JP2009527321A

JP2009527321A - 薬剤の細胞中へのアバランシェ媒介導入のための方法および装置

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Publication number: JP2009527321A
Application number: JP2008556302A
Authority: JP
Inventors: アレクサンダーバンコブ; トマスダブリュー．ジュニアチャルバーグ; フィリップジュニアヒュイ; ダニエルブイ．パランカー
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2006-02-22
Filing date: 2006-09-22
Publication date: 2009-07-30
Also published as: US20070059835A1; WO2007106136A3; AU2006340055A1; EP1989317A4; CA2643078A1; US8101169B2; EP1989317A2; WO2007106136A2

Abstract

本発明は、薬剤を細胞中に導入するための方法および装置を提供する。本方法は、薬剤を細胞の外部に提供する段階、ならびに、アバランシェ電極と細胞の周囲の導電性流体との間に蒸気泡およびプラズマ放電を生成する段階を含む。蒸気泡およびプラズマ放電は、それぞれ機械的応力波および電界を生成する。本機械的応力波および電界の組み合わせが、細胞の透過化をもたらし、次に薬剤の細胞中への導入をもたらす。

Description

発明の分野
本発明は、概して細胞生物学および分子生物学に関する。より詳しくは、本発明は、薬剤を細胞中へ導入するための、細胞膜の透過化のための方法および装置に関する。

背景
インジェクション、エレクトロポレーション、超音波導入(sonophoresis)などを含む、生物学的細胞への薬物(または他の材料)の送達のための多種多様の物理的方法が公知である。細胞膜中に自己治癒性の孔の形成を伴うエレクトロポレーションは、相当な関心を引く。この関心の主要な理由は、エレクトロポレーションが化学的送達法よりも有効である傾向があることである。したがって、超音波導入およびエレクトロポレーションの併用を含めて、エレクトロポレーションの多くの変種が研究されてきた。

裸のDNAの送達のためのエレクトロポレーションなどの物理的アプローチは、将来有望で急速に拡大する分野に相当する。物理的方法を用いた細胞への「分子送達」は、DNA、RNA、siRNA、オリゴヌクレオチド、タンパク質、および、薬物または色素などの低分子の送達を包含する。エレクトロポレーションは、DNA導入のためのツールとして幅広い支持を獲得してきており、多くの適用について好ましい非ウイルス法である。大抵のプロトコールにおいて、細胞をキュベット中に懸濁し、平等電界を達成するように平板電極を用いて電気パルス列に曝露し、その後培養に戻す。エレクトロポレーションの主要な利点は、理論的にはほぼすべての細胞タイプに有効であることである。これらの利点にもかかわらず、細胞死の高い割合およびインサイチュー法での難しさが、多くの適用についていまだ問題である。したがって、DNAおよび他の低分子の生物学的細胞中への導入のための新規の方法を開発する必要性が当技術分野において存在する。

発明の概要
本発明は、薬剤を細胞中に導入するための方法および装置を提供する。本方法は、薬剤を細胞の外部に提供する段階、ならびに、アバランシェ電極と細胞の周囲の導電性流体との間に蒸気泡およびプラズマ放電を生成する段階を含む。蒸気泡およびプラズマ放電は、それぞれ機械的応力波および電界を生成する。本機械的応力波および電界の組み合わせが、細胞の透過化をもたらし、次に薬剤の細胞中への導入をもたらす。

アバランシェ電極と導電性流体との間に蒸気泡およびプラズマ放電を生成するために、アバランシェ電極とリターン電極との間に好ましくは不平等電界が生成される。アバランシェ電極の周りの電界の一部は、プラズマ放電および蒸気泡を生成するのに十分強い必要がある。電界は、電極の形状に依存して、好ましくは約0.1 kV/cm〜約100 kV/cmの範囲である。本電界強度を達成するために、約100 V〜約10 kVの間の電圧がアバランシェ電極に印加されてもよい。本電圧は、単相パルスまたは二相パルスとして印加されてもよい。パルス持続時間は、好ましくは約100 ns〜約1 msの範囲である。蒸気泡およびプラズマ放電を生成するために、1〜100の間の電圧パルスがアバランシェ電極に印加されてもよい。電圧パルスは、約0.1 Hz〜約1 kHzの範囲の周波数で印加されてもよい。

