものである[1]〜[33]いずれか記載のMHC分子構築物。
[35]キャリア分子が可溶性キャリア分子である[1]〜[34]いずれか記載のMHC分子構築物。
[36]可溶性形態である[1]〜[35]いずれか記載のMHC分子構築物。
[37]固体または半固体支持体上に固定化された[1]〜[36]いずれか記載のMHC分子構築物。
[38]固体または半固体支持体に直接固定化された[37]記載のMHC分子構築物。
[39]リンカー、スペーサー、または抗体、その抗体誘導体もしくは断片を介して固体または半固体支持体に固定化された[37]記載のMHC分子構築物。
[40]支持体が、粒子、ビーズ、生分解性粒子、シート、ゲル、フィルター、膜(例えば、ナイロン膜)、繊維、毛細管、針、マイクロタイター条片、チューブ、プレートまたはウェル、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイ、およびチップから選ばれるものである[37]〜[39]いずれか記載のMHC分子構築物。
[41]支持体がビーズおよび粒子から選ばれるものである[40]記載のMHC分子構築物。
[42]ビーズおよび粒子がポリマービーズ、ポリマー粒子、磁性ビーズ、磁性粒子、超磁性ビーズ、または超常磁性粒子である[41]記載のMHC分子構築物。
[43]フローサイトメトリー法において使用するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物。
[44]組織学的方法において使用するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物。
[45]細胞学的方法において使用するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物。
[46](a)MHC認識細胞を含有していることが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[1]〜[42]記載のMHC分子構築物とを接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の任意の結合を測定する工程、結合はMHC認識細胞の存在を示す、
を含むサンプル中のMHC認識細胞の存在の検出方法。
[47](a)MHC認識細胞を含有していることが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[1]〜[42]記載のMHC分子構築物とを接触させる工程、
(c)MHC分子構築物の任意の結合を測定する工程、それによりMHC認識細胞をモニターする、
を含むMHC認識細胞のモニター方法。
[48](a)MHC認識細胞を含有していることが予想されるサンプルを提供する工程
(b)サンプルと[1]〜[42]記載のMHC分子構築物とを接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の任意の結合を測定する工程、それによりMHC認識細胞に関与する疾患の予後を確立する、
を含むMHC認識細胞に関与する疾患の予後の確立方法。
[49](a)MHC認識細胞を含有していることが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[1]〜[42]記載のMHC分子構築物とを接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の任意の結合を測定する工程、それによりMHC認識細胞に関与する疾患の状態を決定する、
を含むMHC認識細胞に関与する疾患の状態の決定方法。
[50](a)MHC認識細胞を含有していることが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[1]〜[42]記載のMHC分子構築物とを接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の任意の結合を測定し、それによってMHC認識細胞に関与する疾患を診断する、
を含むMHC認識細胞に関与する疾患の診断方法。
[51](a)医薬での処置を受けた被験体に由来するサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[1]〜[42]記載のMHC分子構築物とを接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の任意の結合を測定する工程、それにより医薬の有効性を決定する、
を含むMHC認識細胞に関与する疾患に対する医薬の有効性を決定する方法。
[52]MHC認識細胞が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系または異種(移植片対宿主および宿主対移植片)起源の疾患に関与する[46]〜[51]いずれか記載の方法。
[53]疾患が、クローン病または潰瘍性結腸炎等の慢性炎症性腸疾患、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、子宮頸癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘疹、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患である[52]記載の方法。
[54]MHC認識細胞が、CD3+T細胞、γ、δT細胞、α、βT細胞、CD4+T細胞、Tヘルパー細胞、CD8+T細胞、サプレッサーT細胞、CD8+細胞傷害性T細胞、CTL、NK細胞、NKT細胞、LAK細胞、およびMAKの分集団から選ばれる[46]〜[53]いずれか記載の方法。
[55]サンプルが、組織学的材料、細胞学的材料、原発腫瘍、二次器官転移物、細針吸引物、脾臓組織、骨髄検体、細胞スメア、剥脱性細胞検体、接触調製物、口腔スワブ、喉頭スワブ、膣スワブ、気管支洗浄物、胃洗浄物から、臍帯から、および血液(例えば、血液または白血球搬出産物などの他の血液由来調製物から単離された末梢血液単核細胞(PBMC)集団から)等の体液から、痰サンプル、喀出物、および気管支吸引液から選ばれるものである[46]〜[51]いずれか記載の方法。
[56]結合の測定が、顕微鏡での検査、光、蛍光、電子伝達、またはフローサイトメトリーにより行われる[46]〜[55]いずれか記載の方法。
[57]サンプルが支持体上にマウントされる[46]〜[56]いずれか記載の方法。
[58]支持体が固体または半固体の支持体である[57]記載の方法。
[59]支持体が、ガラススライド、1つ以上のウェルを有するマイクロタイタープレート、ビーズ、粒子、膜、フィルター、フィルター膜、ポリマースライド、ポリマー膜、チャンバースライド、皿、およびペトリ皿から選ばれるものである[57]または[58]記載の方法。
[60]可溶化媒体中に[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物を含有してなる組成物。
[61]MHC分子構築物がペプチド充填MHC分子を含有してなる[60]記載の組成物。
[62]MHC分子構築物がペプチド非含有MHC分子を含有してなる[60]記載の組成物。
[63]ペプチド非含有MHC分子を充填するためのペプチド、およびペプチド非含有分子を含有するMHC分子が別々に提供される[62]記載の組成物。
[64]MHC分子構築物が固体または半固体支持体に固定化されている[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物を含有してなる組成物。
[65]支持体が、ガラススライド、1つ以上のウェルを有するマイクロタイタープレート、ビーズ、粒子、膜、フィルター、フィルター膜、ポリマースライド、ポリマー膜、チャンバースライド、皿、およびペトリ皿から選ばれるものである[64]記載の組成物。
[66]ビーズおよび粒子が、ポリマービーズ、ポリマー粒子、磁性ビーズ、磁性粒子、超磁性ビーズ、または超常磁性粒子である[64]または[65]記載の組成物。
[67]MHC分子構築物がペプチド充填MHC分子を含有してなる[64]記載の組成物。
[68]MHC分子構築物がペプチド非含有MHC分子を含有してなる[64]記載の組成物。
[69]ペプチド非含有MHC分子を充填するためのペプチド、およびペプチド非含有分子を含有するMHC分子構築物が別々に提供される[68]記載の組成物。
[70]検出系としての[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物の使用。
[71]MHC認識細胞に関与する疾患を診断するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物の使用。
[72]MHC認識細胞に関与する疾患をモニターするための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物の使用。
[73]MHC認識細胞に関与する疾患について診断を確立するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物の使用。
[74]MHC認識細胞に関与する疾患の状態を決定するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物の使用。
[75]MHC認識細胞に関与する疾患に対する医薬の有効性を決定するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物の使用。
