JP2010142188A - 工程精度保証方法及び工程精度保証用キット - Google Patents
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Abstract
【課題】２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料からＲＮＡを抽出し、逆転写反応の後に核酸増幅反応により、標的遺伝子由来のＲＮＡを検出する方法における、各工程の精度を十分に保証し得る方法の提供。
【解決手段】２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料からＲＮＡを抽出する抽出工程、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行ってｃＤＮＡを得る逆転写工程、及び、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程に対して、標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を抽出工程標準陽性試料とし、標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を逆転写工程標準陽性試料とし、的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を増幅工程標準陽性試料とし、工程ごとに異なる標準陽性試料を用いることを特徴とする工程精度保証方法。
【選択図】なし
【解決手段】２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料からＲＮＡを抽出する抽出工程、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行ってｃＤＮＡを得る逆転写工程、及び、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程に対して、標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を抽出工程標準陽性試料とし、標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を逆転写工程標準陽性試料とし、的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を増幅工程標準陽性試料とし、工程ごとに異なる標準陽性試料を用いることを特徴とする工程精度保証方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料からＲＮＡを抽出し、逆転写反応の後に核酸増幅反応により、標的遺伝子由来のＲＮＡを検出する方法における、各工程の精度を保証する方法、及び該方法に用いられるキットに関する。
遺伝子解析は、近年の遺伝子操作技術や遺伝子組換え技術等の進歩に伴い、医療、学術研究、産業等の多くの分野において広く応用されている。例えば、糞便、唾液や血液等の体液、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等の生体試料中に含まれるＲＮＡやＤＮＡを回収し、各試料間の核酸の特徴を比較することによって、癌や、細菌（バクテリア）・ウィルス・寄生虫等による感染症等の疾患を診断することが行われている。
遺伝子解析は、通常、試料中に、解析対象である標的遺伝子と相同的な塩基配列を有する核酸（標的遺伝子由来核酸）が存在するか否かを検出することにより行われるが、臨床検査における検体等のように、検体が微量である場合や試料中の核酸濃度が非常に薄い場合には、試料中の標的遺伝子由来核酸を増幅して解析を行うことが多い。このような核酸の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。例えば、遺伝病、疾病感受性、癌等の診断において、異常細胞特異的なｍＲＮＡ等の標的核酸をＰＣＲ増幅して検出する方法が、広く用いられている。
一般的に、遺伝子解析を行う場合には、まず、生体試料等の生物学的試料から核酸を抽出する工程、その後、得られた核酸を鋳型として標的遺伝子由来核酸を増幅する工程、増幅された核酸を検出する工程などの各工程を行なう。試料から抽出する核酸がＲＮＡである場合には、さらに、得られたＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程を要する場合が多い。このように、遺伝子解析は多くの工程があり、信頼できる解析結果を得るためには、これらの各工程の精度管理が重要となる。各工程が正確に行なわれている保証が無ければ、結果の信頼性が著しく低下してしまう。そこで、一連の工程の精度が十分であり、よって解析結果が信頼できる、という保証を行なうため、ＲＮＡの抽出、増幅、検出等の各工程を行うことができる外部標準試料を用いることが、一般的に行われている。
ヒト組織をサンプルとして、癌等の疾患の遺伝子解析を行なう場合、標的遺伝子はヒトの遺伝子である場合が多い。そのため、核酸解析の工程を保証する際の外部標準試料として、ヒト由来の培養細胞の細胞溶液が、一般的に用いられている。培養細胞の細胞溶液をそのまま用いることによって、核酸の抽出から最後の解析までの一連の工程の保証を、一種類の外部標準試料のみで行なうことができる。
その他、核酸解析の工程の保証を行う方法として、例えば、（１）サンプル中に存在しない塩基配列からなる人工的に作成したＲＮＡを、解析対象であるサンプルにスパイクＲＮＡとして混入させた試料に対して、標識反応やハイブリダイゼーションを同時に行い、スパイクＲＮＡから検出されるシグナル強度等に基づきノーマライズすることにより、各工程を保証する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。この方法では、マイクロアレイで解析を行う際の、ＲＮＡの増幅や標識反応、アレイ上での結合（ハイブリダイゼーション）反応、及びシグナル取込み等の一連の過程において現れる様々なばらつきや誤差を、補正によって取り除く、あるいは、結果を保証することにより信頼性の高いデータを取得することができる。
国際公開第０３／１００４２２号パンフレット
外部標準試料として、標的遺伝子を発現している培養細胞の細胞溶液を用いることにより、核酸の抽出、増幅、検出の一連の解析工程を、１種の外部標準試料のみを用いて保証することができる、すなわち、一気通貫した外部標準試料を用いて保証することが可能と考えられる。しかしながら、一気通貫した外部標準試料を用いた場合には、複数の工程の中のどの工程に問題があるのかを判断することができず、解析工程を効率よく改善することが困難であるという問題がある。さらに、前工程のバラツキを拾い、蓄積してしまうため、各工程の精度を十分に保証し得る外部標準試料を設定することは非常に困難であり、実質的に不可能である。
また、多くの生体試料には、該生体試料が採取された対象である動物以外にも、細菌やウィルスといった様々な生物及び該生物由来のＲＮＡも含まれている。このため、例えば、ヒトから採取された生体試料から、生物種ごとに分離することなくＲＮＡを回収した場合には、ヒト由来のＲＮＡと、細菌やウィルスのようなヒト以外の生物種由来のＲＮＡとが混合された状態で回収される。特に、糞便や唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等には細菌が多く存在するため、これらの生体試料から回収された核酸には、圧倒的に細菌由来の成分が多く含まれており、ヒト由来の生体関連物質は非常に少量である場合が多い。
このように、解析対象である生物学的試料が、便等のように、圧倒的に細菌が多く含まれており、ヒト由来の細胞が非常に少量である生体試料である場合には、標的遺伝子がヒトの遺伝子であるからといって、ヒト由来培養細胞の細胞溶液を外部標準試料として用いたとしても、その工程の精度を保証する信頼に足る結果を得ることは困難である。ヒト由来の細胞のみからなる細胞溶液は、大量の細菌の中にわずかにヒト由来の細胞が混在している解析対象である生体試料の大多数の特徴を反映していないためである。
その他、培養細胞は増殖させるのに時間がかかる上に、取り扱いに十分注意が必要である、という問題もある。継代培養を進めることにより、形質が変化してしまう場合があるためである。調製した細胞溶液の保存を行なう場合にも、十分に取り扱いを注意する必要があり、労力がかかる。
一方、上記（１）の方法では、解析対象である生物学的試料から抽出されたＲＮＡに、人工的に作成したＲＮＡを外部から直接混合することによって、ＲＮＡの増幅や標識反応、ハイブリダイゼーション反応、およびシグナル取込み等の工程を保証することができるが、生物学的試料からＲＮＡを抽出する工程の保証までは言及されていない。また、生物学的試料から抽出されたＲＮＡには、増幅反応等の阻害物質が含まれている場合が多いため、各反応が上手くいかなかった場合に、工程に問題があるのか、それとも生物学的試料から抽出されたＲＮＡに問題があるのかが、明確に判断することができない、という問題もある。また、標的サンプルに外部コントロールを混入させることにより、サンプルへのコンタミネーションの機会が増える、添加できる鋳型ＲＮＡの容量に制限がかかる等の不具合も生じる。
また、工程精度を十分に保証するためには、用いる標準陽性試料は、同一性状のもの（すなわち、同一ロットのもの）を多数ストックすることが可能なものを用いることが好ましい。このように、大量に作成した同一ロットの標準陽性試料を用いることにより、検査毎のばらつきを確認でき、より正確に工程の精度を保証することができるためである。このためには、用いる標準陽性試料としては、大量調製を簡便に行うことができ、かつ、長期間安定して保存することが可能なものであることが好ましい。
本発明は、２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料からＲＮＡを抽出し、逆転写反応の後に核酸増幅反応により、標的遺伝子由来のＲＮＡを検出する方法における、各工程の精度を十分に保証し得る方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料からＲＮＡを抽出する抽出工程、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行ってｃＤＮＡを得る逆転写工程、及び、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程に対して、工程ごとに異なる標準陽性試料を用いることにより、各工程の精度を正確に保証し得ることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、
（１） ２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料から、ＲＮＡを抽出する抽出工程と、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得る逆転写工程と、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程と、増幅された核酸を検出する検出工程と、を含む標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法における工程精度を保証する方法であって、前記標的遺伝子は疾患のマーカー遺伝子であり、前記標的遺伝子以外の遺伝子であって、前記生物学的試料に当該遺伝子由来のＲＮＡが含まれている遺伝子を標準遺伝子とし、下記工程（ａ）及び／又は（ｂ）と、下記工程（ｃ）とを有することを特徴とする工程精度保証方法；（ａ）標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を抽出工程標準陽性試料とし、所定量の抽出工程標準陽性試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ溶液を調製し、当該ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、前記抽出工程の精度を保証する工程；（ｂ）標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を逆転写工程標準陽性試料とし、所定量の逆転写工程標準陽性試料中のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程；（ｃ）標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を増幅工程標準陽性試料とし、所定量の増幅工程標準陽性試料中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程、
（２） 前記生物学的試料が、哺乳生物のＲＮＡよりも微生物のＲＮＡを多く含む生物学的試料であることを特徴とする前記（１）記載の工程精度保証方法、
（３） 前記抽出工程標準陽性試料が、細菌の細胞溶液であることを特徴とする前記（２）記載の工程精度保証方法、
（４） 前記逆転写工程標準陽性試料が、２以上の生物種のＲＮＡを含むことを特徴とする前記（１〜３）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（５） さらに、（ｂ’）鋳型となるＲＮＡを含まない逆転写反応溶液中で逆転写反応を行った後、当該逆転写反応溶液を添加した増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程と、を有することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（６） さらに、（ｃ’）鋳型となるＤＮＡを含まない増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程と、を有することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（７） さらに、下記工程（ｄ）及び／又は（ｅ）を有することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の工程精度保証方法；（ｄ）前記抽出工程において、前記生物学的試料から抽出された標的ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、当該生物学的試料の精度を保証する工程；（ｅ）前記逆転写工程において得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記生物学的試料の精度を保証する工程、
（８） 前記工程（ａ）において、前記ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記抽出工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（９） 前記工程（ａ）において、ＲＮＡの精製度の測定が、前記ＲＮＡ溶液の、２６０ｎｍにおける吸光度を２３０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２３０ｎｍ吸光度比）、及び／又は２６０ｎｍにおける吸光度を２８０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２８０ｎｍ吸光度比）を測定するものであり、前記２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１０） 前記２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、１．０〜２．５の範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（９）記載の工程精度保証方法、
（１１） 前記工程（ａ）において、ＲＮＡの分解度の測定が、前記ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、２３ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量を１６ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量で除した値（２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比）を測定するものであり、
