JP2010017134A

JP2010017134A - Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤、活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法およびこれらの利用

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Publication number: JP2010017134A
Application number: JP2008180749A
Authority: JP
Inventors: Haruki Okamura; 春樹岡村; Shuji Kubo; 秀司久保; Fumi Ri; 文李
Original assignee: Hyogo College of Medicine
Current assignee: Hyogo College of Medicine
Priority date: 2008-07-10
Filing date: 2008-07-10
Publication date: 2010-01-28
Anticipated expiration: 2028-07-10
Also published as: US7749760B2; US20100009447A1; JP4281071B1

Abstract

【課題】非常に高い増殖効率で、抗腫瘍活性とサイトカイン産生能の高いＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることが可能なＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤、活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法およびこれらの利用を提供する。
【解決手段】少なくとも、ゾレドロネート等のビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含む、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤と増殖キット。また、該Ｔ細胞を含む医薬品。
【選択図】図１

Description

本発明は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤、活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法およびこれらの利用に関するものである。より詳しくは、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２、インターロイキン１８を含むＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を用いて刺激する活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法、当該活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞およびこれを含む医薬、並びにＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖キットに関する。

Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞（Ｖγ９Ｖδ２Ｔリンパ球）は、腫瘍組織適合性抗原に拘束されることなく腫瘍細胞の排除や、細胞内寄生性の細菌および寄生虫に対する防衛に当たることのできる細胞として注目されており、現在ヒト末梢血から得られるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いた癌治療の研究が進められている。しかし、ヒト末梢血中に存在するＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の数は少なく、免疫療法に用いるのに十分な数のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を得ることは容易ではない。

最近、骨粗鬆症の改善などに用いられているビスホスホネートが、がん細胞に直接作用して抗腫瘍作用を示すとともに、γδＴ細胞に作用してその増殖や活性化を促すことが明らかになった（非特許文献１）。このようにして増殖したγδＴ細胞は、強い抗腫瘍細胞活性を有することから、癌患者の自己血液より分離したγδＴ細胞をビスホスホネートを用いて体外で増殖させ、該リンパ球を体内に戻すという治療法の確立が試みられており、有望な結果が得られているという報告もある（非特許文献２）。また、補助因子としてインターロイキン２（以下「ＩＬ−２」と略記する）を用い、有機ピロリン酸誘導体に加えることによってＶγ２Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させる方法（特許文献１）や、ゾレドロネートに加えることによってＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させる方法（非特許文献３）も開示されている。
特許第４０２５０１９号公報（２００７年１０月１２日登録） Kunzmann et. al、Blood、97:2917-2918, 2000. Caccmo et. al、Curr. Med. Chem.、15:1147-1153, 2008. Int. J. Cancer 116, 94-99, 2005

しかしながら、従来の技術では、未だＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を十分に増殖させることはできていないという問題がある。例えば、ゾレドロネートとＩＬ−２をＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞に添加した場合のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の最大増幅率は約８００倍である（非特許文献３）。この方法では、増幅率が低いため、増殖させるべきＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を多く用意しなければならず、そのためには患者の末梢血を多く採取する必要がある。ゆえに患者に与える苦痛・負担が大きい。

このような状況の下、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いたがんの治療方法確立のため、より効率良くＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることが可能な技術が待望されている。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、従来法よりも非常に高い増殖効率で、抗腫瘍活性とサイトカイン産生能の高いＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることが可能なＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤、活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法およびこれらの利用を提供することにある。

本発明者らは、上記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、末梢血から分離したリンパ球を、ＩＬ−２、ビスホスホネートおよびインターロイキン１８（以下「ＩＬ−１８」と略記する）を添加した培地で培養することによって、従来法と比較して著しくＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞数が増加することを確認した。さらに得られたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、抗腫瘍活性とガンマ型インターフェロン（以下「ＩＦＮ−γ」と略記する）等のサイトカインの産生能が非常に高いことを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤は、上記課題を解決するために、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含むことを特徴としている。