[76]MHC認識細胞が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系または異種(移植片対宿主および宿主対移植片)起源の疾患に関与する[71]記載の使用。
[77]疾患が、クローン病または潰瘍性結腸炎等の慢性炎症性腸疾患、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、子宮頸癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘疹、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患である[76]記載の使用。
[78]MHC認識細胞が、CD3+T細胞、γ、δT細胞、α、βT細胞、CD4+T細胞、Tヘルパー細胞、CD8+T細胞、サプレッサーT細胞、CD8+細胞傷害性T細胞、CTL、NK細胞、NKT細胞、LAK細胞、およびMAKの分集団から選ばれるものである[70]〜[77]いずれか記載の使用。
[79]治療用組成物として使用するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物。
[80]インビボ治療において使用するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物。
[81]エキソビボ治療で使用するための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物。
[82][1]〜[42]いずれかに規定されるMHC分子構築物を活性成分として含有してなる治療用組成物。
[83]MHC構築物が生分解性の固体または半固体支持体に固定化されている[82]記載の治療用組成物。
[84]MHC分子構築物が、
そこに結合した1つ以上のMHC分子を有するキャリア分子、ここで該MHC分子は直接的にまたは1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合されている
を含有してなる[82]または[83]記載の治療用組成物。
[85]MHC分子が、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシまたはトリ分子等の脊椎動物MHC分子である[82]または[83]記載の治療用組成物。
[86]MHC分子がヒトMHC分子である[82]〜[85]いずれか記載の治療用組成物。
[87]MHC分子が、
重鎖、β2mと結合した重鎖、ペプチドと結合した重鎖、およびペプチドを有する重鎖/β2mダイマーからなる群より選ばれたMHCクラスI分子;
またはα/βダイマー、ペプチドを有するα/βダイマー、アフィニティタグを介して結合したα/βダイマーおよびペプチドを有するアフィニティタグを介して結合したα/βダイマー;
またはMHCクラスI様分子もしくはMHCクラスII様分子
である[82]〜[86]いずれか記載の治療用組成物。
[88]MHC分子がペプチド非含有MHC分子である[82]〜[87]いずれか記載の治療用組成物。
[89]少なくとも2つのMHC分子が異なるものである[82]〜[88]いずれか記載の治療用組成物。
[90]MHC分子が同一である[82]〜[88]いずれか記載の治療用組成物。
[91]MHC分子によって包囲される少なくとも2つのペプチドが異なるものである[82]〜[88]いずれか記載の治療用組成物。
[92]MHC分子によって包囲されるペプチドが同一である[82]〜[88]いずれか記載の治療用組成物。
[93]MHC分子がキャリア分子に直接結合している[82]〜[92]いずれか記載の治療用組成物。
[94]MHC分子が1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合している[82]〜[92]いずれか記載の治療用組成物。
[95]各結合実体が、そこに結合した1〜10個のMHC分子を有してなる[94]記載の治療用組成物。
[96]各結合実体が、そこに結合した1〜8個のMHC分子を有してなる[94]記載の治療用組成物。
[97]各結合実体が、そこに結合した1〜6個のMHC分子を有してなる[94]記載の治療用組成物。
[98]各結合実体が、そこに結合した1〜4個のMHC分子を有してなる[94]記載の治療用組成物。
[99]各結合実体が、そこに結合した1〜3個のMHC分子を有してなる[94]記載の治療用組成物。
[100]各結合実体が、そこに結合した1または2個のMHC分子を有してなる[94]記載の治療用組成物。
[101]前記構築物のMHC分子の総数が1〜100個である[82]〜[100]いずれか記載の治療用組成物。
[102]前記構築物のMHC分子の総数が1〜50個である[82]〜[100]いずれか記載の治療用組成物。
[103]前記構築物のMHC分子の総数が1〜25個である[82]〜[100]いずれか記載の治療用組成物。
[104]結合実体が、ストレプトアビジン(SA)およびアビジンならびにその誘導体、ビオチン、免疫グロブリン、抗体(モノクローナル、ポリクローナル、および組換え)、その抗体断片および誘導体、AP-1のロイシンジッパードメイン(junおよびfos)、ヘキサ-his(金属キレート成分)、ヘキサ-hat GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)グルタチオンアフィニティ、カルモジュリン-結合ペプチド(CBP)、Strep-タグ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、S-ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫反応性エピトープ、エピトープタグ、E2タグ、HAエピトープタグ、Mycエピトープ、FLAGエピトープ、AU1およびAU5エピトープ、Glu-Gluエピトープ、KT3エピトープ、IRSエピトープ、Bタグエピトープ、プロテインキナーゼ-Cエピトープ、VSVエピトープ、炭水化物、脂質およびタンパク質を含む多様な化合物への結合を媒介するレクチン、例えば、ConA(Canavalia ensiformis)またはWGA(コムギ麦芽凝集素)ならびにテトラネクチンまたはプロテインAもしくはG(抗体アフィニティ)から選ばれるものである[94]記載の治療用組成物。
[105]1つ以上の生物学的に活性な分子をさらに含有してなる[82]〜[104]いずれか記載の治療用組成物。
[106]生物学的に活性な分子が、タンパク質、共刺激分子、細胞調節分子、レセプター、アクセサリー分子、接着分子、天然のリガンド、および毒性分子、ならびにそれらに対する抗体および組換え結合分子、ならびにその組み合わせから選ばれるものである[105]記載の治療用組成物。
[107]生物学的に活性な分子が、直接的にまたは1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合している[105]または[106]記載の治療用組成物。
[108]生物学的に活性な分子が、
MIC A、MIC B、CD1d、HLA E、HLA F、HLA G、HLA H、ULBP-1、ULBP-2、およびULBP-3等のMHCクラスI様タンパク質等のタンパク質、
Tおよび/またはNK細胞上に発現されるCD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD147、CDw150(SLAM)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30L)、CD40L(CD154)、NKG2D、ICOS、HVEM、HLAクラスII、PD-1、Fas(CD95)、FasL、APCおよび/または腫瘍細胞上に発現されるCD40、CD48、CD58、CD70、CD72、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、B7RP-1、B7-H3、PD-L1、PD-L2、CD134L、CD137L、ICOSL、LIGHT等の共刺激分子、
NK細胞上に発現されるCD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、2B4、KIR、LIR、CD94/NKG2A、CD94/NKG2C、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、CSF(コロニー刺激因子)、ビタミンD3、IL-2毒素、シクロスポリン、FK-506、ラパマイシン、TGF-β、クロトリマゾール、ニトレンジピン、およびカリブドトキシン等の細胞調節分子、
LFA-1、CD11a/18、CD54(ICAM-1)、CD106(VCAM)、およびCD49a、b、c、d、e、f/CD29(VLA-4)等のアクセサリー分子、
ICAM-1、ICAM-2、GlyCAM-1、CD34、抗-LFA-1、抗-CD44、抗-β7、ケモカイン、CXCR4、CCR5、抗セレクチンL、抗セレクチンE、および抗セレクチンP等の接着分子、
シクロホスファミド、メトロトレキセート、アザチオプリン、ミゾリビン、15-デオキシスペルグアリン、ネオマイシン、スタウロスポリン、ゲネスタイン、ハービマイシンA、シュードモナスエキソトキシンA、サポリン、リタキサン、リシン、ゲムツズマブオゾオガミチン、志賀毒素、無機および有機水銀、ならびにFN18-CRM9等の重金属、ヨウ素、コバルト、セレン、トリチウム、およびリン光体が取り込まれた同位体等の放射性同位体、
ならびにDNP、およびジゴキシゲニン等のハプテン、
