JP2010148457A - Device for cell and method for producing device for cell - Google Patents

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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means which is suitable for handling cells, especially suitable for handling the cells on the cryopreservation and culture of the cells by using a hollow fiber, and is suitable for preventing the breakage of the follow fiber. <P>SOLUTION: This device 10 for cells comprises: a hollow fiber 11 whose both ends are opened; an injection needle 12 connected to the first end 21 of the hollow fiber 11 to form a passage whose inner space is connected to the inner space of the hollow fiber 11; and a core material 13 inserted into the hollow fiber 11. The core material 13 can be pulled out from the hollow fiber 11, when used. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、細胞の取り扱いに好適に用いられ、中空糸の内部空間に細胞を内包しうる細胞用デバイスに関し、特に中空糸の破損防止に適した手段を有する細胞用デバイスに関する。   The present invention relates to a cell device that can be suitably used for handling cells and can enclose cells in the internal space of a hollow fiber, and more particularly to a cell device having means suitable for preventing breakage of a hollow fiber.

また、本発明は、中空糸の破損防止に適した芯材を、中空糸を管体に結合するに適した治具として用いる細胞用デバイスの製造方法に関する。   The present invention also relates to a method for producing a cell device using a core material suitable for preventing breakage of a hollow fiber as a jig suitable for coupling the hollow fiber to a tubular body.

ヒトの不妊治療や動物のクローンの分野において、卵子や初期胚などの生殖細胞を培養したり凍結保存することがある。この培養や凍結保存において、生殖細胞を培地から取り出したり、凍結保存容器に対して出し入れしたりすることがある。このような生殖細胞の取り扱い作業は、ピペットの如くストロー形状の器具を用いて、生殖細胞をストロー内へ吸い込む或いはストロー内から吐き出すことにより行われている。この他にも、膜状又は板状のデバイス(例えば、北里サプライ社製、クライオトップ)が用いられたり、ループ形状のナイロン糸(例えば、北里サプライ社製、クライオループ)が用いられたりしている。   In the field of human infertility treatment and animal cloning, germ cells such as eggs and early embryos are sometimes cultured or cryopreserved. In this culture and cryopreservation, germ cells may be taken out of the medium or taken in and out of the cryopreservation container. Such a germ cell handling operation is performed by sucking germ cells into or discharging them from the straw using a straw-shaped instrument such as a pipette. In addition, a film-like or plate-like device (for example, Kitasato Supply Co., Ltd., Cryotop) is used, or a loop-shaped nylon thread (for example, Kitasato Supply Co., Ltd., Cryoloop) is used. Yes.

特許文献1には、初期胚の遺伝情報の判定のために使用される器具が開示されている。この器具は、移植前初期胚から細胞を取り出すために使用され、ピペットに類似するパイプ材(2)を有する。このパイプ材(2)は、細いガラス管であり、その先端に鋭利な突き刺し部(3)が形成されている。パイプ材(2)の他端はマイクロマニピュレータ用の微量吸引及び排出が可能な操作器具に接続されている。初期胚にパイプ材(2)が突き刺され、初期胚内の細胞がパイプ材(2)の内部に吸引される。   Patent Document 1 discloses an instrument used for determining genetic information of an early embryo. This instrument is used to remove cells from an early embryo prior to transplantation and has a pipe material (2) similar to a pipette. This pipe material (2) is a thin glass tube, and a sharp piercing portion (3) is formed at the tip thereof. The other end of the pipe material (2) is connected to an operating instrument for micro-manipulators capable of micro-aspiration and discharge. The pipe material (2) is stabbed into the early embryo, and the cells in the early embryo are sucked into the pipe material (2).

特許文献2には、中空糸内部で細胞を培養又は保存するための器具が開示されている。この器具は、細胞懸濁液流通管(1)に中空糸固定部(3)を介して中空糸(4)の束が固定され、その中空糸(4)の束の先端が硬化性樹脂(5)で封止されている。中空糸(4)の束が培地に浸漬された状態で細胞懸濁液流通管(1)が吸引され、細胞懸濁液流通管(1)及び中空糸(4)の束に培地が満たされる。その後、細胞懸濁液流通管(1)を通じて中空糸(4)の束に細胞懸濁液が注入されると、中空糸(4)の内部に細胞が堆積される。   Patent Document 2 discloses an instrument for culturing or storing cells inside a hollow fiber. In this instrument, a bundle of hollow fibers (4) is fixed to a cell suspension flow tube (1) via a hollow fiber fixing portion (3), and the tip of the bundle of hollow fibers (4) is a curable resin ( 5). The cell suspension flow tube (1) is sucked with the bundle of hollow fibers (4) immersed in the medium, and the medium is filled into the bundle of cell suspension flow tubes (1) and hollow fibers (4). . Thereafter, when the cell suspension is injected into the bundle of hollow fibers (4) through the cell suspension flow pipe (1), cells are deposited inside the hollow fibers (4).

特許文献3には、生体組織マトリックスへ細胞を播種する方法が開示されている。この方法においては、播種すべき細胞が充填された生体分解性中空糸が生体組織片に埋め込まれ、その生体組織片において中空糸から細胞が放出される。   Patent Document 3 discloses a method of seeding cells on a biological tissue matrix. In this method, a biodegradable hollow fiber filled with cells to be seeded is embedded in a biological tissue piece, and cells are released from the hollow fiber in the biological tissue piece.

特開2003−33200号公報JP 2003-33200 A 特開2003−339368号公報JP 2003-339368 A 特開2007−168号公報JP 2007-168 A

しかし、生殖細胞の培養において培地を交換する度に、従来のストロー形状の器具を用いて、培地などに対して生殖細胞の取出し及び吐き出しを繰り返す作業は煩雑であるという問題がある。   However, every time the medium is exchanged in the culture of germ cells, there is a problem that the operation of repeatedly taking out and discharging germ cells from the medium or the like using a conventional straw-shaped instrument is complicated.

また、生殖細胞を凍結保存する際に、例えばガラス化により凍結保存するのであれば、濃度勾配を有する複数のガラス化平衡液に生殖細胞を順次浸漬するが、その際に、従来のストロー形状の器具を用いて、複数種のガラス化平衡液に対して生殖細胞の注入及び取出しを繰り返す作業は煩雑であるという問題がある。さらには、凍結保存された生殖細胞を解凍して培地に注入する際にも、同様の煩雑さが問題となる。   In addition, when cryopreserving germ cells, for example, if cryopreserving by vitrification, germ cells are sequentially immersed in a plurality of vitrification equilibrium solutions having a concentration gradient. There is a problem that the operation of repeatedly injecting and taking out germ cells from a plurality of types of vitrification equilibria using an instrument is complicated. Furthermore, the same complexity also becomes a problem when thawing cryopreserved germ cells and injecting them into the medium.

本発明は、これらの事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、細胞の取り扱いに好適であり、特に中空糸が用いられることによって、凍結保存や培養に際しての細胞の取り扱いに適し、かつ中空糸の破損防止に適した手段を提供することにある。   The present invention has been made in view of these circumstances, and the object thereof is suitable for handling cells, and in particular, by using hollow fibers, it is suitable for handling cells during cryopreservation and culture, and An object of the present invention is to provide means suitable for preventing breakage of a hollow fiber.

また、本発明の目的は、中空糸の破損防止に適した芯材を、中空糸を管体に結合するに適した治具として用いて細胞用デバイスを簡易に製造できる手段を提供することにある。   Another object of the present invention is to provide a means for easily producing a device for a cell using a core material suitable for preventing breakage of a hollow fiber as a jig suitable for coupling the hollow fiber to a tubular body. is there.

(1) 本発明に係る細胞用デバイスは、両端が開口された中空糸と、上記中空糸の第1端に接続されて、その内部空間が当該中空糸の内部空間と連続する流路を構成する管体と、上記中空糸に挿通された芯材と、を具備する。上記芯材は、使用に際して上記中空糸から脱抜可能である。   (1) The cell device according to the present invention comprises a hollow fiber having both ends opened and a flow path connected to the first end of the hollow fiber, the inner space of which is continuous with the inner space of the hollow fiber. And a core material inserted through the hollow fiber. The core material can be removed from the hollow fiber in use.

本発明における細胞としては、生殖細胞が挙げられる。生殖細胞とは、始原生殖細胞、精子、精子細胞、卵子、卵母細胞、初期胚を含む包括的な概念である。ここで、精子細胞とは、精子となる過程における前駆細胞をいう。卵母細胞とは、卵子となる過程における前駆細胞をいう。初期胚とは、着床前の受精卵をいう。なお、本発明に係る細胞用デバイスは、生殖細胞以外にも、ES細胞のような細胞の取り扱いに用いられてもよい。   Examples of the cells in the present invention include germ cells. Germ cells are a generic concept that includes primordial germ cells, sperm, sperm cells, eggs, oocytes, and early embryos. Here, the sperm cell refers to a progenitor cell in the process of becoming a sperm. An oocyte refers to a progenitor cell in the process of becoming an egg. An early embryo refers to a fertilized egg before implantation. Note that the cell device according to the present invention may be used for handling cells such as ES cells in addition to germ cells.

