JP2010053053A - ペプチドポリマーの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アミン存在下において、ペプチドモノマーを含む第１溶液とペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液とを反応させてペプチドポリマーを製造する方法において、分子量分布が狭いペプチドポリマーを迅速に得る手段を提供する。
【解決手段】アミン存在下において、ペプチドモノマーを含む第１溶液とペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液とを反応させてペプチドポリマーを製造する方法であって、（１）第１溶液を第１微小流路に流通させる第１ステップと、（２）第２溶液を第２微小流路に流通させる第２ステップと、（３）第１微小流路から流出された第１溶液と第２微小流路から流出された第２溶液とを接触させながら第３微小流路に流通させてペプチドポリマーを生成する第３ステップとを含む。
【選択図】図２

Description

本発明は、アミン存在下において、ペプチドモノマーを含む第１溶液とペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液とを反応させてペプチドポリマーを製造する方法に関する。

ペプチドモノマーを含む重合単位が結合されてなるペプチドポリマーは、免疫応答における免疫源として診断や抗体作製に利用されたり、治療薬として利用されたり、培養基材や医療材料として利用されたりなど、様々な医療用途への利用が試みられている（特許文献１，２）。

ペプチドポリマーの合成におけるアシル化反応は、例えば水溶性カルボジイミドなどの縮合剤が用いられる。このような縮合剤は、一般にペプチド合成用縮合剤と称されている。ペプチドポリマーの化学合成は、通常、数日乃至１週間程度の比較的長い時間が必要とされる（非特許文献３，４）。また、アシル化反応終了後に、反応液を透析して、目的とする分子量に達しない低分子量の生成物が取り除く工程が必要とされる。

ところで、キャピラリーなどで実現される微小流路（マイクロチャネル）を利用して、化学的操作や電気的操作、機械的操作が行われている。例えば、物質の分析や、物質の合成、微生物の培養、電気泳動、電気浸透などにおいて微小流路が利用されており、少量の試料に基づいて所望の結果が得られるという利点がある。

特表２００１−５１３１２０号公報 特開平１１−５０９８６１号公報 K.Kaibara, Y.Akinari, K.Okamoto, Y.Uehara, S.Yamamoto, H.Kodama, and M.Kondo. "Characteristic Interaction of Ca2+ Ions with Elastin Coacervate: Ion Transport Study Across Coacervate Layers of α-Elastin and Elastin Model Polypeputide (Val-Pro-Gly-Val-Gly)n", Biopolymers, Vol.39, 189-198 (1996) C.Spezzacatena, T.Perri, V.Guantieri, L.B.Sandberg, T.F.Mitts, and A.M.Tamburro, "Classical Syntyesis of and Structural Studies on a Biologically Active Heptapeptide and a Nonapeptide of Bovine Elastin", Eur.J.Org.Chem. 2002. 95-103

ペプチドポリマーを迅速且つ高収率で合成することは、ペプチドポリマーを用いた医療材料や薬物などを商業的に製造する観点から重要である。しかし、従来の合成方法では多大な反応時間を必要とするために商業的な製造には不向きであった。また、目的とする分子量に到達しない低分子量の生成物が混在するので、収率が悪く、また、目的とする分子量付近の生成物を得るには透析などの工程が必要となる。さらには、例え透析を行ったとしても、目的とする分子量に対して比較的分布が広い生成物しか得ることができず、必ずしも所望の物性の生成物が得られないという問題があった。

本発明は前述された事情に鑑みてなされたものであり、アミン存在下において、ペプチドモノマーを含む第１溶液とペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液とを反応させてペプチドポリマーを製造する方法において、分子量分布が狭いペプチドポリマーを迅速に得る手段を提供することを目的とする。

本発明は、アミン存在下において、ペプチドモノマーを含む第１溶液とペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液とを反応させてペプチドポリマーを製造する方法であって、
（１）第１溶液を第１微小流路に流通させる第１ステップと、
（２）第２溶液を第２微小流路に流通させる第２ステップと、
（３）第１微小流路から流出された第１溶液と第２微小流路から流出された第２溶液とを接触させながら第３微小流路に流通させてペプチドポリマーを生成する第３ステップと、を含む。

本発明におけるペプチドポリマーは、重合単位であるペプチドモノマーが重合されて数多く連なったものである。ペプチドモノマーは、数個のアミノ酸がアミド結合又はペプチド結合により連なったものであり、その両端にＮ末端又はＣ末端を有する。ペプチドモノマーにおけるペプチド数は特に限定されないが、通常、数量体から数十量体が想定される。ペプチドモノマーとして、末端のカルボキシル基のみが遊離され、その他の側鎖官能基が保護されたものがあげられる。

ペプチドモノマーの合成には、化学合成法や酵素合成法などの既に確立されたペプチド合成法が用いられてもよく、自動ペプチド合成装置が用いられてもよい。ペプチド合成は、通常、Ｃ末端側からＮ末端側へ向かって進められ、未反応のアミノ基はＦＭＯＣ基やＢＯＣ基などに代表される保護基によって保護される。また、アミドの反応収率を高くするためにブタノールやＷＳＣＩ（水溶性ＤＣＣ）などの保護剤が用いられてもよい。

ペプチド合成により得られたペプチドモノマーの確認は、例えば、液体クロマトグラフ質量分析装置（Applied Biosystems、商品名：Marinaer）により行われてもよい。また、ペプチドモノマーの構造確認は、例えば、質量分析装置（Applied Biosystems、商品名：Voyager）により行われてもよい。また、ペプチドモノマーのアミノ酸組成は、アミノ酸分析装置（株式会社日立製作所、商品名：Ｌ−８５００）により行われてもよい。

本発明に係るペプチドポリマーの製造方法は、アミン存在下において、ペプチドモノマーを含む第１溶液と、ペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液とが反応されることによって行われる。

本発明におけるアミンとして、三級アミンが用いられる。三級アミンとして、例えば、トリエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、トリメチルアミンなどがあげられるが、その他の三級アミンが用いられてもよい。

本発明において、アミンは、第１溶液に含まれるペプチドモノマーが第２溶液に含まれるペプチド合成用縮合剤によって脱水縮合反応をする際に存在すればよい。仮に、第１溶液にアミンを含ませるとすれば、第１溶液におけるアミンの濃度は、ペプチドモノマーに対してモル比で１．２等量が好ましい。絶対濃度でいえば、第１溶液におけるアミンの濃度は、０．１〜４ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．２〜３ｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．６〜１．２ｍｏｌ／Ｌである。

第１溶液は、少なくともペプチドモノマーを含む。このペプチドモノマーは前述されたものである。第１溶液に用いられる溶媒は、不活性溶媒である。本発明における不活性溶媒とは、ペプチドモノマー、アミン、ペプチド合成用縮合剤、反応中間物及び生成物などと相互反応せず、生成物の収率や分子量分布に悪影響を及ぼさない溶媒又は溶媒混合物をいう。このような不活性溶媒として、例えば無水のジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＡ」とも称される。）があげられる。なお、第１溶液の溶媒としては、ＤＭＳＯの他に、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロヒドリン）やＤＭＦなどが用いられてもよい。

第１溶液におけるペプチドモノマーの濃度は、０．１〜２ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．１〜１．５ｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．５〜１．０ｍｏｌ／Ｌである。ペプチドモノマーの濃度が上記範囲より高ければ、ＤＭＳＯが溶解し難くなったり、第１溶液の粘性が高くなって微小流路に流通させ難くなったりするという不具合が生じ得る。一方、ペプチドモノマーの濃度が上記範囲より低ければ、反応種が少なくなって反応性が低下し得る。

第２溶液は、少なくともペプチド合成用縮合剤を含む。このペプチド合成用縮合剤は、ペプチドモノマーや反応中間物におけるカルボキシル基を活性化するものであり、脱水縮合剤とも称される。このペプチド合成用縮合剤として、例えばジフェニルリン酸アジド、1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-benzotriazoniumu-3-oxide hexafluorophosphate（HBTU）などがあげられる。

第２溶液に用いられる溶媒は、不活性溶媒である。本発明における不活性溶媒とは、ペプチドモノマー、アミン、ペプチド合成用縮合剤、反応中間物及び生成物などと相互反応せず、生成物の収率や分子量分布に悪影響を及ぼさない溶媒又は溶媒混合物をいう。このような不活性溶媒として、例えば無水のジメチルスルホキシドがあげられる。

本発明に係るペプチドポリマーの製造方法は、主に３つのステップからなるが、これら以外のステップが含まれることを除くものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲で、さらに他のステップが後述される各ステップの前後に実施されてもよい。

本発明における第１ステップでは、前述された第１溶液が第１微小流路に流通される。第１微小流路として、例えば、所定の長さのキャピラリーを用いることができる。キャピラリーの中空形状は特に限定されず、その断面が円、楕円、多角形などであってもよい。キャピラリーの中空は、その断面、つまりキャピラリー内を溶液が流通する方向（流路方向）と直交する断面の形状において最大となる寸法（最大寸法）が、１０μｍ〜２ｍｍであることが好ましく、より好ましくは５００μｍ〜１．５ｍｍであり、特に好ましくは約１．０ｍｍである。ここで、最大寸法とは、キャピラリーの断面形状が円であれば直径をさし、多角形であれば最大長さとなる対角線をさす。最大寸法が上記範囲より小さければ、第１溶液の流量が十分に確保できず、ペプチドポリマーの生成量が少なくなり、実用性に欠ける。また、第１溶液中の析出物などによって第１微小流路がつまって流通性が悪くなるなどの不具合が生じやすい。最大寸法が上記範囲より大きければ、ペプチドポリマーの反応を制御しにくくなる。キャピラリーの長さは、特に限定されない。なお、キャピラリーに代えて、ガラス板やシリコン板などに形成された微小溝を第１微小流路として用いることができる。

第１流路における第１溶液の流量は、毎分１μＬ〜１０ｍＬであることが好ましく、さらに好ましくは毎分１０μＬ〜１ｍＬであり、特に好ましくは毎分０．１〜０．５ｍＬである。第１溶液の流量が上記範囲より小さければ、ペプチドポリマーの生成量が少なくなり、実用性に欠ける。第１溶液の流量が上記範囲より大きければ、ペプチドポリマーの反応を制御しにくくなったり、、微小流路における内部圧が高くなって送液が困難になったりするという不具合が生じ得る。第１溶液の流量は、第１流路となるキャピラリーをシリンジポンプやギヤポンプに連結することにより制御することができる。

本発明における第２ステップでは、前述された第２溶液が第２微小流路に流通される。第２微小流路として、例えば、第１微小流路で示されたような所定の長さのキャピラリーを用いることができる。このキャピラリーの詳細についての説明は、第１微小流路と同様であるので省略される。

第２流路における第２溶液の流量は、毎１μＬ〜１０ｍＬであることが好ましく、さらに好ましくは毎分１０μＬ〜１ｍＬであり、特に好ましくは毎分０．１〜０．５ｍＬである。第２溶液の流量が上記範囲より小さければ、ペプチドポリマーの生成量が少なくなり、実用性に欠ける。第２溶液の流量が上記範囲より大きければ、ペプチドポリマーの反応を制御しにくくなったり、、微小流路における内部圧が高くなって送液が困難になったりするという不具合が生じ得る。第２溶液の流量は、第２流路となるキャピラリーをシリンジポンプやギヤポンプに連結することにより制御することができる。

第３ステップでは、第１微小流路から流出された第１溶液と第２微小流路から流出された第２溶液とが接触されながら第３微小流路に流通される。第１溶液及び第２溶液が第３微小流路に流通される過程において脱水縮合反応が行われて所望のペプチドポリマーが生成される。

第３微小流路として、例えば、第１微小流路で示されたような所定の長さのキャピラリーを用いることができる。このキャピラリーの詳細についての説明は、第１微小流路と同様であるので省略される。第３微小流路としてのキャピラリーは、第１微小流路としてのキャピラリー及び第２微小流路としてのキャピラリーと連結される。

