JP2009537536A - 眼の血管形成および黄斑変性に対するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の刺激 - Google Patents

Abstract

眼の血管形成および新生血管形成を治療または予防するための方法および組成物が提供される。ＴＬＲ３受容体もしくはＴＬＲ７受容体、Ｔｒｉｆ、またはＩＬ−１０もしくはＩＬ−１２の刺激因子の投与は、眼の血管形成を阻害する。さらに、全ｓｉＲＮＡ（標的化および非標的化の両方）は、眼の血管形成を阻害できる。

Description

［継続出願データ］
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００６年５月１５日に出願された米国仮出願第６０／８００，７４２号の利益を主張するものである。

［発明の分野]
本発明は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）作用の刺激による眼の血管形成の抑制に関する。

黄斑は、中心視野を担当している網膜の一部である。加齢性黄斑変性は、黄斑内の組織が劣化すると発生する慢性眼疾患である。黄斑変性は、中心視野には影響を及ぼすが、周辺視野には影響を及ぼさない。黄斑変性は、６０歳以上の人々における重度の失明の主要な原因である。

加齢性黄斑変性には、乾性および湿性の２つの形態がある。乾性黄斑変性は、黄斑変性の中で最も一般的なタイプであり、黄斑の細胞が緩徐に崩壊し始めると発生する。網膜色素上皮（ＲＰＥ）と網膜を支持するブルッフ膜との間の網膜の下で、「ドルーゼ」と呼ばれる黄色沈着物が形成される。ドルーゼ沈着物は、ＲＰＥ内の機能低下した細胞代謝に関連する残屑である。最終的には、ドルーゼ沈着物に関連する黄斑領域の損傷が起こり、結果として中心視野の消失が起こる。

湿性黄斑変性は、黄斑の背部で異常な血管が成長した場合に発生する。これらの血管は脆弱であり、液体や血液を漏出させることがあり、黄斑の瘢痕化を生じさせ、急速な重度損傷の可能性を生じさせる。ブルッフ膜は、通常はドルーゼ沈着物の近くで崩壊する。これは、新規な血管の成長、または新血管形成が発生する場所である。中心視野は短期間の内に、時には数日以内に歪むか、または完全に消失することがある。湿性黄斑変性は、加齢性黄斑変性の症例の約１０％の原因となっているが、法的盲の症例の約９０％を占めている。

本発明は、眼の血管形成を阻害する方法に関する。１つの態様では、本方法は、網膜細胞または脈絡膜細胞を、ｔｏｌｌ様受容体刺激有効量の、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７を含むｔｏｌｌ様受容体の活性を刺激する化合物に曝露する工程を含む。また別の態様では、本方法は、網膜もしくは脈絡膜細胞を有効量のＩＬ−１０および／またはＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−γに曝露する工程を含む。

本発明は、眼の血管形成を阻害するための組成物にさらに関する。１つの態様では、本組成物は、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆの活性を刺激する化合物を含む。また別の態様では、本組成物は、ＩＬ−１０および／またはＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−γを含む。

本発明は、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆと相互作用する化合物についてスクリーニングするための方法にさらに関する。１つの態様では、本方法は、ＴＬＲ３もしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはそれらの結合フラグメントを試験化合物と接触させる工程と、ＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはそれらの結合フラグメントと試験化合物との間で複合体が形成されるかどうかを決定する工程とを含む。また別の態様では、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆと相互作用すると同定された試験化合物が眼の血管形成を阻害する能力についてアッセイされる。

本発明のその他の系、方法、特徴および利点は、以下の図面および詳細な説明から当業者に明白であるか、それらを吟味すれば明白になる。すべてのそのような追加の系、方法、特徴および利点は本説明の中に含まれ、本発明の範囲内に含まれ、添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。

ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ｐｏｌｙ ｄＩ：ｄＣおよびロキソリビンが脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示す。 種々のｓｉＲＮＡが脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示す。 種々のｓｉＲＮＡが、野生型、ＴＬＲ３−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウス、およびインターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ１）−／−マウスにおける脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示す。 ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃおよびロキソリビンが、野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜におけるＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生に及ぼす作用を示す。 ＩＬ−１０およびＩＬ−１２が脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示す。 ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃおよびロキソリビンが、野生型マウス、ＩＬ−１０−／−マウスおよびＩＬ−１２−／−マウスにおける脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示す。 非標的化ｓｉＲＮＡおよび標的化ｓｉＲＮＡが野生型マウスおよびＴＬＲ３−／−マウスにおける脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示す。 Ｓｉｒｎａ−０２７（ＶＥＧＦＲ１に対するｓｉＲＮＡ）がＶＥＦＧＲ１チロシンキナーゼ−／−マウスにおける脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示す。 ＣＮＶの非標的化ｓｉＲＮＡ抑制がＴｒｉｆ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体ドメイン含有アダプター誘導性ＩＦＮ−β；Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体／耐性（ＴＩＲ）アダプタータンパク質）欠損性マウスにおいては無効にされることを示す。 ２−Ｏ’−メチル修飾非標的化ｓｉＲＮＡが硝子体内投与された場合にＣＮＶを抑制する能力を保持していることを示す。 ２−Ｏ’−メチル修飾非標的化ｓｉＲＮＡが腹腔内投与された場合にＣＮＶを抑制する能力を保持していることを示す。 非標的化ｓｉＲＮＡ（ＮＳ１ ｓｉＲＮＡ）がレーザー傷害後のマウスの網膜色素上皮／脈絡膜においてＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βを誘導しないことを示す。 非標的化ｓｉＲＮＡ（ＮＳ１ ｓｉＲＮＡ）がレーザー傷害後のマウスの網膜色素上皮／脈絡膜においてＩＦＮ−αおよびＩＬ−１２を誘導することを示す。 組換えマウスＩＦＮγが用量依存的にマウスにおける脈絡膜新生血管形成を減少させることを示す。 非標的化ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ ｓｉＲＮＡおよびＮＳ１ ｓｉＲＮＡ）がＩＦＮα／βＲ−／−マウス（ＩＦＮＡＲ１−／−マウスとしても知られている）における脈絡膜新生血管形成を抑制するが、ＩＦＮγ−／−マウスまたはＩＬ−１２−／−マウスにおいては抑制しないことを示す。 長さの短い非標的化ｓｉＲＮＡ（５＋２ヌクレオチドおよび１１＋２ヌクレオチド）もまたレーザー誘導性の脈絡膜新生血管形成を抑制することを示す。 野生型マウスＲＰＥ／脈絡膜細胞懸濁液のフローサイトメトリー実験を示す。 野生型マウスＲＰＥ／脈絡膜細胞懸濁液のフローサイトメトリー（透過化を行わずに実施した）実験を示す。 組換え可溶性ＴＬＲ３を用いたプレインキュベーションが、レーザー傷害直後に硝子体液中に注入されたｓｉＲＮＡ（ＮＳ１）による、野生型マウスのＣＮＶの抑制を無効にすることを示す。 マウスＴＬＲ３に対する中和ラット抗血清は、レーザー傷害直後に硝子体液中へ注射されたｓｉＲＮＡ−ＮＳ２によって誘導された野生型マウスにおける脈絡膜新生血管形成の抑制を無効にしたが、コントロールラット血清は無効にしなかったことを示す。

Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、微生物の保存構造を認識することによって先天性免疫に関与するＩ型膜貫通タンパク質である。Ｔｏｌｌ様受容体は、適応的免疫応答を活性化するのに役立ち、それによって先天性免疫応答および後天性免疫応答を結び付けることができる。ヒトでは１０個のＴＬＲ（ＴＬＲ１からＴＬＲ１０と称する）が同定され、各ＴＬＲは種々の微生物に関連する分子パターンに対して特異的である。本発明者らは、驚くべきことにＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆ（ＴＬＲ３に対するアダプタータンパク質）は、眼の血管形成を阻害できることを見出した。

本発明は、眼の血管形成および新生血管形成を治療および予防するための方法および組成物に関する。ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７の刺激因子の投与は、眼の血管形成を阻害する。さらに、ＴＬＲ３に対するアダプタータンパク質であるＴｒｉｆの刺激因子の投与も眼の血管形成を阻害する。眼の血管形成には、脈絡膜血管形成および網膜血管形成が含まれる。血管新生疾患を治療および／または予防する目的でＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆを刺激するための組成物および方法が提供される。さらに、脈絡膜新血管形成のための新規な治療標的および診断マーカーもまた提供される。

本発明では、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆの活性を刺激する任意の化合物を使用できる。そのような化合物には、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆへ直接的に結合する刺激性分子、例えば各々ＴＬＲ３アゴニストもしくはＴＬＲ７アゴニストもしくはＴｒｉｆアゴニスト、またはＴＬＲ３受容体もしくはＴＬＲ７受容体もしくはＴｒｉｆに結合してそれらを活性化する抗体が含まれる。

ＴＬＲ３に対する天然アゴニストには、ウイルス二本鎖ＲＮＡが含まれる。本発明によると、ＴＬＲ３活性を刺激するためにＴＬＲ３の任意の天然アゴニストを使用できる。さらに、ＴＬＲ３活性を刺激するために他のリガンドも使用できる。そのようなリガンドには、配列特異的（または標的化）二本鎖ＲＮＡおよび配列非特異的（または非標的化）二本鎖ＲＮＡが含まれる。二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、または任意の他の二本鎖ＲＮＡであってよい。

二本鎖ＲＮＡがＴＬＲ３活性を刺激する方法に関する任意の理論または作用機序に縛られることは意図していないが、本発明者らは、二本鎖ＲＮＡがＴＬＲ３活性を刺激する場合に細胞表面の外側に作用すると思われることを観察によって認めた。詳細には、二本鎖ＲＮＡは、眼の血管形成を阻害するために、一般に予測されるように細胞内部でのＲＮＡ干渉を通して機能するのではなく、むしろ細胞表面のＴＬＲ３を活性化すると思われる。そこで、本発明の実施形態は、ｓｉＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡを介する細胞表面ＴＬＲ３の活性化によって、眼の血管形成、例えば脈絡膜新生血管形成を阻害する方法を含む。

本発明において使用するためのｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉の分野における標準方法にしたがって設計される。ｓｉＲＮＡの細胞内への導入は、発現ベクターを用いるトランスフェクション、合成ｄｓＲＮＡを用いるトランスフェクション、または任意の他の適切な方法によって行われてもよい。好ましいのは、発現ベクターを用いたトランスフェクションである。

本発明によってｓｉＲＮＡを送達するために使用できる発現ベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターが含まれる。発現ベクターは、特定遺伝子またはナンセンス配列に対して特異的かどうかに関わらず、標的遺伝子の一部分をコードする配列または任意の他の配列が含まれる。遺伝子配列は、トランスフェクトされた宿主内で転写されると、自己相補的塩基の存在に起因してＲＮＡ配列がヘアピン構造を形成するように設計される。細胞内でのプロセッシングは、ループを除去してｓｉＲＮＡ二本鎖を形成させる。二本鎖ＲＮＡ配列は、３０ヌクレオチド塩基未満であるべきであり、好ましくは、ｄｓＲＮＡ配列は１９〜２５塩基長であり、より好ましくは、ｄｓＲＮＡ配列は２０ヌクレオチド長である。

発現ベクターは、標的遺伝子の合成を増強するために１つ以上のプロモーター領域を含むことができる。使用できるプロモーターには、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、マウスＵ６遺伝子のプロモーター、およびヒトＨ１遺伝子のプロモーターが含まれる。