ならびにそれに対する抗体、またはその抗体誘導体もしくは断片、およびその組み合わせから選ばれるものである[105]〜[107]いずれか記載の治療用組成物。
[109]キャリア分子が、
デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デキストランポリアルデヒド、カルボキシメチルデキストランラクトン、およびシクロデキストリンを含む多糖類、
プルラン、シゾフィラン、スクレログルカン、キサンタン、ジェラン、O-エチルアミノグアラン、6-O-カルボキシメチルキチンおよびN-カルボキシメチルキトサンを含むキチンならびにキトサン、
カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、6-アミノ-6-デオキシセルロースおよびO-エチル-アミンセルロースを含む誘導体化セロロジクス、
ヒドロキシル化デンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラゲナン、アルギン酸塩、およびアガロース、
フィコールおよびカルボキシメチル化フィコールを含む合成多糖類、
ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アクリル酸エステル)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(マレイン酸)、ポリ(無水マレイン酸)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(エチル-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアルコール-コ-ビニルクロロアセテート)、アミノ化ポリ(ビニルアルコール)、およびそのコブロックポリマーを含むビニルポリマー、
ポリエチレングリコール(PEG)あるいはポリプロピレングリコールまたは直鎖、コーム形もしくはStarBurstTMデンドリマーを含むポリマー骨格を含むポリ(エチレンオキシド-コ-プロピレンオキシド)、
ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリウレタン、ポリ(エチレンイミン)、プルリオールを含むポリアミノ酸、
アルブミン、免疫グロブリン、およびウイルス様タンパク質(VLP)を含むタンパク質、ならびに
ポリヌクレオチド、DNA、PNA、LNA、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドデンドリマー構築物、
から選ばれるものである[82]〜[108]いずれか記載の治療用組成物。
[110]キャリア分子が可溶性キャリア分子である[82]〜[109]いずれか記載の治療用組成物。
[111]1つ以上のアジュバントおよび/または賦形剤をさらに含有してなる[82]〜[110]いずれか記載の治療用組成物。
[112]アジュバントが、Quil AおよびQs-21等のサポニン、MF59、MPL、PLG、PLGA、アルミニウム塩、リン酸カルシウム等の水中油エマルジョン、IFA(フロイントの不完全アジュバント)およびCFA(フロイントの完全アジュバント)等の油中水エマルジョン、IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、およびINFγ等のインターロイキン、Adju-Phos(登録商標)、グルカン、抗原製剤、生分解性微粒子、Cholera Holotoxin、リポソーム、DDE、DHEA、DMPC、DMPG、DOC/Alum複合体、ISCOMs(登録商標)、ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質A、ムラミルトリペプチド、およびホスファチジルエタノールアミンから選ばれるものであり、好ましい態様では、アジュバントはQuil AおよびQs-21等のサポニン、MF59、MPL、PLG、PLGA、リン酸カルシウム、およびアルミニウム塩から選ばれるものである[111]記載の治療用組成物。
[113]賦形剤が希釈剤、緩衝液、懸濁剤、湿潤剤、可溶化剤、pH調整剤、分散剤、保存剤、および/または着色剤から選ばれるものである[113]記載の治療用組成物。
[114]MHC認識細胞に関与する疾患の処置、予防、安定化、または軽減のための[82]〜[113]いずれか記載の治療用組成物。
[115]MHC認識細胞が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系または異種(移植片対宿主および宿主対移植片)起源の疾患に関与する[114]記載の方法。
[116]疾患が、クローン病または潰瘍性結腸炎等の慢性炎症性腸疾患、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘疹、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患である[115]記載の治療用組成物。
[117]静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、皮内投与、皮下投与、上皮/経皮投与、および腹腔内投与を含む非経口投与、注入、経口投与、経鼻投与、直腸投与、または局所投与のために製剤化された[82]〜[116]いずれか記載の治療用組成物。
[118]MHC認識細胞を含有する被験体に由来するサンプルを[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物と接触させる工程、それによりMHC認識細胞がMHC分子構築物に結合する、結合MHC分子構築物およびMHC認識細胞を単離する工程、および
かかるMHC認識細胞を臨床的に関連する数に拡大する工程
により得られるものであるMHC認識細胞の有効量を活性成分として含有してなる治療用組成物。
[119]単離されたMHC認識細胞が、拡大の前にMHC分子構築物から遊離される[118]記載の治療用組成物。
[120]MHC分子構築物が、固体または半固体支持体に固定化される[118]または[119]記載の治療用組成物。
[121]MHC分子構築物が、サンプルとの接触の前に固体または半固体支持体に個体化される[120]記載の治療用組成物。
[122]MHC分子構築物が、サンプルの接触後に固体または半固体支持体に固定化される[120]記載の治療用組成物。
[123]拡大が、1つ以上のMHC分子構築物、任意に1つ以上の生物学的に活性な分子および任意に樹状細胞またはフィーダー細胞等のフィーダー細胞の存在下で行われる[118]〜[122]いずれか記載の治療用組成物。
[124]MHC分子構築物が固体または半固体支持体に直接固定化されている[120]〜[123]いずれか記載の治療用組成物。
[125]MHC分子構築物が、リンカー、スペーサー、または抗体、その抗体誘導体もしくは断片を介して固体または半固体支持体に固定化されている[120]〜[124]いずれか記載の治療用組成物。
[126]固体または半固体支持体が、粒子、ビーズ、生分解性粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、繊維、毛細管、針、マイクロタイター条片、チューブ、プレートまたはウェル、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイ、チップおよび1つ以上のウェルを有するマイクロタイタープレートから選ばれるものである[120]〜[125]いずれか記載の治療用組成物。
[127]固体支持体が粒子およびビーズから選ばれる[120]〜[126]いずれか記載の治療用組成物。
[128]粒子およびビーズがポリマー、磁性または超磁性である[127]記載の治療用組成物。
[129]単離が、磁場を適用することにより、またはフローサイトメトリーにより行われるものである[118]〜[128]いずれか記載の治療用組成物。
[130]MHC分子構築物が、
それに結合した1つ以上のMHC分子を有するキャリア分子を含有してなり、ここで該MHC分子が直接的にまたは1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合される[118]〜[128]いずれか記載の治療用組成物。
[131]MHC分子が、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシまたはトリ分子等の脊椎動物MHC分子である[118]〜[130]いずれか記載の治療用組成物。
[132]MHC分子がヒトMHC分子である[118]〜[131]いずれか記載の治療用組成物。
[133]MHC分子が、
重鎖、β2mを有する重鎖、ペプチドと結合した重鎖、およびペプチドを有する重鎖/β2mダイマーからなる群より選ばれたMHCクラスI分子;
またはα/βダイマー、ペプチドを有するα/βダイマー、アフィニティタグを介して結合したα/βダイマーおよびペプチドを有するアフィニティタグを介して結合したα/βダイマーからなる群より選ばれたMHCクラスII分子;
またはMHCクラスI様分子もしくはMHCクラスII様分子
である[118]〜[132]いずれか記載の治療用組成物。
[134]MHC分子がペプチド非含有MHC分子である[118]〜[133]いずれか記載の治療用組成物。
[135]少なくとも2つのMHC分子が異なるものである[118]〜[134]いずれか記載の治療用組成物。
[136]MHC分子が同一である[118]〜[135]いずれか記載の治療用組成物。
[137]MHC分子によって包囲される少なくとも2つのペプチドが異なるものである[118]〜[136]いずれか記載の治療用組成物。