ＩＬ−１８は、ＩＦＮ−γの誘導因子として岡村らによって１９９５年に発見され（Okamura et. al、Nature 378:88-91、1995.）、近年様々な生物学的作用を有することが明らかになってきているサイトカインである。本発明者らは、ＩＬ−１８が、活性化されたＣＤ８陽性Ｔリンパ球およびＮＫ細胞のアポトーシスを抑制することにより、それらの細胞のポピュレーションサイズを著しく増大させること、さらに活性化ＣＤ８陽性Ｔ細胞はＩＬ−１８レセプターβ鎖を強く発現し、ＩＬ−１８刺激により、ＰＩ３Ｋ／ＡｋｔやＢｃｌ２などの細胞生存を高める因子が増強されること（Li Wen et. al、J.Leukocyte Biol.、82、142-151、2007.）を報告している。

このように、ＩＬ−１８は細胞死を抑制し、細胞生存を高める性質を有するため、ビスホスホネートに対する補助因子として作用し、ビスホスホネートおよびＩＬ−２によるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効果を著しく高めることができるものと考えられる。それゆえ、上記構成によれば非常に効率的にＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることができる。

本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤では、上記ビスホスホネートがゾレドロネートであることが好ましい。ゾレドロネートはビスホスホネートの中でもＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖刺激能が高い化合物である。それゆえ、上記構成によればより効率的にＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることができる。

本発明にかかる活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を用いて刺激することを特徴としている。上述のように、ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を効率よく増殖させることができる。さらに、後述する実施例に示すように、増殖したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は抗腫瘍活性、サイトカイン産生能が高い。よって、上記構成によれば、優れた生理活性を備えたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を非常に効率よく生産することができる。

本発明にかかる活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を用いて刺激されてなることを特徴としている。また、本発明にかかる医薬は、本発明にかかる活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含むことを特徴としている。

後述する実施例に示すように、上記活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、従来のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞よりも優れたサイトカイン産生能を有し、抗腫瘍活性も高い。よって、上記活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含む医薬は、優れた抗がん作用、抗ウィルス作用、免疫応答の制御作用、細胞増殖・分化などの調節作用等を示すことができる。

本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖キットは、少なくとも、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞、ビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を備えることを特徴としている。上記構成によれば、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖に最低限必要とされるものが予めセットになっているため、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖を簡便に行うことができる。

本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤は、以上のように、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含むので、従来十分に増殖させることができなかったＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を非常に効率的に増殖させることができるという効果を奏する。さらに、増殖させたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞に、優れた抗腫瘍作用およびサイトカイン産生能を付与することができるという効果を奏する。

本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。

（１．Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤）
本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤は、ビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を必須成分として含んでいる。

ビスホスホネートとは、生理的に存在するピロリン酸のアナローグで、側鎖の違いにより窒素を含むものと含まないものに分類される。ビスホスホネートの種類としては、基本骨格の中央のＣに付く誘導体の種類により３種類に分類されている。すなわち、エチドロネートやクロドロネートのように側鎖の構造が簡単なもの、ゾレドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、レセドロネート、イバンドロネートのようにアミノ基を有するもの、インカドロネート、リセドロネート、ミノドロネートのように環状構造を有するものがある。

本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤に含まれるビスホスホネートの種類は特に限定されるものではない。また、１種類のみを用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。中でもＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖刺激能が高いため、ゾレドロネートであることが特に好ましい。ゾレドロネートは、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効果を有するとともに、がん細胞のファルネシルピロリン酸合成酵素を阻害することにより、ＩＰＰをがん細胞表面に表出させ、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞に対する抗原性を高めることが知られているため、特に好ましいといえる。

ビスホスホネートの形態は特に限定されるものではない。例えば、遊離のビスホスホネートであってもよいし、塩を形成していてもよく、ビスホスホネートまたはビスホスホネートの塩の水和物であってもよい。また、遊離のビスホスホネート、上記塩、上記水和物は、それぞれ単独で用いてもよいし、適宜混合して用いてもよい。ビスホスホネートの塩としては、特に限定されるものではないが、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などを挙げることができる。