前記２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（２）〜（１０）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１２） 前記２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、１．６〜２．５の範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（１１）記載の工程精度保証方法、
（１３） 前記工程（ｂ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記逆転写工程及び／又は前記増幅工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１４） 前記工程（ｃ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記増幅工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記増幅工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１５） 前記工程（ｂ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さく、かつ、前記工程（ｃ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記逆転写工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１６） 前記工程（ｃ）が、（ｃ”）標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を段階的に希釈し、調製された各濃度の希釈液中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度の保証と、前記生物学的試料中の標的遺伝子由来ＲＮＡの定量とを行う工程、であることを特徴とする前記（１）〜（１５）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１７） 前記生物学的試料が糞便であることを特徴とする前記（１）〜（１６）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１８） 標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法における工程精度を保証するためのキットであって、前記標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法は、２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料から、ＲＮＡを抽出する抽出工程と、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得る逆転写工程と、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程と、増幅された核酸を検出する検出工程とを含み、前記標的遺伝子は疾患のマーカー遺伝子であり、前記標的遺伝子以外の遺伝子であって、生物学的試料に当該遺伝子由来のＲＮＡが含まれている遺伝子が標準遺伝子であり、前記標的遺伝子及び／又は前記標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料と、前記標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液並びに／又は標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／若しくは標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料と、を含むことを特徴とする工程精度保証用キット、
（１９） 前記標的遺伝子が哺乳生物の遺伝子であり、前記細胞溶液が細菌の細胞溶液であることを特徴とする前記（１８）記載の工程精度保証用キット、
を、提供するものである。
（１） ２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料から、ＲＮＡを抽出する抽出工程と、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得る逆転写工程と、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程と、増幅された核酸を検出する検出工程と、を含む標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法における工程精度を保証する方法であって、前記標的遺伝子は疾患のマーカー遺伝子であり、前記標的遺伝子以外の遺伝子であって、前記生物学的試料に当該遺伝子由来のＲＮＡが含まれている遺伝子を標準遺伝子とし、下記工程（ａ）及び／又は（ｂ）と、下記工程（ｃ）とを有することを特徴とする工程精度保証方法；（ａ）標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を抽出工程標準陽性試料とし、所定量の抽出工程標準陽性試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ溶液を調製し、当該ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、前記抽出工程の精度を保証する工程；（ｂ）標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を逆転写工程標準陽性試料とし、所定量の逆転写工程標準陽性試料中のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程；（ｃ）標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を増幅工程標準陽性試料とし、所定量の増幅工程標準陽性試料中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程、
（２） 前記生物学的試料が、哺乳生物のＲＮＡよりも微生物のＲＮＡを多く含む生物学的試料であることを特徴とする前記（１）記載の工程精度保証方法、
（３） 前記抽出工程標準陽性試料が、細菌の細胞溶液であることを特徴とする前記（２）記載の工程精度保証方法、
（４） 前記逆転写工程標準陽性試料が、２以上の生物種のＲＮＡを含むことを特徴とする前記（１〜３）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（５） さらに、（ｂ’）鋳型となるＲＮＡを含まない逆転写反応溶液中で逆転写反応を行った後、当該逆転写反応溶液を添加した増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程と、を有することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（６） さらに、（ｃ’）鋳型となるＤＮＡを含まない増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程と、を有することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（７） さらに、下記工程（ｄ）及び／又は（ｅ）を有することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の工程精度保証方法；（ｄ）前記抽出工程において、前記生物学的試料から抽出された標的ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、当該生物学的試料の精度を保証する工程；（ｅ）前記逆転写工程において得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記生物学的試料の精度を保証する工程、
（８） 前記工程（ａ）において、前記ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記抽出工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（９） 前記工程（ａ）において、ＲＮＡの精製度の測定が、前記ＲＮＡ溶液の、２６０ｎｍにおける吸光度を２３０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２３０ｎｍ吸光度比）、及び／又は２６０ｎｍにおける吸光度を２８０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２８０ｎｍ吸光度比）を測定するものであり、前記２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１０） 前記２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、１．０〜２．５の範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（９）記載の工程精度保証方法、
（１１） 前記工程（ａ）において、ＲＮＡの分解度の測定が、前記ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、２３ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量を１６ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量で除した値（２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比）を測定するものであり、
前記２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（２）〜（１０）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１２） 前記２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、１．６〜２．５の範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（１１）記載の工程精度保証方法、
（１３） 前記工程（ｂ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記逆転写工程及び／又は前記増幅工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１４） 前記工程（ｃ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記増幅工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記増幅工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１５） 前記工程（ｂ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さく、かつ、前記工程（ｃ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記逆転写工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする前記（１）〜（１２）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１６） 前記工程（ｃ）が、（ｃ”）標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を段階的に希釈し、調製された各濃度の希釈液中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度の保証と、前記生物学的試料中の標的遺伝子由来ＲＮＡの定量とを行う工程、であることを特徴とする前記（１）〜（１５）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１７） 前記生物学的試料が糞便であることを特徴とする前記（１）〜（１６）のいずれか記載の工程精度保証方法、
（１８） 標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法における工程精度を保証するためのキットであって、前記標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法は、２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料から、ＲＮＡを抽出する抽出工程と、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得る逆転写工程と、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程と、増幅された核酸を検出する検出工程とを含み、前記標的遺伝子は疾患のマーカー遺伝子であり、前記標的遺伝子以外の遺伝子であって、生物学的試料に当該遺伝子由来のＲＮＡが含まれている遺伝子が標準遺伝子であり、前記標的遺伝子及び／又は前記標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料と、前記標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液並びに／又は標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／若しくは標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料と、を含むことを特徴とする工程精度保証用キット、
（１９） 前記標的遺伝子が哺乳生物の遺伝子であり、前記細胞溶液が細菌の細胞溶液であることを特徴とする前記（１８）記載の工程精度保証用キット、
を、提供するものである。
本発明の工程精度保証方法は、標準陽性試料により保証する範囲を分割し、工程ごとに標準陽性試料を用いる方法である。つまり、各工程に適した標準陽性試料をおくため、本発明の工程精度保証方法を用いることにより、簡便に各工程の精度管理を行うことができることに加えて、前の工程のバラツキを蓄積することなく、各工程の精度のみを純粋に評価することができる。
本発明に供される生物学的試料は、２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料である。生物から採取された試料（生体試料）であってもよく、培養細胞等から調製された試料であってもよい。本発明に供される生物学的試料としては、臨床検体等の生体試料であることが好ましい。生体試料が採取される生物は、特に限定されるものではないが、真核生物であることが好ましく、動物であることがより好ましく、哺乳類であることがさらに好ましく、ヒトであることが特に好ましい。該生体試料として、例えば、糞便、唾液や血液等の体液、喀痰、口腔粘膜や子宮粘膜等の粘膜や粘液等がある。特に、哺乳生物から採取された生体試料であって、該生体試料を採取された生物以外の種類の生物のＲＮＡ、例えば原核生物やウィルス等の微生物のＲＮＡを比較的多く含む生体試料であることが好ましく、真正細菌等の原核生物のＲＮＡをより多く含む生体試料であることが特に好ましい。このような細菌等の微生物を多く含む哺乳生物から採取された生体試料として、例えば、糞便、唾液、喀痰、口腔粘膜、子宮粘膜等がある。本発明に供される生物学的試料としては、糞便であることが特に好ましい。
また、本発明において、「遺伝子由来ＲＮＡ」とは、遺伝子のゲノムＤＮＡの全長又は一部分から転写されたＲＮＡを意味し、該遺伝子のｍＲＮＡであってもよく、該ｍＲＮＡの一部分（フラグメント）であってもよい。
本発明において、標的遺伝子とは、疾患のマーカー遺伝子であって、解析対象となる遺伝子である。疾患のマーカー遺伝子は、解析対象である生物学的試料中における、当該遺伝子の発現の有無やその発現量の多寡を解析することにより、被験者が当該疾患に罹患しているか否かを判断することが可能な遺伝子であれば、特に限定されるものではなく、疾患の種類等を考慮して、適宜決定することができる。疾患のマーカー遺伝子は、特定の疾患に罹患している場合に、特異的に発現する遺伝子や、塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアント（アイソフォーム）等の変異が生ずる遺伝子等が挙げられる。
