JP2010155820A - Skin ameliorating agent, and vascular ameliorating agent, and pharmaceutical composition, food, feed and cosmetic comprising the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、皮膚改善剤、血管改善剤、並びにこれらを含む医薬組成物、食品、飼料及び化粧品に関し、より具体的には魚類の動脈球から抽出されるエラスチンペプチドを有効成分として含む皮膚改善剤、血管改善剤、並びにこれらを含む医薬組成物、食品、飼料及び化粧品に関する。 The present invention relates to a skin improving agent, a blood vessel improving agent, and pharmaceutical compositions, foods, feeds and cosmetics containing them, and more specifically, a skin improving agent containing elastin peptide extracted from arterial spheres of fish as an active ingredient. , A vascularity improving agent, and a pharmaceutical composition, food, feed and cosmetics containing them.
ヒアルロン酸はコラーゲンやエラスチン等と共に細胞外マトリックスを構成し、皮膚の保水、潤滑性及び柔軟性の付与等の役割を果たしている。皮膚中のヒアルロン酸は、生体内で合成されると同時にその分解酵素であるヒアルロニダーゼによる酵素分解を受けており、皮膚中のヒアルロン酸の半減期は約1日であるという報告がある(非特許文献1参照)。しかし、加齢や紫外線曝露等、種々の外的ストレスにより分解酵素であるヒアルロニダーゼ活性が亢進してくると、ヒアルロン酸の分解量が増加するため、次第に組織の柔軟性や潤滑性が失われ、関節の痛みや皮膚のたるみ、しわ等の原因となる。したがって、ヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼの活性を阻害することは、生体内のヒアルロン酸を減らさないことになり、たるみやしわを抑制することになる。 Hyaluronic acid constitutes an extracellular matrix together with collagen, elastin and the like, and plays a role such as water retention, lubricity and flexibility of the skin. There is a report that hyaluronic acid in the skin is synthesized in vivo and at the same time undergoes enzymatic degradation by hyaluronidase, which is its degrading enzyme, and the half-life of hyaluronic acid in the skin is about 1 day (non-patented). Reference 1). However, when hyaluronidase activity, which is a degrading enzyme, increases due to various external stresses such as aging and exposure to ultraviolet rays, the amount of hyaluronic acid degradation increases, so the tissue flexibility and lubricity are gradually lost. Cause joint pain, sagging skin, wrinkles, etc. Therefore, inhibiting the activity of hyaluronidase that degrades hyaluronic acid does not reduce hyaluronic acid in the living body and suppresses sagging and wrinkles.
メラニンは皮膚に存在する色素であり、紫外線から皮膚や組織を保護する役割を果たしている。しかし、皮膚での過度なメラニン産生は過着色によるシミ、ソバカス、斑点等の原因になっている。このような過着色はメラニンを産生する酵素の活性に依存しており、チロシナーゼはこのようなメラニンの産生に関与する酵素として知られている。メラニンは色素細胞の中で生合成されるチロシナーゼの働きによって、チロシンを出発物質とし、ドーパ(DOPA、3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン)、ドーパキノン、5,6−ジヒドロキシインドフェノール等の中間体を経て形成される。したがって、チロシナーゼの活性を阻害することにより、メラニンの生成を抑え、シミ、ソバカス、斑点等を抑制できると考えられている。 Melanin is a pigment present in the skin and plays a role in protecting the skin and tissues from ultraviolet rays. However, excessive melanin production in the skin causes stains, buckwheat, spots, etc. due to overcoloring. Such overcoloring depends on the activity of an enzyme that produces melanin, and tyrosinase is known as an enzyme involved in the production of such melanin. Melanin is formed through the intermediates of dopa (DOPA, 3,4-dihydroxyphenylalanine), dopaquinone, 5,6-dihydroxyindophenol, etc., using tyrosine as a starting material by the action of tyrosinase biosynthesized in pigment cells Is done. Therefore, it is considered that by inhibiting the activity of tyrosinase, the production of melanin can be suppressed and spots, buckwheat, spots, etc. can be suppressed.
高いチロシナーゼ阻害活性作用を有する物質として、コウジ酸、L−アスコルビン酸等が報告されている。また、天然物からヒアルロニダーゼ阻害活性、チロシナーゼ阻害活性を有する物質の探索も行われており、例えばアカギ又はアカギ抽出物(特許文献1参照)、テンニンカ抽出物(特許文献2参照)、ホルトノキ属植物の抽出物(特許文献3参照)、アンマロクの抽出物(特許文献4参照)、ハイノキ属植物の抽出物(特許文献5参照)、メシマコブ子実体の抽出物(特許文献6参照)、ベンケイソウ科イワベンケイ属植物(特許文献7参照)、シャペウ・デ・コウロの抽出物(特許文献8参照)等が報告されている。 Kojic acid, L-ascorbic acid and the like have been reported as substances having a high tyrosinase inhibitory activity. Moreover, the search of the substance which has a hyaluronidase inhibitory activity and a tyrosinase inhibitory activity from a natural product is also performed, for example, a redfish or a redfish extract (refer patent document 1), a tenninka extract (refer patent document 2), a Hortonella plant, etc. Extract (refer to Patent Document 3), extract of Ammarok (refer to Patent Document 4), extract of a genus plant (refer to Patent Document 5), extract of fruit body (refer to Patent Document 6), genus Iwabenkei Plants (see Patent Document 7), Chapeu de Kouro extracts (see Patent Document 8), and the like have been reported.
皮膚改善効果が知られている物質のうち、植物由来以外のもので、食経験のあり安全性が確認されているものとしては、例えば動物タンパク質由来のゼラチン及び/又はコラーゲンの分解物を有効成分として含むヒアルロニダーゼ阻害活性剤並びにコラーゲン成分含有原料を亜臨界水処理して得られた平均分子量200〜1500のコラーゲンペプチドを化粧有効成分として含有するコラーゲンペプチド含有化粧料組成物(特許文献9、10参照)等が知られている。 Among substances that are known to have a skin improvement effect, those that are not derived from plants and that have been confirmed to be safe with food experience include, for example, gelatin derived from animal proteins and / or degradation products of collagen as active ingredients A collagen peptide-containing cosmetic composition containing as a cosmetic active ingredient a collagen peptide having an average molecular weight of 200 to 1500 obtained by subjecting a collagen component-containing raw material to a subcritical water treatment as a cosmetic active ingredient (see Patent Documents 9 and 10) ) Etc. are known.
一方で、コラーゲンと同じく皮膚等に多く含まれている物質にエラスチンがある。エラスチンは、弾性線維の主要な構成成分で、脊椎動物の結合織に広く分布する不溶性タンパク質である。生体内では動脈壁や項靭帯、肺、皮膚等、弾力性及び伸縮性が必要とされる組織に多く分布し、弾性を与える働きをしている。血管や項靭帯におけるエラスチン含量は、全乾燥重量あたり50%以上を占めている。また、エラスチンは、皮膚の弾性に関与する成分としてコラーゲンと共に真皮結合組織に存在しており、加齢、紫外線等による皮膚中のエラスチンの減少及び変性は、皮膚のたるみやしわの一因である。そのため、エラスチンは、化粧品や健康食品分野を中心に、現在多くの製品に使用されている。また、上述のとおりエラスチンは血管の構成成分であるため、エラスチンの変性は各種血管性疾患にも関与していると考えられることから、医薬分野での利用も検討されている。 On the other hand, elastin is a substance contained in skin and the like as much as collagen. Elastin is a major component of elastic fibers and is an insoluble protein widely distributed in vertebrate connective tissue. In the living body, it is distributed in many tissues that require elasticity and stretchability, such as arterial walls, ligaments, lungs, skin, etc., and functions to give elasticity. The elastin content in blood vessels and interfacial ligaments accounts for 50% or more of the total dry weight. Elastin is present in the dermis connective tissue together with collagen as a component involved in skin elasticity, and the reduction and degeneration of elastin in the skin due to aging, ultraviolet rays, etc. are a cause of skin sagging and wrinkles. . For this reason, elastin is currently used in many products, mainly in the cosmetics and health food fields. In addition, since elastin is a constituent of blood vessels as described above, degeneration of elastin is considered to be involved in various vascular diseases, and therefore its use in the pharmaceutical field is also being studied.
従来、エラスチンは牛項靭帯等のほ乳類由来の弾性組織を原料としていたが、牛海綿状脳症(BSE)や、豚口蹄疫を始めとする家畜疫病の発生により、安全上の見地からほ乳類由来のエラスチンは敬遠される傾向にある。そこで、魚類等の海洋性資源由来のエラスチンが注目されるようになっている。魚類において、エラスチンは動脈球という組織に豊富に含まれている。動脈球は魚類に特有の組織であり、心臓より血管へ移る動脈幹の一種で、大動脈壁の一部が発達したものである。動脈球は、弾性線維に富み、内部は海綿状構造になっているため、心臓の収縮によって常に拡張及び収縮を繰り返している。一部地域では、この動脈球を珍味として食用に供している。 Conventionally, elastin has been made from an elastic tissue derived from mammals such as bovine ligaments, but due to the occurrence of cattle spongiform encephalopathy (BSE) and domestic animal plagues such as swine and foot-and-mouth disease, elastin derived from mammals from a safety standpoint. Tend to be shunned. Therefore, elastin derived from marine resources such as fish has attracted attention. In fish, elastin is abundant in tissue called arterial spheres. An arterial sphere is a fish-specific tissue, a type of arterial trunk that moves from the heart to the blood vessels, and a part of the aortic wall developed. Since the arterial sphere is rich in elastic fibers and has a spongy structure inside, the arterial sphere constantly expands and contracts due to the contraction of the heart. In some areas, this arterial sphere is used as a delicacy.
エラスチンに関しては、ブタ及びウマ由来のエラスチンが皮膚に対して改善効果と美白効果をもたらしたという報告(特許文献11参照)や、動物由来(ウシの項靱帯)エラスチンが血管の状態を改善したという報告(特許文献12参照)等がある。 Regarding elastin, reports that porcine and equine-derived elastin have improved skin and whitening effects (see Patent Document 11), and animal-derived (bovine ligament) elastin has improved vascular conditions There is a report (see Patent Document 12).