ＩＬ−２は、Ｔ細胞増殖因子として知られており、ビスホスホネートの補助因子として用いられる。ＩＬ−１８もビスホスホネートの補助因子として用いられるが、ＩＬ−１８は細胞死を抑制し、細胞生存を高める性質を有するため、ビスホスホネートにＩＬ−２のみを作用させる場合よりも、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を著しく増殖させることができるものと考えられる。

γδＴ細胞は、δ鎖の違いによってＶδ１Ｔ細胞、Ｖδ２Ｔ細胞、Ｖδ３Ｔ細胞の３つの亜分画に分類される。ヒト末梢血中に存在し、ビスホスホネートとの反応しうるのはＶδ２Ｔ細胞に含まれるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞であるため、本発明ではＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が用いられる。

本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤は、ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を混合することによって調製することができる。ビスホスホネートの濃度としては、特に限定されるものではないが、０．５μＭ以上５．０μＭ以下であることが好ましい。ＩＬ−２の至適濃度は特に存在しないが、ビスホスホネートが上記濃度である場合に、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ用いれば十分である。ＩＬ−１８についても至適濃度は特に存在しないが、ビスホスホネートが上記濃度である場合に、５０ｎｇ／ｍｌ用いれば十分である。

ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を最終濃度が上記濃度となるように培養液に添加する場合、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の濃度は、特に限定されるものではないが約５〜1０×１０^３個／ｍｌであることが好ましい。例えば、ＰＢＭＣ５〜１０×１０^５個／ｍｌには、当該ＰＢＭＣ中には約５〜1０×１０^３個／ｍｌのＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が含まれる。上記混合を行う方法は特に限定されるものではない。例えば、水や従来公知の培地中にビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を上記濃度となるように添加し、従来公知のスターラー等を用いて混合することによって行うことができる。

本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤は、ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８のみからなっていてもよいが、ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８によるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖効果を妨げない限り、さらにその他の成分を含んでいても構わない。例えば、ＩＬ−１５のような他の補助因子、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の培養に必要な培地、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、保存剤、安定剤、乳化剤、浸透圧調整剤、基剤などの添加成分を必要に応じて使用することができる。本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤は、上記添加成分を用いて、通常の製剤化技術によって製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、坐剤、クリーム剤、軟膏剤、水溶剤、乳剤、油性剤、もしくは懸濁剤などの固体または液体の剤型として使用することができる。

これらの添加成分の例としては、ヒトＡＢ型血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地、グルコース、乳糖、澱粉、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、流動パラフィン、ポリビニルアルコール、植物油、グリセリン脂肪酸エステル、ポリアルキレングリコール等を挙げることができる。

Ｖδ２Ｔ細胞に含まれるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、ヒト末梢血中に存在し、強い抗腫瘍作用を有するため、ガン治療用のγδＴ細胞として有望であるが、絶対数が非常に少ないため、効率的な増殖法が待望されている。本発明にかかる上記増殖剤は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞と接触させることによって、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を刺激して著しく増殖させることができ、後述する実施例では、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の数を、個人差はあるものの、約３００〜３０００倍に増殖させることに成功している。一方、従来のゾレドロネートとＩＬ−２とを用いる増殖法ではＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の数を最大８００倍にしか増殖させることができていない（非特許文献３）。

それゆえ、本発明にかかる増殖剤は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞をがん治療用細胞として利用する上で非常に有用であるといえる。また、（２．）で述べるように、本発明にかかる上記増殖剤を用いて増殖させたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、単に増殖率が高いだけでなく、非常に強い抗腫瘍作用およびサイトカイン産生能を獲得することができる。このことからも、本発明にかかる上記増殖剤は非常に有用性が高いといえる。

（２．活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法、活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞および活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含む医薬、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖キット）
本発明にかかる活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を用いて刺激することによって、活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞、すなわち強い抗腫瘍作用およびサイトカイン産生能を有するＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を得る方法である。

