JP2009533328A - グリコペプチドの調製法 - Google Patents
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Classifications
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
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- C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
Abstract
Description
本発明は、アメリカ合衆国のNational Institute of Healthによって授与されたグラント番号GM44154の下で、政府の支援によってなされた。米国合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本願は、2006年3月22日に出願された米国仮特許出願第60/743,666号の、米国特許法第119(e)条の下での利益を請求する。米国仮特許出願第60/743,666号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、ペプチドチオエステルと糖部分にチオール基を有するグリコペプチドとのカップリングによるペプチド結合の形成によって、ペプチド類およびグリコペプチド類を製造する方法に関する。
ペプチド類およびタンパク質の化学的合成は、広く研究されている分野であり、逐次カップリング反応を使用してそのような化合物を合成する方法、特にポリマーなどの固相への固定に関与する方法が開発されている。しかし、逐次合成方法は、より大きなペプチド類およびタンパク質の製造にはあまり適さない。このため、より小さなペプチド類を制御されたやり方で結合して大分子を製造するセグメントカップリング法が開発されてきている。
Beligere,G.S.;Dawson,P.E.J.Am.Chem.Soc.1999,121,6332−6333 Yan,L.Z.;Dawson,P.E.J.Am.Chem.Soc.2001,123,526−533 Saxon,E.;Armstrong,J.L;Bertozzi,C.R.Org.Lett.2000,2,2141−2143 Nilsson,B.L.;Kiessling,L.L.;Raines,R.T.Org.Lett.2000,2,1939−1941 Canne,L.E.;Bark,S.J.;Kent,S.B.H.J.Am.Chem.Soc.1996,118,5891−5896 Low,D.W.;Hill,M.G.;Carrasco,M.R.;Kent,S.B.H.;Botti,P.Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.2001,98,6554−6559 Offer,J.;Boddy,C;Dawson,P.E.J.Am.Chem.Soc.2002,124,4642−4646 Macmillan,D.;Anderson,D.W.Org.Lett.2004,6,4659−4662 Lu,Y.−A.;Tarn,J.P.Org.Lett.2005,7,5003−5006
mは、0〜約10であり;
nは、1〜約4であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して各部位で、Hまたはアルキルであり、またはRaとRbとが一緒になって、オキソ(=O)であり;
pは、1、2または3であり;
Xは、OまたはCHR3であり;
各R3は、独立して各部位で、水素、(C1−C3)アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ(C1−C3)アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でO置換されていてよく;ただし、1個のR3は、−OC(=O)(CH(RS))nSHまたは−NHC(=O)(CH(Rs))nSH(式中、Rsは、独立して各部位で、水素または(C1−C6)アルキル((C1−C6)アルキルの任意の炭素原子は、Jで置換されていてよい)であり、sは1〜約6である)を含み;
Yは、C(R4R5)、O、NHまたはSであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して、H、アルキルまたはJであり;
XおよびYを有する炭素原子は、RまたはS配置であり;
各NRは、独立して、NHまたはN(C1−C3)アルキルであり、またはNRは、NRを有する炭素原子に結合するRcまたはReと一緒になって、4〜7員環を形成することができ、または、
各Rc、Rc’、ReおよびRe’は、独立して各部位で、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていないまたは保護基でブロックされている可能性のある天然アミノ酸の側鎖であり;あるいはRcおよびRc’またはReおよびRe’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し;任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、0〜3個のJで置換され;
Jは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、(C1−6)アルキル、(C1−6)アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ;アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1−6)アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり;
R1およびR2は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である)の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、塩類を製造する方法であって、
式(II):
本発明のある請求項ならびに構造および式を伴って示される実施例について詳細に述べる。本発明を、列挙された請求項に関連して説明するが、本発明は、これらの請求項に限定されないことは理解すべきである。対して、本発明は、請求項によって定義された本発明の範囲内に含有されうる、全ての代替、修飾および等価物を包含するものである。
本発明の実施形態は、式(I):
mは、0〜約10であり;
nは、1〜約4であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して各部位で、Hまたはアルキルであり、またはRaとRbとが一緒になって、オキソ(=O)であり;
pは、1、2または3であり;
Xは、OまたはCHR3であり;
各R3は、独立して各部位で、水素、(C1−C3)アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ(C1−C3)アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でO置換されていてよく;ただし、1個のR3は、−OC(=O)(CH(RS))nSHまたは−NHC(=O)(CH(Rs))nSH(式中、Rsは、独立して各部位で、水素または(C1−C6)アルキル((C1−C6)アルキルの任意の炭素原子は、Jで置換されてもよい)であり、sは1〜約6である)を含み;
Yは、C(R4R5)、O、NHまたはSであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して、H、アルキルまたはJであり;
XおよびYを有する炭素原子は、RまたはS配置であり;
各NRは、独立して、NHまたはN(C1−C3)アルキルであり、またはNRは、NRを有する炭素原子に結合するRcまたはReと一緒になって、4〜7員環を形成することができ、または、
各Rc、Rc’、ReおよびRe’は、独立して各部位で、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていないまたは保護基でブロックされている可能性のある天然アミノ酸の側鎖であり;あるいはRcおよびRc’またはReおよびRe’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し;任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、0〜3個のJで置換され;
Jは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、(C1−6)アルキル、(C1−6)アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ;アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1−6)アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり;
R1およびR2は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である)の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、塩類を製造する方法であって、
式(II):
図1を参照すると、本発明の実施形態による合成スキームが示されている。生成物のN末端セグメントを形成する「ペプチド1」と言うペプチドを、アミド(ペプチド)結合形成のためのセグメントを活性化する働きをするC末端カルボキシチオエステルで製造する。ペプチド1は、場合によっては、そのN末端を、たとえば、N−アセチル基で保護してもよく、あるいは遊離アミノ基を有してもよい。そうでなければ、システイン残基が配列中に存在する場合を除いて、側鎖部分をブロックまたは保護する必要はない。リシンの場合のように遊離アミノ基、チロシン、セリンおよびスレオニンの場合のように遊離ヒドロキシル基、アルギニンの場合のように遊離グアニド基、アスパルテートまたはグルタメートの場合のように遊離のカルボキシル基、ならびにアスパラギンおよびグルタミンの場合のように遊離カルボキサミド基を含む側鎖が、カップリング反応の間、保護されていない形態で存在してもよい。しかし、システイン残基は、たとえば、アセタミドメチルまたはtert−ブチル誘導体として、カップリング反応中、ブロックすることができる。
Boc tert−ブトキシカルボニル
DCM ジクロロメタン
DIEA ジイソプロピルエチルアミン
DMF N,N−ジメチルホルムアミド
EA 酢酸エチル
ESI−TOF エレクトロスプレーイオン化−飛しょう時間
Fmoc 9−フルオレニルメトキシカルボニル
HBTU O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3,−テトラメチルウロニウムPF6
Hex ヘキサン
HOBt N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HRMS 高分解能質量スペクトル分析
MALDI−TOF 質量補助レーザー脱離イオン化−飛しょう時間
MBHA メチルベンズヒドリルアミン
MS 分子ふるい
NMA N−メチルアニリン
NMM N−メチルモルホリン
PMB p−メトキシベンジル
PyBOP 1−(7−アザベンズトリアゾリルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムPF6
rt 室温
Tf トリフルオロメタンスルホネート
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TMS トリメチルシリル
Trt トリチル。
グリコペプチド2の合成スキーム
化合物5:化合物4(5.54g、8.92mmol)を、乾燥CH2Cl2(30mL)中のFmoc−Ser−Oアリル(3.92g、10.70mmol)およびMS(AW−300、5g)に加えた。反応系を、アルゴン下、室温で1時間保った。次いで反応混合物を−78℃とし、TMSOTf(174μL、0.89mmol)をゆっくり加えた。反応混合物を−78℃で1.5時間攪拌し、DIEA(155.3μL、0.89mmol)を加えてクエンチした。反応混合物をろ過し、ろ液を20mLのCH2Cl2で希釈し、水洗した。有機層をMgSO4で乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィ(EA/Hex、1:2)で濃縮した。その後、精製された生成物(6.28g、85%)を、20mLのAcOHに懸濁し、次いでZn微粉を加えた。反応混合物をrtで8時間攪拌した。ろ過後、溶媒を真空除去し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ(EA/Hex、3:1)に供し、化合物5(4.36g、88%)を得た。
化合物6:化合物5(1.0g、1.4mmol)を、予備活性化S−トリチル−2−メルカプト酢酸(932.4mg、2.8mmol)に、乾燥DMF(10mL)中のHBTU(1.06g、2.8mmoL)およびDIEA(1mL、5.6mmoL)と共に加えた。反応混合物を、アルゴン下、rtで2時間攪拌した。反応溶液を、80mLの酢酸エチルで希釈し、水次いで飽和食塩水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、フラッシュカラムクロマトグラフィ(EA/Hex1:2)で濃縮した。化合物6(1.0g、90%)を、白色固体として得た。
化合物7:化合物6を、DMF中の20%ピペリジンに溶解し、rtで45分攪拌する。全ての溶媒を真空除去した後、残基を、フラッシュカラムクロマトグラフィ(EA/Hex4:1、次いでMeOH/CH3Cl1:9)に供した。精製した生成物(1.30g、1.74mmol)、BocGly−OH(913mg、5.21mmol)、HBTU(1.32g、3.48mmol)およびHOBt(533mg、3.48mmol)を、Ar下DMF(15mL)に溶解し、次いでDIEA(3.03mL、17.4mmol)を加えた。この反応混合物を、rtで2時間攪拌した。全ての溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ(EA/Hex1:1)に供し、化合物7(1.42g、90%)を得た。HRMS(ESI−TOF)C46H55N3O14S[M+H]+について計算値:906.3477。測定値:906.3480。
化合物8:化合物7(660mg、0.73mmol)を、THF(10mL)に懸濁し、N−メチルアニリン(792μL、7.3mmol)および(PPh3)4Pdを引き続いて加えた。反応混合物をrtで45分攪拌した。溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ(EA/Hex4:1、次いでMeOH/CH3Cl8:1)に供し、生成物(545mg、86%)を得た。精製した生成物(520mg、0.60mmol)、NH2Phe−NH2(361mg、1.8mmol)、HBTU(456mg、1.20mmol)およびHOBt(184mg、1.20mmol)を、アルゴン下で、DMF(15mL)に溶解し、次いでDIEA(1.04mL、6.01mmol)を注入した。反応混合物をrtで2時間攪拌した。全ての溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ(EA/Hex4:1、次いでMeOH/CHCl31:9)に供し、化合物8(395mg、65%)を得た。HRMS(ESI−TOF)C52H61N5O14S[M+H]+について計算値:1012.4008。測定値:1012.4001。
化合物9:化合物8(250mg、0.24mmol)をMeOHに溶解し、0.05NのNaOHをpHが10程度になるまで、滴下した。反応混合物を、rtで1時間攪拌し続けた。反応系を酸性樹脂でpH7の中性とし、次いで真空濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ(MeOH/CHCl31:9、次いで1:5)に供し、化合物9(178mg、82%)を得た。
化合物2:10mLのTFA/Et3SiH/CHCl3(9:0.5:0.5)を、Ar下で化合物9に加えた。反応系をrtで40分攪拌した。殆どのTFAを除去した後、脱保護されたグリコペプチドを、冷Et2Oを加えることによって、析出させた。白色析出物を集め、少量のH2Oに再懸濁させた。粗生成物を0.45μmシリンジフィルターでろ過し、次いで精製のためにHPLCに供した。凍結乾燥後、白色粉末としての純粋な化合物2を、次の連結反応工程のために用意した。HRMS(ESI−TOF)C22H33N5O9S[M+Na]+について計算値:566.1891。測定値:566.1875。
グリコペプチド3の合成スキーム
グリコペプチド1の合成スキーム
固相ペプチド合成
一般的方法。テトラヒドロフラン(THF)を、ナトリウム/ベンゾフェノンで蒸留し、塩化メチレン(CH2Cl2)を塩化カルシウムで蒸留した。市販品質の試薬を購入し、さらに精製することなく使用した。グリコシル化実験を、反応前に高真空下で火炎乾燥した分子ふるい(AW300)を使用して行った。薄層クロマトグラフ(TLC)分析を、シリカゲル60F254ガラスプレートを使用して行い、化合物スポットは、UV光(254nm)およびクエン酸モリブデン酸アンモニウム(citric ammonium molybdate)で染色することによって視覚化した。フラッシュクロマトグラフィを、シリカゲル60Geduran(登録商標)(35〜75μm、EM Science)で行った。1H、13C−NMRスペクトルを、Bruker AMX−500MHzスペクトロメータで記録した。カップリング定数(J)はヘルツで報告し、化学シフトはテトラメチルシラン(TMS、0.0ppm)に対する百万分率(ppm)で報告する。
3−(トリチルチオ)プロパン酸のMBHA−リンカーへのプレローディング:樹脂ローディングは、樹脂を過剰に加えることによって、約300μmol/gを目的とした。先ず、樹脂を洗浄(5×DCM、5%DIEA/DCMで3分、5×DCM、5×DMF)した。3−(トリチルチオ)プロパン酸の予備活性化のため、PyBOP(1当量)を、3−(トリチルチオ)プロパン酸の2当量のNMMを含むDMF0.1M溶液に加えた。予備活性化の5分後、混合物を樹脂に加えた。2時間後、樹脂を洗浄(5×DMF、5×DCM、5%DIPEA/DCMで3分、5×DCM、5×DMF)した。キャッピングのため、樹脂を無水酢酸/ピリジン(1:9)(2×10分)で処理し、洗浄(5×DMF、10×DCM)し、最後に真空乾燥した。
Boc法による固相合成:Boc切断:樹脂を5%のm−クレゾール/TFA(2×4分、4mL)で処理した後、DCM(8×4mL)およびDMF(5×4mL)で洗浄した。カップリング:4当量の保護アミノ酸(最終濃度:DMF中0.1M)を、4当量のPyBOPおよび8当量のNMMを使用して5分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。30分後、樹脂をDMF(5×4mL)、DCM(5×4mL)およびDMF(5×4mL)で洗浄した。キャッピング:無水酢酸/ピリジン(1:9、4mL)を樹脂に加えた。5分後、樹脂を、DMF(5×4mL)およびDCM(5×4mL)で洗浄した。末端キャッピング:無水酢酸/ピリジン(1:9、4mL)を樹脂に加えた。10分後、樹脂をDMF(5×4mL)およびDCM(8×4mL)で洗浄した。切断:TFMSA/TFA/チオアニソール(2:8:1)の混合物を樹脂に加えた。3時間後、樹脂をTFA(4×4mL)で洗浄した。検査:合わせた溶液を真空濃縮した。残渣を水に溶解し、分取HPLCで精製し、MALDI−TOF/MS(マトリックス:α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸)で分析した。
Ac−Leu−Tyr−Arg−Ala−Gly−S(CH2)2CONH215(配列番号:3は、非修飾アミノ酸類に相当する)。:3−(トリチルチオ)プロパン酸がプレロードされたMBHA−樹脂、400mg(100μmol)から出発し、線状アセンブリをBoc法に準じて行った。収量:50.6mg(71.5μmol、72%)。MALDI−TOF/MS(m/z):708.8([M+H]+、計算値708.8);C31H49N9O8S(707.84)。
Ac−Leu−Tyr−Arg−Ala−Ala−S(CH2)2CONH216(配列番号:4は非修飾アミノ酸類に相当する)。:3−(トリチルチオ)プロパン酸がプレロードされたMBHA−樹脂、400mg(100μmol)から出発し、線状アセンブリをBoc法に準じて行った。収量:39mg(54μmol、54%)。MALDI−TOF/MS(m/z):723.0([M+H]+、計算値:722.9);C32H51N9O8S(721.87)。
Ac−Leu−Tyr−Arg−Ala−Val−S(CH2)2CONH217(配列番号:5は、非修飾アミノ酸類に相当する)。:3−(トリチルチオ)プロパン酸がプレロードされたMBHA−樹脂、400mg(100μmol)から出発し、線状アセンブリをBoc法に準じて行った。MALDI−TOF/MS(m/z):750.6([M+H]+、計算値:750.9);C34H55N9O8S(749.92)。
Ac−Leu−Tyr−Arg−Ala−His−S(CH2)2CONH218(配列番号:6は、非修飾アミノ酸類に相当する)。:3−(トリチルチオ)プロパン酸がプレロードされたMBHA−樹脂、400mg(100μmol)から出発し、線状アセンブリをBoc法に準じて行った。収量:31mg(39.3μmol、39%)。MALDI−TOF/MS(m/z):789.4([M+H]+、計算値:788.9);C35H53N11O8S(787.93)。
化学連結反応
保護されていない合成ペプチドセグメントの連結反応を以下のように行った。使用する前に、6Mのグアニジンを含む0.2Mのリン酸緩衝液(pH8.5)を、アルゴンで10分間脱ガスした。ペプチド類を最終濃度10mMで溶解し、次いで2%チオフェノールを添加した。連結反応を37℃で、加熱ブロック中で行い、周期的にボルテックスし、チオール付加物を平衡化した。反応は、LCMS(Agilent1100単一四極子質量スペクトロメータに付随するAgilent1100LC、カラムはAgilent SB C8 50×4.6mm)および/またはHPLC{分析カラム(XTeraMS、Cl8 3.5μm、4.6×l00mmを用いるHitachi D−7000HPLCシステク装置)を用い、流速1mL/分で}を使用してモニタリングした。
脱硫の一般的手順
(Leu−Tyr−Arg−Ala−Gly−Gly−Ser−Pheは、配列番号:79に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす)。
連結反応生成物19の1H−NMRスペクトル(D2O、Bruker MAX−500MHZ)。(Leu−Tyr−Arg−Ala−Gly−Glyは、配列番号:9に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす)。
脱硫生成物20の1H−NMRスペクトル(D2O、Bruker MAX−500MHZ)。(Leu−Tyr−Arg−Ala−Gly−Glyは、配列番号:9に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす)。
質量スペクトル分析によるチオエステル中間体および連結反応生成物の分析
LCMSによる、異なる連結反応の分析の間、以下に示すように、断片化が起こるのが観察された。連結反応生成物が形成された場合は、断片化により、糖部のない全連結反応ペプチドが得られたであろう。しかし、連結反応中間体は形成されるが、ペプチド結合形成が起こらない場合は、断片化により、出発ペプチドチオエステル、およびメルカプトアセタミド−結合された糖が得られる。
(Leu−Tyr−Arg−Ala−Xは、配列番号:81に相当し、これは非修飾アミノ酸類を表わす)。
構造ブロック24aおよび24bの合成
(b)Zn/AcOH;(c)TrtS−CH2COOH、HBTU、DIEA、DMF、84%(2工程);(d)Pd(PPh3)4、NMA、THF、95%。
化合物22aα。反応前に、化合物21(5.0g、10.5mmol)およびFmoc−Thr−Oアリル(4.83g、12.7mmol)を混合し、高真空で一晩乾燥した。次いで混合物をN2下で無水CH2Cl2(30mL)に溶解し、3.0gの新しい、火炎乾燥した分子ふるいを加え、混合物を室温で1時間攪拌した。その後、−78℃に冷却し、TMSOTf(203.9μL、1.066mmol)を反応溶液にゆっくり加えた。次いで、混合物を−78℃に保ち、45分攪拌した。反応が落ちると、Et3Nを加えてクエンチし、温度を室温まで上げた。分子ふるいをセライトによるろ過により除去し、ろ液を真空濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン中20〜50%EtOAc)で生成し、純粋なα生成物(3.31g、4.77mmol、45.4%)を得た。
糖補助連結反応(SAL)を使用するα−O−結合グリコペプチド類の合成
糖補助連結反応(SAL)の連結反応効率を調べるため、4種のモデルα−O−結合グリコペプチド類25a〜bおよび26a〜b、ならびにチオエステルペプチドCys(Acm)37−Gly52を、Gly−Val連結反応部を発現するジプテリシンの配列に基づいて生成した。ここで使用した連結反応条件は、我々の先の研究で使用した条件に類似するが、チオフェノールは省いた。
α−結合グリコペプチド類のSAL
(A)構造ブロック30の合成。(B)側鎖アンカー法を使用するグリコペプチドチオエステルAsp1−Asn36。
化合物28α。化合物27(10.28g、27.55mmol)およびp−チオクレゾール(5.1g、41.3mmol)を、N2(ガス)下でCH2Cl2(40mL)に溶解した。反応溶液を氷浴で0℃に冷却した。この溶液に、BF3OEt2(6.92mL、55.1mmol)をゆっくり加えた。その後、反応温度を徐々に室温まで上げた。8時間後、反応系に飽和NaHCO3をゆっくり加えることによりクエンチし、CH2Cl2で希釈した。生成物を、飽和NaHCO3で洗浄し、CH2Cl2で抽出した。有機層を集め、真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン中20〜40%EtOAc)で精製し、純粋な生成物(αおよびβ混合物、10.3g、23.6mmol、85%)を得た。精製チオグリコシドをMeOHに溶解した。NaOMe(MeOH中25重量%)を、pHが11〜12程度になるまで、反応溶液に滴下した。反応混合物を室温で1時間攪拌し、酸性樹脂(Dowex50WX2−200(H))で中性とした。次いで、樹脂をろ取し、CH2Cl2で洗浄した。ろ液を真空濃縮した。次いで、濃縮残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ(CH2Cl2中5〜10%MeOH)で精製した。次いで、純粋なチオグリコシド(7.83g、25.2mmol)を60mLの乾燥DMFに0℃で溶解し、PMBCl(20.5mL、151mmol)およびNaH(3.62g、151mmol)を加えることにより、PMB基で完全に保護した。反応混合物を室温で2時間攪拌し、MeOHでクエンチした。MeOHを除去した後、真空濃縮した。次いで、生成物をEtOAcで抽出し、H2Oで洗浄した。有機層を集め、飽和食塩水で再び洗浄した。有機層を真空濃縮した後、粗残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィ(ヘキサン中10〜40%EtOAc)で精製し、純粋なPMB保護チオグリコシド28αおよび28βをそれぞれ得た。[15.5g、23.2mmol(α+β)、92%]。
グリコペプチドVal53−Phe82の固相合成
C末端グリコペプチドセグメント(53−82)の合成は、H2N−Phe−2−ClTrt−樹脂から始め、Fmoc法を使用して行った。グリコシル化アミノ酸を樹脂にカップリングするため、2当量の構造ブロック24aを使用し、反応系を24時間振盪した。SPPSが完了すると、糖上のアセテート基を、ヒドラジン/MeOH(1/6)で6時間処理することによって、固体支持体から除去した。このアセテート除去工程の後、樹脂をMeOH、DMFおよびCH2Cl2で洗浄した。得られたグリコペプチドを脱保護し、TFA/H2O/Et3SiH/チオアニソール(17/1/1/1)を用いて室温で50分処理することにより、樹脂から切断した。粗グリコペプチド溶液を蒸留し、切断混合物溶液を全て除去し、次いで、HPLC精製のために乾燥残渣をH2O/CH3CN(1/1)に再溶解した。精製されたグリコペプチドを凍結乾燥し、純粋なグリコペプチド(18%の収率)を得た。ESI−MS:3528Da。(ペプチド塊は、ペプチドの観察されたプロトン化状態の全てからの実験的質量/電荷(m/z)比から再構築した)。
チオエステルペプチドCys(Acm)37−Gly52の合成
チオエステルペプチドの合成は、3−(トリチルチオ)プロパン酸をMBHA−樹脂LLへのプレローディングから始めた。プレローディング手順の詳細は、J.Am.Chem,Soc.2006,128,5626−5627に見ることができ、該文献は参照により本明細書に組み込まれる。
グリコペプチドチオエステルAsp1−Asn36の合成
合成は、Wangらによって、Int.J.Pept Res.Therap.2005,11,117−123に公表された手順に基づいて行った。該文献は参照により本明細書に組み込まれる。合成は、Rinkアミド樹脂から出発した。20%ピペリジン(DMF中)を用い20分(×2)処理することによりFmoc基を除去した後、HBTU(4当量)およびDIEA(10当量)のDMFカップリング溶液と2時間混合することにより、樹脂をFmoc−Asp−Oアリル(4当量)でロードした。その後、樹脂をDMF(4mL×4)で洗浄し、次いでAc2O/DIEA/DMF(1:2:17)を用いて樹脂上の遊離アミンのアセチル化を20分行った。その後、樹脂を、DMF(4mL×4)、DCM(4mL×4)およびDMF(4mL×4)で洗浄した。Fmoc−SPPSを、HBTU/DIEAカップリング条件を用いて行った。グリコシル化アミノ酸をカップリングするために、2当量の構造ブロック16を合成に使用し、カップリング時間を1日に延ばした。樹脂上にグリコペプチドの完全な配列が完了すると、DCM中、Pd(PPh3)4(25mg/0.1mmol樹脂)およびPhSiH3(10当量)で30分(×2)処理することにより、アリル基を除去した。DCM(4mL×4)、DMF(4m×4)、次いでDCM(4mL×4)で洗浄した後、該樹脂を、エチル3−メルカプトプロピオネート(24当量)、DIEA(37.5当量)、無水HOBt(30当量)、DIC(30当量)およびDCM/DMF(1/4)を含む反応溶液と6時間(×2)混合することによって、遊離酸をチオエステルに変換した。その後、樹脂を、DCM(4mL×4)、DMF(4m×4)、次いでDCM(4mL×4)で洗浄した。TFA/H2O/チオアニソール/TES(17/1/1/1)での処理により、完全脱保護とともに、グリコペプチドを樹脂から切断した。粗生成物をHPLC精製に供し、純粋な生成物を9%の収量で得た。ESI−MS:3977Da。(ペプチド塊は、ペプチドの観察されたプロトン化状態の全てからの実験的質量/電荷(m/z)比から再構築された)。
糖補助連結反応(SAL)の一般的手順
保護されていないペプチドセグメントの連結反応は、以下のようにして行った。反応の前、連結反応溶液(6MのGn−HCl、0.2Mリン酸緩衝液、pH8.5)を10分間脱ガスした。続いて、グリコペプチドおよびチオエステルペプチドを、Ar下で、連結反応溶液に溶解した。反応は37℃で行い、周期的にボルテックスし、反応混合物を平衡化した。HPLCまたはLC/MS分析の前に、TCEP(60mM)または10%(v/v)の2−メルカプトエタノールを加え、形成されたジスルフィド結合を減らした。
脱硫の一般的手順
脱硫反応は、室温で、15mMのTCEPを含む、6MのGn−HCl、0.2Mリン酸緩衝液、pH5.8の溶液中で行った。緩衝液は、使用する前、該溶液にArを10分バブリングすることにより脱ガスした。Pd/Al2O3(グリコペプチドの重さの15倍)の添加の後、H2バルーンを使用して、反応混合物をH2下に保った。脱硫反応は、分析HPLCクロマトグラフィおよびLC/MSによってモニタリングした。反応が完了すると、Pd/Al2O3を遠心分離によって沈降させ、上澄み液をHPLC精製のために集めた。
ジプテリシングリコペプチドセグメントCys(Acm)37−Phe82からのAcm基の除去
Cys(Acm)37−Phe82(3mg)を、30当量のHg(OAc)2を含む10%AcOH(pH4.0)、1mLに溶解した。反応混合物をよく混合し、室温で1時間攪拌した。反応が成し遂げられると、120当量のDTTを加え、混合物を12時間反応させると、全てのHg(OAc)2が析出した。その後、黒色析出物を沈降させ、上澄み液をHPLC精製のために集めた。
ジプテリシングリコペプチドCys37−Phe82およびジプテリシングルコペプチドチオエステルAsp1−Asn36のネイティブケミカルライゲーション(NCL)
グリコペプチドセグメントCys37−Phe82(2.9mM)およびグリコペプチドチオエステルセグメントAsp1−Asn36(4.4mM)の連結反応を、37℃で、2%(v/v)のチオフェノールおよび2%(v/v)ベンジルメルカプタンを含む、6MのGn・ΗCl、200mMリン酸緩衝液、pH7.9の溶液中で行った。16時間後、連結反応が完了したことが観察され、連結反応生成物をESI−MSによって確認した。HPLC精製後、純粋な生成物が47%で観察された。
3−O−メルカプトアセチルセリン試薬35の合成
a)Ac2O、AcOH、Zn微粉、91%;b)Pd(PPh3)4、NMA、THF;c)NaOMe、MeOH、pH9;d)臭化アリル、DIEA、DMF;e)ベンズアルデヒドジメチルアセタール、p−TsOH、MeCN、32から、51%;f)TrtSCH2COOH、DIC、DMAP、CH2Cl2、0℃、91%;g)Pd(PPh3)4、NMA、THF、91%。AcOH=酢酸、NMA=N−メチルアニリン、DIEA=N,N−ジイソプロピルエチルアミン、p−TsOH=p−トルエン−4−スルホン酸、Troc=2,2,2−トリクロロエチルカルバメート、Trt=トリチル、DIC=N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、DMAP=4−ジメチルアミノピリジン。
Rf(3:1v/v酢酸エチル/ヘキサン)=0.23;1H−および13C−NMRスペクトルデータは、文献23で報告されたデータと一致した。HRMS(ESI−TOF)C35H40N2O13[M+H]+について計算値:697.2603。測定値:697.2602。
Rf(1:1v/vヘキサン/酢酸エチル)=0.57;
Rf(95:5v/vジクロロメタン/メタノール)=0.26;
3−O−メルカプトアセチル−2−アセタミドグルコシルペプチドフラグメントの固相ペプチド
分析HPLCは、分析カラム(Grace Vydac「タンパク質およびペプチドC18」、150×4.6mm、粒径:10μm、流速:1.5ml/分)を使用して、Hitachi(D−7000HPLCシステム)装置で行った。セミ分取HPLCは、セミ分取カラム(Grace Vydac「タンパク質およびペプチドC18」、250×10mm、粒径:10〜15μm、流速:4mL/分)を使用して、Hitachi(D−7000HPLCシステム)装置で行った。分取HPLCは、分取カラム(Grace Vydac「タンパク質およびペプチドC18」、250×22mm、粒径:10〜15μm、流速:8mL/分)を使用して、Hitachi(D−7000HPLCシステム)装置で行った。シグナルの検出は、フォトダイオードアレイ検出器を用い、λ=280nmの波長で行った。溶出液A(水中0.1%TFA)およびB(アセトニトリル中0.1%TFA)を、50℃の線形勾配において使用した。勾配:30分で、A:0%B→80%B。
水は、Milli−Q超純粋精製システム(Millipore社)から取った。DMFは、バイオテク級のものを購入した。市販の試薬は、Sigma−AldrichまたはAcros Organicsから購入し、さらに精製することなく使用した。テトラヒドロフラン(THF)はナトリウム/ベンゾフェノンで蒸留し、ジクロロメタン(CH2Cl2)は塩化カルシウムで蒸留した。他の無水物級の溶媒は、Sigma−Aldrichから購入し、直接使用した。分子ふるい(AW300)は、グリコシル化実験の前に、新しく粉砕し、直接火炎乾燥した。分析薄層クロマトグラフ(TLC)は、シリカゲル60F254ガラスプレートを使用して行った。化合物スポットは、酸性モリブデン酸セリウムアンモニウムで染色し、UV光(254nm)によって視覚化した。フラッシュクロマトグラフィは、シリカゲル60Geduran(35〜75μm、EMD Science)で行った。樹脂、保護されたアミノ酸類およびPyBOPは、Novabiochemから購入した。重水素化溶媒は、Cambridge Isotope Laboratories社から購入した。
1H−NMRおよび13C−NMRは、それぞれ、600MHzおよび150MHzで操作し、CryoProbeを備えるBruker DRX−600スペクトロメータを使用して記録した。カップリング定数(J)は、可能な場合は、ヘルツ(Hz)で報告し、化学シフトは、テトラメチルシラン(TMS、0.00ppm)に対する百万分率(ppm)として報告する。
MALDI−TOF質量スペクトルは、PerSeptive BiosystemsのVoyager−DE Pro生体分光光度ワークステーションで測定した。0.1%TFAを含む10mg/mlのα−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸溶液を、プローブ−マトリックス混合物を生成するために使用した。
ペプチド合成
Torviqから購入した、テフロン(登録商標)フィルターを備えたシリンジ中で、固相化学を行った。
Fmoc法によるグリコペプチド固相合成:Fmoc切断:樹脂を10%のピペリジン/DMF(2×5分)で処理した後、洗浄(5×DMF、5×DCM、5×DMF)した。カップリング:4当量のPyBOPおよび8当量のNMMを使用して、4当量の保護アミノ酸(最終濃度:DMF中0.1M)を5分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。30分後、樹脂を、DMF(5×)、DCM(5×)およびDMF(5×)で洗浄した。キャッピング:無水酢酸/ピリジン(1:9)を樹脂に加えた。5分後、樹脂を、DMF(5×)、DCM(5×)およびDMF(5×)で洗浄した。糖含有モノマーのカップリング:1当量のPyBOPおよび2当量のNMMを使用して、1当量の構造ブロック(最終濃度:DMF中0.1M)を5分間予備活性化した後、該溶液を樹脂に加えた。6時間後、樹脂を、DMF(5×)、DCM(5×)およびDMF(5×)で洗浄した。切断:TFA、チオアニソール、トリイプロピルシランおよび水(17:1:1:1)の混合物を加えた。2時間後、樹脂をTFA(4×4mL)で洗浄した。検査:合わせた溶液を、真空濃縮した。残渣を水に溶解し、分取HPLCで精製し、MALDI−TOF/MS(マトリックス:α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸)で分析した。
SPPSにより生成されるペプチドチオエステル類
グリコペプチド類(1.5当量、約3μmol)を、脱酸素化連結反応緩衝液(4:1v/vN−メチル−2−ピロリジノン;6Mのグアニジン塩酸塩、1MのHEPES、pH=8.5)に溶解した。この溶液を、ペプチドチオエステル(約2μmol)を含むエッペンドルフチューブに移した。チオフェノール(2体積%、3μl)を加え、反応系を緩やかに混合した。連結反応混合物を、LC−MSが反応の完了を示すまで、12時間毎に緩やかに混合しながら、37℃で培養した。
連結反応生成物
収率:69%。MALDI−TOF(m/z):1446.2([M+H]+、理論値:1446.6)。HPLC:tR:8.7分(勾配A);C62H92N16O22S(1445.6)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1371.8([M+H]+、理論値:1372.5)。HPLC:tR:7.8分(勾配A);C60H90N16O21(1371.5)。
収率:84%。MALDI−TOF(m/z):1451.7([M+H]+、理論値:1452.6)。HPLC:tR:8.7分(勾配A);C60H90N16O22S2(1451.6)
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1378.3([M+H]+、理論値:1378.5)。HPLC:tR:8.1分(勾配A);C58H88N16O21S(1377.5)
収率:28%。MALDI−TOF(m/z):1533.1([M+H]+、理論値:1532.7)。HPLC:tR:8.9分(勾配A);C64H94N18O22S2(1531.7)
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1458.0([M+H]+、理論値:1458.6)。HPLC:tR:8.3分(勾配A);C62H92N18O21S(1457.6)。
収率:27%。MALDI−TOF(m/z):1612.4([M+H]+、理論値:1612.8)。HPLC:tR:8.1分(勾配A);C68H99N20O22S2(1611.8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1538.0([M+H]+、理論値:1538.7)。HPLC:tR:7.6分(勾配A);C66H96N20O21S(1537.7)。
収率:38%。MALDI−TOF(m/z):1509.3([M+H]+、理論値:1510.6)。HPLC:tR:9.3分(勾配A);C62H92N16O24S2(1509.6)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1435.9([M+H]+、理論値:1436.5)。HPLC:tR:8.2分(勾配A);C60H90N16023S(1435.5)。
収率:22%。MALDI−TOF(m/z):1590.5([M+H]+、理論値:1590.7)。HPLC:tR:8.3分(勾配A);C66H97N18O24S2(1589.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1514.6([M+H]+、理論値:1516.6)。HPLC:tR:8.3分(勾配A);C64H94N18O23S(1515.6)。
収率:40%。MALDI−TOF(m/z):1616.4([M+H]+、理論値:1616.7)。HPLC:tR:9.9分(勾配A);C69H98N16O25S2(1615.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1541.8([M+H]+、理論値:1542.6)。HPLC:tR:8.8分(勾配A);C67H96N16O24S(1541.6)。
収率:28%。MALDI−TOF(m/z):1466.2([M+H]+、理論値:1466.6)。HPLC:tR:9.8分(勾配A);C61H92N16O22S2(1465.6)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1392.5([M+H]+、理論値:1392.5)。HPLC:tR:8.6分(勾配A);C59H90N16O21S(1391.5)。
収率:32%。MALDI−TOF(m/z):1637.5([M+H]+、理論値:1638.8)。HPLC:tR:9.6分(勾配A);C71H100N18023S2(1637.8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1564.6([M+H]+、理論値:1564.7)。HPLC:tR:8.4分(勾配A);C69H98N18O22S(1563.7)。
収率:40%。MALDI−TOF(m/z):1548.2([M+H]+、理論値:1546.7)。HPLC:tR:9.6分(勾配A);C65H96N18O22S2(1545.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1472.6([M+H]+、理論値:1472.6)。HPLC:tR:8.2分(勾配A);C63H94N18O21S(1471.6)。
収率:59%。MALDI−TOF(m/z):1524.8([M+H]+、理論値:1524.7)。HPLC:tR:9.8分(勾配A);C63H94N16O24S2(1523.6)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1450.8([M+H]+、理論値:1450.5)。HPLC:tR:8.2分(勾配A);C61H92N16O23S(1449.5)。
収率:62%。MALDI−TOF(m/z):1531.3([M+H]+、理論値:1532.7)。HPLC:tR:9.2分(勾配A);C64H94N18O22S2(1531.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1459.7([M+H]+、理論値:1458.6)。HPLC:tR:7.8分(勾配A);C62H92N18O21S(1457.6)。
収率:65%。MALDI−TOF(m/z):1559.6([M+H]+、理論値:1559.7)。HPLC:tR:9.8分(勾配A);C68H103N17O23S(1558.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1485.2([M+H]+、理論値:1485.6)。HPLC:tR:8.9分(勾配A);C66H101N17O22(1484.6)。
収率:58%。MALDI−TOF(m/z):1625.7([M+H]+、理論値:1625.8)。HPLC:tR:9.3分(勾配A);C71H105N19O23S(1624.8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1551.7([M+H]+、理論値:1551.7)。HPLC:tR:8.2分(勾配A);C69H104N19O22(1550.7)。
収率:48%。MALDI−TOF(m/z):1565.4([M+H]+、理論値:1565.7)。HPLC:tR:10.0分(勾配A);C66H101N17O23S2(1564.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1491.7([M+H]+、理論値:1491.6)。HPLC:tR:9.0分(勾配A);C64H99N17O22S(1490.6)。
収率:66%。MALDI−TOF(m/z):1550.8([M+H]+、理論値:1551.7)。HPLC:tR:9.4分(勾配A);C55H99N17O23S2(1550.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1477.3([M+H]+、理論値:1477.6)。HPLC:tR:8.4分(勾配A);C63H97N17O22S(1476.6)。
収率:68%。MALDI−TOF(m/z):1545.5([M+H]+、理論値:1545.7)。HPLC:tR:9.9分(勾配A);C57H101N17O23S(1544.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1471.7([M+H]+、理論値:1471.6)。HPLC:tR:8.5分(勾配A);C65H95N17O22(1470.6)。
収率:60%。MALDI−TOF(m/z):1632.2([M+H]+、理論値:1631.8)。HPLC:tR:9.3分(勾配A);C69H103N19O23S2(1630.8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1557.9([M+H]+、理論値:1557.7)。HPLC:tR:8.3分(勾配A);C67H101N19O22S(1556.7)。
収率:45%。MALDI−TOF(m/z):1657.5([M+H]+、理論値:1657.8)。HPLC:tR:10.6分(勾配A);C72H105N17O24S2(1656.8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1583.1([M+H]+、理論値:1583.7)。HPLC:tR:9.6分(勾配A);C70H103N17O23S(1582.7)。
収率:55%。MALDI−TOF(m/z):1630.3([M+H]+、理論値:1631.8)。HPLC:tR:9.0分(勾配A);C69H103N19O23S2(1630.8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1558.3([M+H]+、理論値:1557.7)。HPLC:tR:8.2分(勾配A);C67H101N19O22S(1556.7)。
収率:23%。MALDI−TOF(m/z):1647.3([M+H]+、理論値:1645.8)。HPLC:tR:10.2分(勾配A);C70H105N19O23S2(1644.8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1571.0([M+H]+、理論値:1571.7)。HPLC:tR:9.5分(勾配A);C68H103N19O22S(1570.7)。
収率:40%。MALDI−TOF(m/z):1712.4([M+H]+、理論値:1711.9)。HPLC:tR:8.5分(勾配A);C73H107N21O23S2(1710.9)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1638.6([M+H]+、理論値:1637.8)。HPLC:tR:8.6分(勾配A);C71H105N21O22S(1636.8)。
収率:39%。MALDI−TOF(m/z):1737.5([M+H]+、理論値:1737.9)。HPLC:tR:10.4分(勾配A);C76H109N19O24S2(1736.9)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1663.4([M+H]+、理論値:1663.8)。HPLC:tR:9.5分(勾配A);C74H107N19O23S(1662.8)。
収率:81%。MALDI−TOF(m/z):1608.5([M+H]+、理論値:1609.8)。HPLC:tR:9.8分(勾配A);C67H101N17O25S2(1608.7)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1535.2([M+H]+、理論値:1535.7)。HPLC:tR:9.0分(勾配A);C65H99N17O24S(1534.6)。
収率:50%。MALDI−TOF(m/z):1623.3([M+H]+、理論値:1623.8)。HPLC:tR:10.2分(勾配A);C68H103N17O25S2(1622、8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1548.8([M+H]+、理論値:1549.7)。HPLC:tR:9.3分(勾配A);C66H101N17024S(1548.7)。
収率:60%。MALDI−TOF(m/z):1687.8([M+H]+、理論値:1689.8)。HPLC:tR:9.4分(勾配A);C71H105N19O25S2(1688.8)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1616.0([M+H]+、理論値:1615.7)。HPLC:tR:8.6分(勾配A);C69H103N19O24S(1614.7)。
収率:37%。MALDI−TOF(m/z):1714.9([M+H]+、理論値:1715.9)。HPLC:tR:10.6分(勾配A);C74H107N17O26S2(1714.9)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1640.8([M+H]+、理論値:1641.8)。HPLC:tR:9.9分(勾配A);C72H105N17O25S(1640.8)。
収率:62%。MALDI−TOF(m/z):1664.0([M+H]+、理論値:1664.9)。HPLC:tR:11.3分(勾配A);C71H110N18O24S2(1663.9)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1588.7([M+H]+、理論値:1590.8)。HPLC:tR:11.0分(勾配A);C69H108N18O23S(1589.8)。
収率:81%。MALDI−TOF(m/z):1745.2([M+H]+、理論値:1745.0)。HPLC:tR:10.8分(勾配A);C75H114N20O24S2(1744.0)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1670.0([M+H]+ 3、理論値:1670.9)。HPLC:tR:9.5分(勾配A);C73H112N20O23S(1669.9)。
収率:56%。MALDI−TOF(m/z):1722.0([M+H]+、理論値:1721.9)。HPLC:tR:11.4分(勾配A);C73H113N19O25S2(1720.9)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1647.5([M+H]+、理論値:1647.8)。HPLC:tR:10.0分(勾配A);C71H111N19O24S(1646.8)。
収率:62%。MALDI−TOF(m/z):1778.8([M+H]+、理論値:1779.0)。HPLC:tR:10.8分(勾配A);C75H116N20O26S2(1778)。
収率:>95%。MALDI−TOF(m/z):1704.9([M+H]+、理論値:1704.9)。HPLC:tR:10.4分(勾配A);C73H114N20O25S(1703.9)。
N末端延長グリコペプチド試薬の合成
N末端延長グリコペプチド類44〜48の合成は、Fmoc−保護Rinkアミド樹脂から出発して、Fmoc法に準じて固相ペプチド合成(SPPS)により行った。不必要なモノマーの消費を避けるため、1当量だけを使用し、反応時間を6時間に増やした。302nmでのFmoc/ピペリジン付加物のUV吸収により、これらの条件が許容しうるカップリング収率を提供することを示唆した。立体障害方側鎖を持つアミノ酸類は、N末端をグリコシル化アミノ酸に導入し、糖タンパク質配列を負荷する方法の適応性を実証した。たとえば、グリコペプチド48は、N末端グリシンの導入前、配列:Ala−Ser−Arg−Val−Leu(配列番号:63)を含む。所望のアミノ酸配列をカップリングした後、先ずヒドラジンを使用してアセテート基を除去し、そして樹脂をトリフルオロ酢酸/チオアニソール/トリイソプロピルシラン/水(85:5:5:5)で処理し、トリチル保護基、側鎖保護基を切断し、固体支持体からオリゴマーを放出させた。HPLCによる精製後、グリコペプチド類44〜48を46%と52%との間の収率で得た。
延長糖補助連結反応
アミノ酸類グリシン、ヒスチジン、アラニンおよびチロシンをC末端に持つチオエステル類を、Boc法によるSPPSを使用して合成した。
(配列番号:64は、非修飾アミノ酸類に相当する)。
反応速度研究
これらの研究から、アミノ酸類をグリコペプチド類のN末端に付加させると、連結反応収率に、有意な減少があることが明らかになる。得られる単離収率にいくらかの光明を投じることを期待して、研究の次の段階は、反応の速度論を分析することに関する。この目的のために、延長SAL方法の速度を、先に報告されたSAL方法と比較した。生成物形成の速度を、HPLCにより、最初の11時間は2時間ごとにモニタリングし、終点は24時間後とした。SAL反応の半減期は9時間であり、12時間の半減期を示したexSAL反応より僅かに速かった。連結反応速度は、追加のアミノ酸類がN末端に付加されると、より遅くなり始めた。興味深いことに、dexSAL、texSALおよびqexSAL反応は、19時間の半減期を持つ連結反応と類似する速度を示した。pexSALにおける第6番目のアミノ酸残基の付加により、連結反応速度が大きく落ちる結果となり、そのため、反応は、24時間後に42%しか進まなかった。これらの反応速度研究により、SALは、その延長された相当物より容易であるが、これらの速度は、大きさの順番によって異ならず、このように、これら延長方法の全て(exSAL、dexSAL、texSAL、qexSALおよびpexSAL)は、合成的に有用であることが示される。
exSALの範囲
exSAL中の連結反応部にある他のアミノ酸残基の効果を研究するために、以下に示すグリコペプチド−ペプチドチオエステル対を調べた。N末端ヒスチジンを含有するグリコペプチド類と、アスパラギン酸残基とを、SPPS(Fmoc法)により合成した。これらを、C末端グリシン、ヒスチジンおよびアラニン残基を含むペプチドチオエステル類と、混合溶媒系で反応させた。グリコペプチド44と、C末端グリシンを有するペプチドチオエステル49との間の連結反応では、86%の単離収率を得た。(上記エントリー1)。C末端ヒスチジン残基を含有するペプチドチオエステルは、先に報告したSAL法に従って、良好な収率(70%、以下のエントリー2)で連結反応させた。チオエステル成分のC末端アミノ酸の立体的嵩高さの増加によって、連結反応効率は実質的に減少した(Ala−Glyが44%、以下のエントリー3)。N末端アスパラギン酸残基を有するグリコペプチド類は、注目に値する連結反応効率を達成した。このグリコペプチドを利用した単離連結反応収率は、グリシングリコペプチド44の単離連結反応収率(64〜91%の収率、以下のエントリー7〜9)を超えていた。驚くべきことに、立体的に困難な連結反応部、たとえばHis−His(73%、以下のエントリー5)、Ala−His(77%、以下のエントリー6)およびHis−Asp(91%、以下のエントリー8)でさえ、優れた収率を示した。
(配列番号:70は、非修飾アミノ酸類に相当する)。
dexSAL方法を、種々のアミノ酸類に連結反応部で適用することにより、さらなる延長の範囲を試験した(以下を参照)。グリコペプチド類は、SPPS(Fmoc法)により合成した。これらのグリコペプチド類を、先に記載した混合溶媒系を使用して、C末端グリシン、アラニン、ヒスチジンおよびチロシン残基を有するペプチドチオエステル類と反応させた。グリシングリコペプチド類を使用する反応により、連結反応生成物を良好な収率(44〜70%)で得た。対照的に、N末端ヒスチジン残基を含有するグリコペプチド類は、延長SAL法(24〜48%)と比べると、著しく低い収率で連結反応した。Gly−HisおよびHis−His連結反応は、十分な収率で単離したが、立体的に妨害されたアラニンおよびチロシンペプチドチオエステル類の導入により、収率が著しく低下する(それぞれ28%および24%)結果となった。アスパラギン酸塩で延長されたグリコペプチド類は、全てのケースにおいて、高収率(49〜76%)で連結反応させた。
(配列番号:70は、非修飾アミノ酸類に相当する)。
(配列番号:70は、非修飾アミノ酸類に相当する)。
Claims (40)
- 式(I):
mは、0〜約10であり;
nは、1〜約4であり;
RaおよびRbは、それぞれ独立して各部位で、Hまたはアルキルであり、またはRaとRbとが一緒になって、オキソ(=O)であり;
pは、1、2または3であり;
Xは、OまたはCHR3であり;
各R3は、独立して各部位で、水素、(C1−C3)アルキル、ヒドロキシまたはヒドロキシ(C1−C3)アルキルであり、任意のヒドロキシまたはヒドロキシアルキルは、単糖類、二糖類、オリゴ糖またはヒドロキシ保護基でO置換されていてよく;ただし、1個のR3は、−OC(=O)(CH(RS))nSHまたは−NHC(=O)(CH(Rs))nSH(式中、Rsは、独立して各部位で、水素または(C1−C6)アルキル((C1−C6)アルキルの任意の炭素原子は、Jで置換されていてよい)であり、sは1〜約6である)を含み;
Yは、C(R4R5)、O、NHまたはSであり;
R4およびR5は、それぞれ独立して、H、アルキルまたはJであり;
XおよびYを有する炭素原子は、RまたはS配置であり;
各NRは、独立して、NHまたはN(C1−C3)アルキルであり、またはNRは、NRを有する炭素原子に結合するRcまたはReと一緒になって、4〜7員環を形成することができ、または、
各Rc、Rc’、ReおよびRe’は、独立して各部位で、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリル、あるいはブロックされていなくても保護基でブロックされていてもよい天然のアミノ酸の側鎖であり;あるいはRcおよびRc’またはReおよびRe’、あるいは両方が、これらが結合する炭素原子と一緒になって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成し;任意のアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキルまたはヘテロシクリルは、0〜3個のJで置換され;
Jは、ハロゲン、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、(C1−6)アルキル、(C1−6)アルコキシ、シクロアルキル、カルボキシ;アセタミド、ヒドロキシ、ヒドロキシ(C1−6)アルキル、トリフルオロメトキシ、スルファモイル、カルバモイル、スルホンアミド、アルキルスルホニルまたはアリールスルホニルであり;
R1およびR2は、それぞれ独立して、ペプチド残基またはグリコペプチド残基である)の化合物、およびその任意の立体異性体、互変異性体、溶媒和物、水和物、または塩を製造する方法であって、
式(II):
- RsはHであり、sは1である請求項1に記載の方法。
- pは、1または2であり、WはOである請求項1に記載の方法。
- pは、1または2であり、WはNHである請求項1に記載の方法。
- nは1であり、YはOであり、RaはHまたはメチルであり、RbはHである請求項1に記載の方法。
- YはNHであり、(CRaRb)nは、−CH2C(O)−または−(CH2)2C(O)−である請求項1に記載の方法。
- Rdは、メチル、フェニルまたは−(CH2)2C(O)NH2である請求項1に記載の方法。
- mは、1、2、3、4、5または6である請求項1に記載の方法。
- XおよびYを有する炭素原子が、R配置である請求項1に記載の方法。
- XおよびYを有する炭素原子が、S配置である請求項1に記載の方法。
- R2は、フェニルアラニンアミドである請求項1に記載の方法。
- R1は、N−アセチル−Leu−Tyr−Arg−Ala(配列番号:1)である請求項1に記載の方法。
- 式(II)の化合物のN末端アミノ酸残基のReおよびRe’が、両方Hである請求項1に記載の方法。
- XがOである請求項1に記載の方法。
- XがCHOHである請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、水溶液中で接触することを含む請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、アルカリ水溶液中で接触することを含む請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、グアニジンを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、チオールを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項1に記載の方法。
- 前記接触が、チオフェノールを含むアルカリ水溶液中で接触することを含む請求項1に記載の方法。
- 前記接触を、約35℃〜約40℃で行う請求項1に記載の方法。
- 式(III)の化合物の濃度が、約5mM〜約20mMである請求項1に記載の方法。
- 式(III)の化合物の濃度が、約7.5mM〜約15mMである請求項1に記載の方法。
- 式(II)の化合物および式(III)の化合物を、約0.8〜約1.2のモル比で使用する請求項1に記載の方法。
- 式(I)の化合物を、少なくとも約70モル%の収率で得る請求項1に記載の方法。
- 式(I)の化合物を、約90%を超える純度で得る請求項1に記載の方法。
- 前記接触を、約6時間〜約24時間の間で行う請求項1に記載の方法。
- 前記接触を、約6時間〜約18時間の間で行う請求項1に記載の方法。
- さらに、式(I)の化合物をHPLCにより精製することを含む請求項1に記載の方法。
- さらに、式(I)(式中、Wは、OまたはNHである)の化合物を、触媒の存在下、水素源と接触させることによって、該化合物を脱硫することを含む請求項1に記載の方法。
- 前記水素源が水素ガスである請求項30に記載の方法。
- 前記触媒が、パラジウム族の金属である請求項30に記載の方法。
- 前記触媒が、パラジウム金属である請求項30に記載の方法。
- 前記水素源が、ホウ化水素塩である請求項30に記載の方法。
- 前記水素源が、ホウ化水素ナトリウムである請求項30に記載の方法。
- 前記触媒が、ラネーニッケルである請求項30に記載の方法。
- 前記接触が、水溶液中で接触させることを含む請求項30に記載の方法。
- 前記接触が、グアニジンを含む水溶液中で接触させることを含む請求項30に記載の方法。
- さらに、式(I)(式中、WはOである)の化合物を、ヒドラジンまたはアルカリ溶液と接触させることによって、該化合物を脱硫させることを含む請求項1に記載の方法。
- 請求項1の方法で製造された式(I)の化合物。
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