中空糸とは、細胞を通過させないが、水や電解質、タンパク質などを通過させうる径の孔を複数有する膜がストロー形状に成形されたものをいう。中空糸を形成する膜として、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロースアセテート、再生セルロースなどが挙げられる。この膜が有する細孔径は、ナノメートルオーダーのものであればよい。また、膜の厚みは、前述の細胞を観察できる程度の透明性を中空糸が有するためには、好ましくは0.5〜30μmであり、さらに好ましくは1〜10μmである。   The hollow fiber refers to a membrane in which a cell having a plurality of pores having a diameter that does not allow cells to pass through but allows water, electrolytes, proteins, and the like to pass therethrough is formed into a straw shape. Examples of the membrane forming the hollow fiber include polysulfone, polyethersulfone, polyacrylonitrile, polyamide, polyethylene, polypropylene, cellulose acetate, and regenerated cellulose. The pore diameter of the membrane may be in the nanometer order. Further, the thickness of the membrane is preferably 0.5 to 30 μm, and more preferably 1 to 10 μm, in order for the hollow fiber to have transparency that allows the aforementioned cells to be observed.

中空糸の内径は、対象となる細胞を内包することができる程度が選択され、好ましくは20〜1000μmであり、さらに好ましくは50〜500μmである。   The inner diameter of the hollow fiber is selected so that the target cells can be included, and is preferably 20 to 1000 μm, and more preferably 50 to 500 μm.

中空糸の長さは、数個の細胞を内包することが可能であり、後述される気泡を形成したりするに適した長さが選択され、好ましくは1〜100mmであり、さらに好ましくは10〜40mmである。中空糸の長さがこの範囲内であれば、卵母細胞、卵子及び初期胚であれば1〜数十個程度を内包することができ、始原生殖細胞、精子及び精子細胞であれば数十〜数万個程度を内包することができ、かつ、その内包された複数個の生殖細胞に対して中空糸の両開口側に気泡を形成することができる。   The length of the hollow fiber can enclose several cells, and a length suitable for forming bubbles to be described later is selected, preferably 1 to 100 mm, and more preferably 10 ~ 40 mm. If the length of the hollow fiber is within this range, about 1 to several tens of cells can be encapsulated in the case of an oocyte, egg and early embryo, and several tens of cells in case of a primordial germ cell, sperm and sperm cell. About tens of thousands can be encapsulated, and bubbles can be formed on both open sides of the hollow fiber with respect to the encapsulated germ cells.

第1管体は、中空糸と接続可能なものであって、接続された中空糸を支持する剛性を有する。第1管体は、その内部空間が中空糸の内部空間と連続して気体又は液体の流路となり得るものである。第1管体の素材は特に限定されないが、例えば、ステンレスなどの金属や、プラスチック、ガラスなどが挙げられる。   The first tubular body can be connected to a hollow fiber and has rigidity to support the connected hollow fiber. The first tubular body can have a gas or liquid flow path in which the internal space is continuous with the internal space of the hollow fiber. The material of the first tubular body is not particularly limited, and examples thereof include metals such as stainless steel, plastic, and glass.

第1管体の形状は、特に限定されず、円管、角管などを採用しうるが、通常、中空糸が円筒形状となるので、円管であることが好ましい。   The shape of the first tubular body is not particularly limited, and a circular tube, a square tube, or the like can be adopted. However, since the hollow fiber is generally cylindrical, a circular tube is preferable.

第1管体の外径又は内径は、中空糸との接続を考慮して選択される。例えば、第1管体に対して中空糸を外嵌させるのであれば、第1管体の外径は中空糸の内径と同程度としてもよい。逆に、中空糸に対して第1管体を外嵌させるのであれば、第1管体の内径は中空糸の外径と同程度としてもよい。また、筒形状のジョイントを用いて中空糸と第1管体とを接続するのであれば、第1管体の外径は中空糸の外径と同程度としてもよい。   The outer diameter or inner diameter of the first tubular body is selected in consideration of the connection with the hollow fiber. For example, if the hollow fiber is externally fitted to the first tubular body, the outer diameter of the first tubular body may be approximately the same as the inner diameter of the hollow fiber. Conversely, if the first tubular body is externally fitted to the hollow fiber, the inner diameter of the first tubular body may be approximately the same as the outer diameter of the hollow fiber. If the hollow fiber and the first tube are connected using a cylindrical joint, the outer diameter of the first tube may be approximately the same as the outer diameter of the hollow fiber.

第1管体の長さは、ハンドリングを考慮して選択され、50〜1000mm程度がハンドリングに優れるので好適である。   The length of the first tubular body is selected in consideration of handling, and about 50 to 1000 mm is preferable because it is excellent in handling.

中空糸と第1管体との接続は、内嵌や外嵌、ジョイントによる機械的な接続構造が選択されてもよく、さらに医療用接着剤などを用いて接着固定が行われてもよい。   For the connection between the hollow fiber and the first tubular body, an internal fitting, an external fitting, or a mechanical connection structure by a joint may be selected, and further, adhesive fixing may be performed using a medical adhesive or the like.

芯材は、中空糸に挿抜可能なものであって、中空糸に挿通された状態において、中空糸が折れ曲がらないように支持する程度の剛性を有する。芯材の素材は特に限定されないが、例えば、ステンレスなどの金属やプラスチックなどが挙げられる。なお、芯材は、中空糸のみに挿通されるものであっても、中空糸及び第1管体に挿通されるものであってもよい。   The core material can be inserted into and removed from the hollow fiber, and has a rigidity enough to support the hollow fiber so that the hollow fiber is not bent when inserted into the hollow fiber. The material of the core material is not particularly limited, and examples thereof include metals such as stainless steel and plastics. The core material may be inserted only through the hollow fiber or may be inserted through the hollow fiber and the first tubular body.

芯材の形状は、特に限定されず、円柱や角柱などの棒材が採用されうるが、通常、中空糸が円筒形状となるので、円柱形状の棒材であることが好ましい。また、芯材の外径は、中空糸への挿通を考慮して選択され、中空糸の内径より若干小さい外径のものが好適である。   The shape of the core material is not particularly limited, and a bar material such as a cylinder or a prism can be adopted. However, since the hollow fiber is generally cylindrical, it is preferably a columnar bar material. The outer diameter of the core material is selected in consideration of insertion into the hollow fiber, and an outer diameter slightly smaller than the inner diameter of the hollow fiber is preferable.

細胞用デバイスの使用に際して、芯材を中空糸から脱抜する。これにより、中空糸内に細胞を吸引することができる。一方、使用までの間においては、芯材によって中空糸が支持されることにより、中空糸が他の部材に接触したりして外力が加わって、中空糸が折れ曲がることが防止される。   When using the cell device, the core material is removed from the hollow fiber. Thereby, cells can be sucked into the hollow fiber. On the other hand, until the hollow fiber is supported by the core material, the hollow fiber is prevented from being bent due to an external force applied by the hollow fiber coming into contact with another member.

中空糸から芯材を抜き取った後、例えば、顕微鏡などによって培地中の細胞を確認して、細胞用デバイスの第1管体を操作して、第1管体に接続された中空糸を培地中に挿入し、中空糸の先端を細胞に近接させる。そして、適当な吸引具を用いて、第1管体を通じて中空糸の内部空間を負圧とすると、その負圧が吸引圧となって、中空糸の先端から細胞が培養液と共に中空糸の内部空間へ吸引される。複数個の細胞を中空糸の内部空間へ吸引する場合には、この作業を繰り返す。   After extracting the core material from the hollow fiber, for example, the cells in the medium are confirmed with a microscope or the like, and the first tubular body of the cell device is operated, so that the hollow fiber connected to the first tubular body is in the medium. And the tip of the hollow fiber is brought close to the cells. Then, when a negative pressure is applied to the inner space of the hollow fiber through the first tube using a suitable suction tool, the negative pressure becomes a suction pressure, and the cells are brought together with the culture solution from the tip of the hollow fiber into the hollow fiber. Sucked into space. This operation is repeated when a plurality of cells are sucked into the internal space of the hollow fiber.

培地から取り出した細胞を凍結保存する場合には、中空糸から細胞を取り出すことなく、中空糸に内包された状態の細胞を凍結保存溶液に浸漬する。前述のように、中空糸の孔は、細胞を通過させないが、培養液や凍結保存溶液などを通過させるので、中空糸の内部空間に細胞が内包された状態を維持しながら、中空糸の内部空間の培養液や細胞の細胞内液などを凍結保存溶液に置換することができる。そして、その中空糸を液体窒素などに浸漬することによって、中空糸内の細胞を凍結する。   When cryopreserving the cells removed from the medium, the cells encapsulated in the hollow fibers are immersed in the cryopreservation solution without removing the cells from the hollow fibers. As described above, the hollow fiber hole does not allow the cells to pass through, but allows the culture solution or cryopreservation solution to pass therethrough, so that the inside of the hollow fiber is maintained while maintaining the state in which the cells are encapsulated in the inner space of the hollow fiber. The culture medium in the space or the intracellular solution of the cells can be replaced with a cryopreservation solution. Then, the cells in the hollow fiber are frozen by immersing the hollow fiber in liquid nitrogen or the like.