本発明における標的遺伝子としては、腺腫又はがんのマーカー遺伝子であることが好ましい。腺腫やがんといった疾患では、遺伝子の変異が主な発症原因の１つであると考えられており、遺伝子解析によるマーカー遺伝子の検出が、臨床検査においても行われている。例えば、本発明における標的遺伝子として、ＣＯＸ−２（Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ −２）、ＭＭＰ７（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ７）、ＳＮＡＩＬ等の、腺腫マーカー又はがんマーカーとして公知の遺伝子を用いることができる。
その他、本発明における標的遺伝子としては、感染症等のマーカー遺伝子であることも好ましい。感染症のマーカー遺伝子としては、感染症の原因微生物の遺伝子等が挙げられる。
本発明において、標準遺伝子とは、標的遺伝子以外の遺伝子であって、解析対象である生物学的試料に、当該遺伝子由来のＲＮＡが含まれている遺伝子であれば、特に限定されるものではなく、用いる生物学的試料の種類、標的遺伝子がマーカーとして機能する疾患の種類等を考慮して、適宜決定することができる。標準遺伝子は、標的遺伝子と同一種類の生物の遺伝子であってもよく、異なる種類の生物の遺伝子であってもよい。
例えば、生物学的試料がヒトから採取された糞便であり、標的遺伝子がヒトの遺伝子である場合のように、生物学的試料中に比較的少量しか含まれていない生物の遺伝子を標的遺伝子とする場合には、標準遺伝子としては、当該標的遺伝子と同じ生物種の遺伝子であることが好ましい。当該標的遺伝子と同じ生物種の遺伝子を標準遺伝子とすることにより、標的遺伝子の生物由来の核酸が、解析に用いた生物学的試料中に存在していたことを確認することができるためである。
一方、生物学的試料が採取された生物の感染症への罹患の有無を判断するために、標的遺伝子を感染症の原因微生物の遺伝子とする場合には、当該生物学的試料が採取された生物の遺伝子を標準遺伝子とすることが好ましい。
本発明においては、標準遺伝子として、ハウスキーピング遺伝子を用いることが好ましい。ハウスキーピング遺伝子由来ＲＮＡは、一般的に、特定の疾患に対する罹患の有無に関わらず、同一生物種の細胞中にほぼ同程度の量存在しているためである。該ハウスキーピング遺伝子としては、例えば、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ：ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、１８Ｓ リボソームＲＮＡ、２８Ｓ リボソームＲＮＡ、βアクチン、β２ミクログロブリン、ヒポキサンチンホスホリボシル・トランスフェラーゼ１、リボソーム蛋白質ラージＰ０、ペプチジルプロピル・イソメラーゼＡ（シクロスポリンＡ）、チトクロームＣ、ホスホグリセレート・キナーゼ１、β−グルクロニダーゼ、ＴＡＴＡボックス結合因子、トランスフェリン受容体、ＨＬＡ−Ａ０２０１重鎖、リボソームタンパク質Ｌ１９、αチューブリン、βチューブリン、γチューブリン、ＡＴＰシンセターゼ、翻訳伸長因子１ガンマ（ＥＥＦ１Ｇ：ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ｇａｍｍａ）、コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＳＤＨＡ：ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）、アミノレブリン酸シンターゼ１（ＡＬＡＳ：ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈａｓｅ １）、ＡＤＰ−リボシル化因子６（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）、エンドヌクレアーゼＧ（ＥＮＤＯＧ：ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｇ）、及びペルオキシソーム形成因子（ＰＥＸ：ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）等が挙げられる。
なお、本発明において、「遺伝子由来核酸」とは、遺伝子由来ＲＮＡから逆転写反応により合成されるｃＤＮＡ、当該ｃＤＮＡから増幅される核酸であって、当該遺伝子由来ＲＮＡの全部又は一部と相同的又は相補的な塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本発明の工程精度保証方法は、２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料から、ＲＮＡを抽出する抽出工程と、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応（ＲＴ：Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行い、ｃＤＮＡを得る逆転写工程と、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程と、増幅された核酸を検出する検出工程と、を含む標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法における工程精度を保証する方法である。
工程精度の保証対象である、ＲＮＡの抽出工程、逆転写工程、核酸増幅反応を行う増幅工程、及び増幅された核酸の検出工程は、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知のいずれの方法を用いて行ってもよい。
例えば、生物学的試料からのＲＮＡの抽出・精製方法としては、ＩＳＯＧＥＮ等の酸性フェノールグアニジン−クロロホルム法や、Ｂｏｏｍ法等が挙げられ、これらの方法を組み合わせて用いることもできる。その他、市販されている精製キット等を利用することもできる。
例えば、生物学的試料からのＲＮＡの抽出・精製方法としては、ＩＳＯＧＥＮ等の酸性フェノールグアニジン−クロロホルム法や、Ｂｏｏｍ法等が挙げられ、これらの方法を組み合わせて用いることもできる。その他、市販されている精製キット等を利用することもできる。
また、抽出工程により、生物学的試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ溶液を調製した後、得られたＲＮＡ溶液中のＲＮＡの全量又は一部に対して、逆転写反応を行う方法も、通常用いられる逆転写酵素等の試薬を用いて、一般的に行われる反応条件において行うことができる。なお、抽出工程により得られたＲＮＡ溶液をノーマライズ（予め定められた所定の濃度に調整する）した後に、逆転写反応を行ってもよい。ノーマライズする濃度は、後の増幅工程・検出工程の方法等を考慮して、適宜決定することができる。
増幅工程において、逆転写工程により得られたｃＤＮＡを鋳型として行う増幅方法としては、一般的にＤＮＡを鋳型として、特定の塩基配列を有する核酸を増幅する方法であれば、特に限定されるものではなく、当該技術分野において公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、ＰＣＲ、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）であってもよく、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）やＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）等のように、ｃＤＮＡと共にＲＮＡが増幅される反応であってもよい。
検出工程において、増幅された核酸を検出する方法としては、一般的にＤＮＡやＲＮＡを検出し得る方法であれば、特に限定されるものではなく、定性的な検出方法であってもよく、定量的な検出方法であってもよい。このような検出方法として、例えば、電気泳動法、ハイブリダイゼーション法、免疫凝集法、ＥＬＩＳＡ法、吸光度測定法、一分子蛍光分析法、蛍光偏光解析法等がある。試料中に微量に存在する核酸を容易に検出し定量することが可能であるため、定量的核酸増幅法、ＥＬＩＳＡ法、一分子蛍光分析法や、蛍光偏光解析法を用いて測定することが好ましい。例えば、リアルタイムＰＣＲやリアルタイムＮＡＳＢＡ等を行うことにより、増幅工程と増幅産物の検出工程とを同時に行うことができる。
本発明の工程精度保証方法は、下記工程（ａ）及び／又は（ｂ）と、下記工程（ｃ）とを有することを特徴とする。
（ａ）標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を抽出工程標準陽性試料とし、当該抽出工程標準陽性試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ溶液を調製し、当該ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、前記抽出工程の精度を保証する工程。
（ｂ）標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を逆転写工程標準陽性試料とし、当該逆転写工程標準陽性試料中のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程。
（ｃ）標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を増幅工程標準陽性試料とし、当該増幅工程標準陽性試料中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程。
（ａ）標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を抽出工程標準陽性試料とし、当該抽出工程標準陽性試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ溶液を調製し、当該ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、前記抽出工程の精度を保証する工程。
（ｂ）標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を逆転写工程標準陽性試料とし、当該逆転写工程標準陽性試料中のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程。
（ｃ）標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を増幅工程標準陽性試料とし、当該増幅工程標準陽性試料中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程。
本発明の工程精度保証方法は、工程（ａ）及び（ｃ）のみを有する方法であってもよく、工程（ｂ）及び（ｃ）のみを有する方法であってもよく、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）をいずれも有する方法であってもよい。より確度の高い保証を行うことができるため、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）をいずれも有する方法であることが好ましい。
本発明及び本願明細書において、「工程の精度が保証されている」とは、当該工程の操作が適確であり、操作上の不具合等が生じていないことを意味する。逆に、「工程の精度が保証されていない」とは、用いた試薬の劣化、器具や装置の故障、人為的な操作ミス等により、不具合が生じており、当該工程の操作が適切に行われなかったことを意味する。
本発明の工程精度保証方法は、前述の標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法の各工程の精度を保証するものであるから、工程（ａ）〜（ｃ）における、ＲＮＡの抽出方法、逆転写反応、及び核酸増幅反応は、各工程の標準陽性試料を用いる以外は、当該検出方法の各工程における方法と同じ操作を行う。
・工程（ａ）
工程（ａ）においては、抽出工程標準陽性試料として、標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を用いる。当該抽出工程標準陽性試料としては、細胞を含む溶液であればよく、哺乳細胞等の多細胞生物の細胞溶液であってもよく、細菌等の微生物の細胞溶液であってもよい。
工程（ａ）においては、抽出工程標準陽性試料として、標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を用いる。当該抽出工程標準陽性試料としては、細胞を含む溶液であればよく、哺乳細胞等の多細胞生物の細胞溶液であってもよく、細菌等の微生物の細胞溶液であってもよい。
従来は、全工程に対して一の標準陽性試料を用いていたため、標的遺伝子と同種の生物の細胞溶液を、標準試料として用いていた。つまり、標的遺伝子が哺乳生物の疾患マーカー遺伝子であった場合には、哺乳生物由来の培養細胞株の細胞溶液を、標的遺伝子が感染症の原因微生物の遺伝子であった場合には、当該原因微生物の培養溶液を、それぞれ用いていた。しかしながら、前述したように、哺乳細胞の細胞溶液は、調製に手間と労力がかかる上に、取扱いにも注意を要する。また、病原性の微生物の培養溶液を標準試料とすることは、安全上好ましくない。これに対して、本発明の工程精度保証方法においては、各工程に対して別個に標準陽性試料を設定するため、生物学的試料からのＲＮＡの抽出工程に対して標準陽性試料として機能し得る細胞溶液であれば、当該細胞溶液から抽出されたＲＮＡが、標的遺伝子由来ＲＮＡを含んでおらず、以降の工程の標準試料としては不適当なものであっても、抽出工程標準陽性試料として用いることができる。
本発明の抽出工程標準陽性試料としては、哺乳細胞よりも取り扱い性や保存性が良好であり、調製に要するコストも比較的廉価で済むことから、細菌の細胞溶液（培養液）であることが好ましい。このような細菌の培養液としては、例えば、非病原性の大腸菌や大腸菌群、バクテロイデス属、ユウバクテリウム属等のグラム陰性菌や、バチルス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、スタフィロコッカス属、ビフィドバクテリウム属、リューコノストック属等のグラム陽性菌の培養液を用いることができる。
細菌は、大量培養を簡便に行うことができ、かつ、凍結保存や凍結融解処理に対しても安定である。このため、抽出工程標準陽性試料として細菌の培養液を用いた場合には、一度に大量に調製した細菌の培養液を、適当量ずつ分注して凍結保存することによって、同一ロットの抽出工程標準陽性試料を大量に準備してストックすることが可能となる。複数の検査における抽出工程において、プールされた同一ロットの抽出工程標準陽性試料を用いることにより、検査毎のばらつきを確認でき、より正確に工程の精度を保証することが可能となる。また、このようにして凍結保存された抽出工程標準陽性試料は、解凍後すぐに用いることができ、検査の度に抽出工程標準陽性試料を新たに調製する必要がない。なお、細菌の培養液を凍結保存する際は、グリセロール等の凍結保護剤を含有させた溶液の状態で保存したものであっても良く、また、細菌の培養液を遠心し、上清を捨て、沈殿として細菌を濃縮して保存したものであっても良い。
その他、生物学的試料として、糞便等の細菌を多く含む生体試料を用いる場合には、抽出工程標準陽性試料として細菌の培養液を用いることにより、解析対象である生体試料の性状に近い標準試料とすることができる。
抽出工程の操作に何ら不具合がなく、操作が適確に行われた場合には、抽出工程標準陽性試料から、量や質が十分であるＲＮＡが抽出される。そこで、抽出工程標準陽性試料から抽出されたＲＮＡの量や質を調べ、これらが予め設定された基準を満たす場合には、抽出工程の精度が保証されていると判断することができる。逆に、抽出されたＲＮＡの量や質が、予め設定された基準に満たない場合には、抽出工程の精度が保証されていないと判断することができる。
具体的には、まず、所定量の抽出工程標準陽性試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ溶液を調製し、当該ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定する。ＲＮＡの濃度、精製度、又は分解度のいずれか１のみの測定値に基づき工程の精度を保証してもよく、２以上の測定値の結果を組み合わせて工程の精度を保証してもよく、３種すべての測定値の結果に基づいて工程の精度を保証してもよい。
当該ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、抽出工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、抽出工程の精度が保証されていると判断する。この場合の判断基準となる閾値は、ＲＮＡを抽出・精製する抽出工程標準陽性試料の濃度や量、ＲＮＡの定量方法等を考慮して、適宜決定することができる。なお、ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度は、通常用いられている方法により定量することができる。例えば、２６０ｎｍの紫外線吸収値や、インターカレーター等の２本鎖核酸結合物質を用いて測定される蛍光値等に基づいて、濃度を算出することができる。また、濃度を算出することによって、抽出されたＲＮＡの総量も算出することができる。
本発明において、ＲＮＡの精製度とは、抽出・精製されたＲＮＡ中の不純物（ＲＮＡ以外の物質）の割合を意味する。ＲＮＡの精製度が高いほど、該ＲＮＡの質は高い。
ＲＮＡの精製度の測定は、一般的に核酸試料の精製度（純度）を測定する場合に用いられる公知の手法の中から、適宜選択して行うことができる。本発明においては、ＵＶを用いてＲＮＡの吸光度を測定し、２６０ｎｍにおける吸光度を２３０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２３０ｎｍ吸光度比）や２６０ｎｍにおける吸光度を２８０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２８０ｎｍ吸光度比）を、精製度の指標とすることが好ましい。２６０／２３０ｎｍ吸光度比からＲＮＡと塩類との濃度比がわかる。一方、２６０／２８０ｎｍ吸光度比からＲＮＡとタンパク質等との濃度比がわかるため、これらによりＲＮＡの精製度を知ることができる。つまり、２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、抽出工程の精度が保証されていないと判断することができる。これらの吸光度比のいずれかを用いてもよく、両方を用いてもよい。
ＲＮＡの精製度の測定は、一般的に核酸試料の精製度（純度）を測定する場合に用いられる公知の手法の中から、適宜選択して行うことができる。本発明においては、ＵＶを用いてＲＮＡの吸光度を測定し、２６０ｎｍにおける吸光度を２３０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２３０ｎｍ吸光度比）や２６０ｎｍにおける吸光度を２８０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２８０ｎｍ吸光度比）を、精製度の指標とすることが好ましい。２６０／２３０ｎｍ吸光度比からＲＮＡと塩類との濃度比がわかる。一方、２６０／２８０ｎｍ吸光度比からＲＮＡとタンパク質等との濃度比がわかるため、これらによりＲＮＡの精製度を知ることができる。つまり、２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、抽出工程の精度が保証されていないと判断することができる。これらの吸光度比のいずれかを用いてもよく、両方を用いてもよい。
具体的には、２６０／２３０ｎｍ吸光度比が１．０未満又は２．５超である場合には、塩類の含有割合が高く、精製度が不十分であり、抽出工程の精度が保証されていないと判断することができる。逆に、２６０／２３０ｎｍ吸光度比が１．０〜２．５である場合、好ましくは１．７〜２．１である場合には、精製度が十分であり、抽出工程の精度が保証されていると判断することができる。一方、２６０／２８０ｎｍ吸光度比が１．０未満又は２．５超である場合には、タンパク質の混入等があり、精製度が不十分であると考えられ、抽出工程の精度が保証されていないと判断することができる。逆に、２６０／２８０ｎｍ吸光度比が１．０〜２．５である場合、好ましくは１．７〜２．１である場合には、精製度が十分であり、抽出工程の精度が保証されていると判断することができる。
本発明において、ＲＮＡの分解度とは、抽出・精製されたＲＮＡが核酸分解酵素等により分解された割合を意味する。ＲＮＡの分解度が低いほど、該ＲＮＡの質は高い。
ＲＮＡの分解度の測定は、一般的に核酸の分解・断片化を測定する場合に用いられる公知の手法の中から、適宜選択して行うことができる。例えば、ＲＮＡの電気泳動によるサイズ分離測定を行うと、それぞれのサイズごとの核酸量がわかるため、ＲＮＡの分解度を測定することができる。
ＲＮＡの分解度の測定は、一般的に核酸の分解・断片化を測定する場合に用いられる公知の手法の中から、適宜選択して行うことができる。例えば、ＲＮＡの電気泳動によるサイズ分離測定を行うと、それぞれのサイズごとの核酸量がわかるため、ＲＮＡの分解度を測定することができる。
抽出工程標準陽性試料として、細菌の培養液を用いた場合には、細菌由来ＲＮＡ、特に細菌のリボソーマルＲＮＡである２３Ｓ ｒＲＮＡ・１６Ｓ ｒＲＮＡサブユニットを指標とし、ＲＮＡの分解度を測定することが有効である。例えば、分解の起こっていないｔｏｔａｌＲＮＡでは、２本のリボソーマルＲＮＡ（細菌由来の２３Ｓ ｒＲＮＡと１６Ｓ ｒＲＮＡ）のはっきりとしたバンドが、およそ２：１の割合でみられる。これに対して、分解・断片化が起こっているｔｏｔａｌＲＮＡでは、リボソーマルＲＮＡの各サブユニットのバンドが拡散し、バンドが明瞭でなくなり、低分子サイズでスメア状に検出される。このため、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、抽出工程の精度が保証されていないと判断することができる。
具体的には、２３ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量を１６ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量で除した値（２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比）が１．６〜２．５である場合、好ましくは１．８〜２．０である場合には、分解度が十分に低く、抽出工程の精度が保証されていると判断することができる。逆に、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が１．６未満又は２．５超である場合には、分解度が高く、抽出工程の精度が保証されていないと判断することができる。
ＲＮＡの電気泳動に用いることのできるアジレントテクノロジー社の電気泳動装置「バイオアナライザ」は、分子生物学分野では広く用いられている自動キャピラリーゲル電気泳動装置の１つである（例えば、“A microfluidic system for highspeed reproducible DNA sizing and quantitation”、Electrophoresis、２００年、第２１巻第１号、第１２８〜１３４ページ参照。）。これは、核酸のサイズごとの定量結果が測定終了後に自動表示されるため、リボソーマルＲＮＡ比である２８Ｓ ｒＲＮＡ／１８Ｓ ｒＲＮＡ比（２８ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量を１８ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量で除した値）、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比や、その他のバンドの値がわかり、リボソーマルＲＮＡの分解・断片化の割合から目的ＲＮＡの分解度・精製度を推測することができる。この装置のアルゴリズムの１つであるＲＩＮ（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）値は、核酸の分解度の指標の１つとして一般的に用いられている。このＲＩＮ値（範囲：１〜１０）を用いた場合、ＲＩＮ値が高い（＝１０）と分解度が少なく、ＲＩＮ値が低い（＝１）と分解度が高いといえる。例えば、細菌の培養液由来のＲＮＡでは、ＲＩＮ値の範囲は１０〜４であれば、分解度が十分に低いと判断することができる。
工程（ａ）において、ＲＮＡを抽出するために供される抽出工程標準陽性試料の濃度あるいは量は、当該濃度あるいは量の抽出工程標準陽性試料から抽出した場合に、抽出されるＲＮＡの濃度あるいは量が予め設定された閾値よりも大きいこと、抽出されるＲＮＡの精製度が予め設定された数値範囲内であること、抽出されるＲＮＡの分解度が予め設定された数値範囲内であることが、確認されている量であればよい。例えば、同一ロットの細菌培養液のストックを多数調製し冷凍保存した場合に、１のストックの所定量の細菌培養液からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡの濃度あるいは量、精製度、分解度が十分であることが確認できた場合には、以後の検査において、当該ロットのストックから分取した同じ量の細菌培養液を、抽出工程標準陽性試料として使用することができる。
・工程（ｂ）
工程（ｂ）においては、逆転写工程標準陽性試料として、標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を用いる。当該逆転写工程標準陽性試料としては、標的遺伝子由来ＲＮＡと標準遺伝子由来ＲＮＡとのいずれか一方を少なくとも含むＲＮＡ溶液であれば、いずれのＲＮＡ溶液であってもよいが、大量のＲＮＡを、少なくとも複数回の逆転写反応に必要な量のＲＮＡを、一度の調製により得ることができるＲＮＡ溶液であることが好ましい。同一ロットのＲＮＡ溶液を、適当量ずつに分注して多数ストックしておくことができるためである。複数の検査における逆転写工程において、プールされた同一ロットのＲＮＡ溶液を逆転写工程標準陽性試料として使用することにより、検査毎のばらつきを確認でき、より正確に工程の精度を保証することができる。
工程（ｂ）においては、逆転写工程標準陽性試料として、標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を用いる。当該逆転写工程標準陽性試料としては、標的遺伝子由来ＲＮＡと標準遺伝子由来ＲＮＡとのいずれか一方を少なくとも含むＲＮＡ溶液であれば、いずれのＲＮＡ溶液であってもよいが、大量のＲＮＡを、少なくとも複数回の逆転写反応に必要な量のＲＮＡを、一度の調製により得ることができるＲＮＡ溶液であることが好ましい。同一ロットのＲＮＡ溶液を、適当量ずつに分注して多数ストックしておくことができるためである。複数の検査における逆転写工程において、プールされた同一ロットのＲＮＡ溶液を逆転写工程標準陽性試料として使用することにより、検査毎のばらつきを確認でき、より正確に工程の精度を保証することができる。
逆転写工程標準陽性試料としては、例えば、標的遺伝子由来ＲＮＡと標準遺伝子由来ＲＮＡとのいずれか一方を少なくとも含む培養細胞の細胞溶液から、常法により抽出・精製したＴｏｔａｌ ＲＮＡ溶液が挙げられる。また、標的遺伝子と標準遺伝子が異なる生物種の遺伝子同士である場合には、標的遺伝子由来ＲＮＡを含む培養細胞の細胞溶液から抽出・精製したＴｏｔａｌ ＲＮＡ溶液と、標準遺伝子由来ＲＮＡを含む培養細胞の細胞溶液から抽出・精製したＴｏｔａｌ ＲＮＡ溶液とを混合した溶液であってもよい。また、標的遺伝子由来ＲＮＡを、ＮＡＳＢＡやＴＲＣ等のＲＮＡ増幅法により増幅し、得られた増幅産物を、そのまま逆転写工程標準陽性試料として用いてもよく、この増幅産物を、標準遺伝子のみを発現する培養細胞から抽出・精製したＴｏｔａｌ ＲＮＡにスパイク混合させたものを、逆転写工程標準陽性試料としてもよい。その他、人工配列ＲＮＡであってもよい。なお、「人工配列ＲＮＡ」とは、塩基配列を人工的に設計したＲＮＡを意味する。
また、前述したように、生体試料は、一般的に、採取された生物以外の細菌等の生物由来のＲＮＡを含むものであるため、逆転写工程標準陽性試料として、標的遺伝子と同種の生物のＲＮＡと、その他の生物種のＲＮＡとを含む試料、つまり、２以上の生物種のＲＮＡを含む試料とすることにより、解析対象である生体試料の性状に近い標準試料とすることができ、このような逆転写工程標準陽性試料を用いることにより、逆転写工程をより正確に反映できる。例えば、生物学的試料が糞便等の哺乳細胞由来ＲＮＡと細菌由来ＲＮＡを含む試料である場合には、標的遺伝子由来ＲＮＡを含む培養細胞から調製されたＲＮＡ溶液と、細菌から調製されたＲＮＡ溶液とを、任意の割合で混合し、より実際の生物学的試料から抽出されたＲＮＡ溶液の状態に近づけたものを、逆転写工程標準陽性試料として用いることが好ましい。また、別個に調製したＲＮＡ溶液を混合したものを逆転写工程標準陽性試料として用いる場合にも、それぞれのＲＮＡ溶液を一度に大量に調製し、これらを混合して均一化したものを、適当量ずつに分注して多数ストックしておくことが好ましい。
具体的には、所定量の逆転写工程標準陽性試料中のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、逆転写工程及び増幅工程の精度を保証する。
一般的に、逆転写反応で成功したか否かについて、逆転写後のＲＮＡを直接確認することは困難である。そこで、逆転写工程の結果は、増幅工程の結果と合わせて判断する。すなわち、得られたｃＤＮＡを鋳型にした増幅反応を行い、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、逆転写工程及び／又は増幅工程の精度が保証されていないと判断することができる。逆に、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度が保証されていると判断することができる。この場合の判断基準となる閾値は、逆転写反応において用いられた逆転写工程標準陽性試料の濃度や量、増幅反応や増幅産物の検出反応の種類等を考慮して、適宜決定することができる。
増幅量や増幅効率は、増幅工程により得られた増幅産物を、定量的又は半定量的に検出することにより、測定又は算出することができる。また、増幅工程をリアルタイムＰＣＲ等の半定量的な増幅方法を用いて行うことによっても、増幅量や増幅効率を測定することができる。
なお、抽出工程標準陽性試料と同様に、逆転写工程に供される逆転写工程標準陽性試料の量は、当該量の逆転写工程標準陽性試料に対して逆転写反応を行い、さらに得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行った場合に、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも大きいことが、確認されている量であればよい。
・工程（ｂ’）
本発明においては、さらに下記の工程（ｂ’）を有していてもよい。
（ｂ’）鋳型となるＲＮＡを含まない逆転写反応溶液中で逆転写反応を行った後、当該逆転写反応溶液を添加した増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程。
本発明においては、さらに下記の工程（ｂ’）を有していてもよい。
（ｂ’）鋳型となるＲＮＡを含まない逆転写反応溶液中で逆転写反応を行った後、当該逆転写反応溶液を添加した増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程。
具体的には、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸が検出された場合には、少なくとも逆転写工程と増幅工程のいずれか一方の工程に不具合があり、工程精度が保証されていないと判断される。なお、鋳型となるＲＮＡを含まない逆転写反応溶液は、工程（ｂ）において調製される逆転写反応溶液において、逆転写工程標準陽性試料に換えて、純水やバッファー等を添加することにより調製することができる。
・工程（ｃ）
工程（ｃ）においては、増幅工程標準陽性試料として、標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を用いる。ここで、「人工配列ＤＮＡ」とは、塩基配列を人工的に設計したＤＮＡを意味する。つまり、増幅工程標準陽性試料は、標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列に、その他の塩基配列を結合させた配列からなるＤＮＡ（以下、人工配列標準ＤＮＡ）の溶液であって、当該ＤＮＡの濃度が既知の溶液である。