発現ベクターを用いたトランスフェクションを促進するためには、１つ以上の選択マーカーを含めることができる。選択マーカーは、発現ベクター内に含めることができ、または個々の遺伝要素上に導入することができる。例えば、細菌性ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子は、選択マーカーとして使用することができ、上述した遺伝子を用いてトランスフェクトされた細胞を選択するために、細胞はハイグロマイシンの存在下で培養される。

合成ｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによる遺伝子抑制を提供するために細胞内へ導入することもできる。合成ｄｓＲＮＡは、長さが３０塩基対未満である。好ましくは、合成ｄｓＲＮＡは、長さが１９〜２５塩基対である。より好ましくは、ｄｓＲＮＡは、任意に２ヌクレオチドの３’オーバーハングを備える、長さが１９、２０または２１塩基対である。他の実施形態では、合成ｄｓＲＮＡは、任意で２ヌクレオチドの３’オーバーハングを備える、長さが５、７、９または１１塩基対であってよい。３’オーバーハングは、好ましくはＴＴ残基である。合成ｄｓＲＮＡは、裸のｄｓＲＮＡ、または１つ以上の２−Ｏ’−メチル基を含有するｄｓＲＮＡであってもよい。

合成ｄｓＲＮＡは、注射によって、作用物質、例えば陽イオン性脂質との複合体化によって、遺伝子銃を使用して、または任意の他の適切な方法によって細胞内に導入できる。

ＴＬＲ７の機能の刺激因子には、イミキモド（Ｒ−８３７）、レシキモド（Ｒ−８４８）、ロキソリビン、およびブロピリミンが含まれる。さらに、リガンドとして機能するため、ＴＬＲ７の機能の刺激因子である、一本鎖ＲＮＡまたはウイルスＲＮＡについての報告もある。ＴＬＲ７の機能のこれらの刺激因子はいずれも、本発明にしたがって使用できる。

ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆを刺激するための追加の化合物には、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆに特異的に結合する抗体が含まれる。

本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含むことが意図されている。本発明の抗体は、本発明のタンパク質もしくはポリペプチド、例えば、単離および／または組換え哺乳動物のＴＬＲ３もしくはＴＬＲ７もしくはＴｒｉｆまたはそれらの一部分、または合成分子、例えば合成ペプチドを含む適切な免疫原に対して生じさせることができる。

免疫抗原の調製、ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の製造は、任意の適切な技術を用いて実施できる。種々の方法が報告されている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０−５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，１７２，１２４号明細書；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２７，Ｓｕｍｍｅｒ ’９４），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｅｄｓ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），Ｃｈａｐｔｅｒ １１，（１９９１）を参照されたい）。一般に、ハイブリドーマは、適切な不死化細胞株（例えば、ＳＰ２／０などの骨髄腫細胞系）を抗体産生細胞と融合させることによって生成される。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節の抗体産生細胞は、当該抗原を用いて免疫された動物から入手される。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を用いて単離され、そして限界希釈法によってクローン化される。所望の特異性を備える抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択される。

一本鎖抗体、およびキメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化（ＣＤＲグラフト化）抗体、ならびに様々な種に由来する部分を含むキメラ一本鎖抗体またはＣＤＲグラフト化一本鎖抗体もまた、本発明および用語「抗体」に含まれる。これらの抗体の様々な部分は、従来の技術によって化学的に結合でき、または遺伝子組み換え技術を用いて隣接するタンパク質として調製できる。例えば、隣接するタンパク質を生成するためにキメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸を発現させることができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第０，１２５，０２３（Ｂ１）号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，３９７明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第０，１２０，６９４（Ｂ１）号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、欧州特許第０，１９４，２７６（Ｂ１）号パンフレット；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；およびＷｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００（Ｂ１）号明細書を参照されたい。さらにまた、霊長類化抗体に関するＮｅｗｍａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）、および一本鎖抗体に関するＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９４６，７７８号明細書およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）も参照されたい。

さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体または一本鎖抗体を含む抗体の機能的フラグメントもまた産生することができる。上記の抗体の機能的フラグメントは、それらが由来する全長抗体の結合機能および／または調節機能のうちの少なくとも１つを保持している。例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２を含むがそれらに限定されない哺乳動物のＴＬＲ３もしくはＴＬＲ７もしくはＴｒｉｆまたはそれらの一部分に結合できる抗体フラグメントは、本発明に包含される。そのようなフラグメントは、酵素的切断によって、または組み換え技術によって生成することができる。例えば、パパインまたはペプシンによる切断は、各々ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）_２フラグメントを生成できる。あるいは、抗体は、１つ以上の停止コドンが天然停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を用いて種々の短縮形を生成することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）_２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ_１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含めるように設計することができる。

抗イディオタイプ抗体もまた提供される。抗イディオタイプ抗体は、他の抗体の抗原結合部位に関連する抗原決定基を認識する。抗イディオタイプ抗体は、第２の抗体を生成するために使用される動物と同一種の動物、好ましくは同一系統の動物を免疫化することによって第２の抗体に対して調製できる。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号明細書を参照されたい。一本鎖、およびキメラ、ヒト化もしくは霊長類化（ＣＤＲグラフト化）、ならびにキメラ一本鎖もしくはＣＤＲグラフト化一本鎖の抗イディオタイプ抗体を調製することができ、これらは用語「抗イディオタイプ抗体」に含まれる。そのような抗体の抗体フラグメントもまた調製できる。

本発明者らは、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆの刺激による眼の血管形成の阻害が、少なくとも部分的に、ＩＬ１０および／またはＩＬ１２によって媒介されることもまた見出した。そこで、眼の血管形成は、ＩＬ１０および／またはＩＬ１２をそれを必要とする被験者に投与することによって阻害することもできる。ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆの刺激因子を投与するために本明細書に記載した方法もまた、通常、眼の血管形成を阻害するためのＩＬ１０および／またはＩＬ１２の投与にも適用できる。

哺乳動物のＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆに特徴的な少なくとも１つの機能の刺激を通しての、本発明による哺乳動物ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆの機能の調節は、眼の血管形成を阻害する有効かつ選択的な方法を提供する。ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆの１つ以上の刺激因子、例えば本明細書に記載したように同定された刺激因子は、眼の血管形成を阻害するために治療目的で使用できる。

そこで、本発明は、治療を必要とする個体における眼の血管形成を阻害する方法であって、そのような治療を必要とする個体にＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆの機能を刺激する化合物を投与する工程を含む方法を提供する。そのような個体には、加齢性黄斑変性を有する個体が含まれる。

本発明の方法は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスターおよびウマを含む任意の哺乳動物種において使用できる。好ましくはヒトである。

本発明の方法によると、１つ以上の化合物は、単独に、または他の薬物と組み合わせて、適切な経路によって対象へ投与することができる。有効量の化合物が投与される。有効量とは、投与条件下で所望の治療作用を達成するために有効な量、例えばＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆの機能を刺激し、それによって眼の血管形成を阻害するために有効な量である。

治療対象の疾患もしくは状態に依存して、経口、食事、局所的、非経口（例えば、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射）、吸入（例えば、気管支内吸入、鼻腔内吸入もしくは経口吸入、鼻腔内滴剤）、および眼内注射投与経路を含む種々の投与経路が可能であるが、必ずしもそれらに限定されない。眼内注射経路には、眼周囲（結膜下／経強膜）、硝子体内、網膜下および房内注射方法が含まれる。

投与すべき化合物の調製は、選択される投与経路によって変動する（例えば、液剤、エマルジョン剤、カプセル剤）。投与すべき化合物を含む適切な組成物は、生理学的に許容可能なビヒクルまたは担体中で調製できる。液剤もしくはエマルジョン剤のためには、適切な担体には、例えば、生理食塩水および緩衝溶媒を含む、水溶液またはアルコール性水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油を含むことができる。静脈内用ビヒクルには、種々の添加物、保存料、または液体、栄養物または電解質補給剤を含むことができる（例えば、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照されたい）。吸入用には、本化合物は、可溶化されて投与のために適切なディスペンサー（例えば、アトマイザー、ネブライザーまたは加圧式エーロゾルディスペンサー）内に装填される。また別の例として、化合物は、硝子体液中、房水中、強膜上、強膜中、脈絡膜上腔中、または網膜下腔中に埋め込まれる徐放性のデバイスまたは組成物を介して投与することができる。

また別の実施形態では、本発明は、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆと相互作用する化合物についてスクリーニングするための方法を提供する。本発明は、種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいてＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはそれらの結合フラグメントを使用することによって化合物をスクリーニングするために有用である。そのような試験において使用されるＴＬＲ３ポリペプチドまたはＴＬＲ７ポリペプチドまたはＴｒｉｆポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中に遊離しているか、固体支持体に付着しているか、細胞表面上にあるか、または細胞内に位置するかのいずれかであってよい。薬物スクリーニングの１つの方法は、ポリペプチドもしくはフラグメントを発現する組換え核酸を用いて安定に形質転換されている真核宿主細胞または原核宿主細胞を利用する。薬物は、競合的結合アッセイにおいてそのような形質転換細胞に対してスクリーニングされる。そのような細胞は、生存形態または固定された形態のいずれでも、標準結合アッセイのために使用できる。例えば、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆと、試験される作用物質との複合体の形成を測定することができる。または、試験される作用物質に起因するＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆとその標的細胞、単球などとの複合体形成の減少を試験できる。

そこで、本発明は、眼の血管形成および疾患に影響を及ぼし得る薬物または他の任意の作用物質についてスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、そのような作用物質をＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはフラグメントと接触させる工程と、当分野において周知である方法によって、（ｉ）作用物質とＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはフラグメントとの複合体の存在についてアッセイする工程、または（ｉｉ）ＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはフラグメントと細胞との複合体の存在についてアッセイする工程とを含む。そのような競合的結合アッセイでは、ＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはフラグメントは、典型的には標識される。適切なインキュベーション後、遊離のＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはフラグメントは、結合形態で存在するものから分離され、遊離または複合化していない標識の量は、特定の作用物質がＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆへ結合するか、あるいはＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆと作用物質の複合体を干渉する能力の尺度である。

薬物スクリーニングのためのまた別の技術は、ＴＬＲ３ポリペプチドまたはＴＬＲ７ポリペプチドまたはＴｒｉｆポリペプチドへの適切な結合親和性を有する化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、引用することにより本明細書の一部をなすものとする１９８４年９月１３日に公開された欧州特許出願第８４／０３５６４号明細書に詳細に記載されている。手短に述べると、多数の相違する小ペプチド試験化合物は固体基質、例えばプラスチック製ピンまたは他の表面上で合成される。ペプチド試験化合物は、ＴＬＲ３ポリペプチドまたはＴＬＲ７ポリペプチドまたはＴｒｉｆポリペプチドと反応させられ、そして洗浄される。結合したＴＬＲ３ポリペプチドまたはＴＬＲ７ポリペプチドまたはＴｒｉｆポリペプチドは、次に当分野において周知の方法によって検出される。精製されたＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆは、さらにまた上記の薬物スクリーニング技術において使用するためにプレート上に直接塗布することもできる。さらに、非中和抗体を使用すると、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化することができる。

本発明は、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７もしくはＴｒｉｆに結合できる中和抗体が、試験化合物と、ＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはそれらのフラグメントに結合することについて特異的に競合する、競合的薬物スクリーニングアッセイの使用もまた企図している。この方法で、抗体を使用すると、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆと１つ以上の抗原決定因子とを共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。