凍結された細胞を内包する中空糸を保存するために、中空糸において細胞が存在する一部分を第1管体から切断して、中空糸を第1管体から分離する。そして、分離された中空糸をディープフリーザなどで冷凍保存する。また、中空糸を第1管体から切断することなく、中空糸が接続された第1管体を吸飲具等から取り外して、中空糸及び第1管体を冷凍保存に適した容器などに封入してディープフリーザなどで冷凍保存してもよい。   In order to preserve the hollow fiber containing the frozen cells, a part of the hollow fiber where the cells are present is cut from the first tube, and the hollow fiber is separated from the first tube. Then, the separated hollow fiber is frozen and stored in a deep freezer or the like. Moreover, without cutting the hollow fiber from the first tubular body, the first tubular body to which the hollow fiber is connected is removed from the drinking device, etc., and the hollow fiber and the first tubular body are made into a container suitable for freezing storage. It may be sealed and stored frozen in a deep freezer.

なお、前述のように中空糸の内部空間に内包されて凍結保存された細胞は、中空糸と共に加温液に浸すことにより解凍される。解凍後に、中空糸の一端から内部空間へ排出圧を付与すると、中空糸の内部空間から細胞が外部へ排出される。また、中空糸の内部空間に細胞を内包させた状態で培養を行うのであれば、解凍された中空糸を所望の培地中に投入すればよい。   Note that, as described above, the cells that are encapsulated in the internal space of the hollow fiber and cryopreserved are thawed by being immersed in a warming solution together with the hollow fiber. After thawing, when a discharge pressure is applied from one end of the hollow fiber to the internal space, the cells are discharged from the internal space of the hollow fiber to the outside. Further, if culturing is performed in a state where cells are encapsulated in the internal space of the hollow fiber, the thawed hollow fiber may be put into a desired medium.

(2) 上記芯材は、中空糸の両端から突出されたものであってもよい。   (2) The core material may protrude from both ends of the hollow fiber.

これにより、中空糸の両端が芯材によって支持されるので、その両端の破損が防止される。   Thereby, since the both ends of a hollow fiber are supported by a core material, the breakage of the both ends is prevented.

(3) 上記中空糸の第1端に対して上記管体が外嵌されて、上記中空糸と上記管体とが接続され、上記芯材は、上記中空糸の第1端に当接する段差部を有するものであってもよい。   (3) A step in which the tubular body is externally fitted to the first end of the hollow fiber, the hollow fiber and the tubular body are connected, and the core material is in contact with the first end of the hollow fiber. It may have a part.

中空糸の第1端側から芯材を挿入すると、芯材の段差部が中空糸の第1端と当接して、芯材の挿入限界が決定される。また、芯材の脱抜が、第1端側から引き抜く向きに限定されるので、中空糸の第1端側を鉛直上向きにしていれば、自重によって芯材が中空糸から脱落することがない。   When the core material is inserted from the first end side of the hollow fiber, the stepped portion of the core material contacts the first end of the hollow fiber, and the insertion limit of the core material is determined. Moreover, since the removal of the core material is limited to the direction in which the core material is pulled out from the first end side, the core material will not fall out of the hollow fiber by its own weight if the first end side of the hollow fiber is vertically upward. .

(4) 本発明に係る細胞用デバイスの製造方法は、両端が開口された中空糸に挿通可能な芯部と、当該中空糸の第1端と当接し得る段差部とを有する芯材を、当該中空糸を挿入可能な管体に挿通して、その段差部を当該管体内の所定位置に位置決めする第1ステップと、上記芯材の芯部を中空糸に挿通させるようにして、当該中空糸の第1端を上記管体に挿入し、当該第1端を上記芯材の段差部に当接させて、上記管体に対して当該中空糸を位置決めする第2ステップと、上記中空糸の第1端側と上記管体との間に接着剤を充填して、上記中空糸と上記管体とを結合する第3ステップと、を含む。   (4) In the method for producing a cell device according to the present invention, a core material having a core part that can be inserted into a hollow fiber having both ends opened, and a step part that can come into contact with the first end of the hollow fiber, A first step of inserting the hollow fiber into an insertable tube and positioning the stepped portion at a predetermined position in the tube; and inserting the core of the core into the hollow fiber, A second step of inserting the first end of the yarn into the tube, bringing the first end into contact with the stepped portion of the core, and positioning the hollow fiber relative to the tube; and the hollow fiber A third step of filling an adhesive between the first end side of the tube and the tubular body to bond the hollow fiber and the tubular body.

第1ステップにおいて、管体の所定の位置まで芯材を挿入する。この芯材の挿入において、管体において中空糸の第1端と接続される側に芯材の段差部が向くようにする。管体に対して芯材を挿入する位置は、管体の内部空間において、中空糸の第1端が位置決めされるべき位置に、芯材の段差部が配置されるように決定される。このような管体の芯材との配置は、適当な治具などによって決められてもよい。   In the first step, the core material is inserted to a predetermined position of the tubular body. In the insertion of the core material, the stepped portion of the core material is directed to the side of the tube that is connected to the first end of the hollow fiber. The position where the core material is inserted into the tubular body is determined so that the stepped portion of the core material is disposed at the position where the first end of the hollow fiber is to be positioned in the internal space of the tubular body. The arrangement of the tubular body with the core material may be determined by an appropriate jig or the like.

第2ステップにおいて、芯材の芯部を中空糸に挿通させるようにして、芯部に沿って中空糸を移動させながら、管体に中空糸の第1端を挿入する。管体に挿入された中空糸の第1端は、管体の内部空間に配置された芯材の段差部と当接する。この当接によって、管体へ中空糸を挿入する位置が決定される。このようにして、芯材が、管体へ挿入される中空糸のガイドとして用いられ、また、中空糸の第1端を位置決めする治具として用いられる。   In the second step, the first end of the hollow fiber is inserted into the tube while moving the hollow fiber along the core so that the core of the core is inserted through the hollow fiber. The 1st end of the hollow fiber inserted in the pipe body contacts the level | step-difference part of the core material arrange | positioned in the internal space of a pipe body. By this contact, the position at which the hollow fiber is inserted into the tube body is determined. In this way, the core material is used as a guide for the hollow fiber inserted into the tubular body, and is also used as a jig for positioning the first end of the hollow fiber.

第3ステップにおいて、中空糸の第1端側と管体との間に接着剤を充填する。中空糸と管体との間に隙間があれば、その隙間に接着剤を充填する。中空糸と管体との間に隙間が殆ど無ければ、中空糸と管体との境界に接着剤を塗布するように充填する。この接着剤は、いわゆる医療用接着剤を使用する。これにより、管体と中空糸とが結合される。製造後の細胞用デバイスは、芯材により中空糸が支持されて、中空糸の折れ曲がりや破損が防止される。この芯材は、使用に際して中空糸から引き抜かれる。   In the third step, an adhesive is filled between the first end side of the hollow fiber and the tube body. If there is a gap between the hollow fiber and the tube, the gap is filled with an adhesive. If there is almost no gap between the hollow fiber and the tubular body, filling is performed so that an adhesive is applied to the boundary between the hollow fiber and the tubular body. As this adhesive, a so-called medical adhesive is used. Thereby, a tubular body and a hollow fiber are couple | bonded. In the cell device after production, the hollow fiber is supported by the core material, and the hollow fiber is prevented from being bent or damaged. This core material is pulled out from the hollow fiber in use.

本発明に係る細胞用デバイスによれば、各々の内部空間が流路として連続されて第1管体と中空糸とが接続されているので、吸引具により流路に吸引圧を付与すると、中空糸の内部空間へ細胞を取り込むことができる。この中空糸の孔は、細胞を通過させないが、培養液や凍結保存溶液などを通過させるので、中空糸の内部空間に細胞が内包された状態を維持しながら、中空糸の内部空間の培養液や細胞の細胞内液などを凍結保存溶液に置換することができる。   According to the cell device of the present invention, each internal space is continuous as a flow path, and the first tubular body and the hollow fiber are connected. Cells can be taken into the internal space of the thread. The pores of the hollow fiber do not allow cells to pass through, but allow the culture solution or cryopreservation solution to pass through. Therefore, while maintaining the state in which the cells are encapsulated in the inner space of the hollow fiber, the culture solution in the inner space of the hollow fiber Or the intracellular solution of the cells can be replaced with a cryopreservation solution.

また、使用に際して脱抜可能な芯材が中空糸に挿通されているので、使用までの間においては、芯材によって中空糸が支持される。これにより、中空糸が他の部材に接触したりして外力が加わって、中空糸が折れ曲がることが防止される。   Further, since the core material that can be removed during use is inserted into the hollow fiber, the hollow fiber is supported by the core material until use. As a result, the hollow fiber is prevented from being bent due to an external force applied to the hollow fiber coming into contact with another member.

また、本発明に係る細胞用デバイスの製造方法によれば、管体に挿通された芯材が、管体へ挿入される中空糸のガイドとして機能する。また、管体内に位置決めされた芯材の段差部が、管体に挿入された中空糸の第1端と当接して、管体へ中空糸を挿入する位置が決定されるので、芯材が、管体へ挿入される中空糸の第1端を位置決めする治具として機能するとともに、製造後においては、芯材により中空糸が支持されて、中空糸の折れ曲がりや破損が防止される。   Moreover, according to the manufacturing method of the device for cells concerning this invention, the core material penetrated by the pipe body functions as a guide of the hollow fiber inserted in a pipe body. Further, since the stepped portion of the core material positioned in the tubular body is in contact with the first end of the hollow fiber inserted into the tubular body, the position at which the hollow fiber is inserted into the tubular body is determined. In addition to functioning as a jig for positioning the first end of the hollow fiber to be inserted into the tubular body, the hollow fiber is supported by the core material after manufacturing, and the hollow fiber is prevented from being bent or damaged.

以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。   Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described. In addition, this embodiment is only one embodiment of this invention, and it cannot be overemphasized that an embodiment can be changed in the range which does not change the summary of this invention.

[図面の説明]
図1は、本発明の実施形態にかかる細胞用デバイス10の全体構成を示す斜視図である。図2は、中空糸11、注射針12及び芯材13の分解斜視図である。図3は、芯材13の全体構成を示す斜視図である。図4から図7は、細胞用デバイス10の製造方法を説明するための断面図である。図8は、細胞用デバイス10にチューブ14を介して注射筒15が接続された状態を示す斜視図である。図9〜図16は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。なお、図9〜図16には、細胞用デバイス10の中空糸11、注射針12の一部のみが示されており、チューブ14及び注射筒15は各図に示されていない。
[Explanation of drawings]
FIG. 1 is a perspective view showing the overall configuration of a cell device 10 according to an embodiment of the present invention. FIG. 2 is an exploded perspective view of the hollow fiber 11, the injection needle 12, and the core material 13. FIG. 3 is a perspective view showing the overall configuration of the core member 13. 4 to 7 are cross-sectional views for explaining a method for manufacturing the cell device 10. FIG. 8 is a perspective view showing a state where the syringe barrel 15 is connected to the cell device 10 via the tube 14. 9 to 16 are schematic views showing the procedure of the cell cryopreservation method using the cell device 10. 9 to 16, only a part of the hollow fiber 11 and the injection needle 12 of the cell device 10 are shown, and the tube 14 and the syringe barrel 15 are not shown in each drawing.

[細胞用デバイス10]
図1及び図2に示されるように、細胞用デバイス10は、主として、中空糸11と、注射針12と、芯材13と、を有する。
[Cellular device 10]
As shown in FIGS. 1 and 2, the cell device 10 mainly includes a hollow fiber 11, an injection needle 12, and a core material 13.

中空糸11は、細胞を通過させないが、水や電解質、タンパク質などを通過させうる径の孔を複数有する膜が、両端が開口したストロー形状に成形されたものである。中空糸11の内径及び長さは、対象となる細胞に対応させて適宜選択されるが、内径は数百μm程度であり、長さは数cm程度である。   The hollow fiber 11 is formed by forming a membrane having a plurality of pores having a diameter that allows water, electrolyte, protein, and the like to pass therethrough, but does not allow cells to pass, into a straw shape having both ends opened. The inner diameter and length of the hollow fiber 11 are appropriately selected according to the target cells, but the inner diameter is about several hundred μm and the length is about several cm.

注射針12は、本発明における第1管体の一実施態様である。注射針12は一般的なものであり、ポリウレタン樹脂製のカヌラがハブに固定されている。注射針12のカヌラの先端開口に中空糸11の一端が挿入されて、医療用接着剤により中空糸11と注射針12固定されている。これにより、中空糸11の内部空間が注射針12のカヌラの内部空間と連続する。この連続した内部空間は、後述されるように吸引圧が付与されて気体又は液体の流路となる。本明細書において、注射針12と連結された側の中空糸11の端が第1端21と称され、注射針12から延出された先端が中空糸11の第2端22と称される。   The injection needle 12 is an embodiment of the first tubular body in the present invention. The injection needle 12 is a general one, and a polyurethane resin cannula is fixed to the hub. One end of the hollow fiber 11 is inserted into the end opening of the cannula of the injection needle 12, and the hollow fiber 11 and the injection needle 12 are fixed by a medical adhesive. Thereby, the internal space of the hollow fiber 11 continues to the internal space of the cannula of the injection needle 12. As will be described later, the continuous internal space is provided with a suction pressure and becomes a gas or liquid flow path. In the present specification, the end of the hollow fiber 11 connected to the injection needle 12 is referred to as a first end 21, and the tip extending from the injection needle 12 is referred to as a second end 22 of the hollow fiber 11. .

図1から図3に示されるように、芯材13は、中空糸11及び注射針12の軸線101と同じ方向に長尺の部材であり、全体として、概ね細長な円柱形状をなしている。芯材13は、軸線101に沿って小径部24と大径部25とが並設された形状であり、その小径部24と大径部25との境界に段差部26が形成されている。   As shown in FIGS. 1 to 3, the core member 13 is a member that is long in the same direction as the axis 101 of the hollow fiber 11 and the injection needle 12, and has a generally elongated cylindrical shape as a whole. The core member 13 has a shape in which a small diameter portion 24 and a large diameter portion 25 are arranged in parallel along the axis 101, and a stepped portion 26 is formed at the boundary between the small diameter portion 24 and the large diameter portion 25.

小径部24の外径は、中空糸11の内径とほぼ同等乃至若干小さい。したがって、小径部24は、中空糸11に挿通可能である。小径部24の軸線101方向に沿った長さは、中空糸11の長さより若干長い。したがって、小径部24が中空糸11に挿通された状態において、小径部24は、中空糸11の両端である第1端21及び第2端22からそれぞれ突出し得る。この小径部24が、本発明における芯材の芯部に相当する。   The outer diameter of the small diameter portion 24 is substantially the same as or slightly smaller than the inner diameter of the hollow fiber 11. Therefore, the small diameter portion 24 can be inserted into the hollow fiber 11. The length of the small diameter portion 24 along the direction of the axis 101 is slightly longer than the length of the hollow fiber 11. Therefore, in a state where the small diameter portion 24 is inserted through the hollow fiber 11, the small diameter portion 24 can protrude from the first end 21 and the second end 22 that are both ends of the hollow fiber 11. The small diameter portion 24 corresponds to the core portion of the core material in the present invention.

大径部25の外径は、中空糸11の内径より大きく、かつ注射針12の内径とほぼ同等乃至若干小さい。したがって、大径部25は、注射針12に挿通可能であるが、中空糸11に挿通することはできない。大径部25の軸線101に沿った長さは、注射針12より若干長い。   The outer diameter of the large diameter portion 25 is larger than the inner diameter of the hollow fiber 11 and is substantially the same as or slightly smaller than the inner diameter of the injection needle 12. Therefore, the large diameter portion 25 can be inserted into the injection needle 12 but cannot be inserted into the hollow fiber 11. The length of the large diameter portion 25 along the axis 101 is slightly longer than that of the injection needle 12.

小径部24と大径部25との境界に形成された段差部26は、軸線101と直交する方向へ拡がる平面を形成している。この段差部26をなす平面は、小径部24の外径と大径部25の外径との差となる寸法幅で環状をなしている。後述されるように、段差部26には、中空糸11の第1端21が当接し得る。   The step portion 26 formed at the boundary between the small diameter portion 24 and the large diameter portion 25 forms a flat surface extending in a direction orthogonal to the axis 101. The flat surface forming the stepped portion 26 has an annular shape with a dimensional width that is a difference between the outer diameter of the small diameter portion 24 and the outer diameter of the large diameter portion 25. As will be described later, the first end 21 of the hollow fiber 11 can come into contact with the stepped portion 26.

芯材13は、小径部24が中空糸11に挿通された状態において、中空糸11が容易に折れ曲がらないように支持できる剛性を有する。芯材13の素材は特に限定されないが、例えば医療用ステンレスから芯材13が作製されうる。   The core material 13 has a rigidity capable of supporting the hollow fiber 11 so that the hollow fiber 11 is not easily bent in a state where the small diameter portion 24 is inserted into the hollow fiber 11. Although the raw material of the core material 13 is not specifically limited, For example, the core material 13 can be produced from medical stainless steel.

[細胞用デバイス10の製造方法]
以下に、前述された細胞用デバイス10の製造方法が説明される。
[Method for Manufacturing Cell Device 10]
Below, the manufacturing method of the device 10 for cells mentioned above is demonstrated.

細胞用デバイス10の製造方法は、主として、芯材13を注射針12に挿通して、段差部26を注射針12内の所定位置に位置決めする第1ステップ(S1)と、芯材13の小径部24を中空糸11に挿通させるようにして、中空糸11の第1端21を注射針12に挿入し、第1端21を段差部26に当接させて位置決めする第2ステップ(S2)と、中空糸11の第1端21側と注射針12との間に接着剤27を充填して、中空糸11と注射針12とを結合する第3ステップ(S3)と、からなる。   The manufacturing method of the cell device 10 mainly includes a first step (S1) in which the core material 13 is inserted into the injection needle 12 and the stepped portion 26 is positioned at a predetermined position in the injection needle 12, and a small diameter of the core material 13 The second step of inserting the first end 21 of the hollow fiber 11 into the injection needle 12 so that the portion 24 is inserted through the hollow fiber 11 and positioning the first end 21 in contact with the stepped portion 26 (S2). And a third step (S3) in which the adhesive 27 is filled between the first end 21 side of the hollow fiber 11 and the injection needle 12, and the hollow fiber 11 and the injection needle 12 are coupled.

図4に示されるように、第1ステップ(S1)において、注射針12の所定の位置まで芯材13を挿入する。この芯材13の挿入において、注射針12において中空糸11の第1端21と接続される側へ芯材13の段差部26の平面が向くようにする。つまり注射針12の先端から芯材13の小径部24が突出するように、芯材13を注射針12に挿入する。   As shown in FIG. 4, in the first step (S <b> 1), the core material 13 is inserted to a predetermined position of the injection needle 12. In the insertion of the core material 13, the flat surface of the step portion 26 of the core material 13 faces the side of the injection needle 12 connected to the first end 21 of the hollow fiber 11. That is, the core material 13 is inserted into the injection needle 12 so that the small diameter portion 24 of the core material 13 protrudes from the tip of the injection needle 12.

注射針12に対して芯材13を挿入する位置は、注射針12の内部空間において、中空糸11の第1端21が位置決めされるべき位置に、芯材13の段差部26が配置されるように決定される。図4には治具が現れていないが、注射針12に芯材13が挿入された状態において、注射針12のカヌラ側及び芯材13の小径部24側を上側とし、注射針12のハブ側及び芯材13の大径部25側を下側として、注射針12及び芯材13を不図示の治具上に起立させる。この治具によって、注射針12と芯材13との配置が決定され、図4に示されるように、注射針12の先端付近に芯材13の段差部26が配置される。   As for the position where the core material 13 is inserted into the injection needle 12, the stepped portion 26 of the core material 13 is arranged at the position where the first end 21 of the hollow fiber 11 is to be positioned in the internal space of the injection needle 12. To be determined. Although the jig does not appear in FIG. 4, in the state where the core material 13 is inserted into the injection needle 12, the cannula side of the injection needle 12 and the small diameter portion 24 side of the core material 13 are the upper side, and the hub of the injection needle 12. The injection needle 12 and the core material 13 are erected on a jig (not shown) with the side and the large-diameter portion 25 side of the core material 13 as the lower side. With this jig, the arrangement of the injection needle 12 and the core material 13 is determined, and the step portion 26 of the core material 13 is arranged near the tip of the injection needle 12 as shown in FIG.

図5に示されるように、第2ステップ(S2)において、注射針12の先端側へ中空糸11の第1端21を挿入する。芯材13の小径部24に沿って中空糸11を注射針12側へスライドさせると、中空糸11の第1端21が注射針12に挿入される。つまり、芯材13が、注射針12へ挿入される中空糸11のガイドとして用いられる。   As shown in FIG. 5, in the second step (S <b> 2), the first end 21 of the hollow fiber 11 is inserted into the distal end side of the injection needle 12. When the hollow fiber 11 is slid toward the injection needle 12 along the small diameter portion 24 of the core member 13, the first end 21 of the hollow fiber 11 is inserted into the injection needle 12. That is, the core material 13 is used as a guide for the hollow fiber 11 inserted into the injection needle 12.

図6に示されるように、注射針12に挿入された中空糸11の第1端21は、注射針12の内部空間に配置された芯材13の段差部26と当接する。この当接によって、注射針12へ中空糸11を挿入する位置が決定される。つまり、芯材13が、注射針12へ挿入される中空糸11の第1端21を位置決めする治具として用いられる。前述されたように、芯材13の段差部26は上側を向いているので、中空糸11は、第1端21が段差部26に支持された状態で静止する。   As shown in FIG. 6, the first end 21 of the hollow fiber 11 inserted into the injection needle 12 comes into contact with the step portion 26 of the core member 13 disposed in the internal space of the injection needle 12. By this contact, the position at which the hollow fiber 11 is inserted into the injection needle 12 is determined. That is, the core material 13 is used as a jig for positioning the first end 21 of the hollow fiber 11 inserted into the injection needle 12. As described above, since the step portion 26 of the core member 13 faces upward, the hollow fiber 11 is stationary with the first end 21 supported by the step portion 26.

図7に示されるように、第3ステップ(S3)において、中空糸11の第1端21側と注射針12との間に接着剤27を充填する。中空糸11の外周に沿って注射針12との間に隙間があれば、その隙間に接着剤27を充填すればよいし、中空糸11の外周に沿って注射針12との間に隙間が殆ど無ければ、中空糸11の外周に沿った注射針12との境界に接着剤27を塗布するように充填する。この接着剤27は、いわゆる医療用接着剤を使用する。これにより、中空糸11と注射針12とが結合される。   As shown in FIG. 7, in the third step (S <b> 3), an adhesive 27 is filled between the first end 21 side of the hollow fiber 11 and the injection needle 12. If there is a gap between the hollow fiber 11 and the injection needle 12, the gap 27 may be filled with an adhesive 27, and the gap between the hollow fiber 11 and the injection needle 12 may be filled. If there is little, it fills so that the adhesive agent 27 may be apply | coated to the boundary with the injection needle 12 along the outer periphery of the hollow fiber 11. As the adhesive 27, a so-called medical adhesive is used. Thereby, the hollow fiber 11 and the injection needle 12 are combined.

[細胞凍結保存方法]
以下に、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法が説明される。
[Cell cryopreservation method]
Hereinafter, a cell cryopreservation method using the cell device 10 will be described.

以下に説明される細胞凍結保存方法は、主として、細胞浮遊液から細胞41及び培養液42を中空糸11の内部空間へ吸引する第1ステップ(S11)と、細胞41及び培養液42を内包した中空糸11をガラス化溶液43に浸漬する第2ステップ(S12)と、中空糸11を注射針12から分離する第3ステップ(S13)と、分離された中空糸11を冷却する第4ステップ(S14)と、の4つのステップを有する。   The cell cryopreservation method described below mainly includes the first step (S11) of sucking the cells 41 and the culture solution 42 from the cell suspension into the internal space of the hollow fiber 11 and the cells 41 and the culture solution 42. A second step (S12) of immersing the hollow fiber 11 in the vitrification solution 43, a third step (S13) of separating the hollow fiber 11 from the injection needle 12, and a fourth step of cooling the separated hollow fiber 11 ( S14) and four steps.

細胞用デバイス10の使用に際して、芯材13を中空糸11から脱抜する。前述されたように、注射針12の内部空間において、芯材13の段差部26が中空糸11の第1端21と当接しているので、注射針12のハブ側から芯材13を引き抜く。これにより、中空糸11内に細胞41を吸引することができる状態となる。一方、使用までの間においては、芯材13によって中空糸11が支持されることにより、中空糸11が他の部材に接触したりして外力が加わって、中空糸11が折れ曲がることが防止される。   When the cell device 10 is used, the core material 13 is removed from the hollow fiber 11. As described above, since the stepped portion 26 of the core material 13 is in contact with the first end 21 of the hollow fiber 11 in the internal space of the injection needle 12, the core material 13 is pulled out from the hub side of the injection needle 12. Thereby, the cell 41 can be sucked into the hollow fiber 11. On the other hand, until the hollow fiber 11 is supported by the core material 13 until it is used, the hollow fiber 11 is prevented from being bent due to the external force applied by the hollow fiber 11 coming into contact with other members. The

図8に示されるように、芯材13が脱抜された後の細胞用デバイス10は、チューブ14を介して注射筒15と接続される。   As shown in FIG. 8, the cell device 10 after the core material 13 is removed is connected to the syringe barrel 15 via the tube 14.

チューブ14は、シリコーンゴム製である。チューブ14の内径及び外径は、注射針12及び注射筒15に対応させて適宜選択される。図8においては、チューブ14が、その長さ方向に対して一部が省略されて現されているが、チューブ14の長さは、注射針12と注射筒15とを作業者が両手に分けて持って操作できるに適した長さであり、通常、数十cm程度である。チューブ14の可撓性は、注射針12と注射筒15とを作業者が両手に分けて持って操作した際にチューブ14が座屈せず、かつチューブ14の内部空間が後述される吸引に適した負圧にされた際にチューブ14が内部空間を閉塞して潰れない程度である。チューブ14の一端は、ジョイントなどを介して注射針12のハブと接続されている。これにより、注射針12の内部空間は、チューブ14の内部空間と連続されている。このジョイントなどは、公知のものを適宜用いればよいので、ここでは詳細な説明が省略される。   The tube 14 is made of silicone rubber. The inner diameter and outer diameter of the tube 14 are appropriately selected according to the injection needle 12 and the syringe barrel 15. In FIG. 8, the tube 14 is shown with a part thereof omitted in the length direction. However, the length of the tube 14 is such that the operator separates the injection needle 12 and the syringe barrel 15 into both hands. The length is suitable for holding and operating, and is usually about several tens of centimeters. The flexibility of the tube 14 is suitable for the suction in which the tube 14 does not buckle and the inner space of the tube 14 is described later when the operator holds the syringe needle 12 and the syringe barrel 15 separately in both hands. When the negative pressure is increased, the tube 14 is not clogged by closing the internal space. One end of the tube 14 is connected to the hub of the injection needle 12 via a joint or the like. Thereby, the internal space of the injection needle 12 is continuous with the internal space of the tube 14. As this joint or the like, a well-known joint may be used as appropriate, and detailed description thereof is omitted here.

なお、チューブ14は、可撓性を有するものであれば、例えば天然ゴム、ポリウレタン、シリコーンゴム、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン・プロピレン共重合体などをチューブ形状に成形したものが適宜用いられる。チューブ14の長さは特に限定されないが、注射針12と注射筒15とを別々に操作するに適した長さが採用され、50〜1000mm程度であれば、一方の手で注射針12を操作しながら他方の手で注射筒15を操作できるの好適である。   As long as the tube 14 is flexible, for example, natural rubber, polyurethane, silicone rubber, polyvinyl chloride, polyethylene, polypropylene, an ethylene / propylene copolymer, or the like formed into a tube shape is used as appropriate. It is done. Although the length of the tube 14 is not specifically limited, if the length suitable for operating the injection needle 12 and the syringe barrel 15 separately is adopted and the length is about 50 to 1000 mm, the injection needle 12 is operated with one hand. However, it is preferable that the syringe barrel 15 can be operated with the other hand.

注射筒15の構成は一般的である。シリンジ31は略円筒形状であり、その先端側が縮径されて円筒形状の取付部33が形成されている。取付部33の両端は開口しており、一端がシリンジ31の内部空間と通ずる。つまり、取付部33の内部空間は、シリンジ31の内部空間と外部とを連続させるポートを形成する。この取付部33にチューブ14の他端が外嵌されて、シリンジ31の内部空間とチューブ14の内部空間とが連続されている。シリンジ31の基端側は開口されており、その基端側からプランジャ32が内部空間へ挿入されている。プランジャ32は、シリンジ31の内部空間の軸線101方向の長さより長く、シリンジ31の内部空間の最奥部まで挿入された状態で、プランジャ32の一部がシリンジ31の基端から外部へ突出している。   The configuration of the syringe barrel 15 is common. The syringe 31 has a substantially cylindrical shape, and a distal end side thereof is reduced in diameter to form a cylindrical attachment portion 33. Both ends of the attachment portion 33 are open, and one end communicates with the internal space of the syringe 31. That is, the internal space of the attachment portion 33 forms a port that connects the internal space of the syringe 31 and the outside. The other end of the tube 14 is externally fitted to the attachment portion 33 so that the internal space of the syringe 31 and the internal space of the tube 14 are continuous. The proximal end side of the syringe 31 is opened, and the plunger 32 is inserted into the internal space from the proximal end side. The plunger 32 is longer than the length of the internal space of the syringe 31 in the direction of the axis 101 and is inserted to the innermost part of the internal space of the syringe 31, and a part of the plunger 32 protrudes from the proximal end of the syringe 31 to the outside. Yes.

各図には現れていないが、プランジャ32の先端にはガスケットが接続されている。ガスケットは、ゴムなどの弾性素材からなる円柱体であり、シリンジ31の内部空間に気密に嵌合されて、プランジャ32とともにシリンジ31の内部空間を軸線101に沿った方向へスライド移動可能である。プランジャ32が延びる方向は、ガスケットのスライド方向と一致する。ガスケットがシリンジ31の基端側へ移動されると、シリンジ31の内部空間が負圧となって、取付部33から気体又は液体が内部空間へ吸引される。   Although not shown in each figure, a gasket is connected to the tip of the plunger 32. The gasket is a cylindrical body made of an elastic material such as rubber, and is fitted in the inner space of the syringe 31 in an airtight manner, and can slide along the axis 101 along the inner space of the syringe 31 together with the plunger 32. The direction in which the plunger 32 extends coincides with the sliding direction of the gasket. When the gasket is moved to the proximal end side of the syringe 31, the internal space of the syringe 31 becomes negative pressure, and gas or liquid is sucked from the attachment portion 33 into the internal space.

なお、注射筒15は吸引具の一例であって、マイクロポンプなどの他の吸引具が用いられてもよいが、コストや廃棄の観点からは、吸引具としてディスポーザブルの注射筒15が好ましい。また、注射針12と注射筒15との接続は特に限定されず、本実施形態に示されるようにチューブ14を介して接続されても、注射筒15に注射針12が直接に接続されてもよい。また、注射筒15が用いられずに、チューブ14に対して口などから吸引圧が付与されてもよい。   The syringe 15 is an example of a suction tool, and other suction tools such as a micropump may be used. However, from the viewpoint of cost and disposal, the disposable syringe 15 is preferable as the suction tool. In addition, the connection between the injection needle 12 and the injection cylinder 15 is not particularly limited, and even if the injection needle 12 is connected directly to the injection cylinder 15 even if connected via the tube 14 as shown in the present embodiment. Good. Further, suction pressure may be applied to the tube 14 from the mouth or the like without using the syringe barrel 15.

凍結保存すべき細胞41は培養液42中に浮遊している。培養液42は、培地皿などの容器に保持されているが、図9〜図14では容器が省略されて複数個の細胞41及び培養液42の一部のみが示されている。培養液42中には複数個の細胞41が浮遊しており、これら細胞41は、同一個体から採取された単一種類のものである。   Cells 41 to be cryopreserved are suspended in the culture solution 42. The culture solution 42 is held in a container such as a medium dish. However, in FIGS. 9 to 14, the container is omitted and only a plurality of cells 41 and a part of the culture solution 42 are shown. A plurality of cells 41 are suspended in the culture solution 42, and these cells 41 are of a single type collected from the same individual.

培養液42は、細胞41を浮遊させるに適した液体であり、細胞41の種類及び目的により選択され、例えば、精子細胞や卵母細胞、初期胚を培養する場合には、TCM−199培地、RPMI−1640培地、DMEM培地、MEM培地、α−MEM培地、IMDM培地などが挙げられる。また、ヒトの体外受精を目的とする培地として、HUCUM培地(ニプロ社製)が挙げられる。ウシの体外受精を目的とする培地として、TCM−199培地、SOF培地、CR1培地、KSOM培地、IVF100培地、IVF110S培地、IVMD101培地、IVD101培地(機能性ペプチド研社製)が挙げられる。ブタの体外受精を目的とする培地として、NCSU培地、PZM−5培地(機能性ペプチド研社製)が挙げられる。   The culture solution 42 is a liquid suitable for suspending the cells 41, and is selected according to the type and purpose of the cells 41. For example, when culturing sperm cells, oocytes, or early embryos, the TCM-199 medium, Examples thereof include RPMI-1640 medium, DMEM medium, MEM medium, α-MEM medium, and IMDM medium. Moreover, HUCUM culture medium (made by a Nipro company) is mentioned as a culture medium aiming at human in vitro fertilization. Examples of the medium for in vitro fertilization of bovine include TCM-199 medium, SOF medium, CR1 medium, KSOM medium, IVF100 medium, IVF110S medium, IVMD101 medium, and IVD101 medium (manufactured by Functional Peptide Institute). Examples of media for in vitro fertilization of pigs include NCSU media and PZM-5 media (manufactured by Functional Peptide Institute).

図9に示されるように、第1ステップ(S11)において、細胞用デバイス10の注射針12を片手で持って操作し、中空糸11の第2端22を培養液42中に挿入する。そして、他方の手で注射筒15を操作してプランジャ32をシリンジ31から引き出し、中空糸11内に微量の培養液42を吸引する。   As shown in FIG. 9, in the first step (S11), the injection needle 12 of the cell device 10 is operated with one hand, and the second end 22 of the hollow fiber 11 is inserted into the culture solution. Then, the syringe cylinder 15 is operated with the other hand, the plunger 32 is pulled out from the syringe 31, and a small amount of the culture solution 42 is sucked into the hollow fiber 11.

つづいて、図10に示されるように、注射針12を操作して中空糸11の第2端22を培養液42から取り出し、再び注射筒15を操作して微量の空気を中空糸11の内部空間へ吸引する。これにより、中空糸11に吸引された微量の培養液42は、中空糸11の内部空間を注射針12側へ若干移動する。   Subsequently, as shown in FIG. 10, the injection needle 12 is operated to take out the second end 22 of the hollow fiber 11 from the culture solution 42, and the injection cylinder 15 is operated again to allow a small amount of air to be contained inside the hollow fiber 11. Aspirate into space. Thereby, the trace amount culture solution 42 sucked into the hollow fiber 11 slightly moves in the inner space of the hollow fiber 11 to the injection needle 12 side.

つづいて、図11に示されるように、注射針12を操作して中空糸11の第2端22を再び培養液42中に挿入し、顕微鏡を用いて培養液42中の細胞41を確認しながら、中空糸11の第2端22を細胞41に近接させる。そして、注射筒15を操作して、中空糸11の内部空間へ細胞41を培養液42と共に吸引する。これにより、中空糸11の内部空間において、細胞41及び培養液42が存在する液体層44より第1端21側に、微量の気体層45が形成される。つまり、中空糸11の内部空間には、第1端21側から第2端22側へ向かって順次、培養液42のみの層、気体層45、細胞41及び培養液42を含む液体層44がそれぞれ形成される。   Next, as shown in FIG. 11, the injection needle 12 is operated to insert the second end 22 of the hollow fiber 11 into the culture solution 42 again, and the cells 41 in the culture solution 42 are confirmed using a microscope. However, the second end 22 of the hollow fiber 11 is brought close to the cell 41. Then, the syringe cylinder 15 is operated to suck the cells 41 together with the culture solution 42 into the internal space of the hollow fiber 11. Thereby, in the internal space of the hollow fiber 11, a small amount of gas layer 45 is formed on the first end 21 side from the liquid layer 44 in which the cells 41 and the culture solution 42 exist. That is, in the inner space of the hollow fiber 11, a layer including only the culture solution 42, a gas layer 45, a cell 41, and a liquid layer 44 including the culture solution 42 are sequentially provided from the first end 21 side to the second end 22 side. Each is formed.

つづいて、図12に示されるように、中空糸11の第2端22を培養液42から取り出さずに、第2端22を他の細胞41に近接させ、注射筒15を操作して、中空糸11の内部空間へ他の細胞41を培養液42と共に吸引する。中空糸11の内部空間へ吸引する細胞41の個数は特に限定されないが、本実施形態では、3個の細胞41が培養液42とともに中空糸11の内部空間へ吸引されて液体層44が形成されている。   Next, as shown in FIG. 12, the second end 22 of the hollow fiber 11 is not taken out from the culture solution 42, the second end 22 is brought close to another cell 41, the syringe cylinder 15 is operated, and the hollow fiber 11 is hollow. Other cells 41 are sucked into the internal space of the thread 11 together with the culture solution 42. The number of cells 41 to be sucked into the inner space of the hollow fiber 11 is not particularly limited, but in this embodiment, three cells 41 are sucked into the inner space of the hollow fiber 11 together with the culture solution 42 to form a liquid layer 44. ing.

中空糸11の内部空間へ3個の細胞41を吸引した後、図13に示されるように、注射針12を操作して中空糸11の第2端22を培養液42から取り出し、注射筒15を操作して、微量の空気を中空糸11の内部空間へ吸引する。これにより、中空糸11内の液体層44及び気体層45は、中空糸11の内部空間を注射針12側へ若干移動する。   After the three cells 41 are sucked into the internal space of the hollow fiber 11, the syringe needle 12 is operated to take out the second end 22 of the hollow fiber 11 from the culture solution 42 as shown in FIG. To suck a small amount of air into the internal space of the hollow fiber 11. Thereby, the liquid layer 44 and the gas layer 45 in the hollow fiber 11 slightly move in the inner space of the hollow fiber 11 to the injection needle 12 side.

つづいて、図14に示されるように、注射針12を操作して中空糸11の第2端22を再び培養液42中に挿入し、注射筒15を操作して、中空糸11の内部空間へ培養液42を吸引する。これにより、液体層44に対して第2端22側に、微量の気体層46が形成される。   Next, as shown in FIG. 14, the injection needle 12 is operated to insert the second end 22 of the hollow fiber 11 into the culture solution 42 again, and the injection cylinder 15 is operated to change the internal space of the hollow fiber 11. Aspirate the culture solution 42. Thereby, a small amount of gas layer 46 is formed on the second end 22 side with respect to the liquid layer 44.

第2ステップ(S12)において、図15に示されるように、内部空間に細胞41及び培養液42を内包する中空糸11をガラス化溶液43に浸す。前述されたように、中空糸11の孔は、細胞41を通過させないが、培養液42やガラス化溶液43を通過させるので、中空糸11の内部空間に細胞41が内包された状態が維持されながら、中空糸11の内部空間の培養液42や細胞41の細胞内液などがガラス化溶液43に置換される。   In the second step (S 12), as shown in FIG. 15, the hollow fiber 11 containing the cells 41 and the culture solution 42 is immersed in the vitrification solution 43 in the internal space. As described above, the hole of the hollow fiber 11 does not allow the cell 41 to pass through, but allows the culture solution 42 and the vitrification solution 43 to pass therethrough, so that the state where the cell 41 is included in the internal space of the hollow fiber 11 is maintained. However, the culture solution 42 in the internal space of the hollow fiber 11, the intracellular solution of the cells 41, and the like are replaced with the vitrification solution 43.

また、中空糸11内の培養液42をガラス化溶液43に置換する際に、細胞41に対して緩慢な条件を選択したい場合には、ガラス化溶液43として、培養液42が適度な濃度勾配で混合された複数種のものが用いられる。このような濃度勾配は、例えば2〜5種類に設定される。複数種のガラス化溶液43が用いられる場合には、予め調整された各ガラス化溶液43が準備されており、図15に示されるようにして、複数種のガラス化溶液43に中空糸11が順次浸漬される。   In addition, when replacing the culture solution 42 in the hollow fiber 11 with the vitrification solution 43, when it is desired to select a slow condition for the cells 41, the culture solution 42 has an appropriate concentration gradient as the vitrification solution 43. A plurality of kinds mixed in the above are used. Such concentration gradients are set to 2 to 5 types, for example. When a plurality of types of vitrification solutions 43 are used, preliminarily prepared vitrification solutions 43 are prepared, and the hollow fibers 11 are added to the plurality of types of vitrification solutions 43 as shown in FIG. Soaked sequentially.

なお、細胞の凍結保存方法として、高濃度の凍害保護液中での急速冷凍と、低濃度の凍害保護液での通常冷凍とが挙げられる。高濃度の凍害保護液中での急速冷凍は、ガラス化とも称され、また、凍害保護液はガラス化溶液とも称される。細胞内保護タイプのガラス化溶液として、ジメチルスルホキシド(DMSO)含有液、エチレングリコール含有液、プロパンジオール含有液などが挙げられる。細胞外保護タイプのガラス化溶液として、シュークロース含有液、トレハロース含有液、フィルコールコンレイ溶液が挙げられる。   Examples of the cryopreservation method for cells include quick freezing in a high-concentration freezing protection liquid and normal freezing in a low-concentration freezing protection liquid. Rapid freezing in a high concentration frost damage protection liquid is also referred to as vitrification, and the frost damage protection liquid is also referred to as a vitrification solution. Examples of the intracellular protection type vitrification solution include dimethyl sulfoxide (DMSO) -containing liquid, ethylene glycol-containing liquid, and propanediol-containing liquid. Examples of the extracellular protection type vitrification solution include a sucrose-containing solution, a trehalose-containing solution, and a fill coal conley solution.

図16に示されるように、第3ステップ(S13)において、細胞41を内包する中空糸11を注射針12から分離する。この分離は、中空糸11を、細胞41が含まれる液体層44及び気体層45より第1端21側において、鋏などで切断することによって行う。これにより、細胞用デバイス10から、細胞41及びガラス化溶液43を内包する中空糸11が分離される。   As shown in FIG. 16, in the third step (S <b> 13), the hollow fiber 11 containing the cell 41 is separated from the injection needle 12. This separation is performed by cutting the hollow fiber 11 with a scissors or the like on the first end 21 side from the liquid layer 44 and the gas layer 45 containing the cells 41. As a result, the hollow fiber 11 containing the cells 41 and the vitrification solution 43 is separated from the cell device 10.

図には示されていないが、第4ステップ(S14)において、細胞用デバイス10から分離された中空糸11を液体窒素又は液体ヘリウムに投入して冷却する。これにより、中空糸11の内部空間に内包された細胞41がガラス化される。そして、ガラス化された細胞41を含有する中空糸11は、適当な容器内に投入してフリーザ内に保存する。   Although not shown in the figure, in the fourth step (S14), the hollow fiber 11 separated from the cell device 10 is put into liquid nitrogen or liquid helium and cooled. Thereby, the cell 41 included in the internal space of the hollow fiber 11 is vitrified. The hollow fiber 11 containing the vitrified cells 41 is put into a suitable container and stored in a freezer.

なお、前述のように中空糸11の内部空間に内包されて凍結保存された細胞41は、中空糸11と共に加温液に浸すことにより解凍される。解凍を終えた後、中空糸11の第1端21又は第2端22から内部空間へ排出圧を付与すると、中空糸11の内部空間から細胞41が外部へ排出される。また、中空糸11の内部空間に細胞41を内包させた状態で培養を行うのであれば、解凍後に、細胞41を内包する中空糸11を所望の培地中に投入すればよい。   As described above, the cells 41 encapsulated in the internal space of the hollow fiber 11 and cryopreserved are thawed by being immersed in a warming solution together with the hollow fiber 11. After the thawing is completed, when a discharge pressure is applied from the first end 21 or the second end 22 of the hollow fiber 11 to the internal space, the cells 41 are discharged from the internal space of the hollow fiber 11 to the outside. Further, if culturing is performed in a state where the cells 41 are encapsulated in the internal space of the hollow fiber 11, the hollow fiber 11 encapsulating the cells 41 may be put into a desired medium after thawing.