第３流路における第１溶液及び第２溶液の流量は、毎分１μＬ〜１０ｍＬであることが好ましく、さらに好ましくは、毎分１０μＬ〜１ｍＬであり、特に好ましくは、毎分０．１〜０．５ｍＬである。なお、第１溶液及び第２溶液は、第３流路においてペプチドポリマーを生成するので、第１流路における第１溶液及び第２溶液とペプチドポリマーとが明確に区別されなくてもよい。つまり、第３流路における第１溶液及び第２溶液の流量は、第３流路におけるペプチドポリマーの流量として把握されてもよい。第１溶液及び第２溶液の流量が上記範囲より小さければ、ペプチドポリマーの生成量が少なくなり、実用性に欠ける。第１溶液及び第２溶液の流量が上記範囲より大きければ、ペプチドポリマーの反応を制御しにくくなったり、、微小流路における内部圧が高くなって送液が困難になったりするという不具合が生じ得る。第１溶液及び第２溶液の流量は、第１流路及び第２流路において第１溶液の流量及び第２溶液の流量がそれぞれ制御されることによって制御される。

第３微小流路において、第１溶液と第２溶液とは層流として流通すると想定される。したがって、第１溶液と第２溶液との界面においてペプチドモノマーの脱水縮合反応が生じる。脱水縮合反応は、例えば、温度２０〜３０℃の範囲で、１〜１０分間で行われるが、第１溶液と第２溶液との界面の面積を増大させることにより、脱水縮合反応を一層促進させることができる。反応温度が上記範囲より低ければ、ＤＭＳＯなどの融点以下となって溶液が固化し得る。一方、反応温度が上記範囲より高ければ、ＤＰＡＡが分解しうる。

第１溶液と第２溶液との界面は、第３微小流路を、第１溶液及び第２溶液が流れる方向が湾曲する湾曲流路とすることにより増大される。第１溶液及び第２溶液が流れる方向とは、第３微小流路がキャピラリーで構成されているとすれば、そのキャピラリー内を溶液が流通する方向、つまり流路方向である。第３微小流路を構成するキャピラリーを長さ方向に対して湾曲させると、その湾曲部分において流路方向も湾曲される。このような第３微小流路の湾曲は、例えば、第３微小流路の流路方向が反転を繰り返すように、複数のＵ字形状を連続して形成されたり、Ｓ字カーブやクランク形状のコーナーが連続されたりすることにより実現される。

第３流路が湾曲されることにより、湾曲部分において第１溶液が流れる経路長と第２溶液が流れる経路長が異なる。例えば、湾曲部分の外側を第１溶液が層流をなして流れ、湾曲部分の内側を第２溶液が層流をなして流れるとすると、湾曲部分においては第２溶液の経路長に対して第１溶液の経路長が長くなる。第３微小流路の全経路において第１溶液の流速及び第２溶液の流速が一定に制御されているとすると、第３微小流路の湾曲部分において、第２溶液の流速より第１溶液の流速が速くなり、これに遠心力も作用して、第１溶液と第２溶液との界面に乱れが生じる。この界面の乱れにより、第１溶液と第２溶液とが新たに接触する界面が生じ、その界面において新たな脱水縮合反応が生じる。このように、第１溶液と第２溶液とが新たに接触する界面が、本発明において界面の面積の増加とも称される。

また、第１溶液と第２溶液との界面は、第３微小流路において二以上の流路に分岐させる分岐位置、及び分岐された流路を合流させる合流位置が設けられることにより、第３流路における第１溶液と第２溶液との界面の面積が分岐位置の上流より合流位置の下流で広くされてもよい。

詳細に説明するに、第３微小流路が分岐位置において二以上の流路に分岐される。仮に二つの流路に分岐されるとして、それらを第１分岐流路及び第２分岐流路と称する。第３微小流路における分岐位置より上流側では、第１溶液及び第２溶液は層流をなして流れている。分岐位置において、第１溶液と第２溶液との界面と交差する面によって第１溶液及び第２溶液の流れが分断される。例えば、第３微小流路を流路方向と直交する断面から視たときに第１溶液と第２溶液とが左右に分かれて層流をなしているとすれば、分岐位置において第１溶液及び第２溶液の流れが、その断面において上下に二分され、例えば、二分された上側が第１分岐流路に流れ込み、下側が第２分岐流路に流れ込む。

第１分岐流路及び第２分岐流路においては、第１溶液及び第２溶液がそれぞれ層流をなして流れる。これにより、第１分岐流路及び第２分岐流路のそれぞれにおいて第１溶液と第２溶液との界面が生ずるが、各々の界面の面積が半分となっていれば分岐位置の上流側と下流側において界面の面積に変化がない。勿論、第１分岐流路及び第２分岐流路の断面形状を変更することによって、分岐位置より下流側において界面の面積を増大させることもできる。

第１分岐流路と第２分岐流路とは、合流位置において合流される。合流位置においては、前述されたように断面において上下二段に分断された各層流が、同じ方向から視た断面において左右に連結される。つまり、第１分岐流路の第１溶液及び第２溶液の層流に、第２分岐流路の第１溶液及び第２溶液の層流が左右に隣接するように合流される。これにより、第１分岐流路における第２溶液に対して、第２分岐流路における第１溶液が隣接するので、これらの間にも第１溶液と第２溶液との界面が生じる。この界面によって、合流位置より下流側において第１溶液と第２溶液との界面が広くなる。新たな界面において、第１溶液と第２溶液とが新たに接触して新たな脱水縮合反応が生じる。このように、合流位置より下流側において、第１溶液と第２溶液とが新たに接触する界面が生じることが、本発明において界面の面積が広くなるとも称される。

本発明に係るペプチドポリマーの製造方法によれば、数平均分子量が１０００〜２５０００の範囲内であり、分子量分布が１．１〜１．３の範囲内のペプチドポリマーを得ることができる。ペプチドポリマーの平均分子量及び分子量分布は、例えば、ＲＩ検出器に分離カラムを連結させて、ペプチドポリマーを含む反応液を分析し、標準物質としてＳｈｏｄｅｘ Ｐ−８２を用いたプルランの検量線に基づいて解析し得る。

本発明に係るペプチドポリマーの製造方法によれば、第１ステップにおいて第１微小流路を流出された第１溶液と、第２ステップにおいて第２微小流路を流出された第２溶液とが、第３微小流路において接触させることによりペプチドポリマーの生成が進行するので、反応の制御が容易であり、かつ分子量分布の狭いペプチドポリマーを得ることができる。

また、第３微小流路を、第１溶液及び第２溶液が流れる方向が湾曲する湾曲流路とすることにより、第１溶液と第２溶液とが接触する界面の面積が増加されるので、ペプチドポリマーの生成速度が向上される。

また、第３微小流路を分岐位置において二以上の流路に分岐させてから、合流位置において第１溶液と第２溶液との界面の面積が広くなるように合流させることにより、第１溶液と第２溶液とが接触する界面の面積が増加されるので、ペプチドポリマーの生成速度が向上される。

また、本発明に係るペプチドポリマーの製造方法により得られたペプチドポリマーの分子量分布が、１．１〜１．３であるので、所望の物性のペプチドポリマーを得ることできる。

以下に、本発明の好ましい実施形態が説明される。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様が変更されてもよいことは言うまでもない。

［図面の説明］
図１は、本発明の第１実施形態に係るマイクロリアクタ１０の外観構成を示す斜視図である。図２は、マイクロリアクタ１０の構成を示す上面図である。図３は、図２における領域IIIを示す拡大図である。図４は、第１実施形態の変形例に係るマイクロリアクタ１０の構成を示す上面図である。図５（Ａ）は、図４におけるＶＡ−ＶＡ切断面を示す断面図であり、図５（Ｂ）は、図４におけるＶＢ−ＶＢ切断面を示す断面図であり、図５（Ｃ）は、図４におけるＶＣ−ＶＣ切断面を示す断面図である。なお、図５においては、微小流路以外の構成が省略されている。図６は、本発明の第２実施形態に係るマイクロリアクタ４０の構成を示す模式図である。図７は、第２実施形態の第１変形例に係るマイクロリアクタ４０の構成を示す模式図である。図８は、第２実施形態の第２変形例に係るマイクロリアクタ４０の構成を示す模式図である。

［第１実施形態］
図１及び図２に示されるように、第１実施形態においては、マイクロリアクタ１０が用いられる。マイクロリアクタ１０は、例えばガラスなど、第１溶液及び第２溶液や生成物及び中間物などと反応しない不活性物質を素材とするプレート形状である。マイクロリアクタ１０の上面には、第１導入口１１、第２導入口１２及び流出口１３が形成されている。マイクロリアクタ１０の内部には、第１導入口１１、第２導入口１２及び流出口１３を接続する微小流路（マイクロチャネル）が形成されている。この微小流路の詳細な構成は後述されるが、例えばマイクロマシニング技術を用いてマイクロリアクタ１０に微小流路が形成されている。第１導入口１１は、ペプチドモノマー及びアミンを含む第１溶液が導入されるためのものである。第２導入口１２は、ペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液が導入されるためのものである。流出口１３は、脱水縮合反応により得られたペプチドポリマーを含む反応液が流出されるためのものである。

図２に示されるように、微小流路は、第１微小流路２１、第２微小流路２２及び第３微小流路２３に大別される。図１及び図２には現れていないが、第１微小流路２１、第２微小流路２２及び第３微小流路２３は、液体が流通し得る流路であり、その断面形状は矩形や多角形、円形、楕円形などが採用され得る。本実施形態では、第１微小流路２１、第２微小流路２２及び第３微小流路２３の各断面形状は流路方向に対して一定の四角形であるが、本発明において各微小流路の断面形状は特に限定されず、また、流路方向に対して変化されてもよい。

第１微小流路２１は、第１導入口１１から合流位置２４へほぼ直線状に延出されている。第２微小流路２２は、第２導入口１２から合流位置２４へほぼ直線状に延出されている。合流位置２４においては、第１微小流路２１と第２微小流路２２と第３微小流路２３とが接続されている。したがって、第１導入口１１から第１微小流路２１へ注入された第１溶液と、第２導入口１２から第２微小流路２２へ注入された第２溶液とが、合流位置２４において合流して第３微小流路２３へ流れ込む。

第３微小流路２３には、流れの向きが反転する湾曲部２５が複数形成されている。各湾曲部２５によって流れの向きが相反する向きへ反転しながら、第３微小流路２３が蛇行しながら流出口１３へ延出されている。第１溶液及び第２溶液は、複数の湾曲部２５を通過しながら第３微小流路２３を流出口１３へ向かって流される。

本実施形態におけるペプチドポリマーを製造するは、主として以下の３つのステップを含む。
（１）第１溶液を第１微小流路２１に流通させる第１ステップ。
（２）第２溶液を第２微小流路２２に流通させる第２ステップ。
（３）第１微小流路２１から流出された第１溶液と第２微小流路２２から流出された第２溶液とを接触させながら第３微小流路２３に流通させてペプチドポリマーを生成する第３ステップ。

第１ステップでは、第１溶液が第１導入口１１を通じて第１微小流路２１に流通される。第１導入口１１に、直接に又はチューブなどを介して第１溶液が充填されたシリンジが接続され、そのシリンジから第１溶液が流出されることによって、第１溶液が第１導入口１１から第１微小流路２１へ注入される。シリンジから一定の流速で第１溶液が流出されることにより、第１微小流路２１において第１溶液が一定の流速で流通される。

第２ステップでは、第２溶液が第２導入口１２を通じて第２微小流路２２に流通される。第２導入口１２に、直接に又はチューブなどを介して第２溶液が充填されたシリンジが接続され、そのシリンジから第２溶液が流出されることによって、第２溶液が第２導入口１２から第２微小流路２２へ注入される。シリンジから一定の流速で第２溶液が流出されることにより、第２微小流路２２において第２溶液が一定の流速で流通される。

なお、前述された第１ステップ及び第２ステップは、いずれのステップが先に開始されてもよく、また、２つのステップが同時に開始されてもよい。

第３ステップでは、第１微小流路２１から流出された第１溶液と第２微小流路２２から流出された第２溶液とが接触されながら第３微小流路２３に流通される。第３微小流路２３における第１溶液及び第２溶液の流速は、前述された各シリンジからの流出圧によって制御されてもよく、また、流出口１３から吸引圧を第３微小流路２３に付与するこによって制御されてもよい。

第３微小流路２３において、第１溶液と第２溶液とは層流として流通する。したがって、第１溶液と第２溶液との界面においてペプチドモノマーの脱水縮合反応が生じる。脱水縮合反応を制御するために、マイクロリアクタ１０が恒温槽などに入れられて所定の温度範囲に保持されてもよい。

第３微小流路２３における第１溶液と第２溶液との界面は、各湾曲部２５において増大される。図３に示されるように、湾曲部２５においては、第１溶液が流れる経路長２６と第２溶液が流れる経路長２７とが異なり、同図に示されるように湾曲部２５における外側を層流となって流れる第１溶液の経路長２６は、内側を層流となって流れる第２溶液の経路長２７より長くなる。

第３微小流路２３の全経路において第１溶液の流速及び第２溶液の流速が一定に制御されているとすると、第３微小流路２３の湾曲部２５において、第２溶液の流速より第１溶液の流速が速くなり、これに遠心力も作用して、第１溶液と第２溶液との界面２８に乱れが生じる。また、第３微小経路２３が湾曲されていることにより、仮に第３微小経路２３が湾曲されずに直線状に延出されているよりも、界面２８が流路方向へ長くなる。これらにより、湾曲部２５において第１溶液と第２溶液とが新たに接触する界面２８が生じ、その界面２８において新たな脱水縮合反応が生じる。

前述されたようにして、第３微小経路２３において脱水縮合反応が生じ、第３微小流路２３の全経路長や保持される温度範囲などによって脱水縮合反応が制御されて、所望の分子量及び分子量分布のペプチドポリマーが生成される。そして、生成されたペプチドポリマーが流出口１３から流出される。

［第１実施形態の作用効果］
第１実施形態に係るペプチドポリマーの製造方法によれば、第１ステップにおいて第１微小流路２１を流出された第１溶液と、第２ステップにおいて第２微小流路２２を流出された第２溶液とが、第３微小流路２３において接触されることによりペプチドポリマーの生成が進行するので、反応の制御が容易であり、かつ分子量分布の狭いペプチドポリマーを得ることができる。

また、第３微小流路２３において、第１溶液及び第２溶液が流れる方向が湾曲する複数の湾曲部２５が設けられることにより、各湾曲部２５において第１溶液と第２溶液とが接触する界面２８の面積が増加されるので、ペプチドポリマーの生成速度が向上される。

［第１実施形態の変形例］
以下に第１実施形態の変形例が説明される。この変形例では、マイクロリアクター１０において、前述された第３微小流路２３に代えて後述される第３微小流路３０が設けられた点が異なり、その他の構成は同様である。したがって、第３微小流路３０の構成が以下に詳細に説明され、その他の構成の説明が省略される。なお、図４において、第１実施形態に係るマイクロリアクタ１０と同じ参照符号が付された箇所は同じ構成部材を示している。

図４に示されるように、第３微小流路３０は、分岐位置３３において第１分岐流路３１及び第２分岐流路３２に分岐されている。図５に示されるように、第１分岐流路３１は、分岐位置３３より上流側における第３微小流路３０の上側半分を導く流路である。第２分岐流路３２は、分岐位置３３より上流側における第３微小流路３０の下側半分を導く流路である。つまり、分岐位置３３において第３微小流路３０は、その断面において上下に二分され、二分された上側が第１分岐路３１と連続し、下側が第２分岐路３２と連続する。第１分岐流路３１及び第２分岐流路３２は、それぞれの幅が第３微小流路３０の幅と同じであって、かつそれぞれの高さが第３微小流路３０の高さの半分である。

図４に示されるように、第１分岐流路３１と第２分岐流路３２とは、合流位置３４において合流されている。図５に示されるように、合流位置３４においては、第１分岐流路３１と第２分岐流路３２とが、断面視において左右に並ぶように連結されている。つまり、合流位置３４より下流側の第３微小流路３０において、断面視において第１分岐流路３１が左側となり、第２分岐流路３２が右側半分となるように連結されている。分岐位置３３より上流側の第３微小流路３０と、合流位置３４より下流側の第３微小流路３０の幅及び高さは同じである。

図４に示されるように、前述されたような分岐位置３３、第１分岐流路３１及び第２分岐流路３２、並びに合流位置３４を一組として、このような組が第３微小流路３０において流路方向に複数設けられている。第３微小流路３０の最下流端は流出口１３に接続されている。

本変形例においても、前述された第１実施形態と同様の第１ステップ、第２ステップ及び第３ステップが行われる。このうち、第３ステップにおいて、第３微小流路３０を流通する第１溶液及び第２溶液の流れが、前述された第１実施形態における第３ステップと異なる。したがって、以下には第１実施形態と異なる第３ステップのみが詳細に説明され、第１ステップ及び第２ステップの説明が省略される。

図５（Ａ）に示されるように、第３微小流路３０における分岐位置３３より上流側では、第１溶液３５及び第２溶液３６は断面視において左右に分かれるが如く層流をなして流れる。このような層流において第１溶液３５と第２溶液３６との界面３７において、脱水縮合反応が生じる。

分岐位置３３においては、第１溶液３５と第２溶液３６との界面３７と直交する仮想面３８によって第１溶液３５及び第２溶液３６の流れが断面視において上下に二分され、図５（Ｂ）に示されるように、二分された上側が第１分岐流路３１に流れ込み、下側が第２分岐流路３２に流れ込む。

第１分岐流路３１及び第２分岐流路３２においては、第１溶液３５及び第２溶液３６がそれぞれ層流をなして流れる。これにより、第１分岐流路３１及び第２分岐流路３２のそれぞれにおいて第１溶液３５と第２溶液３６との界面３７Ａ，３７Ｂがそれぞれ生ずるが、各々の界面３７Ａ，３７Ｂにおける流路方向の単位長さ当たりの面積の合計は、分岐位置３３より上流側における界面３７における流路方向の単位長さ当たりの面積と同等である。

図５（Ｃ）に示されるように、合流位置３４においては、前述されたように断面において上下二段に分断された第１分岐流路３１及び第２分岐流路３２の各層流が左右に並ぶように連結される。つまり、第１分岐流路３１の第１溶液３５及び第２溶液３６の層流に、第２分岐流路３２の第１溶液３５及び第２溶液３６の層流が左右に隣接するように合流される。これにより、第１分岐流路３１における第２溶液３６に対して、第２分岐流路３２における第１溶液３５が隣接するので、これらの間にも第１溶液３５と第２溶液３６との界面３９が生じる。界面３９における流路方向の単位長さ当たりの面積は、界面３７における流路方向の単位長さ当たりの面積と同等である。また、各界面３７Ａ，３７Ｂは、合流位置３４より下流側の第３微小流路３０において、それぞれの高さが界面３７の高さと同じとなって、各界面３７Ａ，３７Ｂにおける流路方向の単位長さ当たりの各面積は、界面３７における流路方向の単位長さ当たりの面積と同等となる。これにより、合流位置３４より下流側において、第１溶液３５と第２溶液３６との界面３７Ａ，３７Ｂ，３９における流路方向の単位長さ当たりの面積の合計は、界面３７における流路方向の単位長さ当たりの面積より広くなる。このようにして拡がった界面３７Ａ，３７Ｂ，３９において、第１溶液３５と第２溶液３６とが新たに接触して新たな脱水縮合反応が生じる。したがって、第３微小流路３０におけるペプチドポリマーの生成速度が向上される。

前述と同様の分岐位置３３、第１分岐流路３１及び第２分岐流路３２、並びに合流位置３４の組が第３微小流路３０において流路方向に複数設けられているので、前述と同様にして、３つの界面３７Ａ，３７Ｂ，３９が７つの界面に増加されて、それぞれの流路方向の単位長さ当たりの面積の合計が増加され、同様に、その下流側における組においても界面の増加が繰り返される。これにより、第３微小流路３０におけるペプチドポリマーの生成速度が一層向上される。

［第２実施形態］
図６に示されるように、第２実施形態においては、第１シリンジ４１、第２シリンジ４２及びキャピラリー４３，４４，４５を連結させたマイクロリアクタ４０が用いられる。第１シリンジ４１、第２シリンジ４２及びキャピラリー４３，４４，４５は、第１溶液及び第２溶液や生成物及び中間物などと反応しない不活性物質を素材とする。

第１シリンジ４１には、ペプチドモノマー及びアミンを含む第１溶液が充填されている。また、第１シリンジ４１には、キャピラリー４３が接続されている。このキャピラリー４３が、本発明における第１微小流路を形成している。第１シリンジ４１のプランジャが操作されることにより、第１シリンジ４１に充填された第１溶液がキャピラリー４３へ流出される。第１シリンジ４１のプランジャは手動で操作されても、シリンジポンプの如く機械的に動作されるものであってもよい。

第２シリンジ４２には、ペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液が充填されている。また、第２シリンジ４２には、キャピラリー４４が接続されている。このキャピラリー４４が、本発明における第２微小流路を形成している。第２シリンジ４２のプランジャが操作されることにより、第２シリンジ４２に充填された第２溶液がキャピラリー４４へ流出される。第２シリンジ４２のプランジャは手動で操作されても、シリンジポンプの如く機械的に動作されるものであってもよい。

各キャピラリー４３，４４は、ジョイント４６により連結されてキャピラリー４５へ連続する流路を形成している。このキャピラリー４５が、本発明における第３微小流路を形成している。キャピラリー４５の末端はフラスコ４７内へ挿入されている。フラスコ４７は生成物であるペプチドポリマーを回収するための容器である。キャピラリー４５は、所望の分子量のペプチドポリマーを得るために必要な脱水縮合反応が生じるような長さに設定されている。また、キャピラリー４５の一部は蛇行するように湾曲されており、その湾曲部分４８は脱水縮合反応に適した温度範囲に保持されている。

本実施形態におけるペプチドポリマーを製造するは、主として以下の３つのステップを含む。
（１）第１溶液を第１シリンジ４１からキャピラリー４３に流通させる第１ステップ。
（２）第２溶液を第２シリンジ４２からキャピラリー４４に流通させる第２ステップ。
（３）キャピラリー４３から流出された第１溶液とキャピラリー４４から流出された第２溶液とを接触させながらキャピラリー４５に流通させてペプチドポリマーを生成する第３ステップ。

第１ステップでは、第１溶液が第１シリンジ４１からキャピラリー４３へ流通される。前述されたように、第１シリンジ４１のプランジャーが手動で又は機械的に動作されることにより、第１シリンジ４１から第１溶液が流出される。第１シリンジから一定の流速で第１溶液が流出されることにより、キャピラリー４３において第１溶液が一定の流速で流通される。

なお、前述された第１ステップ及び第２ステップは、いずれのステップが先に開始されてもよく、また、２つのステップが同時に開始されてもよい。

第３ステップでは、キャピラリー４３から流出された第１溶液とキャピラリー４４から流出された第２溶液とが接触されながらキャピラリー４５に流通される。キャピラリー４５における第１溶液及び第２溶液の流速は、第１シリンジ４１及び第２シリンジ４２からの流出圧によって制御されてもよく、また、キャピラリー４５の最下流端から吸引圧をキャピラリー４５内に付与するこによって制御されてもよい。

キャピラリー４５において、第１溶液と第２溶液とは層流として流通する。したがって、第１溶液と第２溶液との界面においてペプチドモノマーの脱水縮合反応が生じる。脱水縮合反応を制御するために、キャピラリー４５の湾曲部分４８が恒温槽などに入れられて所定の温度範囲に保持されてもよい。

第１実施形態で説明されたように、キャピラリー４５における第１溶液と第２溶液との界面は、湾曲部分４８において増大される。これにより、湾曲部分４８において第１溶液と第２溶液とが新たに接触する界面が生じ、その界面において新たな脱水縮合反応が生じる。