工程（ｃ）においては、増幅工程標準陽性試料として、標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を用いる。ここで、「人工配列ＤＮＡ」とは、塩基配列を人工的に設計したＤＮＡを意味する。つまり、増幅工程標準陽性試料は、標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列に、その他の塩基配列を結合させた配列からなるＤＮＡ（以下、人工配列標準ＤＮＡ）の溶液であって、当該ＤＮＡの濃度が既知の溶液である。
当該人工配列標準ＤＮＡの塩基配列は、標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を含んでいてもよく、標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を含んでいてもよく、標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列と標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列との両方を含んでいてもよい。その他、増幅工程標準陽性試料としては、標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を含む人工配列標準ＤＮＡと、標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を含む人工配列標準ＤＮＡとの混合物であってもよい。
人工配列標準ＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡ又は化学合成された核酸鎖であることが好ましい。例えば、ｐＵＣ系のプラスミド等のプラスミドに、標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列や、標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を組み込むことにより、プラスミドＤＮＡからなる人工配列標準ＤＮＡを作製することができる。また、１００塩基対長程度の長さであれば、人工配列標準ＤＮＡは化学合成によって作製することが可能である。大腸菌等を用いた発現系を利用することにより、一度の調製により大量のプラスミドＤＮＡを簡便に調製することが可能であるため、人工配列標準ＤＮＡがプラスミドＤＮＡであることが好ましい。
増幅工程標準陽性試料を調製する場合には、逆転写工程標準陽性試料等と同様に、大量の人工配列標準ＤＮＡを、少なくとも複数回の増幅反応に必要な量の人工配列標準ＤＮＡを、一度の調製により製造し、適当量ずつに分注して多数の均一なストックをプールしておくことが好ましい。複数の検査における増幅工程において、プールされた同一ロットの人工配列標準ＤＮＡ溶液を増幅工程標準陽性試料として使用することにより、検査毎のばらつきを確認でき、より正確に工程の精度を保証することができる。
具体的には、増幅工程標準陽性試料中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、増幅工程の精度を保証する。すなわち、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記増幅工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記増幅工程の精度が保証されていると判断する。増幅量や増幅効率の測定又は算出は、工程（ｂ）と同様にして行うことができる。
また、工程（ｂ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、逆転写工程と増幅工程のどちらの工程において不具合が生じているのか判別できないが、工程（ｃ）を組み合わせることにより、不具合が生じている工程を特定できる場合がある。つまり、工程（ｃ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも大きい場合には、増幅工程の精度は保証されていると判断することができるため、逆転写工程の精度が保証されていないと判断することができる。
なお、逆転写工程標準陽性試料と同様に、増幅工程に供される増幅工程標準陽性試料の量は、当該量の増幅工程標準陽性試料に対して増幅反応を行った場合に、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも大きいことが、確認されている量であればよい。
・工程（ｃ”）
本発明においては、工程（ｃ）は、下記の工程（ｃ”）であってもよい。
（ｃ”）標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を段階的に希釈し、調製された各濃度の希釈液中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度の保証と、前記生物学的試料中の標的遺伝子由来ＲＮＡの定量とを行う工程。
なお、工程（ｃ”）における「標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡ」は、前述の人工配列標準ＤＮＡと同様である。
本発明においては、工程（ｃ）は、下記の工程（ｃ”）であってもよい。
（ｃ”）標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を段階的に希釈し、調製された各濃度の希釈液中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度の保証と、前記生物学的試料中の標的遺伝子由来ＲＮＡの定量とを行う工程。
なお、工程（ｃ”）における「標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡ」は、前述の人工配列標準ＤＮＡと同様である。
一般的に、増幅反応により増幅された核酸を定量する場合には、標準試料の希釈系列（標準試料を段階的に希釈して調製した希釈液のセット）を用いて検量線を作成し、当該検量線に基づいて増幅産物量を定量する。工程（ｃ”）においては、工程精度を調べるための標準陽性試料として、人工配列標準ＤＮＡの希釈系列を用いることにより、当該標準陽性試料を、定量的解析用の標準試料としても同時に用いることができる。これにより、検量線作成のために別個に増幅反応を行うことなく、増幅された標的遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率を求めることができる。
・工程（ｃ’）
本発明においては、さらに下記の工程（ｃ’）を有していてもよい。
（ｃ’）鋳型となるＤＮＡを含まない増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程。
本発明においては、さらに下記の工程（ｃ’）を有していてもよい。
（ｃ’）鋳型となるＤＮＡを含まない増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程。
具体的には、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸が検出された場合には、増幅工程に不具合があり、工程精度が保証されていないと判断される。なお、鋳型となるＤＮＡを含まない逆転写反応溶液は、工程（ｃ）において調製される増幅反応溶液において、増幅工程標準陽性試料に換えて、純水やバッファー等を添加することにより調製することができる。
図１は、本発明の工程精度保証方法の一態様を示したフローチャートである。抽出工程標準陽性試料として細菌の培養液（細菌標準サンプル）を、逆転写工程標準陽性試料として培養細胞由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡと細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡとの混合溶液（培養細胞＋細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプル）を、増幅工程標準陽性試料として標的遺伝子又は標準遺伝子の遺伝子配列を有するプラスミドＤＮＡ（プラスミドＤＮＡサンプル）を、それぞれ用いている。なお、本発明が、これらの態様に限定されるものではないことは、言うまでもない。
細菌標準サンプルに対して抽出工程を行った場合に、ＲＮＡの濃度あるいは量、分解度、精製度が閾値以上の場合には、ＲＮＡ抽出工程の精度が正常である（保証されている）と判断され、検出結果の信頼性が高いと判断される。一方、細菌標準サンプルが、ＲＮＡの濃度あるいは量、分解度、精製度が閾値未満の場合には、ＲＮＡ抽出工程の精度が異常である（保証されていない）と判断され、検出結果の信頼性が低いと判断される。
培養細胞＋細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルに対して逆転写工程を行い、その後増幅工程を行った場合に、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量や増幅効率が閾値以上の場合には、逆転写工程の精度が正常であると判断され、検出結果の信頼性が高いと判断される。一方、標的遺伝子由来核酸等の増幅量や増幅効率が閾値未満の場合には、逆転写工程の精度が異常であると判断され、検出結果の信頼性が低いと判断される。
また、プラスミドＤＮＡサンプルに対して増幅工程を行った場合に、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量や増幅効率が閾値以上の場合には、増幅工程の精度が正常であると判断され、検出結果の信頼性が高いと判断される。一方、標的遺伝子由来核酸等の増幅量や増幅効率が閾値未満の場合には、増幅工程の精度が異常であると判断され、検出結果の信頼性が低いと判断される。
培養細胞＋細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルに対して逆転写工程を行い、その後増幅工程を行った場合に、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量や増幅効率が閾値以上の場合には、逆転写工程の精度が正常であると判断され、検出結果の信頼性が高いと判断される。一方、標的遺伝子由来核酸等の増幅量や増幅効率が閾値未満の場合には、逆転写工程の精度が異常であると判断され、検出結果の信頼性が低いと判断される。
また、プラスミドＤＮＡサンプルに対して増幅工程を行った場合に、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量や増幅効率が閾値以上の場合には、増幅工程の精度が正常であると判断され、検出結果の信頼性が高いと判断される。一方、標的遺伝子由来核酸等の増幅量や増幅効率が閾値未満の場合には、増幅工程の精度が異常であると判断され、検出結果の信頼性が低いと判断される。
表１は、工程（ａ）における抽出工程の判断をまとめたものである。表中、「＋」は、表中に記載の判断基準を満たしている場合を、「−」は判断基準を満たしていない場合を、それぞれ示している。細菌標準サンプル（抽出工程標準陽性試料）による抽出を行なった際に、ＲＮＡ濃度が閾値以上である場合、ＲＮＡ分解度が閾値以上である場合、ＲＮＡ精製度が閾値以上である場合（「＋」）には、ＲＮＡの抽出工程精度が正常であり、結果の信頼性が高いと判断される。一方、ＲＮＡ濃度が閾値未満である場合、ＲＮＡ分解度が閾値未満である場合、ＲＮＡ精製度が閾値未満である場合（「−」）には、抽出工程精度が異常であり、結果の信頼性が低いと判断される。
表２は、工程（ｂ）及び（ｃ）における逆転写工程と増幅工程の判断法を表にまとめたものである。表中の「＋」及び「−」は、表１と同様である。培養細胞＋細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルからの標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量もしくは増幅効率が一定量以上になる場合、逆転写工程及び増幅工程が正常であり、結果の信頼性が高い。また、標的遺伝子由来核酸等の増幅量もしくは増幅効率が一定量以上になり、かつ、プラスミドＤＮＡサンプルからの標的遺伝子由来核酸等の増幅量もしくは増幅効率が一定量未満になる場合、逆転写工程は正常であるが、増幅工程が不安定な異常であり、結果の信頼性が低い。
一方、培養細胞＋細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルからの標的遺伝子由来核酸等の増幅量もしくは増幅効率が一定量未満になり、かつ、プラスミドＤＮＡサンプルからの標的遺伝子由来核酸等の増幅量もしくは増幅効率が一定量以上になる場合、逆転写工程は異常であるが、増幅工程が正常であり、結果の信頼性が低い。これに対して、培養細胞＋細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルからとプラスミドＤＮＡサンプルからとの両方の標的遺伝子由来核酸等の増幅量もしくは増幅効率が一定量未満になる場合、少なくとも増幅工程が異常であり、逆転写工程にも異常がある可能性があり、結果の信頼性が低い。
一方、培養細胞＋細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルからの標的遺伝子由来核酸等の増幅量もしくは増幅効率が一定量未満になり、かつ、プラスミドＤＮＡサンプルからの標的遺伝子由来核酸等の増幅量もしくは増幅効率が一定量以上になる場合、逆転写工程は異常であるが、増幅工程が正常であり、結果の信頼性が低い。これに対して、培養細胞＋細菌由来Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルからとプラスミドＤＮＡサンプルからとの両方の標的遺伝子由来核酸等の増幅量もしくは増幅効率が一定量未満になる場合、少なくとも増幅工程が異常であり、逆転写工程にも異常がある可能性があり、結果の信頼性が低い。
標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法における抽出工程、逆転写工程、増幅工程に対して、本発明の工程精度保証方法を行うことにより、いずれの工程の精度も保証されている、と判断された場合には、当該検出方法により得られた標的遺伝子由来ＲＮＡの検出結果は信頼できる、と判断することができる。一方、抽出工程、逆転写工程、増幅工程のうちの１の工程において、精度が保証されていない、と判断された場合には、当該検出方法により得られた標的遺伝子由来ＲＮＡの検出結果は信頼できず、擬陽性、擬陰性である可能性が高いと判断することができる。
また、検出結果が信頼できない、と判断された場合であっても、抽出工程、逆転写工程、増幅工程のうち、工程の精度が保証されていないと判断された工程から操作をやり直すことにより、検出方法全体の無駄を防止することもできる。
また、検出結果が信頼できない、と判断された場合であっても、抽出工程、逆転写工程、増幅工程のうち、工程の精度が保証されていないと判断された工程から操作をやり直すことにより、検出方法全体の無駄を防止することもできる。
また、本発明の工程精度保証方法は、各工程の標準陽性試料をキットとすることにより、より簡便に行うことができる。具体的には、標的遺伝子及び／又は前記標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料と、標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液並びに／又は標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／若しくは標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料と、を含む工程精度保証用キットとすることができる。なお、前記細胞溶液を、細菌の培養液とすることにより、抽出工程標準陽性試料についても、凍結保存に対しても安定であり、同一ロットのストックを多数調製することができるため、より取扱性・安定性に優れたキットとすることができる。