本発明によると、薬剤は任意のタイプの生物学的細胞に導入されてもよい。例は、原核細胞、真核細胞、初代細胞、細胞株、および組織を含む。同様に、任意のタイプの薬剤が細胞中に導入されてもよい。例は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、治療剤、低分子、DNA、RNA、および低分子干渉RNA(siRNA)を含むが、それらに限定されない。好ましい態様において、薬剤はプラスミドDNA分子である。そのようなDNA分子は、タンパク質またはミクロRNAもしくは低分子ヘアピン型RNAなどのRNA分子をコードするカセットを含んでもよい。

本発明はまた、薬剤を細胞中に導入するための装置を提供する。本装置は、アバランシェ電極、リターン電極、電圧源、および回路を含む。アバランシェ電極は細胞の近くに配置され、かつ、プラズマ放電の間、融解に抵抗性であるのに十分高い融解温度の材料で作製される。電圧源は、アバランシェ電極とリターン電極との間に電圧を供給し、次にアバランシェ電極とリターン電極との間に不平等電界を生成する。電圧源は、アバランシェ電極の周りの不平等電界の一部がアバランシェ電極と細胞の周囲の導電媒質との間に蒸気泡およびプラズマ放電を生成するのに十分であるように、十分な強度の電圧を供給する必要がある。同様に、アバランシェ電極、リターン電極、および電圧源を接続する回路は、蒸気泡およびプラズマ放電を生成するのに十分なレベルで電流を伝導することが可能である必要がある。

発明の詳細な説明
アバランシェ法
本発明者らは、十分に高い電圧が電極に印加される際、電流のパルスと同調された機械的応力波が生成されて細胞に印加され得ることを発見した。これが次に細胞の透過化をもたらし、細胞の外部にある薬剤の細胞中への導入を可能にする。図1A〜Cは、絶縁体120によって覆われた電極110に高電圧が印加される際に起きる三段階を示す。電極110は、導電性液体培地132、細胞134、および薬剤136を有する組織培養ウェル130中に位置している。(本図において細胞が描かれているが、組織も使用され得る。)電圧が最初に電極110に印加される際(図1A)、電極110の絶縁されていない部分の周りに電界140が生成される。培地における電界が十分に高い場合は、生成されたジュール熱が電極110に隣接した領域において液体培地132の急速な蒸発をもたらし、結果として蒸気泡150の生成をもたらす(図1B)。蒸気泡150は形成されるや否や、電流が流れるのを止め、かつ標的細胞上の電界が終結するように、電極110の表面を導電媒質132から遮断する。この困難さを克服するため、図1Cに示されるように、泡における蒸気は、電気伝導性を回復するイオン化蒸気160を形成するためにイオン化され得る。プラズマとしても公知であるイオン化蒸気160は、電界170を有する一種の仮想電極を形成する。この過程の間に、蒸気泡の形成およびその後の崩壊は、培地を通して伝播する衝撃波を引き起こし、細胞または組織を機械的応力180に曝露する。衝撃波および電界の組み合わせは、薬剤136が細胞132に入り得るような細胞132の透過化をもたらす(図1D)。プラズマ媒介放電における電子なだれ(electron-avalanche)の役割を強調して、本発明者らは本技術をアバランシェ法と名づけた。

図1において説明された過程は、電極の表面上の電界が比較的均一である際、または蒸気泡が電極より大きい際に働く。または、頂部に形成された蒸気空洞がより低い電界を有する電極の表面全体を覆わないように、非常に不均一な電界を有する電極が使用されてもよい。このように、培地への電流は完全には遮断されないと考えられる。不平等電界を有する電極形状の一つの例は、鋭利な末端を有する、ワイヤーなどの円筒プローブである。図2Aは、プラズマ放電220を生成するワイヤー電極210の画像を示す。図2Aから見られ得るように、プラズマ放電は明らかに目に見える。また明らかに聞こえる。図2Bは、電圧がワイヤープローブに印加された際の時間に対する電流230および電圧240を示す。この特定の例において、ワイヤープローブは直径が50μmであり、約30 kV/cmのワイヤーの先端で電界を生成するために600 Vまでの電気パルスが使用された。しかしながら、これらのパラメータは変更されてもよい。図2Bは、電圧がそのようなプローブに印加される際に、波形の最初の20μsが蒸発の始まりにより電流の減少を示すことを示す。これに続いて、蒸気空洞のイオン化の後に導電率が安定化する。図2Aに示されるように、イオン化された蒸気空洞は、プローブのサイズを大きく超過し得る一過性電極として貢献する。結果として、電界の分布は小さなワイヤー電極上で最初に生成されたものよりもずっと均一になり、したがって標的細胞または組織のより均一なエレクトロポレーションをもたらす。