本発明は、例えば薬物または作用物質が眼の血管形成を阻害する能力などについて、薬物または任意の他の作用物質がバイオアッセイにおいて監視される薬物スクリーニングアッセイを使用することもまた企図している。そのような薬物スクリーニングアッセイは、上述した種々の結合アッセイと結び付けて使用できる。すなわち薬物または他の作用物質は、それらがＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆに結合する能力について最初に試験され、次にＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆに対する結合親和性を有する化合物は、バイオアッセイにおいて、例えば薬物または作用物質が眼の血管形成を阻害する能力などについて試験される。または、バイオアッセイは、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆの作用を遮断する化合物、例えばＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆに対する抗体などを含むか、含まない薬物または作用物質を用いて実施できる。その薬物または作用物質を用いると眼の血管形成が阻害されるが、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆの作用を遮断する化合物の存在下では、その薬物または作用物質を用いても眼の血管形成が阻害されないことは、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆとの相互用により眼の血管形成を阻害する化合物の指標である。野生型細胞と、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆに対する遺伝子がノックアウトされている細胞とにおいて、眼の血管形成を比較する類似のスクリーニングアッセイを実施することができ、薬物または作用物質への曝露に起因して野生型細胞においては眼の血管形成の阻害が生じるがノックアウト細胞中では阻害が生じないことは、ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆと相互作用することによって眼の血管形成を阻害する薬物または作用物質であることの指標である。

［動物］
全動物実験は、ケンタッキー大学ＩＡＣＵＣおよび米国視覚眼科学会（Ａｓｓｏｒｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）のガイドラインを遵守した。ばらつきを最小限に抑えるために、６〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を使用した。他のマウス系統についての入手源は次のとおりであった。ＴＬＲ３−／−、ＩＬ−１０−／−、ＩＬ−１２−／−、ＩＦＮγ−／−（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）、ＩＦＮＡＲ−１−／−（ワシントン大学のＨ．Ｖｉｒｇｉｎ氏からの寄贈）、ＴＬＲ７−／−（マサチューセッツ州大学のＤ．Ｇｏｌｅｎｂａｃｋ氏からの寄贈）、ＴＬＲ９−／−（ケースウエスタンリザーブ大学のＥ．Ｐｅａｒｌｍａｎ氏からの寄贈）、ＶＥＧＦＲ１チロシンキナーゼ−／−（東京大学のＭ．Ｓｈｉｂｕｙａ氏からの寄贈）、Ｔｒｉｆ−／−（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社からのＴｒｉｆ欠損性Ｌｐｓ２マウス）。すべての方法のために、麻酔は５０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン（Ｆｔ．Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ社）および１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）の腹腔内注射によって達成し、瞳孔は局所用１％トロピカミド（Ａｌｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて拡張させた。

［ＣＮＶ］
ＣＮＶ（脈絡膜新生血管形成）を誘導するために、各動物の両眼にレーザー光凝固術（５３２ｎｍ、２００ｍＷ、１００ｍｓ、７５μｍ）（ＯｃｕＬｉｇｈｔ ＧＬ、Ｉｎｄｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を実施した（容積試験：３／眼、タンパク質分析／フローサイトメトリー：１２／眼）。ＣＮＶ容積は、０．５％ ＦＴＴＣ−Ｇｒｉｆｆｏｍａ ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａイソレクチンＢ４（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）または０．５％ ＦＩＴＣ−抗マウスラット抗体ＣＤ３１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて走査型レーザー共焦点顕微鏡（ＴＣＳ ＳＰ、Ｌｅｉｃａ社）によって測定した。レクチンおよびＣＤ３１染色によって得られた容積は、高度に相関していた（ｒ^２＝０．９５）。

［薬物および注射剤］
ロキソリビン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、）、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、ｐｏｌｙ ｄＩ：ｄＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＩＦＮγ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、抗マウスラット抗体ＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＩＬ−１２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、またはＩＬ−２３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、コントロールラットＩｇＧ（Ｓｅｒｏｔｅｃ社）、ＧＦＰ、ＢＧＬＡＰ２、ＣＤＨ１６、ＳＦＴＰＢに対するｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）、全長が公知のマウス遺伝子に対して少なくとも４つの塩基ミスマッチを備える３つのナンセンス標的（ＮＳ１、ＮＳ２およびＮＳ３）、２−Ｏ’−メチルＮＳ２、ＲＩＳＣ複合体には組み込まれないｓｉＲＮＡ、ＶＥＧＦ−Ａに対するｓｉＲＮＡ（Ｂｅｖａｓｉｒａｎｉｂ；配列ＡＣＣＵＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣｄＴｄＴを有するセンス鎖、および配列ＧＵＧＣＵＧＧＣＣＵＵＧＧＵＧＡＧＧＵｄＴｄＴを有するアンチセンス鎖を備える）、およびＶＥＧＦＲ−Ｉに対するｓｉＲＮＡ（Ｓｉｒｎａ−０２７；配列ＣＵＧＡＧＵＵＵＡＡＡＡＧＧＣＡＣＣＣｄＴｄＴを有するセンス鎖、および配列ＧＧＧＵＧＣＣＵＵＵＵＡＡＡＣＵＣＡＧｄＴｄＴを有するアンチセンス鎖を備える）は、レーザー傷害直後に３３ゲージの二重口径ニードル（Ｉｔｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）を用いてマウスの硝子体液中に注射された。さらに、５＋２ヌクレオチド長（５ヌクレオチド＋２ヌクレオチドオーバーハング、１本の鎖は配列ＵＡＡＧＧｄＴｄＴを有し、他方の鎖は配列ＣＣＵＵＡｄＴｄＴを有する）、および１１＋２ヌクレオチド長（１１ヌクレオチド＋２ヌクレオチドオーバーハング、１本の鎖は配列ＵＣＡＵＡＧＣＣＵＵＡｄＴｄＴを有し、他方の鎖は配列ＵＡＡＧＧＣＵＡＵＧＡｄＴｄＴを有する）のより短い非標的化ｓｉＲＮＡについても試験した。

［ＥＬＩＳＡ］
ＩＬ−１０およびＩＬ−１２のタンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）によって製造業者の取扱説明書にしたがって測定し、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ（ＰＢＬ ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ社）についても同様に測定した。総タンパク質は、Ｂｉｏｒａｄによって測定した。

［統計学］
ＣＮＶを発生させる各レーザー損傷の確率は、それが属する群であるマウス、眼、およびレーザースポットによって影響されるので、平均損傷容積は、分割反復測定法を用いる線形混合モデルを使用して比較した。全プロット因子は、動物が属する遺伝群であったが、分割プロット因子は眼であった。統計的有意性は、０．０５レベルと決定された。手段の事後比較は、多重比較のためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ調整法を用いて構築した。ＥＬＩＳＡ測定は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって比較した。

［結果］
図１は、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ｐｏｌｙ ｄＩ：ｄＣおよびロキソリビンが脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示している。ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３リガンドであるｐｏｌｙ Ｉ：Ｃは、ＴＬＲ３を活性化しないコントロールｐｏｌｙ ｄＩ：ｄＣと比較してＣＮＶを用量依存的（０．２〜２μｇ）に減少させた。^＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝１６。ＴＬＲ７リガンドであるロキソリビンは、コントロールＰＢＳと比較して用量依存的（０．２〜２μｇ）にＣＮＶを減少させた。＃Ｐ＜０．０５、ｎ＝１６。

図２は、種々のｓｉＲＮＡが脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示している。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するｓｉＲＮＡ、骨γカルボキシグルタミン酸タンパク質１（ＢＧＬＡＰ１−骨特異的）、カドヘドリン１６（ＣＤＨ１６−腎臓特異的）、およびゲノム内のいずれの配列ともマッチしない３種のナンセンス（ＮＳ）ｓｉＲＮＡ、ならびにＲＩＳＣ複合体に組み込まれないｓｉＲＮＡ（ＲＩＳＣフリー）は、全てが用量依存的にＣＮＶを減少させた。^＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝１２〜１６。これは、ランダム配列、非哺乳動物配列、および眼内で発現しない遺伝子を標的とするものを含むあらゆるｓｉＲＮＡが、ＣＮＶを抑制することができることを証明している。

図３は、種々のｓｉＲＮＡが、野生型、ＴＬＲ３−／−マウス、ＴＬＲ７−／−マウス、およびインターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ１）−／−マウスにおける脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示している。１μｇの、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するｓｉＲＮＡ、またはナンセンス配列ｓｉＲＮＡ（ＮＳ３）は、どちらも野生型マウス、ＴＬＲ７−／−マウス、およびインターフェロン受容体（ＩＦＮＡＲ１）−／−マウスにおいてＣＮＶを減少させた。しかし、それらはＴＬＲ３−／−マウスにおいてはＣＮＶを減少させなかったが、このことはＣＮＶの「非特異的／一般的」抑制がＴＬＲ３によって媒介されるが、ＴＬＲ７またはインターフェロンの誘導によっては媒介されないことを示している。Ｎ＝８〜１６。

図４は、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃおよびロキソリビンが野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜中におけるＩＬ−１０およびＩＬ−１２の産生に及ぼす作用を示している。２μｇの、ＴＬＲ３であるｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、およびＴＬＲ７リガンドであるロキソリビン（ＬＯＸ）は各々、レーザー傷害の１日後および３日後に、野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜においてＩＬ−１２およびＩＬ−１０タンパク質の発現を誘導した。Ｎ＝１２。

図５は、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２が脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示している。ＩＬ−１０およびＩＬ−１２はどちらも（１μｇ）ＰＢＳと比較してＣＮＶを減少させ（^＊Ｐ＜０．０５）、ＩＬ−１０（１μｇ）またはＩＬ−１２（１５０ｎｇ）に対する中和抗体（Ａｂ）はどちらもアイソタイプのコントロールラットＩｇＧと比較してＣＮＶを増加させた。ＩＬ−１２抗体もまたＩＬ−２３を阻害することができる。しかし、ＩＬ−２３抗体（１５０ｎｇ）はＣＮＶに影響を及ぼさなかった。ｎ＝８〜１６。

図６は、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃおよびロキソリビンが野生型マウス、ＩＬ−１０−／−マウスおよびＩＬ−１２−／−マウスにおける脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示している。ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃおよびロキソリビン（どちらも２μｇ）がＣＮＶを抑制する能力はＩＬ−１０−／−マウスおよびＩＬ−１２−／−マウスにおいて顕著に減少しているが、これはこれら２種のＴＬＲ７リガンドの抗血管形成作用の大部分がＩＬ−１０およびＩＬ−１２を介して媒介されることを示している。ｎ＝１２。

図７は、非標的化ｓｉＲＮＡおよび標的化ｓｉＲＮＡが野生型マウスおよびＴＬＲ３−／−マウスにおける脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示している。非標的化ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ ｓｉＲＮＡおよびＮＳ２ ｓｉＲＮＡ）ならびに標的化ｓｉＲＮＡ（Ｂｅｖａｓｉｒａｎｉｂ、ＶＥＧＦ−Ａに対するｓｉＲＮＡ、およびＶＥＧＦＲ−１に対するｓｉＲＮＡであるＳｉｒｎａ−０２７）は、全てが野生型マウスにおけるＣＮＶを抑制することについて本質的に同等に有効であったが、それらはいずれもＴＬＲ３−／−マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）におけるＣＮＶを抑制しなかった。そこで、非標的化ｓｉＲＮＡおよび標的化ｓｉＲＮＡはどちらも、ＣＮＶを調節する際にＴＬＲ３を介して機能すると思われる。全てのｓｉＲＮＡは、レーザー傷害の直後に０．２５μｇが硝子体液中に注射された。ｓｉＲＮＡが注射された野生型マウスにおける全ＣＮＶ容積は、ＰＢＳが注射されたＣＮＶ容積より有意に小さかった（^＊Ｐ＜０．０５）。ＴＬＲ３−／−マウスでは、すべての差は統計的有意ではなかった。

図８は、Ｓｉｒｎａ−０２７（ＶＥＧＦＲ１に対するｓｉＲＮＡ）がＶＥＦＧＲ１チロシンキナーゼ−／−マウスにおける脈絡膜新生血管形成に及ぼす作用を示している。Ｓｉｒｎａ−０２７は、ＶＥＧＦＲ１ ｔｋ−／−マウスにおいてＣＮＶを抑制した。これらのマウスはＶＥＧＦＲ１シグナリングが欠損しているので、このため試験結果は、「標的化」ｓｉＲＮＡが標的の内因性機能的核酸の不在下でさえ機能することを証明している。ｓｉＲＮＡ−０２７は、レーザー傷害の直後に０．２５μｇが硝子体液中に注射された。Ｓｉｒｎａ−０２７が注射された眼内のＣＮＶ容積は、野生型マウスおよびＶＥＧＦＲ１ ｔｋ−／−マウスのどちらにおいてもコントロール（ＰＢＳ）が注射された眼より有意に小さかった（Ｐ＜０．０５）。

図９は、ＣＮＶの非標的化ｓｉＲＮＡによる抑制がＴｒｉｆ欠損性マウスにおいては無効にされることを示している（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体ドメイン含有アダプター誘導性ＩＦＮ−β；Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体／耐性（ＴＩＲ）アダプタータンパク質）。Ｔｒｉｆは、ＴＬＲ３に対するアダプタータンパク質である；そこで、試験結果は、ｓｉＲＮＡがＴＬＲ３およびＴｒｉｆシグナリングを介して機能することを確証している。全てのｓｉＲＮＡは、レーザー傷害の直後に１μｇが硝子体液中に注射された。すべての差が統計的有意ではなかった。

図１０は、別の塩基上で２−Ｏ’−メチル基を用いて修飾された非標的化ｓｉＲＮＡ（ＮＳ２）が、硝子体内投与された場合に脈絡膜新生血管形成を抑制する能力を保持することを示している。ｓｉＲＮＡは、レーザー傷害の直後に硝子体液中に注射された。^＊Ｐ＜０．０５。図１１は、２−Ｏ’−メチルで修飾された非標的化ｓｉＲＮＡが、腹腔内へ投与された場合にＣＮＶを抑制する能力を保持していることを示している。

図１２は、非標的化ｓｉＲＮＡ（ＮＳ１ ｓｉＲＮＡ）が、レーザー傷害後のマウスの網膜色素上皮／脈絡膜中では、指示した時間（時間）ではＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βを誘導しないことを示している。ｓｉＲＮＡ（１μｇ）は、レーザー傷害の直後に硝子体液中に注射された。ＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−βは、ＥＬＩＳＡによって測定し、総タンパク質に対して標準化した。すべての差が統計的有意ではなかった。図１３は、非標的化ｓｉＲＮＡ（ＮＳ１ ｓｉＲＮＡ）が、レーザー傷害後のマウスの網膜色素上皮／脈絡膜中で、指示した時間（時間）でＩＦＮ−αおよびＩＬ−１２を誘導することを示している。ｓｉＲＮＡ（１μｇ）は、レーザー傷害の直後に硝子体液中に注射された。ＩＦＮ−γはＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ社）によって測定し、ＩＬ−１２はＥＬＩＳＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）によって測定し、総タンパク質に対して標準化した。^＊Ｐ＜０．０５。

図１４は、レーザー傷害の直後に硝子体液中に注射された組換えマウスＩＦＮγが、用量依存的に野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける脈絡膜新生血管形成を減少させたことを示している。^＊Ｐ＜０．０５。

図１５は、非標的化ｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ ｓｉＲＮＡおよびＮＳ１ ｓｉＲＮＡ）（１μｇがレーザー傷害の直後に硝子体液中に注射された）が、ＩＦＮα／β−／−マウス（ＩＦＮＡＲ１−／−マウスとしても知られている）における脈絡膜新生血管形成を抑制するが、ＩＦＮγ−／−マウスまたはＩＬ−１２−／−マウスにおいては抑制しないことを示している。これらの試験結果は、非標的化ｓｉＲＮＡがＩＦＮγおよびＩＬ１２を介して機能することを示している。^＊Ｐ＜０．０５。

図１６は、長さの短い（５＋２ヌクレオチドおよび１１＋２ヌクレオチド）の非標的化ｓｉＲＮＡもまた野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるレーザー誘導性脈絡膜新生血管形成を抑制することを示している。^＊Ｐ＜０．０５。

図１７は、野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜細胞の懸濁液のフローサイトメトリー実験を示している。これらの試験結果は、硝子体液中に注射された場合に、ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡ（ＮＳ２）は細胞内に侵入しないが（ＦＩＴＣ−ｓｉＲＮＡ曲線は、非染色コントロール曲線と比較して「右方シフト」を示さない）、１０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）は細胞内に侵入する（ＦＩＴＣ−デキストラン曲線は「右方シフト」を示す）ことを明らかにしている。これは、担体無含有／裸のｓｉＲＮＡの細胞内への取り込みは不良であることと、よってそのようなｓｉＲＮＡの生物学的作用は細胞表面相互作用によって媒介されることを示している。

図１８は、野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜細胞の懸濁液のフローサイトメトリー（透過化を行わずに実施した）実験を示している。これらの試験結果は、抗ＲＰＥ６５抗体（米国立眼科学研究所のＴ．Ｍ Ｒｅｄｍｏｎｄ氏からの寄贈）、抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、および抗ＴＬＲ３抗体（Ｉｍｇｅｎｅｘ社）を用いてＴＬＲ３がＲＰＥ６５＋（網膜色素上皮）細胞およびＣＤ３１＋（脈絡膜上皮細胞）の表面上で発現することを明らかにしている。