培養細胞の培養物等とは異なり、生体試料は、微生物や、組織の剥離片等の様々な夾雑物を含有している不均一な試料である。このため、採取後ＲＮＡ抽出工程までの間に、保存中に生体試料中の核酸が分解等により損なわれやすい。また、採取する部位により、細胞の含有量も変動しやすい。特に、糞便のように、大量の腸内細菌や消化物等の雑多な夾雑物が多く含まれているヘテロジニアスな生体試料では、もともとの糞便中には存在していた標的遺伝子由来ＲＮＡが、採取部位や採取後の保存方法等によっては、検出されない場合も多い、という問題がある。
また、核酸の検出方法において、信頼性できる検出結果を得ることができるか否かは、各工程の精度が保証されているか否かに加えて、各工程に供される試料の精度にも依存する。例えば、抽出工程標準陽性試料を用いた工程（ａ）においては、抽出工程の精度が保証されている、と判断された場合であっても、そもそも抽出工程に供される生物学的試料に問題がある場合には、信頼できる検出結果を得ることはできない。そこで、解析対象である生物学的試料の精度を保証することも好ましい。
ここで、生物学的試料の精度とは、当該生物学的試料中のＲＮＡの品質や量が、当該生物学的試料を用いて標的遺伝子由来ＲＮＡを検出した場合であって、各工程の精度が保証されている場合に、信頼性の高い検査結果を得るために十分であることを意味する。すなわち、「生物学的試料の精度が保証されている」とは、当該生物学的試料中のＲＮＡの量や質が十分であり、当該生物学的試料を用いて標的遺伝子由来ＲＮＡを用いて得られた検出結果は、信頼性が高いことを意味する。逆に、「生物学的試料の精度が保証されていない」とは、当該生物学的試料中のＲＮＡの量や質が不十分であり、当該生物学的試料を用いて標的遺伝子由来ＲＮＡを用いて得られた検出結果は、信頼性が低いことを意味する。
具体的には、本発明においては、さらに下記の工程（ｄ）や（ｅ）を有することが好ましい。工程（ｄ）のみを有していてもよく、工程（ｅ）のみを有していてもよく、工程（ｄ）及び（ｅ）を有していてもよい。
（ｄ）前記抽出工程において、前記生物学的試料から抽出された標的ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、当該生物学的試料の精度を保証する工程。
（ｅ）前記逆転写工程において得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記生物学的試料の精度を保証する工程。
（ｄ）前記抽出工程において、前記生物学的試料から抽出された標的ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、当該生物学的試料の精度を保証する工程。
（ｅ）前記逆転写工程において得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記生物学的試料の精度を保証する工程。
工程（ｄ）におけるＲＮＡの濃度、精製度、又は分解度の測定は、工程（ａ）と同様にして行うことができる。標的ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度が予め設定された閾値よりも小さい場合や、２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、予め設定された数値範囲から外れている場合、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、ＲＮＡ抽出に供された生物学的試料の精度が保証されていないと判断する。逆に、標的ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度が予め設定された閾値よりも大きい場合や、２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、予め設定された数値範囲内である場合、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、予め設定された数値範囲内である場合には、当該生物学的試料の精度が保証されていると判断することができる。
工程（ｅ）における標準遺伝子由来核酸の増幅、増幅量や増幅効率の測定は、工程（ｃ）と同様にして行うことができる。ＲＮＡ中の標準遺伝子由来ＲＮＡの量が、予め定められた所定の閾値以上である場合には、ＲＮＡ抽出に供された生物学的試料の精度が保証されていると判断することができる。逆に、ＲＮＡ中の標準遺伝子由来ＲＮＡの量が、予め定められた所定の閾値に満たない場合には、当該生物学的試料の精度が保証されていないと判断することができる。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
大腸癌患者由来の糞便中には、ＣＯＸ−２遺伝子のｍＲＮＡ等が、健常者由来の糞便中よりも多く存在していることが報告されている。これは、大腸癌患者において、ＣＯＸ−２遺伝子が高発現するためと考えられている。そこで、健常人の糞便に対し、ＣＯＸ−２遺伝子を高発現しているヒト胃癌由来細胞株ＭＫＮ４５細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ添加して混合させたものを、擬似大腸癌患者糞便とした。なお、培養細胞であるＭＫＮ４５細胞は、常法により培養した。
大腸癌患者由来の糞便中には、ＣＯＸ−２遺伝子のｍＲＮＡ等が、健常者由来の糞便中よりも多く存在していることが報告されている。これは、大腸癌患者において、ＣＯＸ−２遺伝子が高発現するためと考えられている。そこで、健常人の糞便に対し、ＣＯＸ−２遺伝子を高発現しているヒト胃癌由来細胞株ＭＫＮ４５細胞を６×１０４ｃｅｌｌｓ添加して混合させたものを、擬似大腸癌患者糞便とした。なお、培養細胞であるＭＫＮ４５細胞は、常法により培養した。
［参考例１］ 抽出工程標準陽性試料である細菌標準サンプルの作成
環境より分離された乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）を常法により液体培地で培養した。培養後、１５ｍＬチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に培養液５ｍＬずつ１２０本に分注し遠心後、上清を捨て、集菌し冷凍した。これらのサンプルのうち６本を、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を用い、添付のプロトコールに従い、ＲＮＡの抽出を行ない、沈殿を得た。ＲＮＡの沈殿は、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、ＲＮＡ溶液とした。
このＲＮＡ溶液を、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ＯＤ２６０（２６０ｎｍにおける吸光度）の値から濃度を測定し、回収量を算出した。また、ＯＤ２８０（２８０ｎｍにおける吸光度）、ＯＤ２３０（２３０ｎｍにおける吸光度）の値も測定した。さらに、変性アガロース電気泳動を行い、２３Ｓ ｒＲＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ、１６Ｓ ｒＲＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔをエチジウムブロマイド染色し、各ｆｒａｇｍｅｎｔ濃度をデンシトメーターで測定した。
その結果、表３に示すように、１３．１±０．６６μｇのＲＮＡを抽出できることが確認できた。表中、「２６０／２８０ｎｍ吸光度比」は、ＯＤ２６０値より算出された濃度から算定された量を示す。また、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は、全て１．９以上であり、２６０／２３０ｎｍ吸光度比は、全て１．８以上であった。同時に電気泳動も行った結果、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比は、いずれも２．４以上であった。これらの値から、残りの冷凍サンプルも、ＲＮＡ量・質がともに均一と判断し、これらを細菌標準サンプルとした。また、この細菌標準サンプルの閾値は、ＲＮＡ抽出量で１０μｇ(２００ｎｇ／μＬ)、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は１．８以上、２６０／２３０ｎｍ吸光度比は１．８以上、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比は２．０以上と設定した。
環境より分離された乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属）を常法により液体培地で培養した。培養後、１５ｍＬチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に培養液５ｍＬずつ１２０本に分注し遠心後、上清を捨て、集菌し冷凍した。これらのサンプルのうち６本を、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を用い、添付のプロトコールに従い、ＲＮＡの抽出を行ない、沈殿を得た。ＲＮＡの沈殿は、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、ＲＮＡ溶液とした。
このＲＮＡ溶液を、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、ＯＤ２６０（２６０ｎｍにおける吸光度）の値から濃度を測定し、回収量を算出した。また、ＯＤ２８０（２８０ｎｍにおける吸光度）、ＯＤ２３０（２３０ｎｍにおける吸光度）の値も測定した。さらに、変性アガロース電気泳動を行い、２３Ｓ ｒＲＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ、１６Ｓ ｒＲＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔをエチジウムブロマイド染色し、各ｆｒａｇｍｅｎｔ濃度をデンシトメーターで測定した。
その結果、表３に示すように、１３．１±０．６６μｇのＲＮＡを抽出できることが確認できた。表中、「２６０／２８０ｎｍ吸光度比」は、ＯＤ２６０値より算出された濃度から算定された量を示す。また、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は、全て１．９以上であり、２６０／２３０ｎｍ吸光度比は、全て１．８以上であった。同時に電気泳動も行った結果、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比は、いずれも２．４以上であった。これらの値から、残りの冷凍サンプルも、ＲＮＡ量・質がともに均一と判断し、これらを細菌標準サンプルとした。また、この細菌標準サンプルの閾値は、ＲＮＡ抽出量で１０μｇ(２００ｎｇ／μＬ)、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は１．８以上、２６０／２３０ｎｍ吸光度比は１．８以上、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比は２．０以上と設定した。
［実施例１］ 細菌標準サンプルを用いた抽出工程の精度保証１
健常人から採取した糞便を１５ｍＬチューブに０．５ｇ分取し、３サンプルを得た。さらに、健常人の糞便にＭＫＮ４５細胞を混合した擬似大腸癌患者糞便０．５ｇを２サンプル準備した。
また、実施例１で作成した乳酸菌冷凍サンプルを一検体用い、これを抽出工程保証の標準サンプルとした。
これらのサンプルを、ＩＳＯＧＥＮを用い、添付のプロトコールに従い、同一工程で、並列してＲＮＡの抽出を行ない、沈殿を得た。ＲＮＡの沈殿は、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、ＲＮＡ溶液とした。
細菌標準サンプルの作成と同様にして、細菌標準サンプル由来のＲＮＡ溶液の濃度と質を測定した。回収ＲＮＡ量は1２.８μｇ（２５６ｎｇ/μＬ）、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は１．９２、２６０／２３０ｎｍ吸光度比は１．９３、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比は２．４となった。これらの値は閾値をクリアしており、ＲＮＡ抽出工程精度が正常であり、この同一抽出工程で処理された同一バッチのヒトサンプルを用いた場合も、ＲＮＡ抽出までの結果の信頼性は高いと判断された。
健常人から採取した糞便を１５ｍＬチューブに０．５ｇ分取し、３サンプルを得た。さらに、健常人の糞便にＭＫＮ４５細胞を混合した擬似大腸癌患者糞便０．５ｇを２サンプル準備した。
また、実施例１で作成した乳酸菌冷凍サンプルを一検体用い、これを抽出工程保証の標準サンプルとした。
これらのサンプルを、ＩＳＯＧＥＮを用い、添付のプロトコールに従い、同一工程で、並列してＲＮＡの抽出を行ない、沈殿を得た。ＲＮＡの沈殿は、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、ＲＮＡ溶液とした。
細菌標準サンプルの作成と同様にして、細菌標準サンプル由来のＲＮＡ溶液の濃度と質を測定した。回収ＲＮＡ量は1２.８μｇ（２５６ｎｇ/μＬ）、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は１．９２、２６０／２３０ｎｍ吸光度比は１．９３、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比は２．４となった。これらの値は閾値をクリアしており、ＲＮＡ抽出工程精度が正常であり、この同一抽出工程で処理された同一バッチのヒトサンプルを用いた場合も、ＲＮＡ抽出までの結果の信頼性は高いと判断された。
［実施例２］ 細菌標準サンプルを用いた抽出工程の精度保証２
健常人から採取した糞便を１５ｍＬチューブに０．５ｇ分取し、３サンプルを得た。また、実施例１で作成した乳酸菌冷凍サンプルを一検体用い、これを抽出工程保証の標準サンプルとした。
これらのサンプルに、通常は、ＩＳＯＧＥＮを用い抽出を行なうところ、滅菌水でＩＳＯＧＥＮを１０倍に希釈した１／１０ ＩＳＯＧＥＮを誤って用いたことを想定して、添付のプロトコールに従い、同一工程で、並列してＲＮＡの抽出を行ない、沈殿を得た。ＲＮＡの沈殿は、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、ＲＮＡ溶液とした。
実施例１のように、標準サンプル由来のＲＮＡ溶液の濃度と質を測定した。回収ＲＮＡ量は１.３μｇ、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は１.０１、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は０．９９、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比は１．１となった。これらの値は閾値をクリアしておらず、ＲＮＡ抽出工程精度が異常であり、この同一抽出工程で処理された同一バッチのヒトサンプルを用いた場合も、ＲＮＡ抽出までの結果の信頼性は、低いと判断され、残りの３サンプルは、続く工程には用いなかった。
健常人から採取した糞便を１５ｍＬチューブに０．５ｇ分取し、３サンプルを得た。また、実施例１で作成した乳酸菌冷凍サンプルを一検体用い、これを抽出工程保証の標準サンプルとした。
これらのサンプルに、通常は、ＩＳＯＧＥＮを用い抽出を行なうところ、滅菌水でＩＳＯＧＥＮを１０倍に希釈した１／１０ ＩＳＯＧＥＮを誤って用いたことを想定して、添付のプロトコールに従い、同一工程で、並列してＲＮＡの抽出を行ない、沈殿を得た。ＲＮＡの沈殿は、ＴＥ Ｂｕｆｆｅｒに溶解させ、ＲＮＡ溶液とした。
実施例１のように、標準サンプル由来のＲＮＡ溶液の濃度と質を測定した。回収ＲＮＡ量は１.３μｇ、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は１.０１、２６０／２８０ｎｍ吸光度比は０．９９、２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比は１．１となった。これらの値は閾値をクリアしておらず、ＲＮＡ抽出工程精度が異常であり、この同一抽出工程で処理された同一バッチのヒトサンプルを用いた場合も、ＲＮＡ抽出までの結果の信頼性は、低いと判断され、残りの３サンプルは、続く工程には用いなかった。
［参考例２］ 増幅工程標準陽性試料であるプラスミドＤＮＡサンプルの作成
ＭＫＮ４５細胞から分離・抽出したＣＯＸ-２遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物を、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に結合させて人工配列標準ＤＮＡを構築し (濃度１００ｎｇ／μＬ)、増幅工程標準陽性試料として用いるプラスミドＤＮＡサンプルの作成を行なった。この人工配列標準ＤＮＡを、１〜１０００００倍まで１/１０ずつ５段階希釈して用いた。各希釈系列を１μＬ用いて、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ＣＯＸ−２検出用のＴａｑＭａｎプライマーとプローブキット（ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ解析をＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓの説明に従い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。この際、１／１０００００希釈のＣｔ値が、２３．９になった。この標準サンプルの閾値は、１／１０００００希釈のＣｔ値が、２６未満と設定した。
また、１／１０００００希釈のＣｔ値は、２４４０００コピーと推定される。当該人工配列標準ＤＮＡは、予め設定した濃度におけるＣｔ値が閾値の範囲内である場合に、希釈系列を用いることによって定量の基準サンプルとしても用いることができる。すなわち、Ｃｔ値が閾値の範囲内にあるとき、２４４０００コピーを示すＣｔ値は２３．９であり、２４４００コピーを示すＣｔ値は２７．５、２４４０コピーを示すＣｔ値は３０．８、２４４コピーを示すＣｔ値は３４．７、２４．４コピーを示すＣｔ値は３7．1、となるため、この標準人工配列ＤＮＡを用いることで、解析したいサンプルのＣｔ値より、サンプル中のコピー数を推定することができる。
また、標準人工配列ＤＮＡのサンプルを用いた定性解析の場合には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ‐Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）ではなく、通常のＲＴ−ＰＣＲにより、増幅断片の有無を電気泳動で確認し、増幅が見られた場合は、増幅工程が正常に行なわれたと判断する。
なお、今回は癌に特異的なＣＯＸ−２遺伝子を用いたが、正常検体でも見られるＧＡＰＤＨ遺伝子やアクチンβ遺伝子やβ２マイクログロブリン遺伝子を用いることもできる。
ＭＫＮ４５細胞から分離・抽出したＣＯＸ-２遺伝子のｃＤＮＡ増幅産物を、ｐＣＲ２．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に結合させて人工配列標準ＤＮＡを構築し (濃度１００ｎｇ／μＬ)、増幅工程標準陽性試料として用いるプラスミドＤＮＡサンプルの作成を行なった。この人工配列標準ＤＮＡを、１〜１０００００倍まで１/１０ずつ５段階希釈して用いた。各希釈系列を１μＬ用いて、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ＣＯＸ−２検出用のＴａｑＭａｎプライマーとプローブキット（ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ解析をＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓの説明に従い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。この際、１／１０００００希釈のＣｔ値が、２３．９になった。この標準サンプルの閾値は、１／１０００００希釈のＣｔ値が、２６未満と設定した。
また、１／１０００００希釈のＣｔ値は、２４４０００コピーと推定される。当該人工配列標準ＤＮＡは、予め設定した濃度におけるＣｔ値が閾値の範囲内である場合に、希釈系列を用いることによって定量の基準サンプルとしても用いることができる。すなわち、Ｃｔ値が閾値の範囲内にあるとき、２４４０００コピーを示すＣｔ値は２３．９であり、２４４００コピーを示すＣｔ値は２７．５、２４４０コピーを示すＣｔ値は３０．８、２４４コピーを示すＣｔ値は３４．７、２４．４コピーを示すＣｔ値は３7．1、となるため、この標準人工配列ＤＮＡを用いることで、解析したいサンプルのＣｔ値より、サンプル中のコピー数を推定することができる。
また、標準人工配列ＤＮＡのサンプルを用いた定性解析の場合には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ‐Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）ではなく、通常のＲＴ−ＰＣＲにより、増幅断片の有無を電気泳動で確認し、増幅が見られた場合は、増幅工程が正常に行なわれたと判断する。
なお、今回は癌に特異的なＣＯＸ−２遺伝子を用いたが、正常検体でも見られるＧＡＰＤＨ遺伝子やアクチンβ遺伝子やβ２マイクログロブリン遺伝子を用いることもできる。
［参考例３］ 逆転写工程標準陽性試料である標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルの作成
５×１０６ｃｅｌｌｓのＭＫＮ４５細胞から抽出・回収され、回収量・質ともに閾値をクリアしたＴｏｔａｌ ＲＮＡをプールし、標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルとした。標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルは、１００ｎｇ／μＬに調製し、４μＬずつ８０本に分注し、凍結した。
凍結した標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルから無作為に４本選び、逆転写反応を行なった。具体的には、抽出したＲＮＡサンプルの一部を、リバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μＬ、和光純薬）とランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。さらに、１μＬの該ｃＤＮＡ溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ＣＯＸ−２検出用のＴａｑＭａｎプライマーとプローブキット（ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ解析をＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓの説明に従い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。コピー数の定量は、参考例２で作成したプラスミドＤＮＡサンプルを、同一工程で並列して増幅工程を行ない、コピー数を算出した。
結果は表４のようになり、当該標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプル中のＣＯＸ−２遺伝子由来ＲＮＡのコピー数が算出された。そこで、当該標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用いた定量解析を行う場合に、ＣＯＸ−２コピー数が、１２４０００以上で検出されることという閾値を設定した。
また、当該標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用いた定性解析の場合には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲではなく、通常のＲＴ−ＰＣＲにより、増幅断片の有無を電気泳動で確認し、増幅が見られた場合は、逆転写工程及び増幅工程が正常に行なわれたと判断する。
５×１０６ｃｅｌｌｓのＭＫＮ４５細胞から抽出・回収され、回収量・質ともに閾値をクリアしたＴｏｔａｌ ＲＮＡをプールし、標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルとした。標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルは、１００ｎｇ／μＬに調製し、４μＬずつ８０本に分注し、凍結した。
凍結した標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルから無作為に４本選び、逆転写反応を行なった。具体的には、抽出したＲＮＡサンプルの一部を、リバースクリプトＩＩ（登録商標）（反応液量２０μＬ、和光純薬）とランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。さらに、１μＬの該ｃＤＮＡ溶液に、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、ＣＯＸ−２検出用のＴａｑＭａｎプライマーとプローブキット（ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製)を添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ解析をＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓの説明に従い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。コピー数の定量は、参考例２で作成したプラスミドＤＮＡサンプルを、同一工程で並列して増幅工程を行ない、コピー数を算出した。
結果は表４のようになり、当該標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプル中のＣＯＸ−２遺伝子由来ＲＮＡのコピー数が算出された。そこで、当該標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用いた定量解析を行う場合に、ＣＯＸ−２コピー数が、１２４０００以上で検出されることという閾値を設定した。
また、当該標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用いた定性解析の場合には、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲではなく、通常のＲＴ−ＰＣＲにより、増幅断片の有無を電気泳動で確認し、増幅が見られた場合は、逆転写工程及び増幅工程が正常に行なわれたと判断する。
［実施例３］ 標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用いた逆転写工程及び増幅工程の精度保証１
実施例１において、健常人由来糞便から抽出した３ＲＮＡサンプル（健常人ＲＮＡサンプル）と、擬似大腸がん患者糞便から抽出した２ＲＮＡサンプル（擬似がん患者ＲＮＡサンプル）に対して、逆転写工程を行い、その後増幅工程を行った。具体的には、各ＲＮＡサンプルの一部をリバースクリプトＩＩとランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。この際、参考例３の標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して逆転写工程を行ない、ｃＤＮＡに変換した。さらに、鋳型を添加しない逆転写反応溶液中で反応を行い、その後増幅反応を行った。
各逆転写工程後のｃＤＮＡサンプル１μＬに、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを添加し、ＣＯＸ−２検出用のＴａｑＭａｎプライマーとプローブキットを添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ解析をＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓの説明に従い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。コピー数の定量は、参考例２で作成したプラスミドＤＮＡサンプルを、同一工程で並列して増幅工程を行ない、コピー数を算出した。算出結果を表５に示す。
実施例１において、健常人由来糞便から抽出した３ＲＮＡサンプル（健常人ＲＮＡサンプル）と、擬似大腸がん患者糞便から抽出した２ＲＮＡサンプル（擬似がん患者ＲＮＡサンプル）に対して、逆転写工程を行い、その後増幅工程を行った。具体的には、各ＲＮＡサンプルの一部をリバースクリプトＩＩとランダムプライマーを用いて逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。この際、参考例３の標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して逆転写工程を行ない、ｃＤＮＡに変換した。さらに、鋳型を添加しない逆転写反応溶液中で反応を行い、その後増幅反応を行った。
各逆転写工程後のｃＤＮＡサンプル１μＬに、１２．５μＬの２×ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘを添加し、ＣＯＸ−２検出用のＴａｑＭａｎプライマーとプローブキットを添加し、最終容量が２５μＬとなるようにＰＣＲ溶液を調製した。該ＰＣＲ溶液に対して、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍによるＴａｑＭａｎ ＰＣＲ解析をＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓの説明に従い、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行った。コピー数の定量は、参考例２で作成したプラスミドＤＮＡサンプルを、同一工程で並列して増幅工程を行ない、コピー数を算出した。算出結果を表５に示す。
健常人ＲＮＡサンプルでは、いずれもＣＯＸ−２のコピー数は０であり、ＣＯＸ−２遺伝子の発現が見られなかった。一方、擬似がん患者ＲＮＡサンプルでは、コピー数が３７５０と４９２１となった。この際、標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルでは、１３６０３７コピーであり、閾値の１２４０００以上であったため、逆転写工程及び増幅工程（ＰＣＲの工程）に問題が無いことがわかった。
さらに、同時に参考例２で作成したプラスミドＤＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して増幅工程を行なったところ、１／１０００００希釈のＣｔ値が２４．８であり、閾値の２６未満であったため、ＰＣＲの工程にも問題ないことがわかった。そのため、この解析結果は信頼できるものと判断された。
さらに、同時に参考例２で作成したプラスミドＤＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して増幅工程を行なったところ、１／１０００００希釈のＣｔ値が２４．８であり、閾値の２６未満であったため、ＰＣＲの工程にも問題ないことがわかった。そのため、この解析結果は信頼できるものと判断された。
［実施例４］ 標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用いた逆転写工程及び増幅工程の精度保証２
実施例１において、健常人由来糞便から抽出した３ＲＮＡサンプル（健常人ＲＮＡサンプル）と、擬似大腸がん患者糞便から抽出した２ＲＮＡサンプル（擬似がん患者ＲＮＡサンプル）に対して、逆転写工程を行い、その後増幅工程を行った。具体的には、各ＲＮＡサンプルの一部に対して、ランダムプライマーを用いずに、リバースクリプトＩＩを添加して逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。この際、参考例３の標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して逆転写工程を行ない、ｃＤＮＡに変換した。さらに、鋳型を添加しない逆転写反応溶液中で反応を行い、その後増幅反応を行った。
各逆転写工程後のｃＤＮＡサンプル１μＬに対して、実施例３と同様にしてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、ＣＯＸ−２のコピー数を算出した。算出結果を表６に示す。
