JP5671618B2

JP5671618B2 - Ｐｇａを含んでなる新しいｅｍｄ製剤

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Publication number: JP5671618B2
Application number: JP2013524463A
Authority: JP
Inventors: ラズロ・ガラムセギ; アンドリ・ヴィタル
Original assignee: ストラウマンホールディングアーゲー
Priority date: 2010-10-15
Filing date: 2011-10-17
Publication date: 2015-02-18
Anticipated expiration: 2031-10-17
Also published as: EP2566504B1; KR20130119909A; CN103153334B; CN103153334A; US20130210735A1; KR101821842B1; JP2013534240A; US9789190B2; WO2012049324A2; CA2801332A1; WO2012049324A3; CA2801332C; EP2566504A2

Description

本発明は、精製したエナメル基質の蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を含んでなる、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤に関する。特に、本発明は、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び少なくとも１３０ｋＤａの質量平均分子量を有する滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む安定製剤に関する。

エナメル基質中に存在するエナメル基質蛋白質は、エナメルに対する前駆体として最も広く知られている。セメント質形成の前に、エナメル基質蛋白質は、発育期歯根の先端部（apicl end）において根表面に析出する。析出エナメル基質がセメント質形成のための開始因子である証拠が存在する。再び、セメント質それ自身の形成は、歯根膜及び歯槽骨の発育と関連がある。従って、エナメル基質蛋白質は、歯における自然の付着物発育の擬態を通して歯周組織再生を促進できる（非特許文献１）。

単離したエナメル基質蛋白質は、エナメル基質に隣接して発育する組織において自然に見出される一因子のみならず、因子の組織的なカスケードを誘発できる。それらは、発育組織の自然環境を擬態し、その結果、組織再生、細胞分化及び／又は成熟に対する自然の刺激を擬態する。

ブタのエナメル基質からの蛋白質の精製した酸抽出物の形態におけるエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）は、以前に、厳しい歯付着物喪失を患う患者において、機能的な歯根膜、セメント質及び歯槽骨の修復のために成功裏に採用した（非特許文献２）。

エナメル基質誘導体（ＥＭＤ）製剤は、また、歯周の再生を促進させることが示した（非特許文献３）。この研究において、異なった製剤は、使用される製剤に依存して、結果が異なるか否かを見つけるために使用した。ＥＭＤがＰＧＡに溶解するとき、最も満足すべき結果が得られることを、研究は示した。

例えば、特許文献１は、初めて、活性成分として、いわゆるエナメル基質と呼ばれている歯科エナメルに対する前駆体に由来する蛋白質部分を含む少なくとも一つの部分上での鉱化組織の再生による、鉱化組織の部分間の結合を誘導することに使用する組成を記載する。

更にその上、培養した歯根膜細胞（ＰＤＬ）に関する研究において、これらの細胞の付着率、成長及び代謝は、ＥＭＤが培地に存在するとき著しく増大することが示した。また、ＥＭＤに曝露した細胞は、対象群と比較して、増大した成長因子の分子内ｃＡＭＰシグナリング及び自己分泌産生を示した。他方、上皮細胞は、ＥＭＤが存在するときｃＡＭＰシグナリング及び成長因子の分泌が増大するが、増殖と成長の両方が阻害した（非特許文献４）。

エナメル基質蛋白質及びエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質が、硬組織の形成を誘導することができ（即ち、エナメルの形成：特許文献２(Slavkin)）；組織間の結合を保証すること（特許文献３及び特許文献４）；感染症及び炎症性疾患の処置に有効な効果を有する、皮膚及び粘膜などの開放創の治癒を促進すること（特許文献５及び特許文献６）；象牙質の再生を誘導すること（特許文献７）；移植片の取り込みを促進すること（特許文献８）；腫瘍の処置においてアポトーシスを誘導すること（特許文献９）；全身感染症又は炎症に対して、免疫応答の不均衡を規制すること（特許文献１０）：及び、腫瘍縮小手術などの処置及び／又は外傷からの続く創腔及び／又は組織欠損の充填を支援すること（特許文献１１）が、それぞれ、可能であることを、以前に、特許文献で記載されていた。

ＥＭＤは、アメロゲニン、エナメリン、房状分枝蛋白質、プロテアーゼ及びアルブミンなどの多数の蛋白質より成り立っている。７０〜９０％など、少なくとも６０〜９０％を占めるＥＭＤの主要構成成分であるアメロゲニンは、選択的スプライシング及び制御したポスト分泌腺処理による単一遺伝子からの疎水性蛋白質誘導体のグループである。それらは、脊椎動物の進化を通して高度に保存され、そして、調査した全ての高等脊椎動物の間で（８０％）、配列相同性に全体で高いレベルを示す。事実、ブタ及びヒトのアメロゲニン遺伝子転写物の配列は、基盤の４％が異なっているのみである。それ故、エナメル基質蛋白質及び／又はＥＭＤ蛋白質は、ブタ起源ではあるが、ヒトの肉体に遭遇したとき、「同一のもの」と考えられ、そして、アレルギ応答又はその他の好ましくない反応を引き起こすことなく、ヒトにおいて歯科再生を促進することができる。エナメル基質誘導体蛋白質（ＥＭＤ）は、エナメル質の最も知られた前駆体である。ＰＧＡで濃厚にしたその水溶液は、登録商標名：Straumann（登録商標） Emdogainで、商品化されている。ＰＧＡで濃厚にしたエナメル基質誘導体蛋白質（ＥＭＤ）の水溶液は、また、Straumann（登録商標）Emdogain Plusにおいても見出すことが。

水溶液中でＥＭＤを保持するために、溶液は、蛋白質の等電点（ＩＥＰ）より十分下のｐＨを持つべきであり、ＥＭＤに対しては、ＩＥＰはｐＨ６．５であるので、従って、より好ましくは、溶液のｐＨは、＜５．０である。容易な適用のために、溶液はＰＧＡで濃厚になる。化学的には、ＰＧＡは、ケルプ（海藻）から誘導されるアルギン酸のエステルである。いくつかのカルボキル基は、プロピレングリコールでエステル化され、いくつかは、適切なアルカリで中和され、そして、いくつかは、フリーのまま残っている。ＰＧＡそれ自身は酸性であり、そして、ＰＧＡがＥＭＤ溶液に溶解した後、ｐＨは低下する。酸性条件下で、ＰＧＡの分解に起因して、ｐＨの低下を保持する。混合物の耐久性は、ＥＭＤが歯の表面上に沈殿することが可能となるｐＨ値で決定される。沈殿は生理的条件、即ち、ＩＥＰ近辺のｐＨで発生することが想定される。歯根環境とＥＭＤ−ＰＧＡ混合物の両方のｐＨ及び緩衝能力は、ＥＭＤ蛋白質の沈殿挙動に影響を与え、ＩＥＰ近辺のｐＨ及びＰＧＡで製剤したＥＭＤ溶液の低い緩衝能力は沈殿を支持する。

D.J. McHughは、HYPERLINK（非特許文献５）において、アルギナートの重合度（ＤＰ）は、分子の平均分子量の物差しであり、そして平均鎖当たりのウロン酸ユニットの数でもあることを記載している。ＤＰ及び分子量は、直接、アルギナート溶液の粘度に関連し、貯蔵中の粘度の喪失は、アルギナートの解重合の程度を表す物差しである。

ＰＧＡは、一般的に、低、中、及び高粘度のアルギナート（２％水溶液の粘度を参照して）として記載される様々なグレードで製造される。ＰＧＡアルギナートの分子量が高ければ高いほど、その溶液の粘度は高くなる。製造者は、抽出条件の厳格さを変更することにより分子量（重合度、ＤＰ）を制御することができ、そして彼らは、１００〜１０００ユニットの範囲のＤＰを有する、１０〜１０００ｍＰａ・ｓ（１％溶液）の範囲の製品を提供する。粘度２００〜４００ｍＰa・ｓ「中粘度」のＰＧＡは、恐らく、最も広い適用分野を見出す。高ＤＰを有するＰＧＡは、低ＤＰのそれより安定性が低いことが知られている。低粘度のＰＧＡ（約５０ｍＰa・ｓ程度）は、３年間、１０〜２０℃に貯蔵して、観察可能な変化は見られなかった。中粘度のアルギン酸ナトリウム（約４００ｍＰａ・ｓ程度）は、１年後、２５℃で１０％喪失、及び３３℃で４５％喪失を示した。

プロピレングリコールアルギナートは、２５℃で１年後、約４０％の粘度低下を示し、そして、また、溶解性は低下した。アンモニウムアルギナートは、一般的に、上記のいかなるものより安定性が低下する。アルギン酸は最も安定性の低い生成物であり、そしていかなる長鎖物質も、常温で数ヶ月以内に、より短い鎖長に分解する。しかし、短鎖物質を含むアルギナートは安定であり、そして、鎖長当たり約４０ユニットのウロン酸のＤＰを有するアルギン酸は、２０℃の温度で、１年間に亘ってほとんど変化を示さない。しかし、薬学的錠剤の崩壊剤としてのアルギン酸の主用途は、湿潤下で膨潤する能力に依存し、そして、これはＤＰの変化により影響を受けない。市販のアルギナートは、冷所で、即ち、２５℃以下の温度で貯蔵すべきであり、温度が上昇すると、著しい解重合が起こるかもしれず、粘度及びゲル強度などの商業的に有用な特性に影響を与える。前記のアルギナートは、通常、１０〜１３％の湿度を有し、そして解重合率は、湿度の割合が増加すると上昇し、それ故、貯蔵面積は乾燥すべきである。