図１９は、組換え可溶性ＴＬＲ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたプレインキュベーションが、レーザー傷害直後に硝子体液中に注入されたｓｉＲＮＡ（ＮＳ１）による野生型マウスのＣＮＶの抑制を無効にすることを示している。^＊Ｐ＜０．０５。これらのデータは、ｓｉＲＮＡがＴＬＲ３と直接的に相互作用することを示している。

図２０は、マウスＴＬＲ３に対する中和ラット抗血清（２００ｎＬ）は、レーザー傷害直後に硝子体液内へ注射されたｓｉＲＮＡ−ＮＳ２（１μｇ）によって誘導された野生型マウスにおける脈絡膜新生血管形成の抑制を無効にしたが、コントロールラット血清（２００ｎＬ）は無効にしなかったことを示す図である。^＊Ｐ＜０．０５。ＴＬＲ３抗体は細胞に浸透しないと予測されるので、これらのデータは、ｓｉＲＮＡが細胞表面ＴＬＲ３を活性化することを示している。

本開示で言及したすべての参考文献は、各参考文献が個別に全体として引用するこにより組み込まれた場合と同程度に引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

本発明を詳細にかつそれらの特定の実施形態を参照しながら記載してきたが、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱せずに様々な変更や修正を加えられることは明白である。そのような変更および修正は全部が本開示および本発明の範囲内に含まれ、特許請求の範囲によって保護されることが意図されている。

Claims (31)

1. 眼の血管形成を阻害する方法であって、網膜細胞または脈絡膜細胞を、ｔｏｌｌ様受容体の活性を刺激するｔｏｌｌ様受容体刺激有効量の化合物に曝露する工程を含む方法。
2. 前記ｔｏｌｌ様受容体が、ｔｏｌｌ様受容体３である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｔｏｌｌ様受容体が、ｔｏｌｌ様受容体７である、請求項１に記載の方法。
4. 前記化合物が、ｔｏｌｌ様受容体３アゴニストである、請求項１に記載の方法。
5. 前記化合物が、二本鎖ＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
6. 前記二本鎖ＲＮＡが、裸の二本鎖ＲＮＡ、または１つ以上の２’位にＯ−メチル基を有する二本鎖ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
7. 前記二本鎖ＲＮＡが、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを任意選択的に備え、１９、２０もしくは２１塩基対を有する、請求項５に記載の方法。
8. 前記二本鎖ＲＮＡが、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを任意選択的に備え、５、７、９もしくは１１塩基対を有する、請求項５に記載の方法。
9. 前記化合物が、配列非特異的な二本鎖ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
10. 前記化合物が、配列特異的な二本鎖ＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
11. 前記化合物が、ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃである、請求項５に記載の方法。
12. 前記二本鎖ＲＮＡが、細胞表面ＴＬＲ３を活性化させることによって機能する、請求項５に記載の方法。
13. 前記化合物が、ｔｏｌｌ様受容体７アゴニストである、請求項１に記載の方法。
14. 前記化合物が、イミキモド（Ｒ−８３７）である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記化合物が、レシミキモド（Ｒ−８４８）である、請求項１３に記載の方法。
16. 前記化合物が、ロキソリビンである、請求項１３に記載の方法。
17. 前記化合物が、ブロピリミンである、請求項１３に記載の方法。
18. 前記化合物が、Ｔｒｉｆアゴニストである、請求項１に記載の方法。
19. 前記脈絡膜細胞が、脈絡膜内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
20. 前記網膜細胞または脈絡膜細胞を前記ｔｏｌｌ様受容体刺激化合物に曝露する工程が、哺乳動物において行われる、請求項１に記載の方法。
21. 前記化合物が、前記哺乳動物に経口投与される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記化合物が、前記哺乳動物に静脈内投与される、請求項２０に記載の方法。
23. 前記化合物が、前記哺乳動物に眼内注射される、請求項２０に記載の方法。
24. 前記化合物が、硝子体液中、房水中、強膜上、強膜中、脈絡膜上腔中、または網膜下腔中に埋め込まれる徐放性のデバイスまたは組成物を介して投与され、前記化合物がＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、Ｔｒｉｆアゴニスト、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
25. 眼の血管形成を阻害する方法であって、網膜細胞または脈絡膜細胞を血管形成阻害有効量のＩＬ−１０および／またはＩＬ−１２および／またはＩＦＮ−γに曝露する工程を含む方法。
26. 眼の血管形成を阻害するための組成物であって、ＴＬＲ３および／またはＴＬＲ７および／またはＴｒｉｆの活性を刺激する化合物を含む組成物。
27. ＴＬＲ３の活性を刺激する前記化合物が、配列非特異的または配列特異的な二本鎖ＲＮＡである、請求項２６に記載の組成物。
28. ＴＬＲ７の活性を刺激する前記化合物が、イミキモド（Ｒ−８３７）、レシキモド（Ｒ−８４８）、ロキソリビンまたはブロピリミンである、請求項２６に記載の組成物。
29. 眼の血管形成を阻害するための組成物であって、ＩＬ１０および／またはＩＬ１２および／またはＩＦＮ−γを含む組成物。
30. ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆと相互作用する化合物についてスクリーニングするための方法であって、ＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはそれらの結合フラグメントを試験化合物と接触させる工程と、ＴＬＲ３ポリペプチドもしくはＴＬＲ７ポリペプチドもしくはＴｒｉｆポリペプチドまたはそれらの結合フラグメントと前記試験化合物との間で複合体が形成されるかどうかを決定する工程とを含む方法。
31. ＴＬＲ３またはＴＬＲ７またはＴｒｉｆと相互作用すると同定された試験化合物が、眼の血管形成を阻害する能力についてアッセイされる、請求項３０に記載の方法。

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