皮膚中のエラスチンを産生する皮膚線維芽細胞におけるエラスチン産生を促進する物質には、皮膚改善剤としての可能性が考えられる。例えば、特許文献13〜15では植物抽出物を含むエラスチン産生促進剤が提案されており、特許文献16には合成ペプチドを含むエラスチン産生促進剤が提案されている。 A substance that promotes the production of elastin in skin fibroblasts that produce elastin in the skin has potential as a skin improvement agent. For example, Patent Documents 13 to 15 propose an elastin production promoter containing a plant extract, and Patent Document 16 proposes an elastin production promoter containing a synthetic peptide.
しかし、高いヒアルロニダーゼ阻害活性及びチロシナーゼ阻害活性を示す物質としてこれまでに知られている有機化合物には、副作用等の危険性を有するものが多い。例えば、コウジ酸は発がん性が疑われる等安全性に問題があり、またL−アスコルビン酸及びその誘導体は、溶液中で安定性が悪く、着色や分解等の問題点を抱えている。
また、特許文献1〜10に記載の植物抽出物は、高価な生薬を原料としている、年間を通して安定かつ大量に確保することが困難である、安全性が確認されていない、植物の持つ独特の臭いのために食品として供すると風味を損なうおそれがある等の問題を有している。
However, many organic compounds known so far as substances exhibiting high hyaluronidase inhibitory activity and tyrosinase inhibitory activity have risks such as side effects. For example, kojic acid has safety problems such as suspected carcinogenicity, and L-ascorbic acid and its derivatives have poor stability in solution and have problems such as coloring and decomposition.
In addition, the plant extracts described in Patent Documents 1 to 10 are made from expensive herbal medicines, which are difficult to secure in a stable and large amount throughout the year, have not been confirmed to be safe, and have unique plant characteristics. When it is used as food due to the smell, it has a problem that the flavor may be impaired.
医薬(消炎鎮痛剤、抗アレルギー剤等)に用いられているグリチルリチン酸、クロモグリク酸ナトリウム、バイカリン、インドメタシン、アスピリン等に高いヒアルロニダーゼ活性阻害活性が確認されているが、これらは、用法及び用量に制限がある、副作用がある等の問題点を抱えている。 Glycyrrhizic acid, sodium cromoglycate, baicalin, indomethacin, aspirin, etc. used in medicines (anti-inflammatory analgesics, antiallergic agents, etc.) have been confirmed to have high hyaluronidase activity inhibitory activity. There are problems such as there are side effects.
動物由来のコラーゲン及びエラスチンをそれぞれ分解して得られる水溶性のコラーゲンペプチド及びエラスチンペプチドについては、ヒアルロニダーゼ阻害活性、チロシナーゼ阻害活性、及び肌の美白効果等が報告されているのに対し、魚類由来エラスチンのヒアルロニダーゼやチロシナーゼの阻害活性に関しては未だ報告されていない。また、動物の弾性組織由来のタンパク質を原料とすることは、牛海綿状脳症(BSE)や、豚口蹄疫を始めとする家畜疫病の発生以降、安全上の見地から敬遠される傾向にある。 Regarding water-soluble collagen peptides and elastin peptides obtained by decomposing animal-derived collagen and elastin, hyaluronidase inhibitory activity, tyrosinase inhibitory activity, and skin whitening effect have been reported, whereas fish-derived elastin The inhibitory activity of hyaluronidase and tyrosinase has not been reported yet. In addition, the use of proteins derived from elastic tissues of animals as a raw material tends to be avoided from a safety standpoint after the occurrence of cattle spongiform encephalopathy (BSE) and livestock plague such as swine and foot-and-mouth disease.
また、魚類由来のエラスチンペプチドについて、皮膚線維芽細胞におけるエラスチン産生を促進することにより皮膚機能を改善することについてもこれまで報告されていない。 Moreover, about the elastin peptide derived from fish, it has not been reported until now to improve skin function by promoting the production of elastin in dermal fibroblasts.
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、魚類の動脈球から抽出されるエラスチンペプチドを有効成分として含む皮膚改善剤、血管改善剤、並びにこれらを含む医薬組成物、食品、飼料及び化粧品を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such circumstances, and includes a skin improving agent, an vascular improving agent containing elastin peptide extracted from arterial spheres of fish as an active ingredient, and a pharmaceutical composition, food, feed and cosmetic containing them. The purpose is to provide.
前記目的に沿う本発明の第1の態様は、魚類の動脈球より抽出されたエラスチンペプチドを有効成分として含むことを特徴とする皮膚改善剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
なお、「エラスチンペプチド」とは、エラスチンのポリペプチド鎖を断片化させることにより得られるポリペプチド及びオリゴペプチド又はそれらの混合物を意味する。
The first aspect of the present invention that meets the above-mentioned object is to solve the above-mentioned problems by providing a skin improving agent characterized by containing an elastin peptide extracted from arterial spheres of fish as an active ingredient.
The “elastin peptide” means a polypeptide and an oligopeptide obtained by fragmenting a polypeptide chain of elastin or a mixture thereof.
本発明の第1の態様において、グリシン、アラニン、バリン及びプロリン含量の合計が650残基/1000残基以上であり、アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が10残基/1000残基以上35残基/1000残基以下であり、グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が20残基/1000残基以上50残基/1000残基以下であり、リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が20残基/1000残基以上50残基/1000残基以下であり、デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が0.3残基/1000残基以上であり、ヒドロキシプロリン含量が10残基/1000残基以下であることが好ましい。 In the first aspect of the present invention, the total content of glycine, alanine, valine and proline is 650 residues / 1000 residues or more, and the total content of aspartic acid and asparagine is 10 residues / 1000 residues or more 35 residues / 1000 residues or less, the total content of glutamic acid and glutamine is 20 residues / 1000 residues or more and 50 residues / 1000 residues or less, and the total content of lysine, histidine and arginine is 20 residues / 1000 residues It is preferably 50 residues / 1000 residues or less, the sum of desmosine and isodesmosine content is preferably 0.3 residues / 1000 residues or more, and the hydroxyproline content is preferably 10 residues / 1000 residues or less.
本発明の第1の態様において、前記エラスチンペプチドのうち、分子量が1000以下のものの割合が70%以上であることが好ましい。
なお、本発明において、特に断らない限り「%」は「重量%」を意味する。
1st aspect of this invention WHEREIN: It is preferable that the ratio of those whose molecular weight is 1000 or less among the said elastin peptides is 70% or more.
In the present invention, “%” means “% by weight” unless otherwise specified.
本発明の第1の態様において、皮膚改善剤はヒアルロニダーゼ阻害活性を有していてもよい。 In the first aspect of the present invention, the skin improving agent may have hyaluronidase inhibitory activity.
本発明の第1の態様において、皮膚改善剤はチロシナーゼ阻害活性を有していてもよい。 In the first aspect of the present invention, the skin improving agent may have tyrosinase inhibitory activity.
本発明の第1の態様において、皮膚改善剤は皮膚線維芽細胞におけるエラスチン産生促進活性を有していてもよい。 In the first embodiment of the present invention, the skin improving agent may have elastin production promoting activity in dermal fibroblasts.
本発明の第2の態様は、魚類の動脈球より抽出されたエラスチンペプチドを有効成分として含むことを特徴とする血管改善剤を提供することにより上記課題を解決するものである。 The second aspect of the present invention solves the above-mentioned problems by providing a blood vessel improving agent characterized by containing an elastin peptide extracted from arterial spheres of fish as an active ingredient.
本発明の第2の態様において、グリシン、アラニン、バリン及びプロリン含量の合計が650残基/1000残基以上であり、アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が10残基/1000残基以上35残基/1000残基以下であり、グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が20残基/1000残基以上50残基/1000残基以下であり、リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が20残基/1000残基以上50残基/1000残基以下であり、デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が0.3残基/1000残基以上であり、ヒドロキシプロリン含量が10残基/1000残基以下であることが好ましい。 In the second embodiment of the present invention, the total content of glycine, alanine, valine and proline is 650 residues / 1000 residues or more, and the total content of aspartic acid and asparagine is 10 residues / 1000 residues or more 35 residues / 1000 residues or less, the total content of glutamic acid and glutamine is 20 residues / 1000 residues or more and 50 residues / 1000 residues or less, and the total content of lysine, histidine and arginine is 20 residues / 1000 residues It is preferably 50 residues / 1000 residues or less, the sum of desmosine and isodesmosine content is preferably 0.3 residues / 1000 residues or more, and the hydroxyproline content is preferably 10 residues / 1000 residues or less.
本発明の第2の態様において、前記エラスチンペプチドのうち、分子量が1000以下のものの割合が70%以上であることが好ましい。 2nd aspect of this invention WHEREIN: It is preferable that the ratio of those whose molecular weight is 1000 or less among the said elastin peptides is 70% or more.
本発明の第2の態様において、血管改善剤は加速度脈波のb/a値を減少させ、かつd/a値を増大させる活性を有していてもよい。
なお、「加速度脈波」とは、指先容積脈波の二次微分波であり、血管抵抗及び血流に対する血管の反応性を反映していることから、いわゆる血管年齢の推定に用いられる。
In the second aspect of the present invention, the blood vessel improving agent may have an activity of decreasing the b / a value of the acceleration pulse wave and increasing the d / a value.
The “acceleration pulse wave” is a second-order differential wave of the fingertip volume pulse wave, and reflects vascular resistance and blood vessel responsiveness to blood flow, and is therefore used for so-called estimation of blood vessel age.
本発明の第2の態様において、血管改善剤は平滑筋増殖阻害活性を有していてもよい。 In the second aspect of the present invention, the blood vessel improving agent may have smooth muscle growth inhibitory activity.
本発明の第2の態様において、血管改善剤は血管内皮細胞におけるエンドセリン−1産生抑制活性を有していてもよい。 In the second embodiment of the present invention, the blood vessel improving agent may have endothelin-1 production inhibitory activity in vascular endothelial cells.
本発明の第2の態様において、血管改善剤は血管内皮細胞における組織プラスミノーゲン活性化因子(t−PA)産生促進活性を有していてもよい。 In the second aspect of the present invention, the blood vessel improving agent may have tissue plasminogen activator (t-PA) production promoting activity in vascular endothelial cells.
本発明の第2の態様において、血管改善剤は血管内皮細胞増殖賦活活性を有していてもよい。 In the second aspect of the present invention, the blood vessel improving agent may have vascular endothelial cell proliferation activation activity.