上記の通り、ＥＭＤ蛋白質は、ＰＧＡ水溶液中において事前製剤され、ここでＰＧＡの分解は、時間と共に次々にｐＨを低下させる酸性生成物を提供する。温度が上昇すると、分解が加速する。生成物の急激な酸性化を避けるために、その結果、この影響を制限するために、生成物は低温で、即ち、２〜８℃の温度範囲で輸送し、貯蔵する必要がある。それにもかかわらず、市販のStraumann（登録商標） EmdogainのＰＧＡとの製剤中のＥＭＤの安定性は、時間と共に急速に低下することが知られている。

ＵＳ第５０９８８９１号ＵＳ第４６７２０３２号ＥＰ第０３３７９６７号ＢＥＰ第０２６３０８６号ＢＥＰ第１０５９９３４号ＢＥＰ第１１５３６１０号ＢＷＯ第０１／９７８３４号ＷＯ第００／５３１９７号ＷＯ第００／５３１９６号ＷＯ第０３／０２４４７９号ＷＯ第０２／０８０９９４号

Gestrelius S, Lyngstadaas SP, Hammarstrom L. Emdogain - periodontal regeneration based on biomimicry； Clin Oral Invest 4:120-125 (2000)； Hammarstrom et al., 1997, Journal of Clinical Periodontology 24, 658-668; Hammarstrom et al., 1997, Journal of Clinical Periodontology 24, 669-677; Lyngstadaas et al., 2001 , Journal of Clinical Periodontology 28, 181-188； http://www.fao.org/docrep/x5822e/x5822e04.htm；

エナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及びエナメル基質蛋白質は、軟及び硬組織の再生を促進し、そして炎症及び感染症を低下させる能力により、臨床歯学分野で幅広く使用されている。

Straumann （登録商標）Emdogainは、アルギナート担体、プロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）、及びブタのエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質より成る市販の製品であり、歯周病の処置に使用され、硬質及び軟組織の再生を促進し、及び歯周外科手術につながる炎症を低下させる。Straumann（登録商標）Emdogainの製造において採用したＰＧＡは、５０〜１７５ｍＰａ・ｓ（２％水溶液、２２℃、Brookfield粘度）の粘度、即ち、「低粘度」を有する。製剤は、時間経過によるｐＨの急速な低下に起因して、安定性に欠ける。

それ故、製剤の急激な酸性化を避けるために、製剤は低温で、即ち、２〜８℃の範囲の温度で貯蔵し、輸送する必要がある。

本発明は、精製したエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び滅菌したプロピレングリコールアルギナートを含む薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤の驚くべき発見に関し、ここで、滅菌ＰＧＡは、２５０〜５００ｋＤａの間の質量平均分子量（Ｍ_Ｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡからｅ−ビーム滅菌により入手可能であり、時間と共により安定であり、特に、製剤のｐＨが時間と共により安定となる。

２００２年〜２００９年の粗製ＰＧＡ及びKelcoloid(登録商標）O（ＰＧＡ）の質量平均分子量（Ｍ_ｗ）を示す。ＰＧＡの酸触媒加水分解の反応スキームを示す。 Straumann（登録商標）EmdogainのｐＨ対２〜８℃での貯蔵時間を示す。 Straumann（登録商標）EmdogainのｐＨ対異なった温度での貯蔵時間を示す。２〜５℃の範囲での擬一次反応速度定数のＰＧＡ濃度依存性を示す。ＰＧＡの質量平均分子量の閾値が、ポルランの検量標準に対してＧＰＣで測定して、１３５ｋＤａより大きく（図６Ａ）、及び１４０ｋＧａ大きくなり得る（図６Ｂ）。ｅ−ビーム照射線量の関数としての比較例のManucol(登録商標)エステルＢ− Kelcoloid(登録商標) Oを示す。ＰＧＡ濃度とStraumann（登録商標）Emdogainの耐久性の関係を示す。ｐＨ規格（３．５）が、Emdogain対滅菌ＰＧＡ（即ち、ｅ−ビーム滅菌ＰＧＡ）濃度の寿命を決定した。滅菌ＰＧＡのＭ_ｗが、１８５ｋＤａなど、１３５ｋＤａを超えるときの滅菌ＰＧＡの分子量（Ｍ_ｗ）とEmdogainの貯蔵安定性の関係を示す。参照として、Ｍ_ｗが１１７ｋＤａを有する滅菌ＰＧＡを用いた。滅菌ＰＧＡのＭ_ｗが１３５ｋＤａであるとき、滅菌ＰＧＡの分子量（Ｍ_ｗ）とEmdogainの貯蔵安定性の関係を示す。

定義：
ＡＬＧは、非滅菌のＰＧＡに対して本明細書において使用される略号である。
ＡＬＧＳは、ｅ−ビームを用いて滅菌した滅菌ＰＧＡに対して本明細書で使用される略号である。

この文脈において、「被検体」は、鳥類、爬虫類、哺乳類、霊長類及びヒトなどのいかなる脊椎動物も対象とする。

ＰＧＡはいくつかの異なった名称：プロピレングリコールアルギナート、アルギン酸ヒドロキシプロピル、プロパン−１，２−ジオールアルギナート又はＥ４０５を有する。

本文脈において、「製剤」は、「組成」に代替できる。

本文脈において、「ｅ−ビーム」は電子線を意味し、また、電子の流れである陰極線とも呼ばれている。Ｅ−ビーム滅菌は、殺菌法として用いられる。

用語の非滅菌のプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）は、本文脈において、食品グレードのＰＧＡ、粗製ＰＧＡ、医学グレードのＰＧＡ及び工業グレードのＰＧＡを含むことを意味する。

滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）は、本明細書において、好ましくは、少なくとも２５０ｋＤａで、２５０〜５００ｋＤａの間の質量平均分子量（Ｍ_ｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡのｅ−ビーム滅菌から得られる。あるいは及び互換的に、滅菌ＰＧＡは、少なくとも２５０ｋＤａの初期質量平均分子量（Ｍ_ｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡのｅ−ビーム滅菌から得られる。滅菌ＰＧＡの質量平均分子量（Ｍ_ｗ）は、１３０ｋＤａより高く、１３０〜５００ｋＤａの間である。

本文脈における滅菌は、非滅菌のＰＧＡを調製し、そして約２５〜３０ｋＧｙの範囲の線量を用いて滅菌することにより達成でき、上記線量は少なくとも２５ｋＧｙであるべきである。滅菌方法は次のステップ：
１）無菌性の保証水準（ＳＡＬ）を選択する（１０^-6）；
２）滅菌したサンプルに対する全バイオバーデンを計算する；
３）サンプルはｅ−ビームを用いて滅菌する；
ことを含む。ｅ−ビーム線量の選択は、ステップ２）の計算を基礎とする。方法はＩＳＯ規格１１１３７−２（２００６）に従う。用語「無菌性の保証水準」は、滅菌後の対象物上における単細胞の生存可能な微生物の発生確率であり、そして用語「バイオバーデン」は、製品の上又は中において生存可能な微生物の個体数である。前記ＰＧＡは、粉末として滅菌され、そして得られた製品は無菌環境下で、賦形剤と混合される。あるいは、非滅菌のＰＧＡ粉末は、無菌環境下で、賦形剤と混合され、そしてその後、滅菌される。しかし、その他の一般的に公知の滅菌方法も、当業者に知られた通り、非滅菌ＰＧＡ又は非滅菌ＰＧＡを含む混合物を滅菌するために使用することができる。

正確な値が与えられても、これらの値も、また、これらの値からの誘導値を含むことは本文脈を通して当然である。

ＰＧＡ（滅菌、及び非滅菌の両方）の質量平均分子量は、本発明において、ポルランのモル質量を標準として用いたサイズ排除クロマトグラフィにより決定されるが、しかし、万能較正など、固有粘度の測定などの他の方法を分析のために使用するとき、質量平均分子量は、他の用語で特定され、そして、当業者に公知の他の値を有することもあり得る。

本発明は、精製したエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤の驚くべき発見に関し、ここで、滅菌ＰＧＡは、２５０〜５００ｋＤａの間の初期質量平均分子量（Ｍ_wo）を有する非滅菌のＰＧＡから得られ、時間と共により安定であり、特に、ｐＨが時間と共により安定となる。滅菌ＰＧＡの質量平均分子量は、１３０ｋＤａより大きく、１３０〜５００ｋＤａの間である。滅菌ＰＧＡはｅ−ビーム滅菌から得られてもよい。

精製したエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び滅菌プロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む事前に知られた製剤の製造に採用したＰＧＡは、５０〜１７５ｍＰａ・ｓ（２％水溶液、２２℃、Brookfield粘度）の粘度を有し、即ち、それは「低粘度」である。これらの製剤は、低温でも時間と共に急速なｐＨの低下に起因して、安定性の欠如に見舞われる。それ故、製品の急激な酸性化を避けるために、製品は低温で、即ち、２〜８℃の範囲の温度で貯蔵し、輸送しなければならない。更に、前記ＰＧＡは、２１０〜２４５ｋＤａの間の初期質量平均分子量を有し、それは約２３０ｋＤａで、又は２４５ｋＤａ以下であることを意味している（表１参照）。

高い質量平均分子量を有する滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む製剤は、より安定であり、そして温度に感度の低いｐＨを有していることを驚くべきことに見出した。これは時間と共に貯蔵安定性の高い製剤に導く。高い質量平均分子量を有するプロピレングリコールアルギナートの例としては、商標名Kelcoloid （登録商標）O, Kelcoloid（登録商標） NF 及び Manucol（登録商標）Ester Mで市販されているものがある。Kelcoloid （登録商標）Oのバッチ番号9B02535は、高い質量平均分子量を有するプロピレングリコールアルギナートの追加の例である。

Kelcoloid （登録商標）Oに加えて、商品名：Kelcoloid （登録商標）HVF、Kelcoloid （登録商標）LVF及びKelcoloid (登録商標)Sなどの利用可能な、Kelcoloid （登録商標）の異なったグレードも存在する。これら製品シートに基づくグレードは、主として、水溶液の粘度、エステル化度、及びｐＨにおいて、互いに識別する。前記ＰＧＡのエステル化度は、約７０、約８０など高い。

本発明は、薬局方の全ての要求事項を果たし、同一粘度、同一初期ｐＨ及びほぼ同一のエステル化度を有するカルボキシル基を含み、Straumann（登録商標）Emdogain 製剤、及びStraumann（登録商標） Emdogain Plus 製剤に使用され、及び使用されるべき異なったＰＧＡは、時間と共に異なった貯蔵安定性をもたらし得るという、驚くべき発見を基礎としている。この驚くべき発見は、最終生成物のｐＨ安定性がＰＧＡの質量平均分子量に関連する使用ＰＧＡの品質に依存することを有している。それ故、ＰＧＡの酸触媒による加水分解率と担体ＰＧＡの質量平均分子量の間の関係が驚くべきことに判明した。

それ故、本発明は、より安定した、より寿命の長い製剤は、前記製剤で使用したＰＧＡの加水分解の程度を注意深く選択することにより得ることができるという驚くべき知見を基礎としている。また、本発明は、精製したエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質、及び以前に使用したものを超える初期質量平均分子量を有するＰＧＡを含む製剤は、より安定性があり、より耐久性が長くなるという知見を基礎としている。

それ故、本発明の製剤及び特定品質のＰＧＡの使用により避けることができる一つの問題は、前記製剤に対する貯蔵期間及び耐久性が保証できることである。経済的観点より、製剤に使用するＰＧＡの分子量を特定し、測定することは都合がよく、それにより、製剤包装の長い有効期間を保持できる。

高い質量平均分子量（Ｍ_ｗ）、即ち、滅菌したときの質量平均分子量が１３０ｌＤａより高く、質量平均分子量が１３０〜５００ｋＤａ、１３０〜４５０ｋＤａ、１３０〜４２０ｋＤａ、２００〜４５０Ｄａ又は１３０〜２５０ｋＤａの範囲を有するＰＧＡの品質は、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質を含む製剤において望ましいということが今判明した。前記質量平均分子量は、また、１３０〜５５０ｋＤａの範囲内であってもよい。質量平均分子量は、また、１３０より高く、１３５、１４０、１５０、１８又は１８５ｋＤａを超えるか又はそれに等しくてもよい。

ｐＨ安定性は、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及びＰＧＡを含む製剤の最も重要なパラメータであり、そして生成物の耐久性に影響を与え、そして、また、輸送、即ち、製剤が、温度と時間に関していかに輸送されるかに関する重要な影響を有する。ｐＨは時間と共に低下し、そして低下速度が製剤の耐久性に影響を与え、ｐＨがより速く低下すればするほど、製剤がより速く安定性を低下させる。

更にその上、また、高い質量平均分子量を有するＰＧＡを用いることが、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質を含む製剤において、良好に濃縮した（ゲル化した）挙動を有する前記製剤を提供することが驚くべきことに判明した。また、高い質量平均分子量を有するＰＧＡを用いることは、ＰＧＡ濃度が少なくてすむので、良好なｐＨ安定性を有する前記製剤を提供するであろう。本発明によると、特許請求範囲の製剤における滅菌ＰＧＡの濃度は、６質量／体積％（ｗ／ｖ％）以下である。更に、滅菌ＰＧＡの濃度は、３〜５ｗ／ｖ％、３〜４ｗ／ｖ％などの、３〜６ｗ／ｖ％の範囲内である。更に、滅菌ＰＧＡの濃度は、３、３．５、４、４．５、５，５．５又は６ｗ／ｖ％などである。

従って、本発明は、貯蔵安定性のある、安定なエナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を含む、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤に関し、ここで、前記製剤は、３ｗ／ｖ％〜６ｗ／ｖ％範囲など、６ｗ／ｖ％以下の滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含み、そして、滅菌ＰＧＡは、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａを超えるか又はそれに等しい、１３０〜２５０ｋＤａの範囲の質量平均分子量（Ｍ_ｗ）を有する。

特に、前記薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘誘導体蛋白質を、少なくとも、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、８０又は９０％など、少なくとも６０〜９０％のアメロゲニンを含み、１８〜２５ｋＤａ、２０〜２４ｋＤａ、２０〜２２ｋＤａの間、及び２０ｋＤａから成るグループから選択される質量平均分子量を有する製剤である。

本発明に記載の、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を含む、現在入手可能な同様の製剤より、時間と共により安定であり、即ち、それは、少なくとも２４ヶ月、少なくとも、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０ヶ月など、少なくとも１８ヶ月の期間に亘って、好ましくは、２〜８℃範囲の温度で、ｐＨ３．５を超えるｐＨ値を有するが、しかし高い温度も同様に使用できる。本発明の実施態様によると、本発明の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は安定であり、即ち、それは、少なくとも３６ヶ月など、少なくとも３４ヶ月の期間に亘ってｐＨ３．５を超えるｐＨ値を有する。

本発明に記載の、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を含む、現在入手可能な同様の製剤より、時間と共により安定であり、即ち、それは、少なくとも２４ヶ月など、少なくとも１８ヶ月に亘ってｐＨ３．５を超えるｐＨ値を有する。本発明の製剤は、好ましくは、２〜８℃の温度範囲で保持される。しかし、本発明の製剤は、高い温度でも同様に保持できる。

滅菌ＰＧＡは、非滅菌ＰＧＡのe−ビーム滅菌より得られる。それ故、一実施態様において、本発明は、特に、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤に関し、ここで、滅菌ＰＧＡは、２５０〜５００ｋＤａの範囲の初期質量平均分子量（Ｍ_ｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡのｅ−ビーム滅菌など、少なくとも２５０ｋＤａの初期質量平均分子量（Ｍ_ｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡのｅ−ビーム滅菌から得られる。適用したｅ−ビーム滅菌線量は、本文脈において、約２５〜３０ｋＧｙの範囲の線量から選択され、前記線量は少なくとも２５ｋＤｙである。

更に、本発明は、初めて、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤の製造方法を開示し、その結果、それに関し、前記方法は、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を発育する哺乳類の歯から単離すること、２５０ｋＤａを超える初期質量平均分子量（Ｍ_Ｗｏ）を有する非滅菌のＰＧＡをｅ−ビーム滅菌すること、そして両成分を混合することで特徴付けられる。

結果として、本発明は、また、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質、及び１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａを超えるか、又は等しいなど、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量を有する滅菌プロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤に関し、ここで前記製剤は、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を発育期の哺乳類の歯から単離すること、２５０〜５００ｋＤａの範囲の初期質量平均分子量を有する非滅菌ＰＧＡをｅ−ビーム滅菌すること、及び両成分を混合することを含む方法により製造される

一つの実施態様において、本発明は、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤を製造するために２５０〜５００ｋＤａの範囲の初期質量平均分子量（Ｍ_ｗｏ）を有する非滅菌のＰＧＡの使用に関し、ここで、滅菌ＰＧＡの質量平均分子量（Ｍ_ｗ）は、１３５ｋＤａを超える、又はそれに等しい、１８５ｋＤａを超える、又はそれに等しいなど、１３０ｋＤａを超える、そしてここで、前記製剤は、少なくとも２４ヶ月、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０ヶ月など、少なくとも１８ヶ月の期間に亘って、３．５を超えるｐＨ値を有する。製剤は、好ましくは、２〜８℃の温度範囲で保持される。しかし、高い温度もまた同様に使用できる。

本発明は、また、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤を製造するために、２５０〜５００ｋＤａの範囲の初期質量平均分子量（Ｍ_ｗｏ）を有する非滅菌のＰＧＡをｅ−ビーム滅菌して使用することに関し、ここに、滅菌ＰＧＡの質量平均分子量（Ｍ_ｗ）は、少なくとも１３５ｋａ、少なくとも１８５ｋＤａなど、１３０ｋＤａより高く、そしてここに、前記製剤は、少なくとも２４ヶ月など、少なくとも１８ヶ月の期間に亘って３．５を超えるｐＨ値を有する。製剤は、好ましくは、２〜８℃の温度範囲に保持される。しかし、を超える温度も同様に使用できる。

本発明に記載の、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び滅菌ＰＧＡの組合せ全質量を基礎とし、他の賦形剤を含めず、質量／体積比で、９３％〜約９８％、９４％〜約９７％。及び９５％〜約９６％の範囲で、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を含む。

本発明は、また、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及びＰＧＡを含む薬学的製剤に関し、ここで、滅菌前のＰＧＡは、２５０〜５００ｋＤａの範囲の質量平均分子量（Ｍ_ｗｏ）、又は、本明細書で定義した二つ又はそれ以上のＥＭＤ蛋白質の組合せを有す。そのような薬学的製剤は、場合により、また、薬学的に許容可能な担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む。

一つの実施態様において、本発明に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、更に、アニオン性表面安定剤、カチオン性表面安定剤、両性イオン表面安定剤及びイオン性表面安定剤から成るグループから選択できる少なくとも二つの表面安定剤を含む。

本発明に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、医薬品において使用できる。そのような意図した使用のために、前記製剤は、経口、肺内、直腸、眼内、結腸、非経口、大そう内、膣内、腹腔内、局所、頬内、鼻腔内、及び局所投与から成るグループから選択されるいかなる投与に対しても製剤化できる。その意図した投与ルートによると、製剤は、液体分散剤、経口懸濁剤、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏剤、クリーム剤、放出制御製剤、ファーストメルト製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、及び混合型即時放出及び制御放出製剤より成るグループから選択される投薬形態に製剤化される。