実施例１において、健常人由来糞便から抽出した３ＲＮＡサンプル（健常人ＲＮＡサンプル）と、擬似大腸がん患者糞便から抽出した２ＲＮＡサンプル（擬似がん患者ＲＮＡサンプル）に対して、逆転写工程を行い、その後増幅工程を行った。具体的には、各ＲＮＡサンプルの一部に対して、ランダムプライマーを用いずに、リバースクリプトＩＩを添加して逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。この際、参考例３の標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して逆転写工程を行ない、ｃＤＮＡに変換した。さらに、鋳型を添加しない逆転写反応溶液中で反応を行い、その後増幅反応を行った。
各逆転写工程後のｃＤＮＡサンプル１μＬに対して、実施例３と同様にしてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、ＣＯＸ−２のコピー数を算出した。算出結果を表６に示す。
健常人ＲＮＡサンプル、擬似がん患者ＲＮＡサンプル、及び標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルでは、いずれもＣＯＸ−２のコピー数は０であり、ＣＯＸ−２遺伝子の発現が見られなかった。一方、同時に参考例２で作成したプラスミドＤＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して増幅工程を行なったところ、１／１００００希釈のＣｔ値が２５．０であり、閾値の２６未満であったため、増幅工程（ＰＣＲの工程）には問題ないことがわかった。
これらの結果から、逆転写工程の精度に問題があることが推測され、本結果の信頼性は低いことがわかった。
これらの結果から、逆転写工程の精度に問題があることが推測され、本結果の信頼性は低いことがわかった。
［実施例４］ 標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用いた逆転写工程及び増幅工程の精度保証３
実施例１において、健常人由来糞便から抽出した３ＲＮＡサンプル（健常人ＲＮＡサンプル）と、擬似大腸がん患者糞便から抽出した２ＲＮＡサンプル（擬似がん患者ＲＮＡサンプル）に対して、逆転写工程を行い、その後増幅工程を行った。具体的には、各ＲＮＡサンプルの一部に対して、ランダムプライマーを用いずに、リバースクリプトＩＩを添加して逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。この際、参考例３の標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して逆転写工程を行ない、ｃＤＮＡに変換した。さらに、鋳型を添加しない逆転写反応溶液中で反応を行い、その後増幅反応を行った。
各逆転写工程後のｃＤＮＡサンプル１μＬに対して、実施例３と同様にしてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、ＣＯＸ−２のコピー数を算出した。算出結果を表７に示す。
実施例１において、健常人由来糞便から抽出した３ＲＮＡサンプル（健常人ＲＮＡサンプル）と、擬似大腸がん患者糞便から抽出した２ＲＮＡサンプル（擬似がん患者ＲＮＡサンプル）に対して、逆転写工程を行い、その後増幅工程を行った。具体的には、各ＲＮＡサンプルの一部に対して、ランダムプライマーを用いずに、リバースクリプトＩＩを添加して逆転写し、約２０μＬのｃＤＮＡ溶液を得た。この際、参考例３の標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して逆転写工程を行ない、ｃＤＮＡに変換した。さらに、鋳型を添加しない逆転写反応溶液中で反応を行い、その後増幅反応を行った。
各逆転写工程後のｃＤＮＡサンプル１μＬに対して、実施例３と同様にしてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、ＣＯＸ−２のコピー数を算出した。算出結果を表７に示す。
健常人ＲＮＡサンプル、擬似がん患者ＲＮＡサンプル、及び標準Ｔｏｔａｌ ＲＮＡサンプルでは、いずれもＣＯＸ−２のコピー数は０であり、ＣＯＸ−２遺伝子の発現が見られなかった。一方、同時に参考例２で作成したプラスミドＤＮＡサンプルを用い、同一工程で、並列して増幅工程を行なったところ、１／１００００希釈のＣｔ値が４４．０であり、閾値の２６以上であった。
これらの結果から、少なくとも増幅工程の精度に問題があることが推測され、本結果の信頼性は低いことがわかった。
なお、今回は、鋳型無しの際には、増幅が見られていないが、コンタミネーションによって増幅が見られた場合、増幅工程の精度管理に問題があったと判断する。
これらの結果から、少なくとも増幅工程の精度に問題があることが推測され、本結果の信頼性は低いことがわかった。
なお、今回は、鋳型無しの際には、増幅が見られていないが、コンタミネーションによって増幅が見られた場合、増幅工程の精度管理に問題があったと判断する。
本発明の工程精度保証方法により、検査工程精度をより適切に保証することができるため、各工程を保証し、実サンプルで得られる結果の信頼性を向上させることが可能となる。このため、本発明の工程精度保証方法は、医療診断のための臨床検査の分野において特に有用である。
Claims (19)
- ２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料から、ＲＮＡを抽出する抽出工程と、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得る逆転写工程と、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程と、増幅された核酸を検出する検出工程と、を含む標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法における工程精度を保証する方法であって、
前記標的遺伝子は疾患のマーカー遺伝子であり、
前記標的遺伝子以外の遺伝子であって、前記生物学的試料に当該遺伝子由来のＲＮＡが含まれている遺伝子を標準遺伝子とし、
下記工程（ａ）及び／又は（ｂ）と、下記工程（ｃ）とを有することを特徴とする工程精度保証方法。
（ａ）標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液を抽出工程標準陽性試料とし、所定量の抽出工程標準陽性試料からＲＮＡを抽出してＲＮＡ溶液を調製し、当該ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、前記抽出工程の精度を保証する工程。
（ｂ）標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／又は標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料を逆転写工程標準陽性試料とし、所定量の逆転写工程標準陽性試料中のＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程。
（ｃ）標的遺伝子及び／又は標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を増幅工程標準陽性試料とし、所定量の増幅工程標準陽性試料中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の、増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程。 - 前記生物学的試料が、哺乳生物のＲＮＡよりも微生物のＲＮＡを多く含む生物学的試料であることを特徴とする請求項１記載の工程精度保証方法。
- 前記抽出工程標準陽性試料が、細菌の細胞溶液であることを特徴とする請求項２記載の工程精度保証方法。
- 前記逆転写工程標準陽性試料が、２以上の生物種のＲＮＡを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の工程精度保証方法。
- さらに、
（ｂ’）鋳型となるＲＮＡを含まない逆転写反応溶液中で逆転写反応を行った後、当該逆転写反応溶液を添加した増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度を保証する工程と、
を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の工程精度保証方法。 - さらに、
（ｃ’）鋳型となるＤＮＡを含まない増幅反応溶液中で増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の有無に基づき、前記増幅工程の精度を保証する工程と、
を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の工程精度保証方法。 - さらに、下記工程（ｄ）及び／又は（ｅ）を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の工程精度保証方法。
（ｄ）前記抽出工程において、前記生物学的試料から抽出された標的ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、濃度、精製度、及び分解度からなる群より選択される１以上を測定し、得られた測定値に基づき、当該生物学的試料の精度を保証する工程。
（ｅ）前記逆転写工程において得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記生物学的試料の精度を保証する工程。 - 前記工程（ａ）において、前記ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記抽出工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の工程精度保証方法。
- 前記工程（ａ）において、ＲＮＡの精製度の測定が、前記ＲＮＡ溶液の、２６０ｎｍにおける吸光度を２３０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２３０ｎｍ吸光度比）、及び／又は２６０ｎｍにおける吸光度を２８０ｎｍにおける吸光度で除した値（２６０／２８０ｎｍ吸光度比）を測定するものであり、
前記２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の工程精度保証方法。 - 前記２６０／２３０ｎｍ吸光度比又は２６０／２８０ｎｍ吸光度比が、１．０〜２．５の範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする請求項９記載の工程精度保証方法。
- 前記工程（ａ）において、ＲＮＡの分解度の測定が、前記ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの、２３ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量を１６ＳリボソーマルＲＮＡのフラグメント量で除した値（２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比）を測定するものであり、
前記２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、予め設定された数値範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする請求項２〜１０のいずれか記載の工程精度保証方法。 - 前記２３Ｓ ｒＲＮＡ／１６Ｓ ｒＲＮＡ比が、１．６〜２．５の範囲から外れている場合には、前記抽出工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする請求項１１記載の工程精度保証方法。
- 前記工程（ｂ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記逆転写工程及び／又は前記増幅工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記逆転写工程及び前記増幅工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の工程精度保証方法。
- 前記工程（ｃ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、前記増幅工程の精度が保証されていないと判断し、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記増幅工程の精度が保証されていると判断することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の工程精度保証方法。
- 前記工程（ｂ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも小さく、かつ、前記工程（ｃ）において、標的遺伝子由来核酸又は標準遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率が、予め設定された閾値よりも大きい場合には、前記逆転写工程の精度が保証されていないと判断することを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の工程精度保証方法。
- 前記工程（ｃ）が、
（ｃ”）標的遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料を段階的に希釈し、調製された各濃度の希釈液中のＤＮＡを鋳型として増幅反応を行い、増幅された標的遺伝子由来核酸の増幅量又は増幅効率に基づき、前記増幅工程の精度の保証と、前記生物学的試料中の標的遺伝子由来ＲＮＡの定量とを行う工程、
であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の工程精度保証方法。 - 前記生物学的試料が糞便であることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の工程精度保証方法。
- 標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法における工程精度を保証するためのキットであって、
前記標的遺伝子由来ＲＮＡの検出方法は、２以上の生物種のＲＮＡを含む生物学的試料から、ＲＮＡを抽出する抽出工程と、抽出されたＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得る逆転写工程と、得られたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う増幅工程と、増幅された核酸を検出する検出工程とを含み、前記標的遺伝子は疾患のマーカー遺伝子であり、前記標的遺伝子以外の遺伝子であって、生物学的試料に当該遺伝子由来のＲＮＡが含まれている遺伝子が標準遺伝子であり、
前記標的遺伝子及び／又は前記標準遺伝子の全部又は一部の塩基配列を有する人工配列ＤＮＡを含むＤＮＡ含有試料と、
前記標的遺伝子とは異なる生物種の細胞を含む細胞溶液、並びに／又は標的遺伝子由来ＲＮＡ及び／若しくは標準遺伝子由来ＲＮＡを含むＲＮＡ含有試料と、
を含むことを特徴とする工程精度保証用キット。 - 前記標的遺伝子が哺乳生物の遺伝子であり、前記細胞溶液が細菌の細胞溶液であることを特徴とする請求項１８記載の工程精度保証用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008325339A JP2010142188A (ja) | 2008-12-22 | 2008-12-22 | 工程精度保証方法及び工程精度保証用キット |
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| JP (1) | JP2010142188A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014166173A (ja) * | 2013-01-30 | 2014-09-11 | Hitachi High-Technologies Corp | 分析装置 |
-
2008
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