刺激する対象となるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、従来公知の方法によって調製することができる。例えば、ヒトの末梢血やヒト末梢血単核球を採取し、抗γδＴＣＲ抗体や抗Ｖγδ２Ｔ抗体を結合させたマグネティックビーズを作用させ、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を分離することができる。ただし、必ずしも分離されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を用いる必要はない。例えば、ヒト血液、ヒトリンパ液、ヒト末梢血単核球等を少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を用いて刺激した後に、上記マグネティックビーズを用いる方法等によって活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を分離してもよい。

上記刺激は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞と、ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８とを接触させることによって行うことができる。接触させるための方法は特に限定されるものではない。例えば、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖に好適な従来公知の培地（例えば５％のヒトＡＢ型血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地）中にＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞、ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加し、ＣＯ_２インキュベータ等の従来公知の培養装置中で培養することによって上記接触を行うことができる。培養温度、培養時間はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることができれば特に限定されるものではないが、通常、摂氏３７℃、５％ＣＯ_２存在下で培養し、３−５日おきに新鮮な培地とビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８とを追加しながら１０−１４日間培養することが好ましい。

ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８は、それぞれを別々に培地に添加してもよいし、（１．）で説明したように、混合された状態の増殖剤として添加してもよいし、製剤化された増殖剤として添加してもよい。また、例えばＩＬ−１５のような他の補助因子も添加してもよい。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞と、ビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８が接触することによって、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞が特異的に刺激され、非常に高い増殖率で増殖するとともに、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の抗腫瘍作用、サイトカイン産生能の誘導・増強が促され、強い抗腫瘍作用およびサイトカイン産生能を有するＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞である活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞が産生される。なお、ビスホスホネート、ＩＬ−２、ＩＬ−１８の濃度、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の使用量は（１．）で説明したとおりである。

本発明にかかる活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞と、従来の方法で刺激されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞との構造上の相違点は今のところ明らかとなっていないが、本発明にかかる活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、後述する実施例に示すように、強い抗腫瘍作用を示すとともに、従来の方法で刺激されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞よりも非常に強いサイトカイン産生能を示すことができる。例えば、後述する実施例では、ゾレドロネートおよびＩＬ−２を用いて刺激した場合と比べ、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ），顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）について非常に高い産生能を示したことが確認されている。

このように、上記活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、優れた抗腫瘍作用およびサイトカイン産生能を有するため、本発明には、上記活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含む医薬も含まれる。

上記医薬は、上記活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のみからなっていてもよいし、他の成分として、例えば（１．）で説明した添加成分を含んでいてもよい。上記医薬は、ヒトに投与することによってその抗腫瘍作用およびサイトカイン産生能を発揮することができる。投与方法としては、局所への注射、静脈注射、経皮吸収などの方法を取ることができる。

上記医薬は、抗腫瘍作用およびサイトカイン産生能を有するため、がんの治療用医薬として好適に用いることができる。がんとしては特に限定されるものではなく例えば、中皮腫、骨肉腫、腎臓がん、前立腺がん、扁平上皮がん、肺がん、メラノーマ、すい臓がん、胃がん、肝臓がんなど、従来公知の種々のがんに対して適用することができる。また、上記医薬はサイトカイン産生能を有するため、抗ウィルス作用、免疫応答の制御作用、細胞増殖・分化などの調節作用等を示すことができる。よって、これらの作用が治癒に有効な疾病、例えば、マラリア、結核等の難治性感染症に対しても適用可能である。

本発明の利用形態の一例として、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖キットを挙げることができる。このＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖キットの具体例としては、少なくとも、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞、ビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を備えていればよく、必要に応じて、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を培養するための培地や、培養プレート等の実験用素材を添付してもよい。

なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

（実施例１：Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖）
健康な成人より末梢血を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ-Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心法を用いて（条件：室温（摂氏２５℃）で、スイングローターＴＳ−７（トミー精工）を用い、２０００ｒｐｍ、２０分間遠心）、末梢血単核球（以下「ＰＢＭＣ」と略記する）を分離した。