前述されたようにして、キャピラリー４５において脱水縮合反応が生じ、キャピラリー４５の全経路長や湾曲部分４８が保持される温度範囲などによって脱水縮合反応が制御されて、所望の分子量及び分子量分布のペプチドポリマーが生成される。そして、生成されたペプチドポリマーがキャピラリー４５からフラスコ４７へ流出される。

前述されたようなマイクロリアクタ４０によっても、第１実施形態と同様の作用効果が奏される。

［第２実施形態の第１変形例］
以下に第２実施形態の第１変形例が説明される。第１変形例では、マイクロリアクター４０において、フラスコ４７からキャピラリー４５へ溶液を循環するための新たなキャピラリー５１が設けられた点が主に異なり、その他の構成は同様である。したがって、新たなキャピラリー５１の構成を中心として以下に詳細な説明がなされ、その他の構成の説明が省略される。なお、図７において、第２実施形態に係るマイクロリアクタ４０と同じ参照符号が付された箇所は同じ構成部材を示している。

図７に示されるように、第２実施形態の第１変形例においては、第１シリンジ４１に接続されたキャピラリー４３と第２シリンジ４２に接続されたキャピラリー４４とが、ジョイント４６を介してキャピラリー４９に接続され、このキャピラリー４９が、ジョイント５０を介してキャピラリー４５に接続されている。キャピラリー４５，４９が本発明における第３微小流路に相当する。キャピラリー４５の末端はフラスコ４７内へ挿入されている。

フラスコ４７には、別のキャピラリー５１が挿入されており、このキャピラリー５１は、ジョイント５０に接続されている。キャピラリー５１により形成される微小流路には、ポンプ５２が設けられている。このポンプ５２は、例えば、ギアポンプやチューブポンプなどの公知のポンプが用いられる。ポンプ５２は、フラスコ４７からジョイント５０へ向かってキャピラリー５１内の溶液を流通させる。キャピラリー５１から流出された溶液は、ジョイント５０を通じてキャピラリー４５へ流入する。

なお、キャピラリー４９，５１は、第１溶液及び第２溶液や生成物及び中間物などと反応しない不活性物質を素材とする。

本変形例においても、前述された第２実施形態と同様の３つのステップにより、キャピラリー４５においてペプチドポリマーが生成され、生成されたペプチドポリマーがキャピラリー４５からフラスコ４７へ流出される。

フラスコ４７に流出されたペプチドポリマーを含む溶液は、ポンプ５２によってフラスコ４７からキャピラリー５１へ吸入される。そして、キャピラリー５１内を流通されたペプチドポリマーがジョイント５０を通じて再びキャピラリー４５へ流入する。

キャピラリー４５へ流入したペプチドポリマーは、キャピラリー４９から流出された第１溶液及び第２溶液と接触されて脱水縮合反応が生じ、さらに重合される。このように一度キャピラリー４５から流出されたペプチドポリマーを再循環させて脱水縮合反応を行うことにより、キャピラリー４５の径や長さによらずに、マイクロリアクタ４０において所望の分子量のペプチドポリマーを合成することができる。

［第２実施形態の第２変形例］
以下に第２実施形態の第２変形例が説明される。第２変形例では、マイクロリアクター４０において、第１シリンジ４１、第２シリンジ４２、キャピラリー４３，４４，４５と同様の組み合わせが、キャピラリー４５の下流側に直列に接続された点が主に異なり、その他の構成は同様である。したがって、新たな組み合わせである、第３シリンジ５３、第４シリンジ５４、キャピラリー５５，５６，５８，６０などの構成を中心として以下に詳細な説明がなされ、その他の構成の説明が省略される。なお、図８において、第２実施形態に係るマイクロリアクタ４０と同じ参照符号が付された箇所は同じ構成部材を示している。

第３シリンジ５３には、ペプチドモノマー及びアミンを含む第１溶液が充填されている。第４シリンジ５４には、ペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液が充填されている。図８に示されるように、第３シリンジ５３に接続されたキャピラリー５５と第４シリンジ５４に接続されたキャピラリー５６とが、ジョイント５７を介してキャピラリー５８に接続され、このキャピラリー５８が、ジョイント５９を介してキャピラリー４５，６０と接続されている。

キャピラリー６０の末端はフラスコ４７内へ挿入されている。また、キャピラリー６０の一部は蛇行するように湾曲されており、その湾曲部分６１は脱水縮合反応に適した温度範囲に保持されている。

なお、キャピラリー５５，５６，６０は、第１溶液及び第２溶液や生成物及び中間物などと反応しない不活性物質を素材とする。

前述されたキャピラリー５５が、本発明における第１微小流路に相当し、キャピラリー５６が、本発明における第２微小流路に相当し、キャピラリー５８，６０が、本発明における第３微小流路に相当する。つまり、第２変形例にかかるマイクロリアクタ４０は、本発明における第３微小流路を形成するキャピラリー４５の下流側に、本発明における第１微小流路、第２微小流路及び第３微小流路の組み合わせが直列に接続された二段構造のものである。

本変形例においても、前述された第２実施形態と同様の３つのステップにより、キャピラリー４５においてペプチドポリマーが生成され、生成されたペプチドポリマーがキャピラリー４５からジョイント５９を介してキャピラリー６０へ流出される。

キャピラリー６０へ流入したペプチドポリマーは、キャピラリー５８から流出された第１溶液及び第２溶液と接触されて脱水縮合反応が生じ、さらに重合される。このようにキャピラリー４５から流出されたペプチドポリマーに対して、さらにペプチドモノマー及びペプチド用縮合剤を接触させて脱水縮合反応を行うことにより、マイクロリアクタ４０において所望の分子量のペプチドポリマーを合成することができる。

なお、前述された第１実施形態及び第２実施形態、並びに各々の変形例においては、第１溶液にペプチドモノマーとともにアミンが含まれるものとしたが、本発明においてアミンは必ずしも第１溶液に含まれる必要はなく、例えば、別の微小流路を通じて第３微小流路にアミンが注入されてもよい。

以下に、本発明の実施例が説明される。実施例は、本発明の一実施形態であり、本発明が実施例に記載されたものに限定されないことは言うまでもない。

〔第１実施例〕
（第１溶液）
トリエチルアミン（東京化成工業）２．２mmol（２１５μL）を加えたＤＭＳＯ溶液（和光純薬、脱水、安定剤不含）１ｍＬに、プロリル-4-ベンジルヒドロキシプロリル−グリシン（H-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OH、MW=343、ＮＳマテリアルズ製）１．０mmol（0.343g）を溶解して第１溶液を調整した。

（第２溶液）
ＤＭＳＯ溶液（和光純薬、脱水、安定剤不含）１ｍＬに、ジフェニルリン酸アジド（渡辺化学工業）１６６μＬを溶解して第２溶液を調整した。

（マイクロリアクタ）
前述された第１実施形態に係るマイクロリアクタ１０を用いた。なお、第１溶液及び第２溶液は、マイクロシリンジ（ハミルトン、１ｍＬ）にそれぞれ充填し、各マイクロシリンジをテフロン（登録商標）チューブ（ジーエルサイエンス、1/16"×0.5mm）を用いて第１導入口１１及び第２導入口１２にそれぞれ接続した。また、マイクロリアクタ１０の流出口にもテフロン（登録商標）チューブを接続し、そのテフロン（登録商標）チューブの末端をサンプル管と接続した。

（ペプチドポリマーの合成）
シリンジポンプ（kdScientific）を用いて、各マイクロシリンジから第１溶液及び第２溶液を２００μL／minの流速で全量を流出させ、サンプル管に反応液を回収した。マイクロリアクタ１０は、２０〜３０℃の温度範囲に保持された環境内に載置した。

（評価）
サンプル管に回収された反応液をそのままゲルろ過クロマトグラフ分析に供与した。日立LaCHromeシステムにゲルろ過用カラム（ナカライテスク5GPC-300（φ4.6×250mm）を連結したもの）を装着し、ＤＭＳＯ溶液を遊離液として０．２mL／minで流通させた。化合物の検出は示差屈折率計で行い、結果の解析は、プルランを標準とした構成曲線を用いて行った。その結果、数平均分子量２０万、分子量分布１．２のペプチドポリマーが生成されていることが確認された。

〔第２実施例〕
ペプチドモノマーとしてエラスチンペンタペプチド（H-Gly-Val-Gly-Val-Pro-OH、MW=379、ＮＳマテリアルズ製）１．０mmolを溶解して第１溶液とした他は、第１実施例と同様にして、ペプチドポリマーを合成した。その結果、数平均分子量１４万、分子量分布１．２のペプチドポリマーが生成されていることが確認された。

〔第３実施例〕
ペプチド合成用縮合剤としてHBTU（MW=３７９）０．３８ｇを溶解して第２溶液とした他は、第１実施例と同様にして、ペプチドポリマーを合成した。その結果、数平均分子量２０万、分子量分布１．２のペプチドポリマーが生成されていることが確認された。

〔第３実施例〕
ペプチド合成用縮合剤としてHBTU（MW=３７９）０．３８ｇを溶解して第２溶液とした他は、第２実施例と同様にして、ペプチドポリマーを合成した。その結果、数平均分子量１４万、分子量分布１．２のペプチドポリマーが生成されていることが確認された。

図１は、本発明の第１実施形態に係るマイクロリアクタ１０の外観構成を示す斜視図である。 図２は、マイクロリアクタ１０の構成を示す上面図である。 図３は、図２における領域IIIを示す拡大図である。 図４は、第１実施形態の変形例に係るマイクロリアクタ１０の構成を示す上面図である。 図５（Ａ）は、図４におけるＶＡ−ＶＡ切断面を示す断面図であり、図５（Ｂ）は、図４におけるＶＢ−ＶＢ切断面を示す断面図であり、図５（Ｃ）は、図４におけるＶＣ−ＶＣ切断面を示す断面図である。 図６は、本発明の第２実施形態に係るマイクロリアクタ４０の構成を示す模式図である。 図７は、第２実施形態の第１変形例に係るマイクロリアクタ４０の構成を示す模式図である。 図８は、第２実施形態の第２変形例に係るマイクロリアクタ４０の構成を示す模式図である。

符号の説明

２１・・・第１微小流路
２２・・・第２微小流路
２３・・・第３微小流路
２５・・・湾曲部（湾曲経路）
３３・・・分岐位置
３４・・・合流位置
４３，５５・・・キャピラリー（第１微小流路）
４４，５６・・・キャピラリー（第２微小流路）
４５，４９，５８，６０・・・キャピラリー（第３微小流路）
４８，６１・・・湾曲部分（湾曲経路）

Claims (5)

1. アミン存在下において、ペプチドモノマーを含む第１溶液とペプチド合成用縮合剤を含む第２溶液とを反応させてペプチドポリマーを製造する方法であって、
   第１溶液を第１微小流路に流通させる第１ステップと、
   第２溶液を第２微小流路に流通させる第２ステップと、
   第１微小流路から流出された第１溶液と第２微小流路から流出された第２溶液とを接触させながら第３微小流路に流通させてペプチドポリマーを生成する第３ステップと、を含むペプチドポリマーの製造方法。
2. 上記第３微小流路を、第１溶液及び第２溶液が流れる方向が湾曲する湾曲流路とする請求項１に記載のペプチドポリマーの製造方法。
3. 上記第３微小流路を二以上の流路に分岐させる分岐位置、及び分岐された流路を合流させる合流位置を設け、第３流路における第１溶液と第２溶液との界面の面積を、分岐位置の上流より合流位置の下流で広くする請求項１に記載のペプチドポリマーの製造方法。
4. 上記第１微小流路、上記第２微小流路、及び上記第３微小流路における溶液が流れる方向と直交する断面の最大寸法が、それぞれ１０μｍ〜２ｍｍである請求項１から３のいずれかに記載のペプチドポリマーの製造方法。
5. 得られたペプチドポリマーの分子量分布が、１．１〜１．３である請求項１から４のいずれかに記載のペプチドポリマーの製造方法。

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