更に、本発明に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、一つ又はそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤（一つ又は複数の）、薬学的に許容可能な担体（一つ又は複数の）、又はそれらの組合せ並びに一つ又はそれ以上の非エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質活性剤を含むことができる。

薬学的製剤は、本文脈において、また、化粧品製剤並びに薬剤と化粧品の間のいわゆる灰色領域に属する組成物、即ち、薬用化粧品を包含する。

薬学的製剤は、例えば、固体、半固体、又は流体製剤の形体であってもよく、例えば：
−送達デバイス、インプラント；
−粉末、顆粒、ペレット、カプセル、アガロース又はキトサンビーズ、微小粒子、ナノ粒子；
−スプレイ、エアゾール、吸入デバイス；
−ゲル、ヒドロゲル、ペースト、軟膏、クリーム、石鹸、歯磨きペースト；
−溶液、分散液、懸濁液、乳化液、混合物、ローション、マウスウオッシュ、シャンプー、浣腸剤；
−例えば、二つの分離した容器を含むキット；
である。ここで、容器の初めの一つが、場合により他の活性薬物物質（一つ又は複数の）及び／又は薬学的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤と混合した本発明の製剤を含み、そして、第二の容器は、即製の製剤を得るために、使用前に第一の容器に添加する目的の好適な媒体を含む。

本発明の製剤は、外科手術中の使用に対して、例えば、ゲル、フィルム又は乾燥ペレットの形体で、又はすすぎ液として、又はペースト若しくはクリームによる処置としての局部適用（例えば、口腔内で）に対して好適であり得る。

製剤は、従来の薬学的実践に基づき製剤してもよく、例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences”及び“Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”, edited by Swarbrick, J. & J. C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988を参照されたい。

本発明の製剤は、例えば、義歯、補綴、インプラント、及び口腔、鼻腔、膣腔などの体腔に適用してもよく、特に、歯科的／歯科学的領域内での適用が想定される。

薬学的に又は化粧品的に許容可能な賦形剤、担体及び／又は希釈剤は、製剤が投与される個人に対して実質的に安全である物質である。そのような賦形剤、担体及び／又は希釈剤は、通常は国の衛生当局により指定した要求事項を達成する。例えば、英国薬局方、米国薬局方及びヨーロッパ薬局方などの公式の薬局方は、薬学的に許容される賦形剤に対して基準を設定する。

薬学的に許容可能な賦形剤が薬学的製剤の使用に適しているか否かについては、一般的に、どのような種類の投与形体が選択されるかに依存する。以下に、本発明に記載の使用に対して、異なった種類の製剤での使用用の適切な薬学的に許容可能な賦形剤の例を示す。

本発明に記載の使用用の組成において、薬学的に許容可能な賦形剤（一つ又は複数の）及びその最適濃度の選択は、一般的に予測できない、そして、最終組成の実験評価を基礎として決定しまければならない。しかし、薬学的製剤の当業者は、例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences”, 18th Edition, Mack Publishing Company, Easton, 1990に指針を見つけることができる。

薬学的に許容可能な賦形剤は、溶媒、緩衝剤、防腐剤、保湿剤、キレート化剤、酸化防止剤、安定剤、乳化剤、懸濁剤、ゲル形成剤、軟膏基材、浸透促進剤、香料及び皮膚保護剤を含んでもよい。

溶媒の例としては。例えば、水、アルコール、植物油又は魚油（例えば、アーモンド油、ひまし油、カカオ脂、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、亜麻仁油、オリーブ油、パーム油、ピーナツ油、けし油、なたね油、ゴマ油、大豆油、ひまわり油、及び茶種油などの食用油）、鉱物油、脂肪油、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、流動ポリアルキルシロキサン及びそれらの混合物がある。

緩衝剤の例としては、例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、リン酸水素（hydrogenphosphoric acid）、ジエチルアミンなどがある。

本発明に記載の製剤の使用に対して好適な防腐剤の例としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル、プロピル、ブチルパラベン、イソブチルパラベン、イソプロピルパラベンなどのパラベン；ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、安息香酸、安息香酸メチル、フェノキシエタノール、ブロノポール、ブロニドックス、ＭＤＭヒダントイン、イソプロピニルブチルカルバメート、ＥＤＴＡ，ベンザルコニウムクロリド及びベンジルアルコール、又は防腐剤の混合物がある。

保湿剤の例としては、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、乳酸、尿素及びそれらに混合物がある。

キレート化剤の例としては、ナトリウムＥＤＴＡ及びクエン酸がある。

酸化防止剤の例としては、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アスコルビン酸及びその誘導体、トコフェロール及びその誘導体、システイン及びその混合物がある。

乳化剤の例としては、天然ゴム、例えば、アカシアゴム又はトラガカントゴム；天然リン脂質、例えば、大豆レシチン、ソルビタンモノオレアート誘導体；羊毛脂；羊毛アルコール；ソルビタンエステル；モノグリセリド；脂肪アルコール；脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸のトリグリセリド）；及びそれらの混合物がある。

懸濁剤の例としては、例えば、及びナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース（例えば、Avicel（登録商標）RC 591 、メチルセルロース）などのセルロース及びセルロース誘導体；カラギーナン；アカシアゴム、アラビアゴム、キサンタンゴム、又はトラガカントゴム、及び、その、例えば、アカシアゴムとの混合物などの天然ゴム；例えば、アルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩及びキトサンなどのセルロースがある。

ゲル基剤、粘度上昇剤、又は傷口から浸出液を取り出すことができる成分としては、流動パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、コロイド状シリカ又はアルミニウム、亜鉛石鹸、グリセロール、プロピレングリコール、トラガカント、カルボキシビニル高分子、マグネシウム−アルミニウムシリケート、Carbopol（登録商標）；例えば、澱粉又は例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及び他のセルロース誘導体などのセルロース誘導体などの親水性高分子；水膨潤性の親水コロイド、カラギーナン、ヒアルロン酸塩（例、場合により塩化ナトリウムを含むヒアルロン酸塩のゲル）及びプロピレングリコールアルギナートを含むアルギナートがある。

本発明に記載の製剤において使用するためのゲルの他の例としては、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、デキストラン硫酸塩、できストロース、ヘパラン硫酸塩、ジェラチンなどのヒドロゲルを含む。

軟膏基剤の例としては、例えば、蜜蝋、パラフィン、セタノール、パルミチン酸セチル、植物油、脂肪酸のソルビタンエステル（Span）、ポリエチレングリコール及び脂肪酸のソルビタンエステルとエチレンオキシド間の縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Tween）がある。

疎水性又は水−乳化軟膏基剤の例としては、パラフィン、植物油、動物油脂、合成グリセリド、ワックス、ラノリン、及び液状ポリアルキルシロキサンがある。

親水性の軟膏基剤の例としては、固体マクロゴール（ポリエチレングリコール）がある。

軟膏基材のその他の例としては、トリエタノールアミン石鹸、硫酸化脂肪アルコール及びポリソルベートがある。

粉末成分の例としては、アルギナート、コラーゲン、ラクトース、傷口に適用したとき、ゲルを形成することができる粉末（液体／傷口浸出液を吸収する）がある。通常、大きい傷口に適用することを意図した粉末は、滅菌し、そして存在する粒子は微粉化しなければならない。

他の賦形剤の例としては、カルメロース、ナトリウムカルメロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ペクチン、キサンタンゴム、ローカストビーンゴム、アカシアゴム、ジェラチン、カルボマ、ビタミンＥなどの乳化剤、グリセリルステアラート、セタニルグルコシド、コラーゲン、カラギーナン、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、及びキトサンなどの高分子である。

好適な分散又は湿潤剤は、例えば、天然リン脂質、例えば、レシチン又は大豆レシチン；エチレンオキシドと、例えば、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール又は脂肪酸とヘキシトール又はヘキシトール無水物から誘導した部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアラート、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートなどがある。

本発明に記載の薬学的製剤におけるＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質の濃度は、当業者なら容易に理解する様に、製剤の目的用途に依存して変わる。一般的に、薬学的製剤におけるペプチドの濃度は、０．０５〜９０ｍｇ／ｍｌなど、０．０５〜８０ｍｇ／ｍｌなど、１〜７０ｍｇ／ｍｌなど、５〜６５ｍｇ／ｍｌなど、１０〜６０ｍｇ／ｍｌなど、１５〜５５ｍｇ／ｍｌなど、２０〜５０ｍｇ／ｍｌなど、２５〜４５ｍｇ／ｍｌなど、２５〜４０ｍｇ／ｍｌなど、２６〜３９ｍｇ／ｍｌなど、２７〜３６ｍｇ／ｍｌなど、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６ｍｇ／ｍｌなどの、０．０１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲内である。被検体の生体内に適用する量は、一般的に、約１μｇ／ｃｍなどの、約１０ｎｇ／ｃｍ²〜０．１ｍｇ／ｃｍ²である。

精製したエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により分離可能な３つの主要蛋白質画分を含む。これらの画分は、画分Ａ、Ｂ及びＣとそれぞれ命名される。分離した及び／又は精製した蛋白質の一般的な量比は、主蛋白質２０、１４、及び５ｋＤａのピークにおいて、それぞれ約８０／８／１２である。

上記の通り、画分Ｃは、一般的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した通り、約５ｋＤａ、４ｋＤａ及び３，５ｋＤａなどの、約３．５ｋＤａ〜５ｋＤａの間の分子量を有する。画分Ａは、一般的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した通り、約２０ｋＤａの分子量を有する。画分Ｂは、一般的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した通り、約１５ｋＤａ、１２ｋＤａ、１０ｋＤａ及び６ｋＤａなど、約６ｋＤａ〜１５ｋＤａの間の分子量を有する。

ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質は、アメロゲニン、エナメリン、房状蛋白質、プロテアーゼ及びアルブミンなどの多数の蛋白質より成る。ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質の主要構成成分（高々、約９０％）であるアメロゲニンは、選択的スプライシング及び制御したポスト分泌腺処理による単一遺伝子から誘導可能な疎水性蛋白質のグループである。それらは脊椎動物の進化を通して高度に保存され、そして調査した全ての高等脊椎動物中、高レベルの配列相同性を示す（８０％）。事実、ブタ及びヒトのアメロゲニン遺伝子転写産物の配列は、基盤の４％が異なるのみである。それ故、エナメル基質蛋白質又はＥＭＤ蛋白質は、ブタ起源ではあるが、ヒト体内に遭遇するとき、「同一のもの」と見なされ、そして、アレルギ応答又は他の望ましくない反応を引き起こすことなく、ヒトにおいて歯科的再生を促進できる。

本文脈において、精製したエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質は、それ故、少なくとも、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０％などの、少なくとも、６０〜７０％で、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ｋＤａ、又は２０〜２２、２０〜２４若しくは２０〜２３ｋＤａなど、２０〜２５ｋＤａの分子量を有するアメロゲニンを含むエナメル基質蛋白質と定義される。一般的に、精製した及び／又は分離したエナメル基質蛋白質の量比は、画分Ａ，Ｂ及びＣの主要蛋白質ピーク間で、７５〜８５／５〜１２／５〜１５など、又は少なくとも８０％、少なくとも８％及び少なくとも５％などの、約８０／８／１２である。少なくとも、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、８０、７０〜９０、６０〜７０、７０〜８０又は８０〜９０％など、約６０〜９０％の精製した及び／又は単離したエナメル基質蛋白質は、アメロゲニン及び／又はアメロゲニン誘導体の断片である。

本発明において、ローカルアルゴリズムプログラムは、蛋白質の同定を決定するのに最もよく適している。ローカルアルゴリズムプログラム（Smith-Watermanなどの）は、一つの配列における部分配列を、第二の配列における部分配列と比較し、そして最大の総類似性スコアをもたらす部分配列とこれら部分配列の配列比較（alignment）の組合せを見つけた。内部にギャップがあれば、それは不利になる。ローカルアルゴリズムは、単一領域又は共通の結合サイトを有する二つの多領域蛋白質を比較するのに十分機能する。

同一性及び類似性を決定する方法は、公的に利用可能なプログラムが制定される。二つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラムの方法としは、ＧＣＧプログラムパッケージ (Devereux, J et al (1994)) BLASTP, BLASTN, and
FASTA (Altschul, S.F. et al (1990))が挙げられるが、それに限定されない。BLASTXプログラムは、NCBI及び他の出所(BLAST Manual, Altschul, S.F. et al, Altschul, S.F. et al (1990))から、公的に利用可能である。別の好ましい例は、Clustal W (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)である。各々の配列分析のプログラムは、デフォルト・スコアリング・マトリックス及びデフォルト・ギャップ・ペナルティを有する。一般的に、分子生物学者は、使用したソフトウエアプログラムにより確立した初期設定を使用することが期待される。

ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質中のアミノ酸は、更に、蛋白質の配列が無傷である限り、化学、等長変換、又はその他いかなる方法によっても改質され得る。ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質中のアミノ酸の改質は、蛋白質の活性、安定性、生体適応性又は臨床実績を向上させ、又は毒性及び蛋白質に対する副作用を低下させ得る。化学的改質の例としては、グリコシル化及びメチル化を含むが、それに限定されない。アミノ酸は、また、アミノ酸のＤ若しくはＬ体又はＳ若しくはＲ異性体などの全ての異なった立体異性形体であってもよい。本発明のＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質におけるアミノ酸は、また、その合成の類似体で代替してもよい。合成類似体の活用は、より安定で、そしてより分解し難いＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質をもたらすかもしれない。非天然のアミノ酸の例としては、α^*、及びα−二置換^*アミノ酸＊、Ｎ−アルキルアミノ酸^*、乳酸^*；トリフルオロチロシン^*、ｐ−Ｃｌフェニルアラニン^*、ｐ−Ｂｒフェニルアラニン^*、ｐ−Ｉフェニルアラニン^*などの天然アミノ酸のハライド誘導体；Ｌ−アリルグリシン^*、β−アラニン^*、Ｌ−a−アミノ酪酸^*、Ｌ−ｇ−アミノ酪酸^*、Ｌ−a−アミノイソ酪酸^*、Ｌ−ｅ−アミノカプロン酸＃、７−アミノヘプタン酸^*、Ｌ−メチオニンスルホン＃^*、Ｌ−ノルロイシン^*、Ｌ−ノルバリン^*、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン^*、Ｌ−ヒドロキシプロリン＃、Ｌ−チオプロリン^*；４−メチル−Ｐｈｅ^*、ペンタメチル−Ｐｈｅ^*などのフェニルアラニンのメチル誘導体；Ｌ−Ｐｈｅ（４−ａｍｉｎｏ）＃、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）^*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）^*、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸）^*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸＃；及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）^*が挙げられる。本明細書において、記号^*は、誘導体の疎水性の性質を表示するために活用され、一方、＃は、誘導体の親水性の性質を表示するために活用され、＃^*は、両親媒性の特性を表示する。

ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質は、更に、アミノ酸Ｈｉｓ及び／又はＭｅｔを含むＮ−及び／又はＣ−末端標識を含む。Ｍｅｔは、以前に説明した通り、金属表面と結合することを容易にする硫黄を含む。Ｈｉｓは、例えば、Ｎｉ及び他の金属に対して強力な親和性を有する。従って、この標識の使用は、チタン、ジルコニウム、アルミニウム、タンタル、金、外科的な鋼材及びニッケルなどの金属表面に、又は金属酸化物，水酸化物及び／又は水素化物表面などに、蛋白質を結合するための利点を有する。それらが例えば医療用人工器官の生体内鉱物形成及び／又は骨結合を改良するために使用するときなど、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質が金属表面に取り付けられるとき、これは非常に重要である。Ｃ−及び／又はＮ−末端の標識は、また、当業者には公知の通り、生成した蛋白質の精製方法において有用である。Ｃ−及び／又はＮ−末端の標識の使用は、また、蛋白質を完全に曝露されることを可能し、即ち、標識は蛋白質を表面に結合するために使用され、そして蛋白質の残りは、例えば、原子、分子、細胞及び組織との相互作用に関係ない。ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質の各々の端部において一つの標識を使用することが、蛋白質の製造中に有用であるかもしれず、不完全な蛋白質生成物から関心ある蛋白質を精製中、ペプチドの一端をカラムに取り付けることを可能にし、一方、蛋白質の他端は、対象物の表面に結合するために使用してもよい。結果として、本発明の一つの好ましい実施態様は、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質を、更に、Ｎ−末端及び／又はＣ−末端ヒスチジン標識を含んでなる製剤に関する。そのような標識は、以前に記載した通り、本発明に記載のＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質に取り付けられたメチオニン及び／又はヒスチジン残基を含む。好ましい実施態様において、この標識は、３〜５個又は５〜１０個の残基など、３個又はそれ以上の残基を含む。標識は、本発明に記載のＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質を共に有し、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質の二次構造に間違った方法（negative manner）では影響を与えない安定製剤のために、尚(still)、提供するいかなる量の残基も含むことができる。好ましくは、このヒスチジン標識は、５個のヒスチジン残基より成る。別の好ましい実施態様において、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質は、好ましくは、５個のメチオニン残基より成るＮ−末端及び／又はＣ−末端メチオニン標識を含む。別の好ましい実施態様において、製剤は、そのＣ−又はＮ−末端においてメチオニン標識を、そして他端においてヒスチジン標識を含むＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質を含む。

一つの実施態様において、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質は、天然源から単離する代わりに、例えば、合成的製造又は生合成により製造される。ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質又はその断片は、化学合成による合成的製造などのペプチド製造のためのいかなる公知の方法によっても製造してもよい。合成的製造は、また、製造した蛋白質又はその断片の安定性を改良することを可能にする。当業者は、アミノ酸配列の合成のために利用可能な方法を知っている。

好ましくは、生物学的製造は、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質又はその断片を製造するための方法として使用してもよい。生物学的製造は、細胞培養又は、例えば、バクテリア細胞などの微生物細胞中での培養など生物学的システムにおけるアミノ酸配列の製造を意味する。生物学的製造のために、特定アミノ酸配列をエンコードする対応核酸配列を構成することは必要である。当業者は、合成すべき特定のアミノ酸配列が決定されると、そのような核酸配列をいかにして構築するか、そしてＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質又はその断片をいかにして製造し、そしてそれを製造するために使用されるシステムから、いかにしてそれを精製するかを容易に知るであろう（参照：例えば、Svensson J, Andersson C, Reseland JE, Lyngstadaas SP, Bulow L：Histidine tag fusion increase expression levels of active recombinant Amelogenin in Escherichia coli.(Protein Expr Purif, 48; 134-41 (2006))。

本文脈における医療用人工器官は、脊椎動物、特に、哺乳類、特にヒトの体内に移植することを意図するいかなるデバイスにも関する。本文脈における医療用人工器官は、生体組織を代替するために及び／又は体内のいかなる機能も回復ために使用し得る。そのような器官の非限定の例としては、大腿骨股関節；大腿骨頭；寛骨臼カップ；幹部、楔状部、関節挿入部を含む肘；大腿骨及び脛骨成分、幹部、楔状部、関節挿入部又は膝蓋骨の英語" 膝蓋骨成分を含む膝；幹部及び頭部を含む肩部；手首；足首；手；指；足指；脊椎；椎間板；人工関節；歯科インプラント；耳小骨の英語" 耳小骨インプラント；きぬた骨、つち骨、あぶみ骨、きぬた骨−あぶみ骨、つち骨−きぬた骨、つち骨−きぬた骨−あぶみ骨を含む人工中耳；人工内耳；爪、ねじ、ステープル及びプレートなどの整形外科固定デバイス；心臓弁；ペースメーカ；カテーテル；脈管；空間充填インプラント；補聴器を支持するためのインプラント；外部固定用のインプラント；及び、また、子宮内器具（ＩＵＤｓ）；及び蝸牛内又は頭蓋内の電子デバイスなどのバイオ電子デバイスなどの体の骨格を代替し、体の機能を回復する医療用のデバイスである。

本発明の製剤は、また、粒子を含んでもよく、粒子の例としては、直径で１００〜５００μの範囲内の孔サイズを有する多孔性粒子である。

投与：
本発明に記載の、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、硬組織の再生、組織鉱化、骨成長及び／又は骨再成長、象牙質の再生、セメント質形成を促進し及び／又は誘導するため、及び／又は生鉱化組織の部分間を結合、他の一部の生組織上の結合サイトに一部の生鉱化組織を結合させるため；硬組織間の結合を支持するため；及び／又は処置及び／又は外傷から続く鉱化した創腔及び／又は組織欠損を補うため、に使用できる。

本発明に記載の、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤は、炎症及び／又は感染症の処置及び／又は予防のため、及び／又は全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）の処置のため、軟組織の再生を促進し、及び／又は、誘導することにおいて、あるいは、及び／又は更に使用できる。

結果として、本発明は、更に、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を含む、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤の使用に関し、ここで、前記製剤は、６質量％（ｗｔ）以下の滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含み、そしてここで、前記滅菌ＰＧＡは、薬学的組成物を製造するために；硬組織の再生、組織鉱化、骨成長及び／又は骨再成長、象牙質の再生、セメント質形成を促進し、及び／又は誘導するため、及び／又は生鉱化組織の部分間を結合するために；一部の生鉱化組織を他の一部の生組織上の結合サイトに結合させるために；硬組織間の結合を支持するために；及び／又は処置及び／又は外傷から続く鉱化した創腔及び／又は組織欠損を補うために；並びに軟組織の再生を促進し、及び／又は、誘導するために；及び／又は炎症及び／又は感染症の処置及び／又は予防のために、及び／又はＳＩＲＳの処置のために、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａ以上又はそれと同等の、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量（Ｍ_ｗ）を有する。

また、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を含むを含む薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤の投与を含む方法は、硬組織の再生、組織鉱化、骨成長及び／又は骨再成長、象牙質の再生、セメント質の形成、及び／又は生鉱化組織の部分間を結合する、他の一部の生組織上の結合サイトに生鉱化組織を結合させるために；硬組織間の結合を支持するために；及び／又は、処置及び／又は外傷から続く鉱化した創腔及び／又は組織欠損を補うために；並びに、軟組織の再生を促進し、及び／又は、誘導するために；及び／又は炎症及び／又は感染症の処置及び／又は予防のため、及び／又はＳＩＲＳの処置のために想定され、ここで前記製剤は、６質量／体積％（ｗ／ｖ％）以下の滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含み、そしてここで、前記滅菌ＰＧＡは、その必要な患者に対して、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａより大きく又はそれと同等など、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量（Ｍ_ｗ）を有する。

エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質、及び滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤、ここで滅菌ＰＧＡの質量平均分子量（Ｍ_ｗ）は、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａを超える又はそれと等しいなど、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量（Ｍ_ｗ）であり、それを必要とする被験者に、ペプチドが、投与されるべき組織に依存して、いかなる好適なルートにより、例えば、局所（経皮）、経口、舌下、鼻腔、耳内、直腸内又は膣内投与により、又は歯根、歯根カナル又は骨片などの体腔へ投与され得る。更にその上、本発明の製剤は、外科手術と連結して、例えば、体内における骨折と連結して、投与することに適用してもよい。本発明の製剤は、また、ゲルの適用により局部注射を経由して、又は医療用人工器官、例えば、移植組織、骨格、又はバイオガラス素材などを経由して投与され得る。本発明の製剤をシャンプー、歯科充填材料におけるアルギナート又はキトサン（徐放出用）ビーズ、歯磨きを経由して投与することも、また、可能である。上記で定義した高い質量平均分子量を有するＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及びＰＧＡを含む本発明の薬学的製剤を、例えば、切れ目、歯周損壊部、抜歯小孔内へ、又はサイナスリフト手法で局部的に投与する場合、蛋白質は、骨の治療を改良し、及び／又は、加速し得る。

製剤は、摂食により、鼻腔又は肺により、吸入により、又は血液内、脊髄液内、関節内又は腹腔内への注射により、徐放性製剤としてカプセル化され、そして経口的に送達される。

別の態様において、本発明は、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤を使用することに関し、ここで滅菌ＰＧＡの質量平均分子量（Ｍ_ｗ）は、バイオ鉱物化の誘導のための薬剤の調製をするため、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａより大きく又はそれと同等など、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量（Ｍ_ｗ）である。特に、本発明は、また、骨の形成及び／又は再生のための薬剤の調製のために、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び上記で定義した通りの高い質量平均分子量を有するＰＧＡを含む薬学的製剤の使用に関する。特別の実施態様において、本発明は、また、軟骨、セメント質及び／又は歯の組織の形成及び／又は再生のための薬剤の調製のために、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び上記で定義した通りの高い質量平均分子量を有するＰＧＡを含む薬学的製剤の使用に関する。ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び上記で定義した通りの高い質量平均分子量を有するＰＧＡを含む本発明の薬学的製剤は、骨粗鬆症、骨折、歯周炎、外傷、骨メタボリックシンドローム、歯髄炎、根尖病変などの処置のための薬剤の調製のために使用され得る。

エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤で、ここで滅菌ＰＧＡの質量平均分子量（Ｍ_ｗ）は、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａより大きく又はそれと同等など、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量（Ｍ_ｗ）であるが、骨折の治療のための薬剤を調製のために使用され得る。

本発明の一つの態様は、また、バイオ鉱物化の誘導のために使用するための、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含む薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤に関し、ここで滅菌ＰＧＡの質量平均分子量（Ｍ_ｗ）は、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａより大きく又はそれと同等など、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量（Ｍ_ｗ）である。例えば、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び上記で定義した通り、高い質量平均分子量を有するＰＧＡを含む本発明の薬学的製剤は、軟骨、セメント質及び／又は歯学組織の形成及び／又は再生のための薬剤の調製に使用し得る。

別の態様において、本発明は、骨の形成及び／又は再生のために使用するための、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び上記で定義した通り高い質量平均分子量を有するＰＧＡを含む本発明の薬学的製剤に関する。

尚、別の態様において、本発明は、骨折の治療のために使用するための、ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び上記で定義した通り高い質量平均分子量を有するＰＧＡを含む本発明の薬学的製剤に関する。

ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質は、また、鉱物沈殿及び／又はバイオ鉱物化及び／又はＢＭＰｓなどの骨生成を含む天然蛋白質の組合せで使用し得る。また、バイオ鉱物化を含む鉱物沈殿の誘導及び／又は刺激のために二つ又はそれ以上の組合せを使用することも可能である。

ＥＭＤ蛋白質及び／又はエナメル基質蛋白質及び上記で定義した通り高い質量平均分子量を有するＰＧＡを含む本発明の薬学的製剤は、また、バイオ鉱物化構造の融合のために、又はバイオ鉱物化構造と別の材料との融合のために使用し得る。そのような材料の例としては、チタン及び鋼材、バイオガラス、リン酸カルシウム、アパタイトなどの移植可能なバイオ材料を含む。他の例としては、カラム材料、フィルタ材料などが挙げられる。

本発明に記載の補足の製剤は、カルボキシメチルセルロース及びＰＧＡなどのセルロース誘導体、アルギナートを、更に、含むことができる製剤である。

本発明は、また、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質から成る製剤に関し、ここで、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０％の蛋白質など、少なくとも６０〜７０％の蛋白質は、２０ｋＤａより高くなど、１６、１７、１８又は１９ｋＤａなど、１６〜４０ｋＤａの間の分子量、及び３、４、５又は６ｗ／ｖ％など、３〜６質量／体積（ｗ／ｖ％）程度の、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａを超える又はそれに等しいなど、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量を有する滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を有する。本発明は、また、本質的に、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質から成る製剤に関し、ここで、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０％など、少なくとも６０〜７０％の蛋白質は、２０ｋＤａなど、１６、１７、１８、１９又は２０ｋＤａなど、１６〜４０ｋＤａ間の分子量を有し、そして、３、４、５又は６ｗ／ｖ％など、３〜６質量／体積％（ｗ／ｖ％）程度で、１３５、１４０、１５０、１８０又は１８５ｋＤａを超える又はそれに等しいなど、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量を有する滅菌したプロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を有する。

〔実験部分〕
〔実施例１〕
質量平均分子量（Ｍ_ｗ）：
質量平均分子量は、ＧＰＣ(Agilent社製)を用いたＡＭ−Ｓ０１分析法に基づいて決定し、そしてパラメータは下記の通りであった：
溶出液：リン酸塩緩衝液：ｐＨ７，０；
プレカラム：PSS Suprema：１０μｍ：１００Å：８×５０ｍｍ；
PSS Suprema：１０μｍ：１００Å：８×３００ｍｍ；
PSS Suprema：１０μｍ：１０００Å：８×３００ｍｍ；
PSS Suprema：１０μｍ：１００Å：８×３００ｍｍ；
ポンプ：Agilent１１００；
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ；
自動サンプラ：Agilent１１００、５ομｌ：注入体積付き；
サンプル濃度：２．０、３．０ｇ／Ｌ；
温度：２３℃；
検出器：Aglient１１００Ｒ１；
計算：PSS WinGPC Unity ７．２０版；
計算はポルランのモル質量基準を用いた従来の検量線を基礎とした。

２００２〜２００９年における非滅菌のＰＧＡ及びKelcoloid（登録商標）Oの質量平均分子量を表１で開示した。

この表は、以前に使用したＰＧＡは、２１０〜２４５ｋＤａ間の質量平均分子量を有することを示し、約２３０ｋＤａで、又は２４５ｋＤａ以下であることを意味する。更にその上、この表は、Ｍ_ｗとＭｚ間の差異が以前に使用したＰＧＡより、Kelcoloid（登録商標）O-9B02535の方がはるかに高いことを示している。

〔実施例２〕
Emdogain製剤で使用した滅菌ＰＧＡは、ＩＳＯ−１１３７−２（２００６）基準に基づき、非滅菌ＰＧＡのｅ−ビーム滅菌から得られた。滅菌法は、次のステップを含む：
１．無菌性保証水準（ＳＡＬ）１０^-6（百万分の一）が、ＰＧＡの一滅菌ユニットに適用される（１００ｇＰＧＡ／ポーチ）；
２．全バイオバーデンは、この滅菌ユニット（１００ｇＰＧＡ／ポーチ）に対して計算される：全バイオバーデン＝１００ｇ^*ＣＦＵ／ｇ −→ この滅菌ユニットが、例えば、５０ｇＰＧＡのみのパッキングを変更する場合、全バイオバーデンは減少する；
３．従って、この全バイオバーデンＶＤｍａｘ２５が適用され −→最小２５ｋＧｙ。

ＰＧＡは、ｅ−ビーム照射のコースでは架橋されない。ｅ−ビーム照射により発生する主要な方法は、鎖の分断である。それ故、この場合、ｅ−ビーム線量（Ｒ）の変動による質量平均分子量（Ｍ_ｗ）の変化は、Charlesby式（式１）により簡略化できる。ＰＧＡの初期質量平均分子量（Ｍ_ｗｏ）、適用したｅ−ビーム線量（Ｒ）、及び放射線分解収率（Ｇ_ｓ）が、基本的に滅菌ＰＧＡの分子量（Ｍ_ｗ）を決定する（参照、例えば、図８）。

Ｇ_ｓは、化学的に同一のＰＧＡに対しては一定である。Manucol（ＧｓＭ）Ester B及びKelcoloid（登録商標）O（ＧｓＫ）ＰＧＡの計算値は、偏差範囲内でほとんど同一であった：

ｅ−ビーム線量の検出誤差範囲は、２ｋＧｙであるので、送達した滅菌ｅ−ビーム線量は、Ｒ＝２６．４〜２８．４ｋＧｙの狭い範囲内で検出され（良好な安全マージン（security margin）を提供し）、初期のＭ_ｗｏは、主として滅菌ＰＧＡのＭ_ｗを決定する。Ｍ_ｗｏ＝滅菌ＰＧＡのＭ_ｗ。これは、初期分子量が高い理由である。これは、良好な濃厚特性を有する推進力である。
(T.Q Nguyen, H.H Kausch, J. App. Polym. Sci. 29(1984), p.455) ；
(A. Schiltz, et al, Revue Phys. Appl. 19(1984)439 (439-444))

〔実施例３〕
ＰＧＡの分解は、C.J. Gray. A. J. Griffiths, D. L. Stevenson, J. F. Kennedy; Studies on the Chemical Stability of Propylene Glycol alginates Ester, Carbohydrate Polymers, 1990, 12, 419-430により研究された。彼らは二つのタイプの分解を同定した：
１）カルボン酸とプロピレングリコールを提供するエステル結合の加水分解（ｐＨの変化）；
２）粘度の低下を伴う多糖類骨格におけるグリコシド結合の分解。

酸性条件下で、ＰＧＡのエステル基は、加水分解に対して安定であり、そして多糖類骨格の加水分解のみ起こることを彼らは見つけた。しかし、この声明（statement）は、中庸な酸性条件下(〜ｐＨ３〜５)では証明されていない。高分子骨格の加水分解は、エステルの加水分解並びにｐＨ及び粘度低下が同時に起こる。

エステルの全加水分解速度は、酸触媒による加水分解速度：ｋ_A［エステル][Ｈ⁺］、中性部分の分解速度：ｋ^' _H20［エステル］、及び塩基触媒による分解速度：ｋ_B［エステル］［ＯＨ^-］の個々の分解速度の合計として書くことができる。

ここで、ｋ_A；ｋ^' _H20；ｋ_Bは、反応速度定数であり、［エステル］、［Ｈ⁺］、［ＯＨ^-］は、それぞれ、エステル、プロトン（水素イオン）及びヒドロキシルイオン濃度である。

酸性条件下で、中性及び塩基性触媒による加水分解は、酸触媒反応と比較して無視でき、従って、式１は：

に簡略化できる。

カルボン酸の生成とエステルの消費の間に、偶奇性が存在する（図３）。

結果として、エステルの消費速度は、カルボン酸の生成と同等であり、そして、式２は：

に転換される。

酸生成の全速度は、ｄ［Ｈ⁺］／ｄｔに比例すると考えられ、

を与える。

EmdogainにおけるＰＧＡの加水分解は、エステルの加水分解と類似する。ｐＨ５とｐＨ３の間の［Ｈ⁺］濃度は、二桁変化する。初期ｐＨ（〜ｐＨ５）からｐＨが３．０に低下するときまでの期間におけるエステル濃度の変化は、［Ｈ⁺］の上昇より、はるかに小さい範囲に広がり、その後、［Ｈ⁺］の変化は、エステル濃度の変化より全体の反応速度に大きい影響を表した。簡略化のために、［エステル］は、反応速度定数ｋ_Aに関与し、ｋ^'の擬一次反応速度定数を提供する。

初期［Ｈ⁺］が、［Ｈ₀ ⁺］であると想定して、式５の積分式は：

を与え、
ここで、ｐＨ＝−log［Ｈ⁺］及びｌｎ［Ｈ⁺］＝−２．３０２５^*ｐＨであり、式７は：

と書くことができる。

ここで、ｋ”＝２．３０２５^*ｋ^'は、Emdogain中の滅菌ＰＧＡ加水分解の擬一次反応速度定数であり、ｔはEmdogainの貯蔵時間であり、ｐＨは、時間＝ｔにおける実際のｐＨあり、そしてｐＨ₀は初期ｐＨである。

式８は、ｐＨと貯蔵時間（ｔ）の間に線形の相関関係が存在し、そして、勾配が擬一次反応速度定数（ｋ”）であることを示す。実際、ｐＨが規定の下限値（ｐＨ３．５）に到達するかぎり、この線形性は想定できる（図４）。

ｐＨ３．５を超えると、酸触媒による脱エステル化反応とエステル化反応の平衡挙動は考慮すべきである。平衡ｐＨ（約ｐＨ２．７〜２．８）に近づくと、ｐＨ対時間曲線は平坦になる（図５）。製品の特定許容限界値は、ｐＨ３．５であるので、式８は、特定ｐＨ値内で、ｐＨ変化の全速度を説明するために使用できる。

滅菌ＰＧＡ濃度の反応速度定数に及ぼす影響
モデルを擬一次反応速度式に簡略化するために（式４から式５へ）、エステル濃度［エステル］は、反応速度定数ｋ_Aと合体させる。Emdogainの安定性の手順において（Biora STP記録）、エステル濃度には従わない。式４が式５に転換したときの同様の考察に従って、エステル濃度の変化は、桁が変わるほど広がっていかないので、それは滅菌ＰＧＡ濃度［滅菌ＰＧＡ］により代替できる。

ここで、ｋ^' _A＝２．３０２５^*Ｋ_A酸性ＰＧＡ加水分解速度定数であり、そして、Constは、滅菌なしのＰＧＡ濃度のエステル化速度定数である。後者は、対応するカルボン酸とアルコールのみが溶液に存在するときの酸触媒によるエステル化反応を意味する。

ｋ”と［滅菌ＰＧＡ］間の線形回帰は：

であり、式９及び１４から、ｐＨが初期ｐＨ₀から３．５に低下するまでの時間のおおまかな推測が行える（ｐＨが、Emadogainｔ_pH3.5の寿命又は耐久性を決定）。

式１４から計算した２４ヶ月間の耐久性のために適用される滅菌ＰＧＡ濃度[滅菌ＰＧＡ]は、高温に製品を曝露することなく、２４ヶ月間の規定の要求性能内でｐＨを維持する臨界濃度を証明した。高温が加水分解プロセスを加速した。

温度の反応速度定数に及ぼす影響：
ｐＨ低下に及ぼす温度の影響は明らかである。Straumann（登録商標）Emdogainの昇温への曝露は、ｐＨ低下の全速度を著しく加速させる。反応速度定数(k”)は、Arrhenius式に基づき、温度（Ｔ）により変化し：

対数形式で書くと、

であり、ここで：
Ｒ＝８．３１４４７２Ｊ／（Ｋ^*ｍｏｌ）−一般ガス定数；
Ａは頻度因子であり；
Ｅ_aは反応の活性化エネルギ[J/mol]であり;
ＴはKelvin温度である。

式１０に基づき：

の間で直線関係があり、
直線回帰線から、ｌｏｇＡとＥ_a／Ｒ定数を決定することができる。温度依存性を表２にまとめた。

温度及びＰＧＡ濃度の温度依存性及び酸性化を加速する曝露温度を含めて、６質量／体積％（ｗ／ｖ）％）が、ＥＭＤ−ＰＧＡシステムのｐＨ安定性のための閾値として決定した。適用可能性のために、臨床テストは製剤粘度の要求値を、３．０〜４．０Ｐａ^*ｓ（２２℃、１９：１／ｓ）と証明した。この目的のために、ＰＧＡの質量平均分子量の閾値は、ＧＰＣのポルラン検量基準により測定して、１３０ｋＤａより高くあるべきである。

〔実施例４〕
ＥＭＤ製剤の貯蔵安定性：
サンプル調整：
ＥＭＤ溶液；
濃度３３ｍｇ／ｍｌを有するＥＭＤ溶液は、正規のＥＭＤバルク溶液製造に基づき正規の製造ラインで調製した。溶液は滅菌濾過の後、製造ラインから取り出した。ＥＭＤ溶液は酢酸及び水を含み、そして溶液のｐＨは４．９〜５の間であった。
ＰＧＡ：
Kelcoloid（登録商標）Oは、FMC Biopolymer社から購入した。分子量は既に上記の通り分析した。得られたＭ_ｗ値は上記の表１に示した。ＰＧＡは、ｅ−ビーム滅菌で滅菌した。使用装置：Sterigenics：San Diego；送達したｅ−ビーム線量：２５〜３０ｋＧｙ。得られた滅菌ＰＧＡは、Ｍ_ｗ＝１８４ｋＤａ±１２ｋＤａを有していた。
Emdoqainサンプルの調製：
得られた滅菌ＰＧＡ（３０．０ｇ）は、層流の空気層（ＬＡＦ）で、常温（約２０℃）の条件下で、ＥＭＤバルク溶液（５００ｍＬ）に徐々に加えた。溶液を撹拌し、撹拌は２４時間継続し、その後、停止した。Emdoqain製剤サンプルは、ＬＡＦの条件下で滅菌サンプル管（５０ｍＬ）内に移送した。一サンプルを引出し、ｐＨ及び粘度を測定した：
粘度＝３．０Ｐａ・ｓ（２２℃、１８．９：１／ｓ）（Anton Paar MRC Physica−300レオメータ、構成：CP-25-2 --> シリアル番号：１２５１３）：
ｐＨ＝４．７０（Metrohm780：pH meter：Entrich pH プローブ番号：６．００２２６．１００装備付き）。
得られたサンプルは、調製後、速やかに冷蔵庫に置いた。冷蔵庫の温度は、＋４℃に調節した。温度はサンプルの近辺で制御した。温度のずれは、±２．０℃を超えなかった。
サンプルのｐＨは、１４ヶ月間測定した（図９参照）。
対照サンプル：
ｐＨの安定性データは、Emdogain安定性プログラムから誘導した。データは、ｅ−ビーム滅菌ＰＧＡ：Ｍ_ｗ＝１１７ｋＤａを用いて調製したEmdogainサンプルから選択した。
対照サンプルの名称は、Ｅ７２５４であり：
初期値：粘度：３．０Ｐａ・ｓ（２２℃、１８．９：１／ｓ）及びｐＨ４．５；
粗製ＰＧＡ：Ｍ_ｗ＝２１９ｋＤａ；
滅菌 (ｅ−ビーム処理)ＰＧＡ：Ｍ_ｗ＝１７ｋＤａ；
対照サンプルのｐＨは２４ヶ月間測定した（図９参照）。

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Claims

エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）を含んでなる、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤であって、６質量／体積％（ｗ／ｖ％）以下の滅菌プロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含み、そしてここで、該滅菌ＰＧＡは、１３０ｋＤａを超える質量平均分子量（Ｍｗ）を有する、上記製剤。
滅菌ＰＧＡの質量平均分子量が、１３０〜２５０ｋＤａの間の範囲内にある、請求項１に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
１３０ｋＤａを超える質量平均分子量を有し、３質量／体積％（ｗ／ｖ％）〜６質量／体積％（ｗ／ｖ％）の範囲内の滅菌ＰＧＡを含んでなる、請求項１又は２に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
滅菌ＰＧＡの質量平均分子量が１３５ｋＤａを超えるか又はそれに等しい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
滅菌ＰＧＡの質量平均分子量（Ｍｗ）が、１８５ｋＤａを超えるか又はそれに等しい、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
滅菌プロピレングリコールアルギナートが、少なくとも２５０ｋＤａの初期質量平均分子量（Ｍｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡのｅ−ビーム滅菌より得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
滅菌ＰＧＡが、２５０〜５００ｋＤａの範囲内の初期質量平均分子量（Ｍｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡのｅ−ビーム滅菌より得られる、請求項６に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
適用されるｅ−ビーム滅菌線量が、２５〜３０ｋＧｙの範囲の線量から選ばれる、請求項６又は７に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質は、１８〜２５ｋＤａの間、２０〜２４ｋＤａの間、２０〜２２ｋＤａの間、及び２０ｋＤａから成るグループから選択される平均分子量を有する、少なくとも６０〜７０％アメロゲニンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
前記製剤が少なくとも１８ヶ月に亘って、３.５を超えるｐＨを有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
前記製剤が２４ヶ月の期間に亘って、３.５を超えるｐＨを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
前記製剤が２〜８℃の温度範囲で、３.５を超えるｐＨを有する、請求項１０又は１１に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
製剤が、更に、一つ又はそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、薬学的に許容可能な一つ又は複数の担体又はそれらの組合せを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質の量が、その基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質及び滅菌ＰＧＡの全組合せ質量で、その他の賦形剤を含まない質量に基づいて、９３％〜９８％、９４％〜９７％、及び９５％〜９６％（質量／体積）の範囲内である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
更に、一つ又はそれ以上の非エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質活性剤を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
少なくとも二つの表面安定剤を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
表面安定剤が、アニオン表面安定剤、カチオン表面安定剤、両性イオン表面安定剤及びイオン性安定剤から成るグループから選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
医療において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
製剤が、経口、肺内、直腸、眼内、結腸、非経口、大そう内、膣内、腹腔内、局所、頬内、鼻腔内及び局所投与から成るグループから選択される投与用に製剤化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
液体分散剤、経口懸濁剤、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏剤、クリーム剤、放出制御製剤ファーストメルト製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、及び混合型即時放出及び制御放出製剤より成るグループから選択した投薬形態に製剤化される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
硬組織の再生、組織鉱化、骨成長及び／又は骨再成長、象牙質の再生、セメント質形成
を促進し及び／又は誘導するのに、及び／又は生鉱化組織の部分間を結合するのに使用するため；他の一部の生組織上の結合サイトに一部の生鉱化組織を結合させるため；硬組織間の結合を支持するため；及び／又は処置及び／又は外傷から続く鉱化した創腔及び／又は組織欠損を補うため；の、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
軟組織の再生を促進し及び／又は誘導するのに使用するため、及び／又は炎症及び／又は感染症を処置し及び／又は予防するため、及び／又はＳＩＲＳを処置するため；硬組織の再生、組織鉱化、骨成長及び／又は骨再成長、象牙質の再生、セメント質形成を促進し及び／又は誘導するため、及び／又は生鉱化組織の部分間を結合するため；一部の生鉱化組織を他の一部の生組織上の結合サイトに結合させるため；硬組織間の結合を支持するため；及び／又は処置及び／又は外傷から続く鉱化した創腔及び／又は組織欠損を補うため；の、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤。
軟組織の再生を促進し及び／又は誘導するため：及び／又は炎症及び／又は感染症の処置及び／又は予防のため；及び／又はＳＩＲＳの処置のため；硬組織の再生、組織鉱化、骨成長及び／又は骨再成長、象牙質の再生、セメント質形成を促進し及び／又は誘導するため、及び／又は生鉱化組織の部分間を結合するため；一部の生鉱化組織を他の一部の生組織上の結合サイトに結合させるため；硬組織間の結合を支持するため；及び／又は処置及び／又は外傷から続く鉱化した創腔及び／又は組織欠損を補うため；の薬学的組成物の製造のための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤の使用。
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤を製造する方法であって、次の：
ａ. 発育期の哺乳類の歯から、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を単離する工程；
ｂ. ２５０ｋＤａを超える初期質量平均分子量（Ｍｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡを２５〜３０ｋＧｙの範囲の線量でｅ−ビーム滅菌する工程；及び
ｃ. ａ.から得られた生産物とｂ.から得られた生産物とを混合する工程；
を含んでなることを特徴とする、上記方法。
エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質、及び１３０ｋＤａを超える質量平均分子量を有する滅菌プロピレングリコールアルギナート（ＰＧＡ）を含んでなる、薬学的、歯科的及び／又は化粧品製剤であって、ここで、該製剤が次の：
ａ. 発育期の哺乳類の歯から、エナメル基質蛋白質及び／又はエナメル基質誘導体（ＥＭＤ）蛋白質を単離する工程；
ｂ. ２５０〜５００ｋＤａの範囲の初期質量平均分子量（Ｍｗｏ）を有する非滅菌ＰＧＡを２５〜３０ｋＧｙの範囲の線量でｅ−ビーム滅菌する工程；及び
ｃ. ａ.から得られた生産物とｂ.から得られた生産物とを混合する工程；
を含んでなる方法により製造される、上記製剤。