５％のヒトＡＢ型血清を含有するＰＲＭＩ１６４０培地にゾレドロネート（最終濃度１μＭ）、ＩＬ-２（最終濃度１０ｎｇ/ｍｌ）、ＩＬ-１８（最終濃度１００ｎｇ/ｍｌ）を添加した培養液に、上記ＰＢＭＣを５〜１０×１０^５個／ｍｌとなるようにサスペンドした。図２（ｅ）に示すように、当該ＰＢＭＣ中に、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は約１〜５％含まれている。

ＣＯ_２インキュベータ中で、５％ＣＯ_２存在下、摂氏３７℃で培養し、細胞が過剰増殖しないよう（培養液の色が黄色くならないよう）３−５日おきに、培養開始時に用いた上記培地の３−５倍量の新鮮な培地に、上記の濃度になるようにゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加した培養液を追加しながら１４日間培養した。なお、ゾレドロネートは、Novartis Pharma社製、ＩＬ−２はR＆D Systems社製、ＩＬ−１８はGlaxoSmithKline社製のものを用いた。

増殖したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の解析は、細胞表面で発現されている抗原に対する標識抗体を用いてフローサイトメトリー法によって解析し（使用装置： BECTN DICKINSON, FACSCalibur）、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞が細胞全体に占める割合と全体の細胞数から、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の絶対数を算出した。

対照として、同様の実験をゾレドロネート（１μＭ）およびＩＬ-２（１０ｎｇ/ｍｌ）を用いて行った。

また、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖に対するＩＬ−１８の役割を確認するために、ゾレドロネート（１μＭ）およびＩＬ-２（１０ｎｇ/ｍｌ）を加えた培地に抗ＩＬ−１８受容体抗体（R＆D Systems社）を２．５μｇ／ｍｌの濃度で加え、内在性のＩＬ−１８をブロックした。

結果を図１、２に示す。図１は、ＩＬ−２の存在下、ゾレドロネートで刺激したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖に対する外因性ＩＬ−１８の効果を示すものである。図中、「ＺＯＬ」とはゾレドロネートを、「aIL-18R Ab」は抗ＩＬ−１８受容体抗体を示している。縦軸の「γδＴ細胞の絶対数」はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の絶対数を表す。

図１のＡは、６２歳の男性の末梢血を用いた場合のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖結果を示すものであり、図１のＢは、３１歳の女性の末梢血を用いた場合のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖結果を示すものである。

ヒト末梢血より分離したＰＢＭＣを、ゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加した培養液中で培養すると、図示しないが、ＰＢＭＣの総数は、個人差はあるが約４０−１００倍に増加し、その中でもＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の数は著しく増加した（図１、図２）。一方、図示しないが、ゾレドロネートとＩＬ−２のみを添加した培養液中で培養した場合は、ＰＢＭＣの総数は１０倍程度にしか増加しなかった。

図１のＡに示す実験系において、培養開始時（Ｄ０）におけるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は約２．５×１０^３個であり、培養１４日後（Ｄ１４）では、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は約４８×１０^５個に増殖していた。また、図１のＢに示す実験系において、培養開始時（Ｄ０）におけるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は約６×１０^３個であり、培養１４日後（Ｄ１４）では、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は約７５０×１０^５個に増殖していた。

このようにゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加した培養液中で培養した場合、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の数は、少なく見積もっても約３００倍から３０００倍に増加することが確認された。よって、被験者によって増殖率に違いは見られるものの、ゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加した場合は、ゾレドロネートとＩＬ−２のみを添加した場合と比べて非常に高い増殖率となることが明らかとなった。

また、図１において点線で表されるグラフに示されるように、抗ＩＬ−１８受容体抗体を添加することによって、ＩＬ−１８はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞に作用することができなくなるため、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖は殆ど見られなくなっている。このことからも、ＩＬ−１８がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖に重要な役割を果たしていることが分かる。

なお、ＩＬ−１８およびゾレドロネートのみを添加した培養液中ではＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の数の増加は観察されず、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖にはＩＬ−２が不可欠であることが示された。さらに、ＩＬ−２とＩＬ−１８のみを添加した培養液中でも有意なＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の数の増加が見られたが、その数はゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加した培養液中で培養した場合に比べてはるかに少なかった。これらの結果は治療に用いられる十分な数量のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を得るためには、従来のようにＩＬ−２とゾレドロネートとを培養液に添加するのに加えて、さらにＩＬ−１８を添加することが有用であることを示している。