図2Cは、電極の異なる直径について、絶縁体240によって覆われた電極230の長さに沿った電界強度(kV/mm)を示す。実線250によって示された電極の直径は10μmであり、点線260は25μm、破線270は50μmである。この特定の実験において、600 Vが電極に印加された。図2Cは、鋭利な先端を有する円筒電極について、電極の先端から遠くに移動するにつれて電界が急速に減少することを示す。したがって、電極の頂部での電界の強度は、電極の直径を変化させることによって変更され得る。

強い応力波を生成するために、電極表面上の電界は液体培地の急速な蒸発に十分であるべきである。加えて、電界は、接続性を維持するために、蒸気のイオン化を誘導するのに十分なほど高いべきである。このように、機械的応力波および電界の両方は、電極の表面で最大強度を有して同調され得る。これらの関心事に加えて、薬剤導入効率を最大にし、かつ細胞死を最小にするために、プラズマ放電が制御される必要がある。

上記の必要条件を満たすために、電界強度、印加電圧、パルス持続時間、パルスの数、周波数などのようないくつかのパラメータが変更されてもよい。これらのパラメータの実際の値は、具体的な電極形状に依存すると考えられる。しかしながら、一般に、印加電圧は、好ましくは約1V 〜約10 kVの範囲、より好ましくは約100 V〜約10 kVの間、最も好ましくは約100 V〜1 kVの間である。印加電圧は、好ましくは約0.1〜約100 kV/cmの間、より好ましくは約10〜約50 kV/cm、最も好ましくは約30 kV/cmの電界をもたらす。パルス持続時間は、好ましくは約1 ns〜約100 msの範囲、より好ましくは約100 ns〜約1 msの間である。単相または二相パルスのいずれかが本発明の目的のために適当である。しかしながら、より少ない気体形成、神経および筋肉応答、ならびに電極腐食をもたらすため、二相パルスが好ましい。任意の数のパルスが本発明により使用されてもよい。パルスの数は、好ましくは約1〜100の間、より好ましくは約1〜50の間である。複数のパルスが使用される際、パルスの周波数は約0.1 Hz〜約1 kHzの範囲であるべきである。好ましくは、周波数は、熱の蓄積を予防するために約1 kHz未満である。

本発明によると、薬剤は任意のタイプの生物学的細胞に導入されてもよい。例は、原核細胞、真核細胞、初代細胞、細胞株、および組織を含む。同様に、任意のタイプの薬剤が細胞中に導入されてもよい。例は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、治療剤、色素、低分子、DNA、RNA、および低分子干渉RNA(siRNA)を含むが、それらに限定されない。好ましい態様において、薬剤はプラスミドDNA分子である。

アバランシェ装置
本明細書でこの後アバランシェ装置と呼ばれる、本発明によるアバランシェ法を行うための装置は、図3に示されるようにいくつかの成分を有する。アバランシェ装置300の第一の成分はアバランシェ電極310であり、そのように呼ばれるのは蒸気泡およびプラズマ放電が生成される電極であるためである。アバランシェ電極310は、薬剤の細胞中への導入が望ましい細胞(示されていない)の近くに配置される。好ましくは、アバランシェ電極310は、細胞から約0.01 mm〜約1 cmの間、より好ましくは細胞から約0.1 mm〜約5 mmの間に配置される。アバランシェ電極310は絶縁体320によって部分的に覆われる。一つの態様において、絶縁体320は、生成された蒸気泡およびプラズマ放電のより大きな空間的制御を与えるために、アバランシェ電極310の先端以外のすべてを覆う。アバランシェ電極310は、好ましくは、プラズマ放電の間、融解に抵抗性であるのに十分高い、すなわち約1000℃および好ましくは約2000℃を超える融解温度の材料で作製される。そのような材料の例は、チタン、モリブデン、およびチタンを含むが、それらに限定されない。好ましくは、アバランシェ電極310の幅は約500μm未満である。アバランシェ電極310は、ワイヤー330を通して電圧源340に接続される。