[138]MHC分子によって包囲されるペプチドが同一である[118]〜[137]いずれか記載の治療用組成物。
[139]MHC分子がキャリア分子に直接結合している[118]〜[138]いずれか記載の治療用組成物。
[140]MHC分子が1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合している[118]〜[138]いずれか記載の治療用組成物。
[141]各結合実体が、そこに結合した1〜10個のMHC分子を有してなる[140]記載の治療用組成物。
[142]各結合実体が、そこに結合した1〜8個のMHC分子を有してなる[140]記載の治療用組成物。
[143]各結合実体が、そこに結合した1〜6個のMHC分子を有してなる[140]記載の治療用組成物。
[144]各結合実体が、そこに結合した1〜4個のMHC分子を有してなる[140]記載の治療用組成物。
[145]各結合実体が、そこに結合した1〜3個のMHC分子を有してなる[140]記載の治療用組成物。
[146]各結合実体が、そこに結合した1または2個のMHC分子を有してなる[140]記載の治療用組成物。
[147]前記構築物のMHC分子の総数が1〜100個である[118]〜[146]いずれか記載の治療用組成物。
[148]前記構築物のMHC分子の総数が1〜50個である[118]〜[146]いずれか記載の治療用組成物。
[149]前記構築物のMHC分子の総数が1〜25個である[118]〜[146]いずれか記載の治療用組成物。
[150]結合実体が、ストレプトアビジン(SA)およびアビジンならびにその誘導体、ビオチン、免疫グロブリン、抗体(モノクローナル、ポリクローナル、および組換え)、その抗体断片および誘導体、AP-1のロイシンジッパードメイン(junおよびfos)、ヘキサ-his(金属キレート成分)、ヘキサ-hat GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)グルタチオンアフィニティ、カルモジュリン-結合ペプチド(CBP)、Strep-タグ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、S-ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫反応性エピトープ、エピトープタグ、E2タグ、HAエピトープタグ、Mycエピトープ、FLAGエピトープ、AU1およびAU5エピトープ、Glu-Gluエピトープ、KT3エピトープ、IRSエピトープ、Bタグエピトープ、プロテインキナーゼ-Cエピトープ、VSVエピトープ、炭水化物、脂質およびタンパク質を含む多様な化合物への結合を媒介するレクチン、例えば、ConA(Canavalia ensiformis)またはWGA(コムギ麦芽凝集素)ならびにテトラネクチンまたはプロテインAもしくはG(抗体アフィニティ)から選ばれる[140]記載の治療用組成物。
[151]1つ以上の生物学的に活性な分子をさらに含有してなる[118]〜[150]いずれか記載の治療用組成物。
[152]生物学的に活性な分子が、タンパク質、共刺激分子、細胞調節分子、レセプター、アクセサリー分子、接着分子、天然のリガンド、および毒性分子、ならびにそれらに対する抗体および組換え結合分子、ならびにその組み合わせから選ばれるものである[151]記載の治療用組成物。
[153]生物学的に活性な分子が、直接的にまたは1つ以上の結合実体を介してキャリア分子に結合している[150]または[151]記載の治療用組成物。
[154]生物学的に活性な分子が、
MIC A、MIC B、CD1d、HLA E、HLA F、HLA G、HLA H、ULBP-1、ULBP-2、およびULBP-3等のMHCクラスI様タンパク質等のタンパク質、
Tおよび/またはNK細胞上に発現されるCD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD147、CDw150(SLAM)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30L)、CD40L(CD154)、NKG2D、ICOS、HVEM、HLAクラスII、PD-1、Fas(CD95)、FasL、APCおよび/または腫瘍細胞上に発現されるCD40、CD48、CD58、CD70、CD72、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、B7RP-1、B7-H3、PD-L1、PD-L2、CD134L、CD137L、ICOSL、LIGHT等の共刺激分子、
NK細胞上に発現されるCD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、2B4、KIR、LIR、CD94/NKG2A、CD94/NKG2C、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、CSF(コロニー刺激因子)、ビタミンD3、IL-2毒素、シクロスポリン、FK-506、ラパマイシン、TGF-β、クロトリマゾール、ニトレンジピン、およびカリブドトキシン等の細胞調節分子、
LFA-1、CD11a/18、CD54(ICAM-1)、CD106(VCAM)、およびCD49a、b、c、d、e、f/CD29(VLA-4)等のアクセサリー分子、
ICAM-1、ICAM-2、GlyCAM-1、CD34、抗-LFA-1、抗-CD44、抗-β7、ケモカイン、CXCR4、CCR5、抗セレクチンL、抗セレクチンE、および抗セレクチンP等の接着分子、
シクロホスファミド、メトロトレキセート、アザチオプリン、ミゾリビン、15-デオキシスペルグアリン、ネオマイシン、スタウロスポリン、ゲネスタイン、ハービマイシンA、シュードモナスエキソトキシンA、サポリン、リタキサン、リシン、ゲムツズマブオゾオガミチン、志賀毒素、無機および有機水銀、およびFN18-CRM9等の重金属、ヨウ素、コバルト、セレン、トリチウム、およびリン光体が取り込まれた同位体等の放射性同位体、ならびにDNP、およびジゴキシゲニン等のハプテン、
ならびにそれに対する抗体、またはその抗体誘導体もしくは断片、およびその組み合わせから選ばれるものである[151]〜[153]いずれか記載の治療用組成物。
[155]キャリア分子が、
デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デキストランポリアルデヒド、カルボキシメチルデキストランラクトン、およびシクロデキストリンを含む多糖類、
プルラン、シゾフィラン、スクレログルカン、キサンタン、ジェラン、O-エチルアミノグアラン、6-O-カルボキシメチルキチンおよびN-カルボキシメチルキトサンを含むキチンならびにキトサン、
カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、6-アミノ-6-デオキシセルロースおよびO-エチル-アミンセルロースを含む誘導体化セロロジクス、
ヒドロキシル化デンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラゲナン、アルギン酸塩、およびアガロース、
フィコールおよびカルボキシメチル化フィコールを含む合成多糖類、
ポリ(アクリル酸)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アクリル酸エステル)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(マレイン酸)、ポリ(無水マレイン酸)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(エチル-コ-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアルコール-コ-ビニルクロロアセテート)、アミノ化ポリ(ビニルアルコール)、およびそのコブロックポリマーを含むビニルポリマー、
ポリエチレングリコール(PEG)あるいはポリプロピレングリコールまたは直鎖、コーム形もしくはStarBurstTMデンドリマーを含むポリマー骨格を含むポリ(エチレンオキシド-コ-プロピレンオキシド)、
ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリウレタン、ポリ(エチレンイミン)、プルリオールを含むポリアミノ酸、
アルブミン、免疫グロブリン、およびウイルス様タンパク質(VLP)を含むタンパク質、ならびに
ポリヌクレオチド、DNA、PNA、LNA、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドデンドリマー構築物、
から選ばれるものである[118]〜[154]いずれか記載の治療用組成物。
[156]1つ以上の標識化合物をさらに含有してなる[118]〜[155]いずれか記載の治療用組成物。
[157]1つ以上の標識化合物がキャリア分子に結合している[156]記載の治療用組成物。
[158]1つ以上の標識化合物が1つ以上の結合実体に結合している[156]記載の治療用組成物。
[159]1つ以上の標識化合物が1つ以上のMHC分子に結合している[156]記載の治療用組成物。
[160]1つ以上の標識物質がキャリア分子および/または1つ以上の結合実体および/または1つ以上のMHC分子に結合している[156]記載の治療用組成物。
[161]標識化合物が直接的または間接的に検出可能である[156]〜[160]いずれか記載の治療用組成物。
[162]標識化合物が、蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、金属粒子、ハプテン、抗体、または色素である[156]〜[161]いずれか記載の治療用組成物。
[163]標識化合物が、
5-(および6)-カルボキシフルオレセイン、5-または6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5-(および6)-カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、およびCy2、Cy3、およびCy5等の色素、AMCA、PerCPを含む任意に置換されたクマリン、R-フィコエリトリン(RPE)およびアロフィコエリトリン(APC)を含むフィコビリンタンパク質、テキサスレッド、プリンストンレッド、グリーン蛍光タンパク質(GFP)およびそのアナログ、ならびにR-フィコエリトリンまたはアロフィコエリトリンおよび例えば、Cy5もしくはテキサスレッドのコンジュゲート、および半導体ナノ結晶(量子ドットおよびQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、ならびにEu3+およびSm3+のようなランタニドに基づく時間分解蛍光標識等の蛍光標識から選ばれるか、
DNP、ビオチン、およびジゴキシゲニン等のハプテンから選ばれるか、または
DNP、フルオレセインチオシアネート(FITC)、ビオチン、およびジゴキシゲニン等のハプテンから選ばれるか、または
セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、β-ガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ(GO)等の酵素標識から選ばれるか、または
ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタンおよびピリドピリダジン等の発光標識から選ばれるか、または
ヨウ素、コバルト、セレン、トリチウム、およびリン光体が取り込まれた同位体等の放射能標識から選ばれるものである、
[156]〜[162]いずれか記載の治療用組成物。
[164]キャリア分子が可溶性キャリア分子である[118]〜[163]いずれか記載の治療用組成物。
[165]1つ以上の賦形剤をさらに含有してなる[118]〜[164]いずれか記載の治療用組成物。
[166]賦形剤が希釈剤、緩衝液、懸濁剤、湿潤剤、可溶化剤、pH調整剤、分散剤、保存剤、および/または着色剤から選ばれるものである[165]記載の治療用組成物。
[167]MHC認識細胞に関与する疾患の処置、予防、安定化、または軽減のための[118]〜[166]いずれか記載の治療用組成物。
[168]MHC認識細胞が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系または異種(移植片対宿主および宿主対移植片)起源の疾患に関与する[167]記載の治療用組成物。
[169]疾患が、クローン病または潰瘍性結腸炎等の慢性炎症性腸疾患、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘疹、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患である[167]または[168]記載の治療用組成物。
[170]静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、皮内投与、皮下投与、上皮/経皮投与、および腹腔内投与を含む非経口投与、注入、経口投与、経鼻投与、直腸投与、または局所投与のために製剤化された[118]〜[169]いずれか記載の治療用組成物。
[171]インビボ治療における使用のための[82]〜[170]いずれか記載の治療用組成物。
[172]有効量の[82]〜[170]いずれか記載の治療用組成物を投与することを含む、ヒトを含む動物の治療方法。
[173]有効量の[82]〜[170]いずれか記載の治療用組成物を投与することを含む、ヒトを含む動物における免疫応答を、アップレギュレート、ダウンレギュレート、調節する方法。
[174]有効量の[82]〜[170]いずれか記載の治療用組成物を投与することを含む、ヒトを含む動物における細胞のアネルギーを誘導する方法。
[175][82]〜[170]いずれか記載の治療組成物をヒトを含む動物に投与することを含む養子細胞免疫療法。
[176]MHC認識細胞がMHC分子構築物に結合する条件下で[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物とMHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルとを接触せる工程、および
結合MHC分子構築物およびMHC認識細胞を単離する工程
を含むMHC認識細胞の入手方法。
[177]単離が、磁場を適用することまたはフローサイトメトリーにより行われる[176]記載の方法。
[178][1]〜[42]に規定されるMHC分子構築物を提供する工程、
治療用物質に適切した媒体中にMHC分子構築物を溶解または分散させ、任意に他のアジュバントおよび/または賦形剤を添加する工程
を含む[82]〜[170]いずれか記載の治療用組成物の製造方法。
[179][1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物を用いてMHC認識細胞を得る工程、
かかるMHC認識細胞を臨床的に関連する数に拡大する工程、
投与に適した媒体に得られた細胞を製剤化する工程、および
任意にアジュバントおよび/または賦形剤を添加する工程
を含む[118]〜[170]いずれか記載の治療用組成物の製造方法。
[180]MHC認識細胞のエキソビボ拡大のための[1]〜[42]いずれか記載のMHC分子構築物の使用。
[181]MHC分子構築物が可溶性形態である[180]記載の使用。
[182]MHC分子構築物が固体または半固体支持体に固定化される[180]記載の使用。
[183]固体または半固体支持体が、粒子、ビーズ、生分解性粒子、シート、ゲル、フィルター、膜(例えば、ナイロン膜)、繊維、毛細管、針、マイクロタイター条片、チューブ、プレートまたはウェル、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイ、チップ、およびスライドから選ばれるものである[182]記載の使用。
[184]固体または半固体支持体がビーズおよび粒子から選ばれるものである[182]または[183]記載の使用。
[185]固体または半固体支持体が、重合体性、磁性または超常磁性粒子およびビーズである[184]記載の使用。
[186]MHC分子構築物が1つ以上の生物学的に活性な分子をさらに含有してなる[180]〜[185]いずれか記載の使用。
[187]生物学的に活性な分子が、
MIC A、MIC B、CD1d、HLA E、HLA F、HLA G、HLA H、ULBP-1、ULBP-2、およびULBP-3等のMHCクラスI様タンパク質等のタンパク質、Tおよび/またはNK細胞上に発現されるCD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD147、CDw150(SLAM)、CD152(CTLA-4)、CD153(CD30L)、CD40L(CD154)、NKG2D、ICOS、HVEM、HLAクラスII、PD-1、Fas(CD95)、FasL、APCおよび/または腫瘍細胞上に発現されるCD40、CD48、CD58、CD70、CD72、B7.1(CD80)、B7.2(CD86)、B7RP-1、B7-H3、PD-L1、PD-L2、CD134L、CD137L、ICOSL、LIGHT等の共刺激分子、NK細胞上に発現されるCD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、2B4、KIR、LIR、CD94/NKG2A、CD94/NKG2C、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、CSF(コロニー刺激因子)、ビタミンD3、IL-2毒素、シクロスポリン、FK-506、ラパマイシン、TGF-β、クロトリマゾール、ニトレンジピン、およびカリブドトキシン等の細胞調節分子、LFA-1、CD11a/18、CD54(ICAM-1)、CD106(VCAM)、およびCD49a、b、c、d、e、f/CD29(VLA-4)等のアクセサリー分子、ICAM-1、ICAM-2、GlyCAM-1、CD34、抗-LFA-1、抗-CD44、抗-β7、ケモカイン、CXCR4、CCR5、抗セレクチンL、抗セレクチンE、および抗セレクチンP等の接着分子、シクロホスファミド、メトロトレキセート、アザチオプリン、ミゾリビン、15-デオキシスペルグアリン、ネオマイシン、スタウロスポリン、ゲネスタイン、ハービマイシンA、シュードモナスエキソトキシンA、サポリン、リタキサン、リシン、ゲムツズマブオゾオガミチン、志賀毒素、無機および有機水銀、およびFN18-CRM9等の重金属、ヨウ素、コバルト、セレン、トリチウム、およびリン光体が取り込まれた同位体等の放射性同位体、ならびにDNP、およびジゴキシゲニン等のハプテン、
ならびにそれに対する抗体、またはその抗体誘導体もしくは断片、およびその組み合わせから選ばれるものである[180]〜[186]いずれか記載の使用。
[188]組織学的方法におけるMHC分子の使用。
[189]細胞学的方法におけるMHC分子の使用。
[190]サンプル中のMHC認識細胞の存在を決定する方法における[188]または[189]記載のMHC分子の使用であって、該方法においてサンプルのMHC認識細胞が支持体にマウントされる、使用。
[191]サンプル中のMHC認識細胞の存在をモニターする方法における[188]または[189]記載のMHC分子の使用であって、該方法においてサンプルのMHC認識細胞が支持体にマウントされる、使用。
[192]MHC認識細胞に関与する疾患の状態を決定する方法における[188]または[189]記載のMHC分子の使用であって、該方法においてサンプルのMHC認識細胞が支持体にマウントされる、使用。
[193]MHC認識細胞に関与する疾患の予後を確立する方法における[188]または[189]記載のMHC分子の使用であって、該方法においてサンプルのMHC認識細胞が支持体にマウントされる、使用。
[194]支持体が固体または半固体の支持体である[188]〜[193]いずれか記載のMHC分子の使用。
[195]支持体が、ガラススライド、膜、フィルター、ポリマースライド、チャンバースライド、皿、およびペトリ皿から選ばれる[188]〜[194]いずれか記載の使用。
[196]サンプルが、組織学的材料、細胞学的材料、原発腫瘍、二次器官転移物、細針吸引物、脾臓組織、骨髄検体、細胞スメア、剥脱性細胞検体、接触調製物、口腔スワブ、喉頭スワブ、膣スワブ、気管支洗浄物、胃洗浄物から、臍帯から、および血液(例えば、血液または白血球搬出産物などの他の血液由来調製物から単離された末梢血液単核細胞(PBMC)集団から)等の体液から、痰サンプル、喀出物、および気管支吸引液から選ばれるものである[188]〜[195]いずれか記載の使用。
[197]MHC分子が、
重鎖、β2mと結合した重鎖、ペプチドと結合した重鎖、およびペプチドを有する重鎖/β2mダイマーからなる群より選ばれたMHCクラスI分子;
またはα/βダイマー、ペプチドを有するα/βダイマー、アフィニティタグを介して結合したα/βダイマーおよびペプチドを有するアフィニティタグを介して結合したα/βダイマーからなる群より選ばれるMHCクラスII分子;
またはMHCクラスI様分子もしくはMHCクラスII様分子である[188]〜[196]いずれか記載の使用。
[198]MHC分子が、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシまたはトリ分子等の脊椎動物MHC分子である[188]〜[197]いずれか記載の使用。
[199]MHC分子がヒトMHC分子である[188]〜[198]いずれか記載の使用。
[200]MHC分子がペプチド非含有MHC分子である[188]〜[199]いずれか記載の使用。
[201]MHC分子が結合実体に結合している[188]〜[200]いずれか記載の使用。
[202]結合実体が、そこに結合した、1〜9個、1〜8個、1〜7個、1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、または1個もしくは2個などの1〜10個のMHC分子を有してなる[201]記載の使用。
[203]結合実体が、ストレプトアビジン(SA)およびアビジンならびにその誘導体、ビオチン、免疫グロブリン、抗体(モノクローナル、ポリクローナル、および組換え)、その抗体断片および誘導体、AP-1のロイシンジッパードメイン(junおよびfos)、ヘキサ-his(金属キレート成分)、ヘキサ-hat GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)グルタチオンアフィニティ、カルモジュリン-結合ペプチド(CBP)、Strep-タグ、セルロース結合ドメイン、マルトース結合タンパク質、S-ペプチドタグ、キチン結合タグ、免疫反応性エピトープ、エピトープタグ、E2タグ、HAエピトープタグ、Mycエピトープ、FLAGエピトープ、AU1およびAU5エピトープ、Glu-Gluエピトープ、KT3エピトープ、IRSエピトープ、Bタグエピトープ、プロテインキナーゼ-Cエピトープ、VSVエピトープ、炭水化物、脂質およびタンパク質を含む多様な化合物への結合を媒介するレクチン、例えば、ConA(Canavalia ensiformis)またはWGA(コムギ麦芽凝集素)およびテトラネクチンまたはプロテインAもしくはG(抗体アフィニティ)から選ばれるものである[201]記載の使用。
[204]MHC分子が標識化合物をさらに含有してなる[188]〜[203]いずれか記載の使用。
[205]標識化合物を直接的または間接的に検出することができる[204]記載の使用。
[206]標識化合物が、蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、金属粒子、ハプテン、抗体、または色素である[204]または[205]記載の使用。
[207]標識化合物が、
5-(および6)-カルボキシフルオレセイン、5-または6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5-(および6)-カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テトラメチルローダミン、ならびにCy2、Cy3、およびCy5等の色素、AMCA、PerCPを含む任意に置換されたクマリン、R-フィコエリトリン(RPE)およびアロフィコエリトリン(APC)を含むフィコビリンタンパク質、テキサスレッド、プリンストンレッド、グリーン蛍光タンパク質(GFP)およびそのアナログ、ならびにR-フィコエリトリンまたはアロフィコエリトリンおよび例えば、Cy5もしくはテキサスレッドのコンジュゲート、および半導体ナノ結晶(量子ドットおよびQdotTMナノ結晶等)に基づく無機蛍光標識、ならびにEu3+およびSm3+のようなランタニドに基づく時間分解蛍光標識から選ばれるか、DNP、ビオチン、およびジゴキシゲニン等のハプテンから選ばれるか、または
セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、β-ガラクトシダーゼ(GAL)、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ(GO)等の酵素標識から選ばれるか、または
ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタンおよびピリドピリダジン等の発光標識から選ばれるか、または
ヨウ素、コバルト、セレン、トリチウム、およびリン光体が取り込まれた同位体等の放射能標識から選ばれる、[204]〜[206]いずれか記載の使用。
[208]標識化合物がMHC分子および/または結合実体に結合されている[204]〜[207]いずれか記載の使用。
[209](a)支持体上にマウントされたMHC認識細胞を含有していることが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[188]〜[208]記載のMHC分子とを接触させる工程、および
(c)MHC分子の任意の結合を測定する工程、結合はMHC認識細胞の存在を示す、
を含むサンプル中のMHC認識細胞の存在の検出方法。
[210](a)支持体上にマウントされたMHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[188]〜[208]記載のMHC分子とを接触させる工程、および
(c)MHC分子の任意の結合を測定し、それによりMHC認識細胞をモニターする工程
を含むMHC認識細胞のモニター方法。
[211](a)支持体上にマウントされたMHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[188]〜[208]に規定されるMHC分子とを接触させる工程、および
(c)MHC分子の任意の結合を測定し、それによりMHC認識細胞に関与する疾患の予後を確立する工程
を含むMHC認識細胞に関与する疾患の予後の確立方法。
[212](a)支持体上にマウントされたMHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[188]〜[208]に規定されるMHC分子とを接触させる工程、および
(c)MHC分子の任意の結合を測定し、それによりMHC認識細胞に関与する疾患の状態を決定する工程
を含むMHC認識細胞に関与する疾患の状態の決定方法。
[213](a)支持体にマウントされたMHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[188]〜[208]に規定されるMHC分子とを接触させる工程、および
(c)MHC分子の任意の結合を測定し、それによりMHC認識細胞に関連する疾患を診断する工程
を含むMHC認識細胞に関与する疾患の診断方法。
[214](a)支持体にマウントされた医薬での処置を受けた被験体由来のサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと[188]〜[208]に規定されるMHC分子とを接触させる工程、および
(c)MHC分子の任意の結合を決定し、それにより医薬の有効性を決定する工程、
を含むMHC認識細胞に関与する疾患に対する医薬の有効性のための方法。
[215]MHC認識分子が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系または異種(移植片対宿主および宿主対移植片)起源の疾患に関与する[209]〜[214]いずれか記載の方法。
[216]疾患が、クローン病または潰瘍性結腸炎等の慢性炎症性腸疾患、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、子宮頸癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘疹、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患である[215]記載の方法。
[217]MHC認識細胞が、CD3+T細胞、γ、δT細胞、α、βT細胞、CD4+T細胞、Tヘルパー細胞、CD8+T細胞、サプレッサーT細胞、CD8+細胞傷害性T細胞、CTL、NK細胞、NKT細胞、LAK細胞、およびMAKの分集団から選ばれる[209]〜[215]いずれか記載の方法。
[218]サンプルが、組織学的材料、細胞学的材料、原発腫瘍、二次器官転移物、細針吸引物、脾臓組織、骨髄検体、細胞スメア、剥脱性細胞検体、接触調製物、口腔スワブ、喉頭スワブ、膣スワブ、気管支洗浄物、胃洗浄物から、臍帯から、および血液(例えば、血液または白血球搬出産物などの他の血液由来調製物から単離された末梢血液単核細胞(PBMC)集団から)等の体液から、痰サンプル、喀出物、および気管支吸引液から選ばれるものである[209]〜[217]いずれか記載の方法。
Claims (41)
- 可溶性媒体に可溶性の形態であるか、または固体もしくは半固体支持体上に固定化されたMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、1つより多くの結合実体が結合したデキストランキャリア分子を含んでなり、該1つより多くの結合実体の各々には、2〜4つのMHC分子が結合しており、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子を含む、MHC分子構築物。
- 可溶性媒体に可溶性の形態であるか、または固体もしくは半固体支持体上に固定化されたMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、1つより多くのストレプトアビジンが結合した多糖類キャリア分子を含んでなり、該1つより多くのストレプトアビジンの各々には、2〜4つのMHC分子が結合しており、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子を含む、MHC分子構築物。
- 可溶性媒体に可溶性の形態であるMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、1つより多くの結合実体が結合した多糖類キャリア分子を含んでなり、該1つより多くの結合実体の各々には、2〜4つのMHC分子が結合しており、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子を含む、MHC分子構築物。
- 可溶性媒体に可溶性の形態であるか、または固体もしくは半固体支持体上に固定化されたMHC分子構築物であって、該MHC分子構築物は、少なくとも5つのMHC分子に結合した可溶性多糖類キャリア分子を含んでなり、該MHC分子は、該多糖類キャリア分子に直接結合しており、該MHC分子構築物は、1つ以上の標識を含む、MHC分子構築物。
- MHC分子が、ペプチド非含有MHC分子であるかまたはペプチド充填MHC分子である請求項1〜4いずれか記載のMHC分子構築物。
- MHC分子が同一であるかまたは少なくとも2つのMHC分子が異なるものである請求項1〜5いずれか記載のMHC分子構築物。
- MHC分子により収容されるペプチドが同一であるかまたはMHC分子によって収容される少なくとも2つのペプチドが異なるものである請求項1〜6いずれか記載のMHC分子構築物。
- 1つ以上の生物学的に活性な分子をさらに含んでなる請求項1〜7いずれか記載のMHC分子構築物。
- 生物学的に活性な分子が、
(a)MIC A、MIC B、CD1d、HLA E、HLA F、HLA G、HLA H、ULBP-1、ULBP-2、およびULBP-3等のMHCクラスI様タンパク質の群に由来するタンパク質、
(b)Tおよび/またはNK細胞上に発現されるCD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD27、CD28、CD30、CD69、CD134、CD137、CD147、CDw150、CD152、CD153、CD40L、NKG2D、ICOS、HVEM、HLAクラスII、PD-1、Fas、およびFasL、ならびにAPCおよび/または腫瘍細胞上に発現されるCD40、CD48、CD58、CD70、CD72、B7.1、B7.2、B7RP-1、B7-H3、PD-L1、PD-L2、CD134L、CD137L、ICOSL、およびLIGHTの群に由来する共刺激分子、
(c)NK細胞上に発現されるCD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、2B4、KIR、LIR、CD94/NKG2A、およびCD94/NKG2C、ならびにIFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、コロニー刺激因子、ビタミンD3、IL-2毒素、シクロスポリン、FK-506、ラパマイシン、TGF-β、クロトリマゾール、ニトレンジピン、およびカリブドトキシンの群に由来する細胞調節分子、
(d)LFA-1、CD11a/18、CD54、CD106、およびCD49a、b、c、d、e、f/CD29の群に由来するアクセサリー分子、
(e)ICAM-1、ICAM-2、GlyCAM-1、CD34、抗-LFA-1、抗-CD44、抗-β7、ケモカイン、CXCR4、CCR5、抗セレクチンL、抗セレクチンE、および抗セレクチンPの群に由来する接着分子、
(f)シクロホスファミド、メトトレキセート(methrotrexate)、アザチオプリン、ミゾリビン、15-デオキシスペルグアリン(deoxuspergualin)、ネオマイシン、スタウロスポリン、ゲネスタイン、ハービマイシンA、シュードモナスエキソトキシンA、サポリン、リタキサン、リシン、ゲムツズマブオゾオガミチン、志賀毒素、重金属、無機水銀、有機水銀、FN18-CRM9、放射性同位体、ヨウ素の取り込まれた同位体、コバルトの取り込まれた同位体、セレンの取り込まれた同位体、トリチウムの取り込まれた同位体、リンの取り込まれた同位体、ハプテン、DNP、およびジゴキシゲニンの群に由来する毒性分子、
ならびに(a)〜(f)のいずれかの分子に対する抗体、該抗体の誘導体、および該抗体の断片、ならびにそれらの組み合わせ、ならびに
(g)タンパク質、共刺激分子、細胞調節分子、レセプター、アクセサリー分子、接着分子、天然のリガンド、および毒性分子、ならびにそれらに対する抗体および組換え結合分子、ならびにそれらの組み合わせ
から選ばれるものである請求項8記載のMHC分子構築物。 - 1つ以上の標識化合物をさらに含んでなる請求項1〜9いずれか記載のMHC分子構築物。
- 1つ以上の標識化合物が、キャリア分子および/または1つ以上の結合実体および/またはストレプトアビジンおよび/または1つ以上のMHC分子に結合している請求項10記載のMHC分子構築物。
- 標識化合物が、
(a)5-および6-カルボキシフルオレセイン、5-または6-カルボキシフルオレセイン、6-フルオレセイン-5-および6-カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、色素、Cy2、Cy3、Cy5、任意に置換されたクマリン、AMCA、PerCP、フィコビリンタンパク質、R-フィコエリトリン、アロフィコエリトリン、テキサスレッド、プリンストンレッド、グリーン蛍光タンパク質、およびそれらのアナログ、R-フィコエリトリンのコンジュゲート、アロフィコエリトリンおよびCy5またはテキサスレッドのコンジュゲート、半導体ナノ結晶に基づく無機蛍光標識、量子ドット、ならびにランタニドに基づく時間分解蛍光標識、Eu3+に基づく時間分解蛍光標識、およびSm3+に基づく時間分解蛍光標識の群に由来する蛍光標識から選ばれる、
(b)DNP、ビオチン、およびジゴキシゲニンの群に由来するハプテンから選ばれる、
(c)セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼの群に由来する酵素標識から選ばれる、
(d)ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタンおよびピリドピリダジンの群に由来する発光標識から選ばれる、および
(e)ヨウ素の取り込まれた同位体、コバルトの取り込まれた同位体、セレンの取り込まれた同位体、トリチウムの取り込まれた同位体、およびリンの取り込まれた同位体の群に由来する放射能標識から選ばれる、および
(f)蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、金属粒子、ハプテン、抗体および色素から選択される
請求項10または11記載のMHC分子構築物。 - キャリア分子が、
(a)多糖類、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、デキストランポリアルデヒド、カルボキシメチルデキストランラクトン、およびシクロデキストリン、プルラン、シゾフィラン、スクレログルカン、キサンタン、ジェラン、O-エチルアミノグアラン、6-O-カルボキシメチルキチンおよびN-カルボキシメチルキトサンを含むキチンおよびキトサン、
(b)誘導体化セロロジクス(cellolosics)、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、6-アミノ-6-デオキシセルロースおよびO-エチルアミンセルロース、
(c)ヒドロキシル化デンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、カラゲナン、アルギン酸塩、およびアガロース、ならびに
(d)合成多糖類、フィコールおよびカルボキシメチル化フィコール
からなる群より選ばれるものである請求項2〜12いずれか記載のMHC分子構築物。 - 固体または半固体支持体に固定化された請求項1〜13いずれか記載のMHC分子構築物。
- 固体または半固体支持体に直接固定化された、あるいはリンカー、スペーサー、または抗体、その抗体誘導体もしくは断片を介して固体または半固体支持体に固定化された請求項14記載のMHC分子構築物。
- 支持体が、粒子、ビーズ、生分解性粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、ナイロン膜、繊維、毛細管、針、マイクロタイター条片、チューブ、プレートまたはウェル、コーム、ピペットチップ、マイクロアレイ、チップおよびスライドからなる群より選ばれるものであり、該ビーズまたは粒子が、ポリマービーズ、ポリマー粒子、磁性ビーズ、磁性粒子、超磁性ビーズ、または超磁性粒子である請求項14または15記載のMHC分子構築物。
- フローサイトメトリー法、組織学的方法または細胞学的方法において使用するための請求項1〜16いずれか記載のMHC分子構築物。
- 請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物を含有してなる組成物。
- 可溶化媒体中における請求項18記載の組成物。
- MHC分子構築物が、ペプチド充填MHC分子またはペプチド非含有MHC分子を含んでなり、ペプチド非含有MHC分子を充填するためのペプチド、およびペプチド非含有分子を含むMHC分子構築物が、別々に提供される請求項18または19記載の組成物。
- 請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物を含んでなる治療用組成物。
- 1つ以上の生物学的に活性な分子および/または賦形剤をさらに含んでなる請求項21記載の治療用組成物。
- MHC認識細胞に関与する疾患の治療、予防、安定化、または軽減における使用のための、請求項21または22記載の治療用組成物。
- 疾患が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系性、異種性、移植片対宿主起源、もしくは宿主対移植片起源の疾患であるか、あるいは慢性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患である請求項21〜23いずれか記載の治療用組成物。
- インビボ療法またはエキソビボ療法における使用のための請求項21〜23いずれか記載の治療用組成物。
- 免疫応答をアップレギュレート、ダウンレギュレート、もしくは調節するための、細胞のアネルギーを誘導するための、または養子免疫療法のための医薬の製造における請求項21〜25いずれか記載の治療用組成物の使用。
- 請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物を提供する工程、
治療用物質に適切な媒体中にMHC分子構築物を溶解または分散させる工程、および
任意に他の賦形剤を添加する工程
を含む請求項21〜25いずれか記載の治療用組成物の製造方法。 - 請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物を用いてMHC認識細胞を得る工程、
かかるMHC認識細胞を臨床的に関連する数に増殖する工程、
投与に適した媒体中で得られた細胞を製剤化する工程、および
任意に賦形剤を添加する工程
を含む請求項21〜25いずれか記載の治療用組成物の製造方法。 - (a)MHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルと請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物を接触させる工程、および
(b)MHC分子構築物の任意の結合を測定し、それによりMHC認識細胞に関与する疾患の予後を確立し、該疾患の状態を決定し、または該疾患を診断する工程
を含むMHC認識細胞に関与する疾患の予後の確立、該疾患の状態の決定、または該疾患の診断のための方法。 - (a)医薬での処置を受けた被験体由来のサンプルと請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物を接触させる工程、および
(b)MHC分子構築物の任意の結合を測定し、それにより医薬の有効性を決定する工程、
を含むMHC認識細胞に関与する疾患に対する医薬の有効性を決定するための方法。 - (a)MHC認識細胞を含有することが予想されるサンプルを提供する工程、
(b)サンプルと請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物を接触させる工程、および
(c)MHC分子構築物の任意の結合を測定し、それによりMHC認識細胞をモニターする工程
を含むMHC認識細胞のモニターまたは検出のための方法。 - MHC認識細胞が、炎症性、自己免疫性、アレルギー性、ウイルス性、癌性、感染性、同種異系性、異種性、移植片対宿主起源、または宿主対移植片起源の疾患、あるいは慢性炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性結腸炎、硬化症、I型糖尿病、慢性関節リウマチ、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、悪性黒色腫、腎癌、乳癌、肺癌、子宮の癌、子宮頸癌、前立腺癌、脳癌、頭部および頚部の癌、白血病、皮膚リンパ腫、肝癌、結腸直腸癌、膀胱癌、拒絶関連疾患、対宿主性移植片病、または肝炎、AIDS、麻疹、痘、水痘、風疹もしくは疱疹に関連するウイルス性疾患に関与している請求項27〜31いずれか記載の方法。
- サンプルが、組織学的材料、細胞学的材料、原発腫瘍、二次器官転移物、細針吸引物、脾臓組織、骨髄検体、細胞スメア、剥脱性細胞検体、接触調製物、口腔スワブ、喉頭スワブ、膣スワブ、気管支洗浄物、胃洗浄物、臍帯サンプル、体液サンプル、血液サンプル、血液から単離された末梢血液単核細胞集団由来のサンプル、血液由来調製物由来のサンプル、白血球搬出産物由来のサンプル、痰サンプル、喀出物、気管支吸引液、生検、および生検の切片からなる群より選ばれるものである請求項27〜32いずれか記載の方法。
- 結合の測定が、顕微鏡での検査、光、蛍光、電子透過、またはフローサイトメトリーにより行われる請求項27〜33いずれか記載の方法。
- サンプルが、支持体、固体もしくは半固体の支持体上に、またはガラススライド、1つ以上のウェルを有するマイクロタイタープレート、ビーズ、粒子、膜、フィルター、フィルター膜、ポリマースライド、ポリマー膜、チャンバースライド、皿、もしくはペトリ皿上にマウントされる請求項27〜34いずれか記載の方法。
- (i)少なくとも5つのMHC分子を提供する工程;
(ii) キャリア分子を提供する工程;
(iii)1つより多くのストレプトアビジンまたは1つより多くの結合実体を提供する工程;
(iv)該キャリア分子に、該1つより多くのストレプトアビジンまたは該1つより多くの結合実体を介して、該少なくとも5つのMHC分子を結合させる工程、ここで、結合により、各ストレプトアビジンまたは各結合実体は、2〜4つのMHC分子に結合される;
(v)任意に、該キャリア分子に、直接にまたは該1つより多くのストレプトアビジンもしくは該1つより多くの結合実体を介して、1つ以上の生物学的に活性な分子を結合させる工程;
(vi)任意に、1つ以上の標識化合物を、該キャリア分子に、該1つより多くのストレプトアビジンの1つ以上に、または該少なくとも5つのMHC分子の1つ以上に結合させる工程、および
それによって請求項21〜25いずれか記載の治療用組成物を製造する工程
を含む、請求項21〜25いずれか記載の治療用組成物の製造方法。 - 請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物を使用する工程を含む、MHC認識細胞を得るための方法。
- MHC認識細胞が、
MHC認識細胞を含有する被験体に由来するサンプルを請求項1〜17いずれか記載のMHC分子構築物の1つ以上と接触させ、それによりMHC認識細胞がMHC分子構築物に結合する工程、
結合MHC分子構築物およびMHC認識細胞を単離する工程、および
任意に、かかるMHC認識細胞を臨床的に関連する数にエキソビボ増殖する工程により得られるものである請求項37記載の方法であって、該単離されたMHC認識細胞は、増殖の前にMHC分子構築物から遊離される、方法。 - 該方法が、磁場を印加することまたはフローサイトメトリーによるMHC認識細胞の単離を含む請求項37または38記載の方法。
- MHC分子構築物が、サンプルとの接触の前または後に、固体または半固体支持体に固定化される請求項37〜39いずれか記載の方法。
- 増殖が、1つ以上のMHC分子構築物、任意に1つ以上の生物学的に活性な分子および任意に樹状細胞または他のフィーダー細胞等のフィーダー細胞の存在下で行われる請求項37〜40いずれか記載の方法。
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