図２は、ＰＢＭＣの細胞構成をフローサイトメトリーで解析した結果を示すものである。図２中、点線より左側の（ａ），（ｂ），（ｅ），（ｈ）がゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８とともに培養する前（以下単に「培養前」という）のＰＢＭＣを表し、点線より右側の各グラフはゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８とともに培養後のＰＢＭＣを表している。

図２の（ａ）は、培養前のＰＢＭＣにおいてαβ型のＴ細胞が５６％を占めることを示している。図中の丸囲みした部分がαβ型のＴ細胞である。図２の（ｂ）は、培養前のＰＢＭＣにおいてＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が１．４〜５％を占めることを示している。図２の（ｃ）は、ゾレドロネートおよびＩＬ−２とともに１４日間培養後、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞がＰＢＭＣ全体の７０％を占めるようになったことを示し、図２の（ｄ）はゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８とともに１４日間培養後、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞がＰＢＭＣ全体の４５％を占めるようになったことを示している。

上述のように、ヒト末梢血より分離したＰＢＭＣを、ゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加した培養液中で培養した場合のＰＢＭＣの総数は培養前の約４０−１００倍に増加しており、ゾレドロネートとＩＬ−２のみを添加した培養液中で培養した場合のＰＢＭＣの総数は培養前の約１０倍しか増えていないので、図２の（ｃ）と（ｄ）とでは、（ｄ）の方がＰＢＭＣの総数が非常に多い。よって、図２の（ｃ）における７０％と、図２の（ｄ）における４５％とでは、後者の方が非常に数が多いことが分かる。よって、ゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を用いた場合の方が、ゾレドロネートとＩＬ−２のみを用いた場合よりも非常に効率よくＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることができることが分かる。

図２の（ｅ）は培養前のＰＢＭＣにおいてＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が１〜５％を占めることを示している。図２の（ｆ）は、ゾレドロネートおよびＩＬ−２とともに１４日間培養後、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞がＰＢＭＣ全体の７５％を占めるようになったことを示し、図２の（ｇ）はゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８とともに１４日間培養後、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞がＰＢＭＣ全体の５１％を占めるようになったことを示している。

図２の（ｈ）は、培養前のＰＢＭＣにおいてαβ型のＴ細胞が５６％、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞が１．５％を占めていたことを示している。図２の（ｉ）はゾレドロネートおよびＩＬ−２とともに１４日間培養後、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞がＰＢＭＣ全体の６５％を占めるようになり、αβ型のＴ細胞が１３．５％に減少したことを示し、図２の（ｊ）はゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８とともに１４日間培養後、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞がＰＢＭＣ全体の８０％を占めるようになり、αβ型のＴ細胞が５．８％に減少したことを示している。

このように、ＰＢＭＣをゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８とともに培養した場合、ゾレドロネートおよびＩＬ−２とともに培養した場合と比べて、非常に効率よくＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させることができることが分かった。

（実施例２：活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の生理作用）
（実施例２−１：表面抗原ＮＫＧ２Ｄの発現）
上記のようにＩＬ−２とゾレドロネートとＩＬ−１８とを用いて刺激し、増殖させたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞）についてフローサイトメトリーを用いて解析したところ、抗腫瘍作用に重要な役割を持つＮＫＧ２Ｄを強く発現していた。それゆえ、強い抗腫瘍作用をもつことが示唆された。図３は、活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの発現を示すものである。図３の（ａ）は図２の（ｇ）と同じであり、丸囲みした部分はＶγ９Vδ２Ｔ細胞である。図３の（ｂ）より、ＩＬ−２とゾレドロネートとＩＬ−１８とを用いて刺激したＶδ２Ｔ細胞がＮＫＧ２Ｄを強く発現していることが分かる。