[本実施形態の作用効果]
本実施形態に係る細胞用デバイス10及び細胞凍結保存方法によれば、各々の内部空間が流路として連続されて中空糸11と注射針12とが接続されているので、注射筒15により流路に吸引圧を付与すると、中空糸11の内部空間へ細胞41を取り込むことができる。この中空糸11の孔は、細胞41を通過させないが、培養液42やガラス化溶液43などを通過させるので、中空糸11の内部空間に細胞41が内包された状態を維持しながら、中空糸11の内部空間の培養液42や細胞41の細胞内液などをガラス化溶液43に置換することができる。
[Operational effects of this embodiment]
According to the cell device 10 and the cell cryopreservation method according to the present embodiment, the hollow spaces 11 and the injection needles 12 are connected to each other through the internal spaces as the flow paths. When a suction pressure is applied to the cells, the cells 41 can be taken into the internal space of the hollow fiber 11. The holes of the hollow fiber 11 do not allow the cells 41 to pass through, but allow the culture solution 42 and the vitrification solution 43 to pass therethrough. The vitrification solution 43 can replace the culture solution 42 in the internal space 11 and the intracellular solution of the cells 41.

また、使用に際して脱抜可能な芯材13が中空糸11に挿通されているので、使用までの間においては、芯材13によって中空糸11が支持される。これにより、中空糸11が他の部材に接触したりして外力が加わって、中空糸11が折れ曲がることが防止される。   Moreover, since the core material 13 that can be removed in use is inserted through the hollow fiber 11, the hollow fiber 11 is supported by the core material 13 until use. As a result, the hollow fiber 11 is prevented from being bent due to the external force being applied to the other member or the hollow fiber 11 being bent.

また、芯材13は、中空糸11の両端である第1端21及び第2端22から突出されるので、中空糸11の両端が芯材13によって支持され、中空糸11の両端の破損が防止される。   Further, since the core material 13 protrudes from the first end 21 and the second end 22 which are both ends of the hollow fiber 11, both ends of the hollow fiber 11 are supported by the core material 13, and the both ends of the hollow fiber 11 are damaged. Is prevented.

また、芯材13は、中空糸11の第1端21に当接する段差部26を有するので、中空糸11の第1端21側から芯材13を挿入すると、芯材13の段差部36が中空糸11の第1端21と当接して、芯材13の挿入限界が決定される。また、芯材13の脱抜が、第1端21側から引き抜く向きに限定されるので、中空糸11の第1端21側を鉛直上向きにしていれば、自重によって芯材13が中空糸11から脱落することがない。   Moreover, since the core material 13 has the step part 26 which contact | abuts to the 1st end 21 of the hollow fiber 11, if the core material 13 is inserted from the 1st end 21 side of the hollow fiber 11, the level difference part 36 of the core material 13 will become. The insertion limit of the core material 13 is determined by contacting the first end 21 of the hollow fiber 11. Further, the removal of the core material 13 is limited to the direction of pulling out from the first end 21 side. Therefore, if the first end 21 side of the hollow fiber 11 is directed vertically upward, the core material 13 is pulled by the own weight. Will not fall off.

また、本実施形態に係る細胞用デバイス10の製造方法によれば、注射針12に挿通された芯材13の小径部24が、注射針12へ挿入される中空糸11のガイドとして機能する。また、注射針12内に位置決めされた芯材13の段差部36が、注射針12に挿入された中空糸11の第1端21と当接して、注射針12へ中空糸11を挿入する位置が決定されるので、芯材13が、注射針12へ挿入される中空糸11の第1端21を位置決めする治具として機能するとともに、製造後においては、芯材13により中空糸11が支持されて、中空糸11の折れ曲がりや破損が防止される。   Further, according to the method for manufacturing the cell device 10 according to this embodiment, the small diameter portion 24 of the core member 13 inserted through the injection needle 12 functions as a guide for the hollow fiber 11 inserted into the injection needle 12. Further, the stepped portion 36 of the core member 13 positioned in the injection needle 12 is in contact with the first end 21 of the hollow fiber 11 inserted into the injection needle 12, and the position where the hollow fiber 11 is inserted into the injection needle 12. Therefore, the core material 13 functions as a jig for positioning the first end 21 of the hollow fiber 11 inserted into the injection needle 12, and the hollow fiber 11 is supported by the core material 13 after manufacture. Thus, the hollow fiber 11 is prevented from being bent or damaged.

図1は、本発明の実施形態にかかる細胞用デバイス10の全体構成を示す斜視図である。FIG. 1 is a perspective view showing the overall configuration of a cell device 10 according to an embodiment of the present invention. 図2は、中空糸11、注射針12及び芯材13の分解斜視図である。FIG. 2 is an exploded perspective view of the hollow fiber 11, the injection needle 12, and the core material 13. 図3は、芯材13の全体構成を示す斜視図である。FIG. 3 is a perspective view showing the overall configuration of the core member 13. 図4は、細胞用デバイス10の製造方法を説明するための断面図である。FIG. 4 is a cross-sectional view for explaining the method for manufacturing the cell device 10. 図5は、細胞用デバイス10の製造方法を説明するための断面図である。FIG. 5 is a cross-sectional view for explaining the method for manufacturing the cell device 10. 図6は、細胞用デバイス10の製造方法を説明するための断面図である。FIG. 6 is a cross-sectional view for explaining the method for manufacturing the cell device 10. 図7は、細胞用デバイス10の製造方法を説明するための断面図である。FIG. 7 is a cross-sectional view for explaining the method for manufacturing the cell device 10. 図8は、細胞用デバイス10にチューブ14を介して注射筒15が接続された状態を示す斜視図である。FIG. 8 is a perspective view showing a state where the syringe barrel 15 is connected to the cell device 10 via the tube 14. 図9は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。FIG. 9 is a schematic diagram showing the procedure of a cell cryopreservation method using the cell device 10. 図10は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。FIG. 10 is a schematic diagram showing the procedure of a cell cryopreservation method using the cell device 10. 図11は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。FIG. 11 is a schematic diagram showing the procedure of a cell cryopreservation method using the cell device 10. 図12は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。FIG. 12 is a schematic diagram showing the procedure of a cell cryopreservation method using the cell device 10. 図13は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。FIG. 13 is a schematic diagram showing the procedure of a cell cryopreservation method using the cell device 10. 図14は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。FIG. 14 is a schematic diagram showing a procedure of a cell cryopreservation method using the cell device 10. 図15は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。FIG. 15 is a schematic diagram showing a procedure of a cell cryopreservation method using the cell device 10. 図16は、細胞用デバイス10を用いた細胞凍結保存方法の手順を示す模式図である。FIG. 16 is a schematic diagram showing the procedure of a cell cryopreservation method using the cell device 10.

符号の説明Explanation of symbols

10・・・細胞用デバイス
11・・・中空糸
12・・・注射針(管体)
13・・・芯材
21・・・第1端
24・・・小径部(芯部)
26・・・段差部
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Cell device 11 ... Hollow fiber 12 ... Injection needle (tube body)
13 ... Core 21 ... First end 24 ... Small diameter part (core part)
26 ... Step part

Claims (4)

両端が開口された中空糸と、
上記中空糸の第1端に接続されて、その内部空間が当該中空糸の内部空間と連続する流路を構成する管体と、
上記中空糸に挿通された芯材と、を具備し、
上記芯材は、使用に際して上記中空糸から脱抜可能である細胞用デバイス。
Hollow fibers open at both ends;
A tubular body connected to the first end of the hollow fiber and constituting a flow path whose internal space is continuous with the internal space of the hollow fiber;
A core material inserted through the hollow fiber,
The device for cells, wherein the core material is removable from the hollow fiber in use.
上記芯材は、中空糸の両端から突出されたものである請求項1に記載の細胞用デバイス。   The cell device according to claim 1, wherein the core material is protruded from both ends of the hollow fiber. 上記中空糸の第1端に対して上記管体が外嵌されて、上記中空糸と上記管体とが接続され、
上記芯材は、上記中空糸の第1端に当接する段差部を有するものである請求項1又は2に記載の細胞用デバイス。
The tubular body is externally fitted to the first end of the hollow fiber, the hollow fiber and the tubular body are connected,
The device for cells according to claim 1 or 2, wherein the core material has a stepped portion that comes into contact with the first end of the hollow fiber.
両端が開口された中空糸に挿通可能な芯部と、当該中空糸の第1端と当接し得る段差部とを有する芯材を、当該中空糸を挿入可能な管体に挿通して、その段差部を当該管体内の所定位置に位置決めする第1ステップと、
上記芯材の芯部を中空糸に挿通させるようにして、当該中空糸の第1端を上記管体に挿入し、当該第1端を上記芯材の段差部に当接させて、上記管体に対して当該中空糸を位置決めする第2ステップと、
上記中空糸の第1端側と上記管体との間に接着剤を充填して、上記中空糸と上記管体とを結合する第3ステップと、を含む細胞用デバイスの製造方法。
A core material having a core part that can be inserted into a hollow fiber having both ends opened and a step part that can come into contact with the first end of the hollow fiber is inserted into a tubular body into which the hollow fiber can be inserted, and A first step of positioning the stepped portion at a predetermined position in the tube;
The core portion of the core material is inserted into the hollow fiber, the first end of the hollow fiber is inserted into the tube body, the first end is brought into contact with the step portion of the core material, and the tube A second step of positioning the hollow fiber relative to the body;
A method for producing a device for a cell, comprising: a third step of filling an adhesive between the first end side of the hollow fiber and the tubular body to bond the hollow fiber and the tubular body.
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