本発明の第3の態様は、本発明の第1の態様に係る皮膚改善剤及び本発明の第2の態様に係る血管改善剤のいずれか一方又は双方を含む医薬組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。 According to a third aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition comprising any one or both of the skin improving agent according to the first aspect of the present invention and the vascular improving agent according to the second aspect of the present invention. The present invention solves the above problems.
本発明の第4の態様は、本発明の第1の態様に係る皮膚改善剤及び本発明の第2の態様に係る血管改善剤のいずれか一方又は双方を含む食品を提供することにより上記課題を解決するものである。 According to a fourth aspect of the present invention, there is provided a food containing either or both of the skin improving agent according to the first aspect of the present invention and the blood vessel improving agent according to the second aspect of the present invention. Is a solution.
本発明の第5の態様は、本発明の第1の態様に係る皮膚改善剤及び本発明の第2の態様に係る血管改善剤のいずれか一方又は双方を含む飼料を提供することにより上記課題を解決するものである。 According to a fifth aspect of the present invention, there is provided the above-mentioned problem by providing a feed containing either or both of the skin improving agent according to the first aspect of the present invention and the blood vessel improving agent according to the second aspect of the present invention. Is a solution.
本発明の第6の態様は、本発明の第1の態様に係る皮膚改善剤及び本発明の第2の態様に係る血管改善剤のいずれか一方又は双方を含む化粧品を提供することにより上記課題を解決するものである。 According to a sixth aspect of the present invention, there is provided the above-mentioned problem by providing a cosmetic comprising one or both of the skin improving agent according to the first aspect of the present invention and the blood vessel improving agent according to the second aspect of the present invention. Is a solution.
本発明によると、副作用、固有の臭気、安全性等に関する従来技術の課題を解決し、幅広い用途に応用が可能な、ヒアルロニダーゼ阻害活性及びチロシナーゼ阻害活性の一方又は双方を有する皮膚改善剤、血管弾性改善作用、血管における平滑筋増殖阻害活性、エンドセリン−1産生抑制能、組織プラスミノーゲン活性化因子産生促進活性及び血管内皮細胞増殖促進活性のうち1又は複数を有する血管改善剤、及びこれらを含む医薬組成物、食品、飼料、及び化粧品を提供できる。 According to the present invention, a skin improving agent having one or both of hyaluronidase inhibitory activity and tyrosinase inhibitory activity, which solves the problems of the prior art relating to side effects, inherent odor, safety, etc. and can be applied to a wide range of uses, vascular elasticity A blood vessel improving agent having one or more of an improving action, a smooth muscle growth inhibitory activity in blood vessels, an endothelin-1 production inhibitory activity, a tissue plasminogen activator production promoting activity and a vascular endothelial cell growth promoting activity, and these Pharmaceutical compositions, foods, feeds and cosmetics can be provided.
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の一実施の形態に係る皮膚改善剤及び血管改善剤は、魚類の動脈球より抽出されたエラスチンペプチド(以下、単に「エラスチンペプチド」と略称する。)を有効成分として含んでいる。
Subsequently, an embodiment of the present invention will be described to provide an understanding of the present invention.
The skin improving agent and blood vessel improving agent according to one embodiment of the present invention contain an elastin peptide extracted from a fish arterial sphere (hereinafter simply referred to as “elastin peptide”) as an active ingredient.
動脈球とは、魚類に特有の器官であり、弁を介して心室と結合しており、心室から大動脈へ送り出される血液の血流調節に関与している。原料として使用される動脈球の起源に特に制限はなく、任意の魚種由来の動脈球を使用することができるが、心臓から動脈球を採取するためにある程度の大きさを有する必要がある。そのため、原料として用いる動脈球は、カツオ、マグロ、カジキ、タラ、ハマチ、ブリ、サケ、マス等の大型魚に由来するものであることが好ましく、大量かつ安定的に入手できる魚種であるカツオ、マグロ、タラ、ハマチ、サケに由来するものであることがより好ましい。 An arterial sphere is an organ peculiar to fish, is connected to the ventricle through a valve, and is involved in blood flow regulation of blood sent from the ventricle to the aorta. There is no particular limitation on the origin of the arterial sphere used as a raw material, and arterial spheres derived from any fish species can be used, but it is necessary to have a certain size in order to collect arterial spheres from the heart. Therefore, the arterial sphere used as a raw material is preferably derived from large fish such as bonito, tuna, swordfish, cod, yellowtail, yellowtail, salmon, trout, etc. More preferably, it is derived from tuna, cod, hamachi, salmon.
エラスチンペプチドは、例えば、以下の方法により調製される。
まず、原料として使用する動脈球から血液を除去するために流水で洗浄後、粉砕する。粉砕は、ホモジナイザー、フードカッター等の任意の公知の手段により行うことができる。次いで、粉砕した動脈球から、脂質、可溶性タンパク質、コラーゲンを除去することにより、エラスチンを主成分とする不溶性タンパク質混合物が得られるが、原料のさらなる洗浄及び以後の処理を容易にするための前処理として、アルカリ溶液を用いた浸漬処理を行うことが好ましい。
The elastin peptide is prepared, for example, by the following method.
First, in order to remove blood from the arterial sphere used as a raw material, it is washed with running water and then pulverized. The pulverization can be performed by any known means such as a homogenizer or a food cutter. Then, by removing lipids, soluble proteins and collagen from the pulverized arterial spheres, an insoluble protein mixture based on elastin can be obtained, but pretreatment for facilitating further washing of the raw material and subsequent processing. It is preferable to perform an immersion treatment using an alkaline solution.
アルカリ溶液による処理条件は魚種により異なるため、事前に検討の上決定することが好ましいが、カツオ由来の動脈球を使用した場合、使用されるアルカリ溶液は、水酸化ナトリウム又は水酸化カルシウム、好ましくは水酸化ナトリウムの溶液である。アルカリ溶液の濃度は0.01N〜0.1N、好ましくは0.02Nである。浸漬温度は20℃以下、浸漬期間は数日〜2週間、好ましくは1週間である。また、浸漬中は、アルカリ溶液を1日につき2回以上取り替えることが好ましい。浸漬後、流水洗浄により過剰のアルカリを除去後、中和処理を行う。中和には、当該技術分野において使用される任意の酸を使用することができる。 Since the treatment conditions with the alkaline solution vary depending on the fish species, it is preferable to determine in advance, but when using bonito-derived arterial spheres, the alkaline solution used is sodium hydroxide or calcium hydroxide, preferably Is a solution of sodium hydroxide. The concentration of the alkaline solution is 0.01N to 0.1N, preferably 0.02N. The immersion temperature is 20 ° C. or less, and the immersion period is several days to 2 weeks, preferably 1 week. Moreover, during immersion, it is preferable to change an alkaline solution twice or more per day. After immersion, neutralization is performed after removing excess alkali by washing with running water. Any acid used in the art can be used for neutralization.
アルカリ処理した原料からの脂質及びコラーゲンの除去は、例えば、蒸留水を添加し高温(例えば、95℃)で加熱する方法により行うことができる。高温で加熱することにより、コラーゲンのらせん構造が崩壊して三量体が解離し、水溶性のトロポコラーゲン(ゼラチン)が遊離する。ろ過、遠心分離、デカンテーション等の任意の公知の方法により上清を分離除去すると、不溶性タンパク質混合物が得られる。 The removal of lipid and collagen from the alkali-treated raw material can be performed, for example, by adding distilled water and heating at a high temperature (for example, 95 ° C.). By heating at a high temperature, the helical structure of collagen collapses, the trimer dissociates, and water-soluble tropocollagen (gelatin) is released. When the supernatant is separated and removed by any known method such as filtration, centrifugation, and decantation, an insoluble protein mixture is obtained.
こうして得られた不溶性タンパク質混合物に対して、ポリペプチド鎖を断片化させ、水溶性を向上させる可溶化処理を行うことにより、エラスチンペプチドを得ることができる。この際、可溶化処理に先立ち、不溶性タンパク質混合物をさらに細片化してもよい。 The elastin peptide can be obtained by subjecting the insoluble protein mixture thus obtained to fragmentation of the polypeptide chain and solubilization treatment for improving water solubility. At this time, the insoluble protein mixture may be further fragmented prior to the solubilization treatment.
可溶化処理は任意の公知の方法を用いて行うことができるが、具体例としては、タンパク分解酵素による酵素分解が挙げられる。酵素分解には、食品、医薬品及び化粧品製造に使用される任意のタンパク分解酵素を使用することができるが、力価の大きなもの、たとえばAlcalase2.4L FG(Novoenzyme製)、プロチンAC−10F(大和化成製)、プロテアーゼN「アマノ」G、ペプシン(天野エンザイム製)が好ましい。分解条件は、使用される酵素及び動脈球、所望の分子量分布等に応じて適宜決定される。酵素の添加量(酵素と基質の重量比)は、当業界でタンパク質分解に用いられる通常の量であり、たとえば1:5000〜1:10000である。また、これらの酵素は単独で用いることもできるが、2種類以上を組み合わせて使用することが好ましい。反応後、酵素の加熱失活により酵素分解反応を終了させる。 The solubilization treatment can be performed using any known method, and specific examples include enzymatic degradation using a proteolytic enzyme. For the enzymatic degradation, any proteolytic enzyme used in the production of foods, pharmaceuticals and cosmetics can be used, but those having a high titer, such as Alcalase 2.4L FG (manufactured by Novoenzyme), protin AC-10F (Yamato) Kasei), protease N “Amano” G, and pepsin (Amano Enzyme) are preferred. Degradation conditions are appropriately determined according to the enzyme used, arterial sphere, desired molecular weight distribution, and the like. The addition amount of enzyme (weight ratio of enzyme to substrate) is a normal amount used for proteolysis in the art, and is, for example, 1: 5000 to 1: 10000. Moreover, although these enzymes can also be used independently, it is preferable to use combining 2 or more types. After the reaction, the enzymatic decomposition reaction is terminated by heat deactivation of the enzyme.
また、可溶化処理は、不溶性タンパク質混合物を無機酸溶液中で加熱処理する酸分解法によっても行うことができる。使用する酸の例としては任意の無機酸が挙げられるが、シュウ酸が好ましく、濃度及び加熱温度は、0.25N、90℃が好ましい。可溶化処理後、アルカリにより中和を行うが、このとき使用するアルカリとしては水酸化ナトリウム及び水酸化カルシウムが好ましい。特に、シュウ酸を使用した場合には、これを完全に除去するために水酸化カルシウムでの中和が必須となる。 The solubilization treatment can also be performed by an acid decomposition method in which an insoluble protein mixture is heated in an inorganic acid solution. Examples of the acid to be used include any inorganic acid, but oxalic acid is preferable, and the concentration and heating temperature are preferably 0.25 N and 90 ° C. After the solubilization treatment, neutralization is performed with an alkali, and sodium hydroxide and calcium hydroxide are preferable as the alkali used at this time. In particular, when oxalic acid is used, neutralization with calcium hydroxide is essential in order to completely remove it.