（実施例２−２．腫瘍細胞に対する殺細胞活性）
腫瘍細胞に対する殺細胞活性は、様々な腫瘍細胞（ターゲット）とＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（エフェクター）とを様々な比率で一晩共培養後、放出されたセリンエステラーゼをＢＬＴ法によって測定し、溶解した標的腫瘍細胞の割合を計算することにより評価した。中皮腫から樹立した３種類の腫瘍細胞（ＭＥＳＯ−１、ＭＥＳＯ−４，ＭＳＴＯ-２１１Ｈ）、正常中皮細胞であるＭｅｔ５Ａ、骨肉腫より樹立した細胞に対し、エフェクター：ターゲットの細胞数比１：１、３：１、１０：１で、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の殺腫瘍細胞活性を測定した。

図４は、ＭＥＳＯ−１、ＭＳＴＯ-２１１Ｈをターゲットとした場合のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の殺細胞活性を示すものである。図中、横軸はエフェクターを示し、コントロールは未刺激のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞、「ＩＬ−２ＺＯＬ」は、ＩＬ−２およびゾレドロネートを用いて刺激したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞、「ＩＬ−２ＩＬ−１８」は、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を用いて刺激したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞、「ＩＬ−２ＺＯＬＩＬ−１８」は、ＩＬ−２、ゾレドロネートおよびＩＬ−１８を用いて刺激したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を表している。なお、図４の凡例は、白四角がＥ（エフェクター）：Ｔ（ターゲット）＝１：１、灰色四角がＥ：Ｔ＝３：１、黒四角がＥ：Ｔ＝１０：１となっており、コントロールのみがこの凡例と一致しているが、各試験区においてもコントロールと同様、３本の棒グラフは、左からＥ：Ｔ＝１：１、Ｅ：Ｔ＝３：１、Ｅ：Ｔ＝１０：１を示している。

ゾレドロネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８を添加した培養液中で培養したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞も、ゾレドロネートとＩＬ−２のみを添加した培養液中で培養したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞も、強い殺腫瘍細胞活性を示したが、両者に目立った違いはなかった。なお、図示しないが、いずれのエフェクターも、対照の正常中皮細胞として用いたＭｅｔ５Ａに対してはほとんど殺細胞活性を示さなかった。

（実施例２−３：ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦの産生）
様々な条件で培養したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の培養液の上清について、ＥＬＩＳＡ法を用いてサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）産生を測定した。図５は、ゾレドロネートとＩＬ−２とＩＬ−１８とを加え、１週間培養したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞によるＩＦＮ‐γおよびＴＮＦαの産生を示すものである。

図５に示すように、培養開始１週間後の培養上清中に含まれるサイトカインの量は、ゾレドロネートとＩＬ−２のみを加えて培養したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞に比べて、ゾレドロネートとＩＬ−２とＩＬ−１８とを加えて培養したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞）の方がＩＦＮ−γについては約１００倍、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）については４倍くらい多かった。

このことはゾレドロネートとＩＬ‐２とＩＬ‐１８とを加えて２週間培養して増殖したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞）を、抗γδＴＣＲ抗体を結合させたマグネティックビーズを用いて９５％以上にまで純化したものをＩＬ‐１８存在下と非存在下で再刺激し、２４時間後の上清について比べた場合も同様であり、ＩＬ‐１８存在下で培養したものの方がＩＦＮ‐γおよびＴＮＦαの産生がはるかに多かった。

なおＧＭ‐ＣＳＦについてもＩＬ‐１８を加えた方が１０倍ほど産生量が増えた（データ提示はせず）。このようにＩＬ‐１８はＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖を促進するばかりでなく、ＩＦＮ−γやＴＮＦの産生能を著しく高めることができ、がん細胞の標的化の作用を持つと考えられる。

（実施例２−４：ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果）
ｉｎｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果の測定は、ＮＯＤｓｃｉｄマウスにヒト中皮腫由来腫瘍細胞を２ｘ１０^６個皮下に移植し、腫瘍の直径が約０．５ｃｍになったところで１０^７個のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を約１週間に１度の割合で尾静脈より注射し、適当な間隔で腫瘍の大きさを測定することで評価した。なお、腫瘍の大きさ（体積）は、（腫瘍の長径）×（腫瘍の短径）^２×π÷６により計算した。図６は、ｉｎｖｉｖｏにおける活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の抗腫瘍効果の測定結果を示すものである。

Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞としては、実施例１に記載した方法でゾレドロネート（１μＭ）、ＩＬ-２（１０ｎｇ/ｍｌ）およびＩＬ-１８（１００ｎｇ/ｍｌ）で刺激したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞）を用いた。図６では、上記腫瘍細胞と活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞とを用いたときの結果を黒丸のポイントで表示しており、凡例では「活性化γδＴ細胞」と示している。

また、ゾレドロネートは、ファルネシルピロリン酸合成酵素の作用を阻害することにより、がん細胞の細胞質内にイソペンテルピロリン酸（ＩＰＰ）等を蓄積し、がん細胞のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞に対する感受性を高めることができる。そこで、１ｍＭの濃度で生理食塩水に溶かしたゾレドロネート溶液０．２ｍｌを予め腹腔内投与しておいて、６−１６時間後に１０^７個の活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を尾静脈より注射した。このようにして得られた腫瘍細胞を用いたときの結果は図６において黒三角のポイントで表示しており、凡例では「ＺＯＬ＋活性化γδＴ細胞」として表示している。

なお、コントロールとしては、ゾレドロネート、ＩＬ−２およびＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の代わりに０．２ｍｌの生理食塩水をそれぞれ腹腔内および尾静脈より注射して得られた腫瘍細胞を用いた。

図６に示すように、ゾレドロネートとＩＬ−２とＩＬ−１８とを添加した培養液中で培養したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞）を投与することにより、腫瘍移植２５日後の腫瘍の大きさは対照群に比べ約半分となり、腫瘍細胞の増加が強く抑制されていることが示された。このことから、ＩＬ‐１８を用いて効率よく増殖させたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞）は生体内でも強い抗腫瘍活性を保っていることが示され、中皮腫などの治療に用いることができる可能性が示された。

以上の観察結果から、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞をビスホスホネート、ＩＬ−２およびＩＬ−１８で刺激することにより、極めて効率よくＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増加させることが可能であることが分かった。しかも、このようにして得られたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞）は、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン産生能も高く、in vitro（試験管内）でも in vivo（生体内）でも、様々な腫瘍細胞に対して強い殺細胞活性を保つ。このように、ビスホスホネート、ＩＬ−２に加えて、さらにＩＬ−１８を用いることにより、がんの治療に用いられる必要な量のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を患者の自己リンパ球から従来より簡便に生産することが可能となる。

本発明にかかるＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤は、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含んでいるため、従来効率的な増殖法がなかったＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を飛躍的に増殖させることができる。それゆえ、製薬業等の生化学関係の産業全般に好適に用いることができる。

ＩＬ−２の存在下、ゾレドロネートで刺激したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖に対する外因性ＩＬ−１８の効果を示すものである。ＰＢＭＣの細胞構成をフローサイトメトリーで解析した結果を示すものである。活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞上のＮＫＧ２Ｄの発現を示すものである。ＭＥＳＯ−１、ＭＳＴＯ-２１１Ｈをターゲットとした場合のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の殺細胞活性を示すものである。ゾレドロネートとＩＬ−２とＩＬ−１８とを加え、１週間培養したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞によるＩＦＮ‐γおよびＴＮＦαの産生を示すものである。ｉｎｖｉｖｏにおける活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の抗腫瘍効果の測定結果を示すものである。

Claims

少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を含むことを特徴とするＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖剤。
上記ビスホスホネートがゾレドロネートであることを特徴とする請求項１に記載の増殖剤。
Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を用いて刺激することを特徴とする、活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の製造方法。
少なくともビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８によって刺激されてなることを特徴とする活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞。
請求項４に記載の活性化Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を含むことを特徴とする医薬。
少なくとも、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞、ビスホスホネート、インターロイキン２およびインターロイキン１８を備えることを特徴とするＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖キット。