JP2010189399A - 生理活性ペプチド及びこれを含有する薬剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物活性を有するシースリン由来の特定のアミノ酸配列からなるペプチドを、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞細胞等の細胞の細胞増殖促進剤又は分化促進剤の有効成分として用いる。
【選択図】なし
Description
るシースリン内部のアミノ酸配列が特定され、そのアミノ酸配列からなるペプチドが取得できれば、シースリンの生物活性をより効果的に発揮できる医薬素材をより安価に提供することができる。
X01 Pro X02 X03 X04 X05 X06 X07 X08 X09 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20
(但し、X01はVal又はGlnを、X02はAla、Phe又はGlyを、X03はPhe又はLeuを、X04はPro又はLysを、X05はArg、Gln又はProを、X06はGln、Arg又はPheを、X07はPro、Ser又はLeuを、X08はアミノ酸残基が存在しないこと又はGly若しくはGlnを、X09はアミノ酸残基が存在しないこと又はAla、Gly若しくはProを、X10はアミノ酸残基が存在しないこと又はGln若しくはThrを、X11はアミノ酸残基が存在しないこと又はGly若しくはAlaを、X12はアミノ酸残基が存在しないこと又はMet若しくはAlaを、X13はGly、Ala又はThrを、X14はThr、Ile、Pro又はGlyを、X15はPro又はValを、X16はGly又はGlnを、X17はVal、Met又はGlyを、X18はAla又はThrを、X19はSer又はProを、X20はLeu又はGlnをそれぞれ示す。)
Val Pro X21 Phe Pro X22 Gln X23 Gly X24 Pro Gly X25 Ala Ser Leu
(但し、X21はAla又はPheを、X22はArg又はGlnを、X23はPro又はSerを、X24はThr又はIleを、X25はVal、Met又はGlyをそれぞれ示す。)
(A) Val Pro Ala Phe Pro Arg Gln Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ser Leu(配列番号3)
(B) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号4)
(C) Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ile Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号5)
(D) Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ala Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号6)
(E) Val Pro Ala Phe Pro Gln Arg Pro Gly Gly Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号7)
(F) Gln Pro Gly Leu Lys Pro Phe Leu Gln Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gln Val Thr Pro Gln (配列番号8)
(G) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Ser Leu (配列番号9)
Asn Lys X26 X27 X28 Pro X28 X29 X30 X31 X32 Ala Trp X31 Phe
(但し、X26はAla又はValを、X27はGln又はHisを、X28はGln又はGluを、X29はIle、Met又はValを、X30はアミノ酸 が存在しないこと又はLys若しくはMetを、X31はArg又はHisを、X32はAsp又はAsnをそれぞれ示す。)
Asn Lys Ala Gln X33 Pro X33 X34 X35 X36 Asp Ala Trp X36 Phe
(但し、X33はGln又はGluを、X34はIle又はMetを、X35はLys又はMetを、X36はArg又はHisをそれぞれ示す。)
(H) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys Arg Asp Ala Trp Arg Phe(配列番号10)
(I) Asn Lys Ala Gln Glu Pro Glu Met Met His Asp Ala Trp His Phe(配列番号15)
(J) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys His Asp Ala Trp His Phe(配列番号16)
(K) Asn Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn Ala Trp Arg Phe(配列番号17)
<1>本発明ペプチド
(1)本発明ペプチド−N
本発明ペプチド−Nは、下記のアミノ酸配列(配列番号1)からなるペプチドである。本発明ペプチド−Nは、シースリンタンパク質のN末端側に存在するアミノ酸配列をもとに設計されたものである。
X01 Pro X02 X03 X04 X05 X06 X07 X08 X09 X10 X11 X12 X13 X14 X15 X16 X17 X18 X19 X20
X01:Val又はGln
X02:Ala、Phe又はGly
X03:Phe又はLeu
X04:Pro又はLys
X05:Arg、Gln又はPro
X06:Gln、Arg又はPhe
X07:Pro、Ser又はLeu
X08:アミノ酸残基が存在しない、又はGly若しくはGln
X09:アミノ酸残基が存在しない、又はAla、Gly若しくはPro
X10:アミノ酸残基が存在しない、又はGln若しくはThr
X11:アミノ酸残基が存在しない、又はGly若しくはAla
X12:アミノ酸残基が存在しない、又はMet若しくはAla
X13:Gly、Ala又はThr
X14:Thr、Ile、Pro又はGly
X15:Pro又はVal
X16:Gly又はGln
X17:Val、Met又はGly
X18:Ala又はThr
X19:Ser又はPro
X20:Leu又はGln
Val Pro X21 Phe Pro X22 Gln X23 Gly X24 Pro Gly X25 Ala Ser Leu
X21:Ala又はPhe
X22:Arg又はGln
X23:Pro又はSer
X24:Thr又はIle
X25:Val、Met又はGly
(A) Val Pro Ala Phe Pro Arg Gln Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ser Leu(配列番号3)
(B) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号4)
(C) Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ile Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号5)
(D) Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ala Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号6)
(E) Val Pro Ala Phe Pro Gln Arg Pro Gly Gly Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号7)
(F) Gln Pro Gly Leu Lys Pro Phe Leu Gln Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gln Val Thr Pro Gln (配列番号8)
(G) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Ser Leu (配列番号9)
本発明ペプチド−Cは、下記のアミノ酸配列(配列番号13)からなるペプチドである。本発明ペプチド−Cは、シースリンタンパク質のC末端側に存在するアミノ酸配列をもとに設計されたものである。
Asn Lys X26 X27 X28 Pro X28 X29 X30 X31 X32 Ala Trp X31 Phe
X26:Ala又はVal
X27:Gln又はHis
X28:Gln又はGlu
X29:Ile、Met又はVal
X30:アミノ酸が存在しない、又はLys若しくはMet
X31:Arg又はHis
X32:Asp又はAsn
Asn Lys Ala Gln X33 Pro X33 X34 X35 X36 Asp Ala Trp X36 Phe
X33:Gln又はGlu
X34:Ile又はMet
X35:Lys又はMet
X36:Arg又はHis
(H) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys Arg Asp Ala Trp Arg Phe(配列番号10)
(I) Asn Lys Ala Gln Glu Pro Glu Met Met His Asp Ala Trp His Phe(配列番号15)
(J) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys His Asp Ala Trp His Phe(配列番号16)
(K) Asn Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn Ala Trp Arg Phe(配列番号17)
本発明ペプチドは、そのアミノ酸配列が本発明により開示されたので、その配列に基づいてペプチドの公知の化学合成法(例えば液相合成法や固相合成法等;泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇 道典、「ペプチド合成の基礎と実験」1985、丸善(株)参照)により製造することが可能である。例えば、前記(A)(配列番号3)のアミノ酸配列からなるペプチドを固相合成法で製造する場合には、アミノ酸配列のC末端(16位)がロイシン残基であるから、α-アミノ基(Nα)-保護-ロイシンのカルボキシル基を直接、或いは場合によってはスペーサーを介して、クロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂に結合させた後、Nα-保護基を除去し、アミノ酸配列の15位から1位までの各保護アミノ酸(Nα-及び側鎖官能基保護アミノ酸を、単に「保護アミノ酸」と略称する)を固相合成法に従って順次結合し、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸のNα-及び側鎖官能基の保護基を脱離させて、前記(A)(配列番号3)のアミノ酸配列からなるペプチドを得ることができる。
ahedron Lett., 30, 1927 (1989))等に従って行なうことができる。これらのうち、DCC法、DCC-HOBt法、BOP-HOBt法、HBTU-HOBt法、対称酸無水物法が好ましい。
これら一連の方法によって本発明ペプチドを製造することができる。
本発明薬剤は、本発明ペプチド(本発明ペプチド−N及び/又はペプチド−C)を有効成分とする薬剤である。本発明薬剤は、医薬であってもよく、実験や試験用の試薬であってもよいが、医薬であることが好ましい。
(A) Val Pro Ala Phe Pro Arg Gln Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ser Leu (配列番号3)
(B) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号4)
(C) Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ile Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号5)
(D) Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ala Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号6)
(E) Val Pro Ala Phe Pro Gln Arg Pro Gly Gly Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号7)
(F) Gln Pro Gly Leu Lys Pro Phe Leu Gln Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gln Val Thr Pro Gln (配列番号8)
(G) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Ser Leu (配列番号9)
(H) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys Arg Asp Ala Trp Arg Phe(配列番号10)
(I) Asn Lys Ala Gln Glu Pro Glu Met Met His Asp Ala Trp His Phe(配列番号15)
(J) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys His Asp Ala Trp His Phe(配列番号16)
(K) Asn Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn Ala Trp Arg Phe(配列番号17)
ペーサーを介して結合させる方法等が挙げられる。これらの公知の結合法から、不溶性担体の種類に応じて適宜選択して本発明ペプチドの結合に利用することができる。
本発明組成物は、本発明ペプチド(本発明ペプチド−N及び/又はペプチド−)Cと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含むことを特徴とする組成物である。
(A) Val Pro Ala Phe Pro Arg Gln Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ser Leu (配列番号3)
(B) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号4)
(C) Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ile Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号5)
(D) Val Pro Ala Phe Pro Gln Gln Pro Gly Ala Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号6)
(E) Val Pro Ala Phe Pro Gln Arg Pro Gly Gly Gln Gly Met Ala Pro Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号7)
(F) Gln Pro Gly Leu Lys Pro Phe Leu Gln Pro Thr Ala Ala Thr Gly Val Gln Val Thr Pro Gln (配列番号8)
(G) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Ser Leu (配列番号9)
(H) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys Arg Asp Ala Trp Arg Phe(配列番号10)
(I) Asn Lys Ala Gln Glu Pro Glu Met Met His Asp Ala Trp His Phe(配列番号15)
(J) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys His Asp Ala Trp His Phe(配列番号16)
(K) Asn Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn Ala Trp Arg Phe(配列番号17)
株式会社ペプチド研究所に委託し、下記(a)〜(e)のペプチドを固相合成法により製造した。(a)はシースリンタンパク質(ブタ由来)のN末端側に存在するアミノ酸配列をもとに、(b)はシースリンタンパク質(ヒト由来)中の(a)に対応する部分のアミノ酸配列をもとに、(c)はシースリンタンパク質(ブタ由来)のC末端側に存在するアミノ酸配列をもとに、(d)及び(e)はいずれもシースリンタンパク質(ブタ由来)のN末端側とC末端側の中間領域に存在するアミノ酸配列をもとにそれぞれデザインしたペプチドである。ペプチド(a)、(b)及び(c)が本発明ペプチドに相当する。
(a) Val Pro Ala Phe Pro Arg Gln Pro Gly Thr Pro Gly Val Ala Ser Leu(配列番号3)
(b) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号4
)
(c) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys Arg Asp Ala Trp Arg Phe(配列番号10)
(d) Glu His Glu Thr Gln Gln Tyr Glu Tyr Ser(配列番号11)
(e) Ala Arg Gly Pro Ala Gly Arg Ser Arg Gly Pro Pro Gly(配列番号12)
時間)を以下に示す。カッコ内の数字は理論値を示す。
ペプチド(a):Thr(1)0.94,Ser(1)0.89,Glu(1)1.00,Gly(2)2.05,Ala(2)2.07,Val(2)2.01,Leu(1)1.02,Phe(1)0.99,NH2(1)1.13,Arg(1)0.98,Pro(4)4.00
ペプチド(b):Thr(1)0.94,Ser(2)1.77,Glu(2)2.00,Gly(2)1.97,Ala(1)1.00,Val(1)0.97,Met(1)0.98,Leu(1)0.99,Phe(2)1.96,NH2(2)2.12,Pro(3)2.99
ペプチド(a):97.3%
ペプチド(b):96.4%
・カラム :Zorbax 300SB-C18 (4.6mmI.D.x 150mm)(アジュレント社製)
・溶離液 :10〜60%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸(25分)
・流速 :1.0mL/分
・温度 :ペプチド(a)については25℃、ペプチド(b)については50℃。
・検出波長:220nm
ペプチド(a):1593.6(理論値:1593.8)
ペプチド(b):1663.6(理論値:1663.9)
プチド(b)のN末端及び/又はC末端に数アミノ酸残基が付加されたペプチド(下記(k)〜(m)のペプチド)、及び上記ペプチド(b)中の一部のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたペプチド(下記(n)のペプチド)を、前記と同様に固相合成法により製造した。
ペプチド(n)が本発明ペプチドに相当する。
(f) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly (配列番号18)
(g) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser (配列番号19)
(h) Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly (配列番号20)
(i) Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号21)
(j) Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号22)
(k) Met Ser Phe Ala Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu (配列番号23)
(l) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu Ser Leu Glu Thr (配列番号24)
(m) Phe Ala Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Met Ala Ser Leu Ser Leu (配列番号25)
(n) Val Pro Phe Phe Pro Gln Gln Ser Gly Thr Pro Gly Gly Ala Ser Leu (配列番号9)
(1)細胞の調製
(i)ヒト由来の歯周靱帯由来細胞(PDL細胞)
PDL細胞は、矯正治療のために抜歯を目的として来院した患者(16.24歳)から歯周靱帯を可能な限り傷つけないようして注意深く抜去した健全小臼歯から分離して培養した。抜去した歯牙を、滅菌した生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;ニッスイ製)で洗浄後、歯根中央1/3に存在する歯周靱帯を尖刃刀を用いてそぎ落とした。これらの歯周靱帯をプラスチックシャーレに入れ替え、丸刃刀を用いてより小さな細片にした。組織片を35mm径のシャーレ(FALCON社製)中で静置し、抗生物質(100 U/ml ペニシリンG、100μg/ml ストレプトマイシン及び 250μg/ml ゲンタマイシン)及び10% ウシ胎仔血清(FBS;EQUITECH-BIO社製)を含有するダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle medium;DMEM;ニッスイ製)中で、37℃、5% CO2条件下で培養した。その後、歯周靱帯組織片から遊出してきた細胞を同様の条件下で継代培養し、3〜5代目の細胞を実験に用いた。
マウス由来の骨芽細胞として、MC3T3細胞株又はST2細胞株(RIKEN CELL BANKより入手)を用いた。
ラットの大腿骨骨髄由来間葉系幹細胞(BMMSC)を用いた。この細胞株は、Maniatopoulosらの方法(文献Maniatopoulos C, Sodek J and Melcher AH: Bone formation in vitroby stromal cells obtained from bone marrow of young adult rats. Cell tissue Res,
254: 317-330, 1988)に従い、大腿骨を無菌的に摘出し、周囲軟組織を可及的に除去した。大腿骨近遠心位骨端を切断し、15S含有minimum essential medium alpha medium(αMEM;GIBCO)5mlを用いて、シリンジにて大腿骨骨髄組織を同培養液10ml中に射出した。
得られた組織を15S含有αMEMにて37℃で培養、3〜5代目の細胞を実験に用いた。
マウス由来のセメント芽細胞として、OCCM30細胞株(Bone. 1999 Jul;25(1):39-47)を用いた。この細胞株は、Washington大学歯学部Somerman教授より供与された。
24ウエルの培養プレート(FALCON社製)に、(1)で調製したPDL細胞を5×103 細胞/ウエルの割合で播種した。播種後1日間は10% FBSを含有するDMEM中で培養した。播種後1日目を0日目として、前記で製造したペプチド(a)を各種濃度で培養液(2% FBSを含有するDMEM)に添加した。4日目および6日目に0.08% トリプシンと0.04% エチレンジア
ミン四酢酸(EDTA)を含有するPBSを用いて細胞を剥離分散し、コールターカウンター(COULTER Z1,Coulter Electronics社製)を用いて細胞数を計測した。
細胞の分化の指標として、細胞のアルカリホスファターゼ(ALP)活性を測定した。24ウエルの培養プレートに、5×103 細胞/ウエルの割合で細胞を播種し、2% FBSを含有するDMEM又はαMEMに各種濃度のペプチド(a)を添加して培養した。細胞がコンフルエントに達した時点から1週間目に以下の酵素化学的方法(Bessey-Lowry法、Bessey OA,Lowry OH and Brock MJ: A method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic millimeter of serum. J Biol Chem, 164: 321-329, 1946)によってALP活性を測定した。
培養細胞をPBSで洗浄後、超音波ホモジナイザー(Handy Sonic model UR-20P;トミー工業製)を用いて10mM トリス塩酸緩衝液(pH7.4、500μl)中で40秒間細胞を破砕し撹拌した。次いで、このサンプル液 25μlをALP緩衝液(0.1M 炭酸塩緩衝液 pH9.8、6.7mM p-ニトロフェニルホスフェート、2mM MgCl2)125μlに添加し、37℃で30分間インキュベートした。0.2N NaOHを125μl添加することによって反応を終了させた後、マイクロプレートリーダー(Model 550,Bio-Rad Laboratories製)を用いて405nmにおける吸光度を測定した。
も有意な細胞分化促進作用を示した。またこの作用はBMP2と同等若しくはそれ以上であり、これらの結果からもペプチド(a)及び(b)には極めて高い細胞の分化促進作用があることが示された。
進作用を示した。
細胞の石灰化物形成能に対するペプチドの影響を検討するために、以下の実験を行った。
歯周病モデルに対する本発明ペプチドの作用を調べるために、以下の実験を行った。
8週齢のWistarラットを体重100g当たり0.5ml量のカルバミル酸エチル溶液にて全身麻酔した後、上顎第一臼歯近心歯肉に縦切開を入れた。歯肉骨膜弁を剥離し、第一臼歯近心
歯槽骨を露出させた。続いて同部の歯槽骨頂より根尖側へ、フィッシャーバーで長さ約2mm、頬舌径約1mmの欠損を生食注水下に作成し、上顎第一臼歯近心根面を露出させた。露出根面に残存付着する歯周靱帯とともにセメント質ならびに象牙質表層を浅い窩洞状に削除した。
この欠損部に、ヒアルロン酸ナトリウム(重量平均分子量90万)の1%PBS溶液により調製した試料を露出根面に塗布し、歯肉骨膜弁を復位縫合した。ペプチド(a)を含むヒアルロン酸ナトリウムの1%PBS溶液(ペプチド(a)の濃度:0.3mg/ml)を塗布した群をペプチド群とし、ヒアルロン酸ナトリウムの1%PBS溶液のみを塗布した群(ヒアルロン酸群)、あるいはなにも塗布せずに歯肉弁を復位縫合した群(コントロール群)を対照として、術後1ヶ月の治癒形態を比較した。
クロロホルムにて動物を安楽死させた後、実験部位を摘出した。摘出した上顎骨は中性緩衝ホルマリンにて一日浸漬固定し、続いて急速脱灰液(K-CX)にて2日間脱灰した。常法に従ってパラフィン包埋後、実験部位について歯根長軸と平行に4.5mm厚で近遠心断切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を施した。欠損部露出歯根面における歯周組織の付着形態や歯槽骨頂の位置を、光学顕微鏡で観察した。
コントロール群、ヒアルロン酸群ともに上皮の根尖側移動が認められたが、ペプチド群はそれらに比較して少なかった。また、コントロール群及びヒアルロン酸群ともにセメント質及びシャーピー線維の封入を伴うセメント質の沈着はほとんどみられず、歯肉と歯根の間にはしばしば亀裂が観察された。これに対し、ペプチド群ではそのような亀裂はみられず、削除歯根表面にはシャーピー線維の封入を伴うセメント質の添加、即ち結合組織性新付着形成も観察された。また、骨再生も他の2群に比べ盛んで、高い骨再生を示した。
骨欠損モデルに対する本発明ペプチドの作用を調べるために、以下の実験を行った。
Wistar系雄性ラット(8週齢)を体重100g当たり0.5ml量のカルバミル酸エチル溶液にて全身麻酔した後、左右後肢脛骨表面皮膚および脛骨骨膜に切開を入れ、骨膜を剥離して、脛骨を露出させた。続いて、生理食塩水の注水下で、同部の皮質骨を直径2mmのラウンドバーで穿孔し、骨髄腔まで達する欠損(直径2mm,深さ3mm)を作製した。
骨欠損部に、ヒアルロン酸ナトリウム製剤(商品名:アルツ(登録商標);ヒアルロン酸ナトリウムの重量平均分子量:約90万;ヒアルロン酸ナトリウムの濃度:1%)に溶解したペプチド(a)(濃度0.3 mg/ml又は3 mg/ml)を填入し、骨膜および皮膚を復位縫合した。ペプチドを填入した群(ペプチド群)、担体であるヒアルロン酸ナトリウムの1%PBS溶液のみを塗 布した群(HA群)又は何も塗布せずに皮膚骨膜弁を復位縫合した群(コントロール群)における、術後3週目の治癒形態をX線で解析した。
各群における軟X線写真像を比較した結果、コントロール群及びHA群では骨欠損の残存が比較的明瞭に観察されたが、ペプチド群(濃度 0.3 mg/ml 又は3 mg
/ml)では、骨欠損がほとんど認識できない程度にまで骨が再生していることが確認された。この結果から、本発明ペプチドは、骨欠損部の骨の再生を有意に促進することが示された。
同様に、コラーゲンゲル(商品名:コーケンアテロコラーゲンインプラント、株式会社高研)、ペプチド(a)及び(b)(濃度:3mg/ml)について実験を行った。その結果、コントロール群及びコラーゲンゲル群では骨欠損の残存が比較的明瞭に観察されたが、ペプチド(a)のみならず(b)を用いた場合であっても、骨欠損がほとんど認識できない程度にまで骨が再生していることが確認された。この結果から、本発明ペプチドは、骨欠損部の骨の再生を有意に促進することが示された。
以下に本発明薬剤の製剤例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明薬剤の剤形がこれらに限定されるものではない。
前記で製造したペプチド(a) 10mg
モノステアリン酸ソルビタン 7mg
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン 7mg
パルミチン酸イソプロピル 37mg
ワセリン 37mg
流動パラフィン 37mg
セタノール 50mg
グリセリン 70mg
ステアリン酸マグネシウム 2mg
上記成分に精製水を加えて、1gのクリームとした。
前記で製造したペプチド(b) 100mg
乳糖 670mg
バレイショデンプン 150mg
結晶セルロース 60mg
軽質無水ケイ酸 50mg
前記で製造したペプチド(b) 100mg
乳糖 80mg
上記成分を均一に混合し、硬カプセルに充填してカプセル剤を得た。
前記で製造したペプチド(a) 30mg
上記成分を5%マンニトール水溶液2mLに溶解し、これを無菌濾過した後、アンプルに入れて密封した。
(A)前記で製造したペプチド(b)(凍結乾燥体) 30mg(アンプル封入した)
(B)無菌濾過したPBS 2mL(アンプル封入した)
上記(A)および(B)を1セットとして、用時溶解用注射剤を製造した。使用時には(A)を(B)で溶解して用いることができる。
以下に本発明組成物の製造例を示すが、これらはあくまで例示であり、本発明組成物の組成・形態等がこれらに限定されるものではない。
前記で製造したペプチド(a) 3mg
ヒアルロン酸ナトリウム(重量平均分子量90万)の1% PBS溶液 10ml
上記成分を混合することにより、液体状態の本発明組成物を製造した。
前記で製造したペプチド(a) 3mg
ヒアルロン酸ナトリウム(重量平均分子量220万)の0.1% PBS溶液 10ml
上記成分を混合することにより、液体状態の本発明組成物を製造した。
前記で製造したペプチド(b) 30mg
ヒアルロン酸ナトリウム(重量平均分子量90万)の1% PBS溶液 10ml
上記成分を混合して凍結乾燥することにより、乾燥状態の本発明組成物を製造した。
が加わって、さらに有利な生物学的効果を奏する可能性もあることから、極めて有用である。
Claims (12)
- 下記のアミノ酸配列(配列番号13)からなるペプチド。
Asn Lys X26 X27 X28 Pro X28 X29 X30 X31 X32 Ala Trp X31 Phe
(但し、X26はAla又はValを、X27はGln又はHisを、X28はGln又はGluを、X29はIle、Met又はValを、X30はアミノ酸が存在しないこと又はLys若しくはMetを、X31はArg又はHisを、X32はAsp又はAsnをそれぞれ示す。) - 下記のアミノ酸配列(配列番号14)からなる、請求項1に記載のペプチド。
Asn Lys Ala Gln X33 Pro X33 X34 X35 X36 Asp Ala Trp X36 Phe
(但し、X33はGln又はGluを、X34はIle又はMetを、X35はLys又はMetを、X36はArg又はHisをそれぞれ示す。) - 下記(H)〜(K)のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のペプチド。
(H) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys Arg Asp Ala Trp Arg Phe(配列番号10)(I) Asn Lys Ala Gln Glu Pro Glu Met Met His Asp Ala Trp His Phe(配列番号15)(J) Asn Lys Ala Gln Gln Pro Gln Ile Lys His Asp Ala Trp His Phe(配列番号16)(K) Asn Lys Val His Gln Pro Gln Val His Asn Ala Trp Arg Phe(配列番号17) - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドを有効成分とする薬剤。
- 医薬であることを特徴とする、請求項4に記載の薬剤。
- 細胞増殖促進剤であることを特徴とする、請求項4又は5に記載の薬剤。
- 「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項6に記載の薬剤。
- 細胞の分化促進剤であることを特徴とする、請求項4又は5に記載の薬剤。
- 「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞又は歯根膜由来細胞であることを特徴とする、請求項8に記載の薬剤。
- 骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項4又は5に記載の薬剤。
- 歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤であることを特徴とする、請求項4又は5に記載の薬剤。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドと、ヒアルロン酸又はその薬学的に許容される塩とを少なくとも含むことを特徴とする組成物。
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