或いは、不溶性タンパク質混合物をアルカリ性含水エタノール溶液で処理するアルカリ−エタノール法によっても可溶化処理を行うことができる。この際使用する溶液は、1N水酸化ナトリウム80%エタノール溶液であることが好ましく、処理温度は室温であることが好ましい。 Alternatively, the solubilization treatment can also be performed by an alkali-ethanol method in which an insoluble protein mixture is treated with an alkaline aqueous ethanol solution. The solution used at this time is preferably a 1N sodium hydroxide 80% ethanol solution, and the treatment temperature is preferably room temperature.
以上のようにして得られたエラスチンペプチドを溶液のまま使用する場合には、溶液を所望の用途に好適なpHに調整し、必要であれば脱塩を行う。脱塩は、限外ろ過法、イオン交換法等の任意の方法により行うことができる。
また、不溶物が存在する場合には、ろ過、遠心分離、デカンテーション等の任意の方法を用いて除去することができる。ろ過による除去の場合には、必要に応じて、不純物を除去するために活性炭、ベントナイト、セライト等の吸着剤やろ過助剤を添加してもよい。特に溶液のまま使用する場合には、メンブレンフィルター等による除菌ろ過を併せて行うことが好ましい。
このようにして得られるエラスチンペプチドは、そのまま溶液として用いてもよく、或いは、更に濃縮後噴霧乾燥又は凍結乾燥を行うことにより得られる粉末の形態で用いてもよい。
When the elastin peptide obtained as described above is used as a solution, the solution is adjusted to a pH suitable for a desired application, and desalting is performed if necessary. Desalting can be performed by any method such as an ultrafiltration method or an ion exchange method.
Moreover, when an insoluble matter exists, it can remove using arbitrary methods, such as filtration, centrifugation, and a decantation. In the case of removal by filtration, an adsorbent such as activated carbon, bentonite, or celite or a filter aid may be added as necessary to remove impurities. In particular, when used as a solution, it is preferable to perform sterilization filtration with a membrane filter or the like.
The elastin peptide thus obtained may be used as a solution as it is, or may be used in the form of a powder obtained by further performing spray drying or freeze drying after concentration.
以上のようにして得られるエラスチンペプチドのうち、分子量が1000以下のものが占める割合は、70%(重量%。以下同じ。)以上、好ましくは75%以上、より好ましくは80%以上である。上記の条件を具備する皮膚改善剤及び血管改善剤は、それぞれ、高い活性を示すと共に、投与時の吸収特性等においても優れている。エラスチンペプチドの分子量及びその存在比(重量比)は、サイズ排除クロマトグラフィー(ゲルろ過クロマトグラフィー)法、質量分析法等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。
エラスチンペプチドのうち、分子量1000以下のものが占める割合が70%を下回ると、吸収効率の低下や変異原性の発現等の問題を生じるおそれがある。
The proportion of the elastin peptide obtained as described above having a molecular weight of 1000 or less is 70% (% by weight, the same applies hereinafter) or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more. Each of the skin improving agent and the blood vessel improving agent having the above conditions exhibits high activity and is excellent in absorption characteristics at the time of administration. The molecular weight of the elastin peptide and its abundance ratio (weight ratio) can be determined using any known method such as size exclusion chromatography (gel filtration chromatography) or mass spectrometry.
If the proportion of the elastin peptide having a molecular weight of 1000 or less is less than 70%, problems such as a decrease in absorption efficiency or expression of mutagenicity may occur.
エラスチンペプチドは、ヒアルロニダーゼ阻害活性を有している。上述のとおり、加齢や紫外線曝露等、種々の外的ストレスに起因するヒアルロニダーゼ活性の亢進に伴い、皮膚の保水、潤滑性、及び柔軟性等の役割を果たしているヒアルロン酸の分解量が増加すると、組織の柔軟性や潤滑性が失われ、皮膚のたるみやしわ等の原因となる。したがって、ヒアルロニダーゼの活性を阻害することにより、皮膚のたるみやしわを抑制し、皮膚機能を改善できる。 Elastin peptide has hyaluronidase inhibitory activity. As described above, with the increase in hyaluronidase activity caused by various external stresses such as aging and exposure to ultraviolet rays, the amount of degradation of hyaluronic acid, which plays the role of water retention, lubricity, and flexibility of the skin, increases. , Tissue flexibility and lubricity are lost, causing skin sagging and wrinkles. Accordingly, by inhibiting the activity of hyaluronidase, sagging and wrinkles of the skin can be suppressed and skin function can be improved.
また、エラスチンペプチドは、チロシナーゼ阻害活性を有している。チロシナーゼは、皮膚におけるメラニンの生成に関与しており、チロシナーゼ活性の亢進は、シミ、ソバカス等の皮膚への色素沈着の原因となる。したがって、チロシナーゼ活性を阻害することにより、皮膚への異常色素沈着を抑制し、皮膚機能を改善できる。以上のように、エラスチンペプチドは、皮膚改善効果を有する皮膚改善剤として用いることができる。 The elastin peptide has tyrosinase inhibitory activity. Tyrosinase is involved in the production of melanin in the skin, and the increase in tyrosinase activity causes pigmentation on the skin such as spots and buckwheat. Therefore, by inhibiting tyrosinase activity, abnormal pigmentation on the skin can be suppressed and skin function can be improved. As described above, the elastin peptide can be used as a skin improving agent having a skin improving effect.
更に、エラスチンペプチドは、皮膚線維芽細胞におけるエラスチンの産生促進活性を有している。上述のとおり、エラスチンは、皮膚の弾性に関与する成分としてコラーゲンと共に真皮結合組織に存在しており、加齢、紫外線等による皮膚中のエラスチンの減少及び変性は、皮膚のたるみやしわの一因である。したがって、皮膚線維芽細胞におけるエラスチンの産生を促進することにより、加齢等に伴う皮膚のたるみやしわの発生を抑制し、皮膚機能を改善できる。 Furthermore, the elastin peptide has an activity to promote the production of elastin in dermal fibroblasts. As described above, elastin is present in the dermis connective tissue together with collagen as a component involved in skin elasticity, and the reduction and degeneration of elastin in the skin due to aging, ultraviolet rays, etc. are a cause of skin sagging and wrinkles. It is. Therefore, by promoting the production of elastin in dermal fibroblasts, it is possible to suppress skin sagging and wrinkles associated with aging and improve skin function.
更に、エラスチンペプチドは、加速度脈波のb/a値を減少させ、かつd/a値を増大させる活性を有している。加速度脈波とは、指先容積脈波の二次微分波であり、測定された指先容積脈波の演算処理により求めることができる。1回の心臓収縮により心臓から駆出された血流は、動脈の内圧変化及び容積変化をもたらすが、動脈の特定部位で測定される内圧と容積との関係は、心臓から当該部位に至る個々の動脈特性の影響の総和となる。したがって、指尖部で測定される容積脈波は、大動脈から末梢動脈に伝播される過程で生じる投射波と反射波の合成及び共鳴の影響を受けており、指先容積脈波の波形解析より、個人における心臓からの拍出の態様、血管性状、血管壁の状態、血液の粘性等を総合的に把握できる。 Furthermore, the elastin peptide has the activity of decreasing the b / a value of the acceleration pulse wave and increasing the d / a value. The acceleration pulse wave is a second-order differential wave of the fingertip volume pulse wave, and can be obtained by a calculation process of the measured fingertip volume pulse wave. The blood flow expelled from the heart by one heart contraction causes changes in the internal pressure and volume of the artery, but the relationship between the internal pressure and volume measured at a specific part of the artery depends on the individual from the heart to the part. The total effect of arterial characteristics. Therefore, the volume pulse wave measured at the fingertip is affected by the synthesis and resonance of the projected wave and the reflected wave generated in the process of propagating from the aorta to the peripheral artery. From the waveform analysis of the fingertip volume pulse wave, It is possible to comprehensively comprehend the manner in which a person pulsates from the heart, the vascular properties, the state of the vascular wall, the viscosity of blood, and the like.
加速度脈波の標準的な波形を図1に示す。標準的な加速度脈波は、a、b、c、d、e波と呼ばれる5つの要素波を有している。加速度脈波の波形は年齢と強い相関を示すことが確認されており、年齢の増大、すなわち動脈の老化に伴い、b波は浅く(ベースラインからの変位が正方向に増大)なり、一方d波は深く(ベースラインからの変位が負方向に増大)なることが知られている。したがって、動脈の老化に伴い、b/a値は増大し、d/a値は減少する。
エラスチンペプチドが、b/a値を減少させ、かつd/a値を増大させる活性を有していることは、エラスチンペプチドが動脈を若い年齢の状態に改善する活性を有していることを意味する。
A standard waveform of the acceleration pulse wave is shown in FIG. A standard acceleration pulse wave has five element waves called a, b, c, d, and e waves. It has been confirmed that the waveform of the acceleration pulse wave shows a strong correlation with age. As the age increases, that is, as the artery ages, the b wave becomes shallower (displacement from the baseline increases in the positive direction), while d It is known that the waves are deep (displacement from the baseline increases in the negative direction). Therefore, with arterial aging, the b / a value increases and the d / a value decreases.
The fact that elastin peptide has the activity of decreasing b / a value and increasing d / a value means that elastin peptide has the activity of improving arteries to a young age state To do.
また、エラスチンペプチドは、平滑筋増殖阻害活性を有している。加齢によるアテローム性動脈硬化を引き起こす要因としては、血管内皮細胞から産出される血管弛緩因子の低下、収縮因子の増加に加え、血管中膜に存在する平滑筋細胞が過剰に増殖することが挙げられる。したがって、エラスチンペプチドは、平滑筋増殖によるアテローム性動脈硬化を防ぎ、動脈壁の弾性を改善できる。以上のように、エラスチンペプチドは、老化した血管を改善する効果を有する血管改善剤として用いることができる。 The elastin peptide has smooth muscle growth inhibitory activity. Factors that cause atherosclerosis due to aging include a decrease in vasorelaxant factor produced from vascular endothelial cells, an increase in contraction factor, and excessive proliferation of smooth muscle cells in the vascular media. It is done. Thus, the elastin peptide can prevent atherosclerosis due to smooth muscle proliferation and improve the elasticity of the arterial wall. As described above, the elastin peptide can be used as a blood vessel improving agent having an effect of improving aged blood vessels.
また、エラスチンペプチドはエンドセリン−1産生抑制活性を有している。血管の老化に伴い、血管が硬化し、あるいはアテローム性動脈硬化が進展することは周知である。これらの現象には、血管内皮細胞における一酸化窒素(NO)やプロスタサイクリンの産生能の低下等による内皮依存型血管弛緩作用の低下やアンジオテンシン、エンドセリン−1による血管収縮作用の増大が関与していると考えられる。 The elastin peptide has endothelin-1 production inhibitory activity. It is well known that blood vessels harden or atherosclerosis develops as blood vessels age. These phenomena involve a decrease in the endothelium-dependent vasorelaxation effect due to a decrease in the ability to produce nitric oxide (NO) and prostacyclin in vascular endothelial cells, and an increase in the vasoconstriction effect by angiotensin and endothelin-1. It is thought that there is.
エンドセリン−1は、血管内皮細胞が産生する21残基のアミノ酸からなる強力な血管収縮ペプチドであり、強力な血管収縮作用と共に持続的で強い昇圧作用も有しており、平滑筋に直接作用して血管を収縮させることがわかっている。エンドセリンの産生は血管内皮の障害によって増強され、その過剰産生は高血圧症、肺血圧症、糖尿病、動脈硬化症、腎不全、心筋梗塞、狭心症、脳血管攣縮および脳梗塞等の病因の1つであると考えられている。また、高血圧、動脈硬化症、急性腎不全に罹病した患者において、血中のエンドセリン−1量が健常者と比較して有意に高いことが報告されている(丸茂ら,医学の歩み,51−54,1992)。したがって、エンドセリン−1の産生を抑制できれば高血圧症等の疾患を治療または予防できる。 Endothelin-1 is a strong vasoconstrictor peptide consisting of 21-residue amino acids produced by vascular endothelial cells, and has a strong and vasoconstrictive action as well as a continuous and strong pressor action, and acts directly on smooth muscle. Have been shown to constrict blood vessels. Endothelin production is enhanced by vascular endothelial damage, and its overproduction is one of the etiologies such as hypertension, pulmonary blood pressure, diabetes, arteriosclerosis, renal failure, myocardial infarction, angina, cerebral vasospasm and cerebral infarction. It is considered to be one. In patients suffering from hypertension, arteriosclerosis, and acute renal failure, it has been reported that the amount of endothelin-1 in the blood is significantly higher than that of healthy individuals (Marushige et al., Medical History, 51- 54, 1992). Therefore, if the production of endothelin-1 can be suppressed, diseases such as hypertension can be treated or prevented.
また、エラスチンペプチドは組織プラスミノーゲン活性化因子(組織プラスミノーゲンアクチベータ:t−PA)産生促進活性を有している。血管の老化に伴う血管の硬化やアテローム性動脈硬化の進展には血管内皮細胞の機能低下による血液凝固亢進及び線溶系低下も関与していると考えられる。
血管内皮細胞で産生される組織プラスミノーゲン活性化因子(t−PA)は、プラスミノーゲンを活性化しプラスミンに変換することでフィブリンを分解して血栓を溶解する。
我が国では,食生活の欧米化に伴い高齢者の脳梗塞,虚血性心臓疾患等の循環器疾患の罹患率が増加しており、その予防には線溶系を正常化させることが重要である。従って、t‐PAの産生を促進し、血栓の形成を予防することによって血栓による疾病を治療または予防できると考えられる。
The elastin peptide has a tissue plasminogen activator (tissue plasminogen activator: t-PA) production promoting activity. It is considered that the increase in blood coagulation and the decrease in the fibrinolytic system due to a decrease in the function of vascular endothelial cells are also involved in the progress of vascular sclerosis and atherosclerosis accompanying aging of blood vessels.
Tissue plasminogen activator (t-PA) produced in vascular endothelial cells activates plasminogen and converts it into plasmin, thereby degrading fibrin and dissolving thrombus.
In Japan, the prevalence of cardiovascular diseases such as cerebral infarction and ischemic heart disease in the elderly is increasing with the westernization of eating habits, and it is important to normalize the fibrinolytic system for its prevention. Therefore, it is considered that thrombotic diseases can be treated or prevented by promoting t-PA production and preventing thrombus formation.
また、エラスチンペプチドは血管内皮細胞に対する増殖促進活性を有している。血管内皮細胞は血管の内膜を構成する細胞で、血圧、血液凝固、線溶系をコントロールする生理活性物質を産生し、血管環境を維持している。しかし、加齢や酸化ストレスの蓄積によって血管内皮細胞は恒常的に障害を受けており、その機能は低下する。動脈硬化症や血栓症の進展は内皮機能の低下が要因であると考えられており、血管内皮細胞を修復し、増殖促進作用を高めることは、これらの血管系疾患の予防及び改善に重要であると考えられる。 In addition, elastin peptide has a proliferation promoting activity on vascular endothelial cells. Vascular endothelial cells are cells that make up the lining of blood vessels, produce physiologically active substances that control blood pressure, blood coagulation, and fibrinolytic system, and maintain the vascular environment. However, vascular endothelial cells are constantly damaged by aging and accumulation of oxidative stress, and their functions are reduced. The progression of arteriosclerosis and thrombosis is thought to be due to a decline in endothelial function, and repairing vascular endothelial cells and enhancing their growth-promoting action are important for the prevention and improvement of these vascular diseases. It is believed that there is.
カラムクロマトグラフィー等の公知の方法を用いてエラスチンペプチドを分画し、個々のフラクションについて各活性のアッセイを行うことにより、上述の活性のうち1つ又は複数を有するフラクションを単独で、或いは任意の2以上を組み合わせて用いてもよく、エラスチンペプチドの分離精製を行うことなく、混合物のまま用いてもよい。いずれの場合においても、エラスチンペプチドは、皮膚改善効果と老化した血管を改善する効果を併せ持っていてよい。 The elastin peptide is fractionated using a known method such as column chromatography, and each activity is assayed for each fraction, whereby a fraction having one or more of the above-mentioned activities is singly or arbitrarily selected. Two or more may be used in combination, or the elastin peptide may be used as it is without separation and purification. In any case, the elastin peptide may have both a skin improvement effect and an effect of improving aged blood vessels.
エラスチンペプチドを担体等と混合することにより、皮膚改善効果及び老化した血管を改善する効果の一方又は双方を有する医薬組成物として用いることができる。医薬組成物のヒトあるいは動物に対する投与形態としては、経口、経直腸、非経口(例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与など)等が挙げられ、投与量は、医薬組成物の製剤形態、投与方法、使用目的及びこれに適用される投与対象の年齢、体重、症状によって適宜設定され一義的に決定することは困難であるが、ヒトの場合、一般には製剤中に含有される有効成分の量で、好ましくは成人1日当り0.1〜2000mg/kgである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。 By mixing elastin peptide with a carrier or the like, it can be used as a pharmaceutical composition having one or both of an effect of improving skin and an effect of improving aging blood vessels. Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition for humans or animals include oral, rectal, parenteral (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, etc.), and the dosage is the formulation of the pharmaceutical composition. However, in the case of humans, the active ingredient generally contained in the formulation is difficult to determine and uniquely determined depending on the administration method, purpose of use, and age, weight, and symptoms of the subject to be applied. The amount is preferably 0.1 to 2000 mg / kg per day for an adult. Of course, since the dosage varies depending on various conditions, an amount smaller than the above dosage may be sufficient or may be necessary beyond the range.
経口投与製剤として調製する場合は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、コーティング剤、液剤、懸濁剤等の形態に調製することができ、非経口投与製剤にする場合には、注射剤、点滴剤、座薬等の形態に調製することができる。製剤化には、任意の公知の方法を用いることができる。例えば、エラスチンペプチドと、製薬学的に許容し得る担体又は希釈剤、安定剤、及びその他の所望の添加剤を配合して、上記の所望の剤形とすることができる。 When prepared as an orally administered preparation, it can be prepared in the form of tablets, granules, powders, capsules, coatings, liquids, suspensions, etc. It can be prepared in the form of drops, suppositories and the like. Any known method can be used for formulation. For example, an elastin peptide and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, a stabilizer, and other desired additives can be blended to obtain the above desired dosage form.
皮膚改善剤及び血管改善剤の一方又は双方を含む食品としては、エラスチンペプチドをそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品又は健康食品に通常用いられる任意の形態をとることができる。 As a food containing one or both of a skin improving agent and a blood vessel improving agent, elastin peptide prepared as it is as a food, added to other foods, or normally used in foods or health foods such as capsules and tablets It can take any form.
食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等と混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。また、適宜、食品原料中に混合して食品を調製し、皮膚改善効果を有する機能性食品として製品化することによって摂取することができる When ingested or administered in foods, mix with excipients, extenders, binders, thickeners, emulsifiers, colorants, flavors, food additives, seasonings, etc. Accordingly, it can be formed into a powder, granule, tablet or the like. Moreover, it can be ingested by preparing a food as a functional food having a skin improvement effect by appropriately mixing it in a food material and preparing a food.
皮膚改善剤及び血管改善剤の一方又は双方を含む飼料としては、エラスチンペプチドをそのまま調製したもの、あるいは飼料に配合したもの等、様々な形態をとることができる。飼料中に混合して、家畜などの動物に投与する場合には、予め飼料の原料中に混合して、機能性を付与した飼料として調製することができる。また、飼料に添加して投与することもできる。すなわち、エラスチンペプチドを有効成分として含む皮膚改善剤は、ブタ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ヒツジ等の家畜や、魚類、ペット(イヌ、ネコ、鳥類)等の飼料に添加することにより、安全で、皮膚改善効果及び老化した血管を改善する効果の一方又は双方を有する機能性飼料として用いることができる。 The feed containing one or both of the skin improving agent and the blood vessel improving agent can take various forms such as a prepared elastin peptide as it is or a blended feed. When mixed in feed and administered to animals such as livestock, it can be mixed in advance with feed ingredients to prepare a feed with functionality. It can also be added to the feed for administration. That is, a skin improvement agent containing an elastin peptide as an active ingredient is safe by adding it to livestock such as pigs, chickens, cows, horses, sheep, and feed such as fish, pets (dogs, cats, birds), It can be used as a functional feed having one or both of a skin improvement effect and an effect of improving aging blood vessels.
皮膚改善剤を含む化粧品としては、エラスチンペプチドを化粧水、クリームに配合したもの等、様々な形態をとることができる。
化粧品等に配合して投与するには、適宜液状あるいはクリーム状化粧品中に混合して機能性化粧品等として調製することができる。その場合、化粧品等の調製に際してよく知られている、可溶化剤、安定剤、乳化剤等を用いることができる。
Cosmetics containing a skin improving agent can take various forms such as those obtained by blending elastin peptide in lotion or cream.
In order to mix and administer to cosmetics etc., it can mix with liquid or creamy cosmetics suitably, and can prepare as functional cosmetics etc. In that case, solubilizers, stabilizers, emulsifiers and the like well known in the preparation of cosmetics and the like can be used.
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。 Next, examples carried out for confirming the effects of the present invention will be described.
実施例1:カツオ由来エラスチンペプチド粉末の製造
新鮮なカツオより動脈球(100g)を採取し、流水洗浄後粉砕した。原料の前処理として0.02N水酸化ナトリウム水溶液に冷蔵庫中で1週間浸漬した。浸漬後、流水洗浄により過剰のアルカリを除去し、排出液が中性となるまで流水洗浄した。これに3倍容の蒸留水を加え、95℃に加熱後、上清を取り除くことにより、脂質及びコラーゲン質を除去した。残留物をフードカッターで細片化し、プロチンAC−10F(大和化成製0.5%)及びプロテアーゼN「アマノ」G(天野エンザイム製)0.1%を基質量の1%添加し、10時間分解を行った。85℃以上の温度で加熱失活を行い、ろ過及び遠心分離により残渣を分離した。その後精密ろ過によって清澄化した抽出液を噴霧乾燥し、水溶性のエラスチンペプチド粉末(8g)を得た。
Example 1: Production of bonito-derived elastin peptide powder Arterial spheres (100 g) were collected from fresh bonito, washed with running water and ground. As a pretreatment of the raw material, it was immersed in a 0.02N aqueous sodium hydroxide solution for 1 week in a refrigerator. After immersion, excess alkali was removed by running water washing, and running water washing was performed until the discharged liquid became neutral. To this was added 3 volumes of distilled water, heated to 95 ° C., and the supernatant was removed to remove lipids and collagen. The residue was cut into pieces with a food cutter, and Protin AC-10F (Yamato Kasei 0.5%) and Protease N “Amano” G (Amano Enzyme) 0.1% were added at 1% of the base mass for 10 hours. Decomposition was performed. Heat deactivation was performed at a temperature of 85 ° C. or higher, and the residue was separated by filtration and centrifugation. Thereafter, the extract clarified by microfiltration was spray-dried to obtain water-soluble elastin peptide powder (8 g).
実施例2:ハマチ由来エラスチンペプチド粉末の製造
原料として新鮮なハマチより採取した動脈球を用い、実施例1と同様の操作により、エラスチンペプチド粉末を得た。
Example 2: An elastin peptide powder was obtained in the same manner as in Example 1 using arterial spheres collected from fresh hamachi as a raw material for producing hamachi-derived elastin peptide powder.
実施例3:マグロ由来エラスチンペプチド粉末の製造
原料として新鮮なマグロより採取した動脈球を用い、実施例1と同様の操作により、エラスチンペプチド粉末を得た。
Example 3: Elastin peptide powder was obtained in the same manner as in Example 1 using arterial spheres collected from fresh tuna as a raw material for producing tuna-derived elastin peptide powder.
実施例1〜3により得られたエラスチンペプチドのアミノ酸分析結果を、下記の表1に示す。 The amino acid analysis results of the elastin peptides obtained according to Examples 1 to 3 are shown in Table 1 below.
いずれのエラスチンペプチドについても、1000残基あたりのグリシン、アラニン、バリン及びプロリン含量の合計が650残基以上であり、アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が10〜35残基であり、グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が20〜50残基であり、リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が20残基〜50残基であり、デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が0.3残基以上であり、ヒドロキシプロリン含量が10残基以下であることがわかる。 For any elastin peptide, the total of glycine, alanine, valine and proline content per 1000 residues is 650 residues or more, the sum of aspartic acid and asparagine content is 10 to 35 residues, glutamic acid and glutamine content The total of lysine, histidine and arginine content is 20 to 50 residues, the sum of desmosine and isodesmosine content is 0.3 residues or more, and the hydroxyproline content is It turns out that it is 10 residues or less.
実施例1〜3により得られたエラスチンペプチドのタンパク質、脂質、水分、及び灰分分析結果を、下記の表2に示す。 The results of protein, lipid, moisture, and ash content analysis of the elastin peptides obtained in Examples 1 to 3 are shown in Table 2 below.
実施例1〜3により得られたエラスチンペプチドの分子量測定結果(財団法人日本食品分析センター:TSKgel G2500PWXLカラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより測定)を、下記の表3に示す。なお、表3において「%」は重量%を意味する。 Table 3 below shows the molecular weight measurement results of the elastin peptides obtained in Examples 1 to 3 (measured by size exclusion chromatography using the Japan Food Analysis Center: TSKgel G2500PWXL column). In Table 3, “%” means wt%.
いずれのエラスチンペプチドについても、分子量1000以下のものが占める割合が70%以上であることがわかる。 As for any elastin peptide, it can be seen that the proportion occupied by those having a molecular weight of 1000 or less is 70% or more.
実施例4:ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定
100mM酢酸緩衝液(pH4.0)に溶解した所定の濃度のエラスチンペプチド溶液50μlにヒアルロニダーゼ(和光純薬製)16.5U、次いで33μlの0.5mM CaCl2(和光純薬製)を加え、37℃で5分間予備加温した。この溶液に最終濃度0.4mg/mlとなるようヒアルロン酸を加え、37℃で10分反応させた後、33μlの0.4N NaOHを加えて反応を停止させた。33μlの0.8Mホウ酸緩衝液(pH9.1)を反応液に加え、100℃で3分間加温した後、氷冷した。この溶液(サンプル)に1mlのp−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬を加え、37℃で20分間反応させた後、λ=585nmにおける吸光度を測定した。ヒアルロニダーゼ阻害活性は次式により求めた。
Example 4: Measurement of hyaluronidase inhibitory activity Hyaluronidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 16.5 U in 50 μl of elastin peptide solution at a predetermined concentration dissolved in 100 mM acetate buffer (pH 4.0), then 33 μl of 0.5 mM CaCl 2 ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and pre-warmed at 37 ° C. for 5 minutes. Hyaluronic acid was added to this solution to a final concentration of 0.4 mg / ml and reacted at 37 ° C. for 10 minutes, and then 33 μl of 0.4N NaOH was added to stop the reaction. 33 μl of 0.8 M borate buffer (pH 9.1) was added to the reaction solution, heated at 100 ° C. for 3 minutes, and then ice-cooled. 1 ml of p-dimethylaminobenzaldehyde reagent was added to this solution (sample) and reacted at 37 ° C. for 20 minutes, and then the absorbance at λ = 585 nm was measured. Hyaluronidase inhibitory activity was determined by the following formula.
ヒアルロニダーゼ阻害活性(%)=[(A−B)−(C−D)]/(A−B)×100
ここで、
A=コントロール(エラスチンペプチドを含まない以外はサンプルと同様に調製)の吸光度
B=ブランク(エラスチンペプチド及びヒアルロニダーゼを含まない以外はサンプルと同様に調製)の吸光度
C=サンプルの吸光度
D=サンプルブランク(ヒアルロニダーゼを含まない以外はサンプルと同様に調製)の吸光度
をそれぞれ意味する。
Hyaluronidase inhibitory activity (%) = [(A−B) − (C−D)] / (A−B) × 100
here,
A = absorbance of control (prepared in the same manner as the sample except for no elastin peptide) B = absorbance of blank (prepared in the same manner as the sample except for no elastin peptide and hyaluronidase) C = absorbance of the sample D = sample blank ( It means the absorbance of each sample prepared except that it does not contain hyaluronidase.
図2及び図3に示すとおり、実施例1及び2で得られたエラスチンペプチドは、濃度依存的にヒアルロニダーゼ阻害活性を示すことがわかる。また、実施例3で得られたエラスチンペプチドについても、これらと同様の濃度依存的なヒアルロニダーゼ阻害活性が確認された。 2 and 3, it can be seen that the elastin peptides obtained in Examples 1 and 2 show hyaluronidase inhibitory activity in a concentration-dependent manner. In addition, the elastin peptide obtained in Example 3 was also confirmed to have the same concentration-dependent hyaluronidase inhibitory activity.
実施例5:チロシナーゼ阻害活性の測定
0.1Mリン酸緩衝液(pH6.8)100μlに、20μlの所定の濃度のエラスチンペプチド溶液、20μlの500U/mlチロシナーゼ溶液を加えて35℃で5分間予備加温した。この溶液(サンプル)に60μlの0.05%L−チロシン溶液を加え、35℃で15分反応させた後、λ=490nmにおける吸光度を測定した。ヒアルロニダーゼ阻害活性は次式により求めた。
Example 5: Measurement of tyrosinase inhibitory activity To 100 μl of 0.1 M phosphate buffer (pH 6.8), 20 μl of a predetermined concentration of elastin peptide solution and 20 μl of 500 U / ml tyrosinase solution were added and preliminarily maintained at 35 ° C. for 5 minutes. Warmed up. 60 μl of 0.05% L-tyrosine solution was added to this solution (sample) and reacted at 35 ° C. for 15 minutes, and then the absorbance at λ = 490 nm was measured. Hyaluronidase inhibitory activity was determined by the following formula.
チロシナーゼ阻害活性(%)=[(A−B)−(C−D)]/(A−B)×100
ここで、
A=コントロールの吸光度
B=ブランクの吸光度
C=サンプルの吸光度
D=サンプルブランクの吸光度
をそれぞれ意味する。なお、「コントロール」、「ブランク」、「サンプルブランク」の定義は、実施例4の場合と同様である。
Tyrosinase inhibitory activity (%) = [(A−B) − (C−D)] / (A−B) × 100
here,
A = absorbance of control B = absorbance of blank C = absorbance of sample D = absorbance of sample blank. The definitions of “control”, “blank”, and “sample blank” are the same as those in the fourth embodiment.
図4に示すとおり、実施例1で得られたエラスチンペプチドは濃度依存的にチロシナーゼ阻害活性を示すことがわかる。また、実施例2及び3で得られたエラスチンペプチドについても、濃度依存的なチロシナーゼ阻害活性が確認された。 As shown in FIG. 4, it can be seen that the elastin peptide obtained in Example 1 exhibits tyrosinase inhibitory activity in a concentration-dependent manner. In addition, the elastin peptides obtained in Examples 2 and 3 were also confirmed to have concentration-dependent tyrosinase inhibitory activity.
実施例6:エラスチンペプチドが加速度脈波に及ぼす影響の検討
46名の被験者(男性30名、平均年齢43.8±11.5歳、女性16名、平均年齢42.3±11.8歳)に、実施例1〜3により得られたエラスチンペプチドを含有するサプリメントを投与し、投与前及び投与開始後1月毎に、加速度脈波の測定を行った。投与したサプリメント(占部大観堂製薬株式会社に調製を依頼)の配合は表4のとおりとした。サプリメントは、チャックシールアルミパウチ(乾燥剤封入、250mg×150錠入)で提供した。
Example 6: Examination of effect of elastin peptide on acceleration pulse wave 46 subjects (30 men, average age 43.8 ± 11.5 years, 16 women, average age 42.3 ± 11.8 years) The supplement containing the elastin peptide obtained in Examples 1 to 3 was administered, and the acceleration pulse wave was measured before administration and every month after the start of administration. Table 4 shows the composition of the administered supplement (requested for preparation from Senbe Daikando Pharmaceutical Co., Ltd.). The supplement was provided in a chuck seal aluminum pouch (with desiccant enclosed, 250 mg × 150 tablets).
エラスチンペプチド含有サプリメント2錠を、就寝前に水又はぬるま湯にて摂取させた。1日あたりのエラスチンペプチド摂取量は360mgとした(タンパク質含量90%と仮定)。 Two tablets of elastin peptide-containing supplement were ingested with water or lukewarm water before going to bed. The elastin peptide intake per day was 360 mg (assuming a protein content of 90%).
加速度脈波の測定は、当社診療所にて看護師指導の下、加速度脈波測定システムArtett((株)ユメディカ)により行なった。被験者は5分間程度の安静の後、Artettセンサに人差し指もしくは中指を挿入して18秒間の指先容積脈波、指先容積脈波の二次微分波である加速度脈波を測定した。加速度脈波を構成する要素波のうち、血管弾力性や抵抗性に関与するb波、d波よりWaveform index及び血管老化偏差値を得た。 The acceleration pulse wave was measured by an acceleration pulse wave measurement system Artett (Umedica Co., Ltd.) under the guidance of a nurse at our clinic. After resting for about 5 minutes, the test subject inserted an index finger or middle finger into the Artett sensor, and measured the acceleration pulse wave, which is the second derivative of the fingertip volume pulse wave and the fingertip volume pulse wave for 18 seconds. Waveform index and vascular aging deviation value were obtained from b wave and d wave related to vascular elasticity and resistance among the element waves constituting the acceleration pulse wave.
実施例1により得られたエラスチンペプチドより調製したサプリメントを投与した各被験者(男性群及び女性群)の加速度脈波波形パラメータ及び血管老化偏差値は、下記の表5及び表6に示すとおりであった。結果は平均±標準偏差で示した。なお、「p<0.05」及び「p<0.01」は、それぞれ、t検定における有意確率p値が5%未満及び1%未満であることを表したものである。 The acceleration pulse wave parameter and blood vessel aging deviation value of each subject (male group and female group) to which a supplement prepared from the elastin peptide obtained in Example 1 was administered were as shown in Table 5 and Table 6 below. It was. The results are shown as mean ± standard deviation. “P <0.05” and “p <0.01” represent that the significance probability p-value in the t-test is less than 5% and less than 1%, respectively.
男性群において、摂取3月目より加速度脈波(波高比b/a、Waveform index I)及び血管老化偏差値に有意な改善が認められた。女性群では5月目に加速度脈波(波高比d/a)に有意な改善が認められた。
なお、実施例2及び実施例3で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。
In the male group, significant improvement was observed in the acceleration pulse wave (wave height ratio b / a, Waveform index I) and vascular aging deviation value from the third month of ingestion. In the female group, significant improvement was observed in the acceleration pulse wave (wave height ratio d / a) in May.
Similar results were obtained for the elastin peptides obtained in Example 2 and Example 3.
実施例7:平滑筋増殖阻害活性の測定
細胞は正常ヒト大動脈血管平滑筋細胞(クラボウ)を使用し、培養培地は専用培地であるHumedia−SG2を使用した。
Example 7: Measurement of smooth muscle growth inhibitory activity Normal human aortic vascular smooth muscle cells (Kurabo) were used as cells, and Humedia-SG2, which is a dedicated medium, was used as the culture medium.
25cm2フラスコにてセミコンフルエントになるまで平滑筋細胞を培養し、常法にて細胞を回収した。回収した細胞は、Humedia−SG2を用いて2×104cells/mlに調製し、96well plateに0.1mlずつ播種した。細胞播種24時間後に培地を除去し、エラスチンペプチドを溶解した培地0.1mlを添加した(最終エラスチン濃度125、250、500、1000、2000μg/ml)。培養開始から4日後(エラスチンペプチド添加から3日後)に培養上清を除去し、PBSで細胞表面を洗浄し新たな培地を100μl/wellずつ添加した。さらにcellcountingkit−8(同仁化学研究所)を10μl/well添加し、37℃で1時間保持した。色素が発色している事を確認し、マイクロプレートリーダーを用いて450nmを測定した。 Smooth muscle cells were cultured until they became semi-confluent in a 25 cm 2 flask, and the cells were collected by a conventional method. The collected cells were prepared to 2 × 10 4 cells / ml using Humedia-SG2, and 0.1 ml each was seeded on a 96-well plate. The culture medium was removed 24 hours after cell seeding, and 0.1 ml of a medium in which the elastin peptide was dissolved was added (final elastin concentration 125, 250, 500, 1000, 2000 μg / ml). Four days after the start of culture (three days after the addition of elastin peptide), the culture supernatant was removed, the cell surface was washed with PBS, and a new medium was added in an amount of 100 μl / well. Furthermore, 10 μl / well of cellcountingkit-8 (Dojindo Laboratories) was added and held at 37 ° C. for 1 hour. After confirming that the dye was colored, 450 nm was measured using a microplate reader.
実施例1で得られたエラスチンペプチドについて、結果を図5に示す。エラスチンペプチドを添加したもの全てに増殖抑制の傾向が見られ、1000、2000μg/ml添加した区ではコントロールに対しそれぞれ90.2%、82.2%の細胞増殖率(ともにp<0.01)となり、平滑筋増殖抑制効果があることが示唆された。
なお、実施例2及び実施例3で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。
The results for the elastin peptide obtained in Example 1 are shown in FIG. A tendency of growth inhibition was observed in all of those added with elastin peptide, and cell growth rates of 90.2% and 82.2% with respect to the control (both p <0.01) in the group added with 1000 and 2000 μg / ml, respectively. Thus, it was suggested that there was an effect of suppressing smooth muscle proliferation.
Similar results were obtained for the elastin peptides obtained in Example 2 and Example 3.
実施例8:エラスチン産生促進活性の測定
エラスチンペプチドを線維芽細胞に添加し、線維芽細胞から産出された培養上清中のエラスチンの定量を行った。線維芽細胞の培養条件は、培養培地としてD−MEM(1%FBS、50units/ml ペニシリンG、50μg/ml ストレプトマイシン含有)を使用し、細胞数は2×105cells/mlに調製し、96well plateに100μlずつ播種した(2×104cells/well)。24時間後、培養培地を除去し、90μlの培養培地を全てのwellに添加し、PBSに溶解したエラスチンペプチドを10、100、1000μg/mlになるように添加した。エラスチンペプチド溶液は0.22μmのフィルターを通すことにより滅菌したものを使用した。エラスチンペプチド添加後、3日後の培養上清を採取し、線維芽細胞から産出されたエラスチン量測定のサンプルとした。
線維芽細胞から産出されたエラスチン量の定量はELISA法にて行った。
Example 8: Measurement of elastin production promoting activity Elastin peptide was added to fibroblasts, and elastin in the culture supernatant produced from the fibroblasts was quantified. Fibroblast culture conditions were such that D-MEM (1% FBS, 50 units / ml penicillin G, containing 50 μg / ml streptomycin) was used as the culture medium, and the number of cells was adjusted to 2 × 10 5 cells / ml. 100 μl each was seeded on the plate (2 × 10 4 cells / well). After 24 hours, the culture medium was removed, 90 μl of culture medium was added to all wells, and elastin peptide dissolved in PBS was added at 10, 100, and 1000 μg / ml. The elastin peptide solution used was sterilized by passing through a 0.22 μm filter. Three days after the addition of elastin peptide, the culture supernatant was collected and used as a sample for measuring the amount of elastin produced from fibroblasts.
The amount of elastin produced from fibroblasts was quantified by ELISA.
実施例1で得られたエラスチンペプチドについて、エラスチンペプチドの添加量とエラスチン産生量(コントロールに対する相対値)との関係を図6に示す。エラスチンペプチド添加によって濃度依存的にエラスチン産生が促進され、100、1000μg/ml添加した区ではコントロールに対しそれぞれ130%、139%の産生促進率(それぞれp<0.05、p<0.01)となり、エラスチン産生促進効果があることを示唆する結果が得られた。
なお、実施例2及び実施例3で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。
FIG. 6 shows the relationship between the amount of elastin peptide added and the amount of elastin produced (relative to the control) for the elastin peptide obtained in Example 1. Elastin production is promoted in a concentration-dependent manner by the addition of elastin peptide, and the production promotion rates of 130% and 139%, respectively, are 100% and 139% of the control group (p <0.05 and p <0.01, respectively). Thus, the results suggesting that there is an elastin production promoting effect were obtained.
Similar results were obtained for the elastin peptides obtained in Example 2 and Example 3.
実施例9:エンドセリン−1産生抑制活性の測定
細胞は正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)(クラボウ)を使用し、培養培地は専用培地であるHumedia−EG2を使用した。
25cm2フラスコにて前培養した血管内皮細胞を常法にて回収した。回収した細胞を1×104cells/wellとなるよう24well plateへ播種し、ほぼコンフルエントとなるまで4〜5日間培養した。培地を除去し、PBSで洗浄した後、培地0.9mlとPBSに溶解した実施例1で得られたエラスチンペプチド、または対照(コントロール)としてPBSを0.1ml添加し、エラスチンペプチドの終濃度を0.1、0.5、1、5μg/mlとした。エラスチンペプチド溶液は0.22μmのフィルターを通すことにより滅菌したものを使用した。37℃、5%CO2下で24時間培養後、培養上清を回収し、サンプルとした。培養上清中のエンドセリン−1量はEndothelin−1(human)EIA Kit(assay designs)にて定量した。
Example 9: Measurement of Endothelin-1 Production Inhibitory Activity Normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (Kurabo) were used as the cells, and Humedia-EG2, which is a dedicated medium, was used as the culture medium.
Vascular endothelial cells pre-cultured in a 25 cm 2 flask were collected by a conventional method. The collected cells were seeded on a 24 well plate so as to be 1 × 10 4 cells / well and cultured for 4 to 5 days until almost confluent. After removing the medium and washing with PBS, 0.9 ml of medium and the elastin peptide obtained in Example 1 dissolved in PBS, or 0.1 ml of PBS as a control (control) were added, and the final concentration of elastin peptide was determined. 0.1, 0.5, 1 and 5 μg / ml. The elastin peptide solution used was sterilized by passing through a 0.22 μm filter. After culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours, the culture supernatant was collected and used as a sample. The amount of endothelin-1 in the culture supernatant was quantified with Endothelin-1 (human) EIA Kit (assay designs).
図7に示すとおり、エラスチンペプチドによって濃度依存的にエンドセリン−1産生が抑制され、その産生量は対照(control)におけるエンドセリン−1の産生量を100%とすると、1μg/mlでは89.8%、5μg/mlでは88.1%(共にp<0.001)であった。これらの結果から、実施例1で得られたエラスチンペプチドにエンドセリン産生抑制活性があることが確認された。
なお、実施例2及び3で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。
As shown in FIG. 7, the production of endothelin-1 is suppressed in a concentration-dependent manner by the elastin peptide, and the production amount is 89.8% at 1 μg / ml, assuming that the production amount of endothelin-1 in the control is 100%. At 5 μg / ml, it was 88.1% (both p <0.001). From these results, it was confirmed that the elastin peptide obtained in Example 1 has endothelin production inhibitory activity.
Similar results were obtained for the elastin peptides obtained in Examples 2 and 3.
実施例10:組織プラスミノーゲン活性化因子(t−PA)産生抑制活性の測定
細胞は正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)(クラボウ)を使用し、培養培地は専用培地HuMedia−EG2(クラボウ)を用いた。
25cm2フラスコにて前培養した血管内皮細胞を常法にて回収した。回収した細胞を1×104cells/wellとなるよう24well plateへ播種し、ほぼコンフルエントとなるまで4〜5日間培養した。培地を除去し、PBSで2回洗浄した後、測定培地(RPMI1640(5%FBSを含む))0.9mlとPBSに溶解した実施例1で得られたエラスチンペプチド、または対照(コントロール)としてPBSを0.1ml添加し、エラスチンペプチドの終濃度を10、100、1000μg/mlとした。エラスチンペプチド溶液は0.22μmのフィルターを通すことにより滅菌したものを使用した。37℃、5%CO2下で24時間培養後、培養上清を回収した。回収後、4℃、2000gで10分間遠心分離し、上清をサンプルとした。培養上清中のt−PA量はAssay Max Human Tissue‐Type Plasminogen Activator ELISA Kit(ASSAYPRO)にて定量した。
Example 10: Measurement of tissue plasminogen activator (t-PA) production inhibitory activity Normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) (Kurabo) were used as the culture medium, and the dedicated culture medium HuMedia-EG2 (Kurabo) was used as the culture medium. ) Was used.
Vascular endothelial cells pre-cultured in a 25 cm 2 flask were collected by a conventional method. The collected cells were seeded on a 24 well plate so as to be 1 × 10 4 cells / well and cultured for 4 to 5 days until almost confluent. After removing the medium and washing twice with PBS, 0.9 ml of measurement medium (RPMI1640 (containing 5% FBS)) and the elastin peptide obtained in Example 1 dissolved in PBS, or PBS as a control (control) 0.1 ml was added to make final concentrations of elastin peptide of 10, 100, 1000 μg / ml. The elastin peptide solution used was sterilized by passing through a 0.22 μm filter. After culturing at 37 ° C. under 5% CO 2 for 24 hours, the culture supernatant was recovered. After collection, the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 2000 g for 10 minutes, and the supernatant was used as a sample. The amount of t-PA in the culture supernatant was quantified with an Assay Max Human Tissue-Type Plasminogen Activator ELISA Kit (ASSAYPRO).
図8に示すとおり、エラスチンペプチドによって濃度依存的にt−PA産生が促進され、その産生量は対照(コントロール)のt−PA量を100%とすると、10μg/mlでは105.2%、100μg/mlでは106.2%(p<0.05)、1000μg/mlでは113.1%(p<0.01)であった。これらの結果から、実施例1で得られたエラスチンペプチドにt−PA産生促進活性があることが確認された。
なお、実施例2及び3で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。
As shown in FIG. 8, the elastin peptide promotes t-PA production in a concentration-dependent manner, and its production amount is 105.2% and 100 μg at 10 μg / ml when the control (control) t-PA amount is 100%. It was 106.2% (p <0.05) at / ml, and 113.1% (p <0.01) at 1000 μg / ml. From these results, it was confirmed that the elastin peptide obtained in Example 1 has t-PA production promoting activity.
Similar results were obtained for the elastin peptides obtained in Examples 2 and 3.
実施例11:血管内皮細胞に対する増殖促進活性の測定
細胞は正常ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(HUVEC)(クラボウ)を使用し、培養培地は専用培地であるHumedia−EG2を使用した。
25cm2フラスコにて前培養した血管内皮細胞を常法にて回収した。回収した細胞をEG−2培地に懸濁し、96wellプレートに1×103cells播種した。同時にPBSに実施例1で得られたエラスチンペプチドを溶解させた被験物を培養液の1/10量添加した。CO2インキュベーター内で(37℃、5% CO2)3日間培養後、cell counting Kit−8を用いて450nmの吸光度を測定した。対照(コントロール)としてPBSのみ添加した。コントロールの吸光度を100とし、エラスチンペプチド添加区の相対値を求めた。
Example 11: Measurement of proliferation promoting activity on vascular endothelial cells Normal human umbilical vein vascular endothelial cells (HUVEC) (Kurabo) were used, and the culture medium used was Humedia-EG2, which is a dedicated medium.
Vascular endothelial cells pre-cultured in a 25 cm 2 flask were collected by a conventional method. The collected cells were suspended in EG-2 medium and seeded at 1 × 10 3 cells in a 96-well plate. At the same time, a test product in which the elastin peptide obtained in Example 1 was dissolved in PBS was added to 1/10 of the culture solution. After culturing in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 3 days, the absorbance at 450 nm was measured using a cell counting kit-8. Only PBS was added as a control. The absorbance of the control was taken as 100, and the relative value of the elastin peptide addition group was determined.
図9に示すとおり、実施例1で得られたエラスチンペプチドによって濃度依存的に血管内皮細胞増殖促進効果を示し、コントロールに対して12.5μg/ml添加区では108%、25μg/mlでは110%、50μg/mlでは115%(p<0.01)であった。
なお、実施例2及び3で得られたエラスチンペプチドについても同様の結果が得られた。
As shown in FIG. 9, the elastin peptide obtained in Example 1 showed an effect of promoting the proliferation of vascular endothelial cells in a concentration-dependent manner, and was 108% in the group added with 12.5 μg / ml and 110% at 25 μg / ml relative to the control. At 50 μg / ml, it was 115% (p <0.01).
Similar results were obtained for the elastin peptides obtained in Examples 2 and 3.
Claims (18)
アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が10残基/1000残基以上35残基/1000残基以下であり、
グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が20残基/1000残基以上50残基/1000残基以下であり、
リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が20残基/1000残基以上50残基/1000残基以下であり、
デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が0.3残基/1000残基以上であり、
ヒドロキシプロリン含量が10残基/1000残基以下であることを特徴とする請求項1記載の皮膚改善剤。 The total content of glycine, alanine, valine and proline is 650 residues / 1000 residues or more,
The total aspartic acid and asparagine content is 10 residues / 1000 residues or more and 35 residues / 1000 residues or less,
The total glutamic acid and glutamine content is 20 residues / 1000 residues or more and 50 residues / 1000 residues or less,
The total content of lysine, histidine and arginine is 20 residues / 1000 residues or more and 50 residues / 1000 residues or less,
The sum of desmosine and isodesmosine content is 0.3 residues / 1000 residues or more,
The skin improving agent according to claim 1, wherein the hydroxyproline content is 10 residues / 1000 residues or less.
アスパラギン酸及びアスパラギン含量の合計が10残基/1000残基以上35残基/1000残基以下であり、
グルタミン酸及びグルタミン含量の合計が20残基/1000残基以上50残基/1000残基以下であり、
リジン、ヒスチジン及びアルギニン含量の合計が20残基/1000残基以上50残基/1000残基以下であり、
デスモシン及びイソデスモシン含量の合計が0.3残基/1000残基以上であり、
ヒドロキシプロリン含量が10残基/1000残基以下であることを特徴とする請求項7記載の血管改善剤。 The total content of glycine, alanine, valine and proline is 650 residues / 1000 residues or more,
The total aspartic acid and asparagine content is 10 residues / 1000 residues or more and 35 residues / 1000 residues or less,
The total glutamic acid and glutamine content is 20 residues / 1000 residues or more and 50 residues / 1000 residues or less,
The total content of lysine, histidine and arginine is 20 residues / 1000 residues or more and 50 residues / 1000 residues or less,
The sum of desmosine and isodesmosine content is 0.3 residues / 1000 residues or more,
8. The blood vessel improving agent according to claim 7, wherein the hydroxyproline content is 10 residues / 1000 residues or less.
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