アバランシェ装置300はまた、リターン電極350を含む。リターン電極350もまた、例えばワイヤー360を通して電圧源340に接続される。リターン電極350およびアバランシェ電極310は、同一の構造物の一部であってもよい。例えば、リターン電極350は、絶縁体320の基部に位置してもよい。

電圧源340は、アバランシェ電極310とリターン電極350との間に電圧を供給する。好ましくは、アバランシェ装置300は、アバランシェ電極310の周りの電界の一部のみが、アバランシェ電極310と薬剤の導入が望ましい細胞の周囲の導電媒質との間に蒸気泡およびプラズマ放電を生成するのに十分の強度であるように、電圧源340がアバランシェ電極310とリターン電極350との間に不平等電界を生成するように構築される。これは、アバランシェ電極310より大きいリターン電極350を作製することによって達成されてもよい。標的細胞の近傍に高い電界を維持するために、リターン電極350は、アバランシェ電極と比較して、薬剤の導入が望ましい細胞から遠くに配置されるべきである。アバランシェ電極とリターン電極との間の距離は、約0.01 mmより小さいべきでなく、好ましくは約0.1 mmより小さいべきではない。

好ましくは、ワイヤー330および360、ならびに電圧源340内の回路は、アバランシェ電極310で蒸気泡およびプラズマ放電を生成するのに十分なレベルで電圧および電流を伝導することが可能である。電圧は水におけるイオン化閾値を超えるべきであり、約200 Vのオーダーである。急速に膨張する蒸気泡の効率的な生成のために、パルス持続時間は泡の寿命を超えるべきではない。ミリメーター以下の泡の寿命は100μsを超えない(Raleigh方程式)ため、電流のパルスの立ち上がり時間はマイクロ秒の範囲であるべきである。

本発明によるアバランシェ装置は、一つより多いアバランシェ電極を含んでもよい。一つの態様において、アバランシェ装置は複数のアバランシェ電極を含む。これらの電極は好ましくはアレイに配置される。アレイは一次元的または二次元的であってもよく、かつ、任意の形状、例えば、線形、正方形、長方形、円形などであってもよい。好ましくは、アレイにおけるアバランシェ電極は、約0.5 mm〜約2 cmの間の間隔で配置される。リターン電極のアレイもまた使用されてもよい。この場合、アバランシェ電極およびリターン電極のアレイは、好ましくは交互配置される。

アバランシェ電極アレイは、表面または基板を含んでもよく、表面から突出するか、または表面に対して平面であるかいずれかである。一つの態様において、リターン電極もまた本表面の一部である。本態様において、リターン電極は表面全体または表面の一部であってもよい。または、リターン電極のアレイは、表面から突出するか、または表面に対して平面であってもよい。

アバランシェ装置の多くの態様が、本発明により可能である。以下は、いくつかの例示的態様の考察である。他の態様が可能であり、以下の例は決して限定として解釈されるべきではない。

カテーテルアバランシェ装置
図4Aは、本発明によるカテーテルアバランシェ装置400の例を図示する。カテーテルアバランシェ装置400は、血管、心筋、または肝臓中への薬剤のアバランシェ媒介導入に有用である可能性がある。装置400は、開口部412および414ならびに内腔416を有する柔軟シース410を含む。内腔416は、絶縁体430によって絶縁されるアバランシェ電極420を含む。好ましくは、アバランシェ電極420の絶縁されていない部分は、開口部414から外へ少量突出する。好ましくは、アバランシェ電極420の絶縁されていない部分は、開口部414の外へ約1 mm〜約1 cm突出する。アバランシェ電極420の絶縁された部分は、示されるように、開口部412を通って伸長し、電圧源450に接続してもよい。または、アバランシェ電極420は、開口部412を通って伸長し、電圧源450に接続するワイヤーに接続されてもよい。カテーテルアバランシェ装置400はまた、リターン電極440を含む。リターン電極440は、例えば、柔軟シース410の周りの金属のリングであってもよい。リターン電極410は、第二の絶縁されたワイヤー442に接続され、次に電圧源450に接続される。好ましい態様において、カテーテル装置400はまた、細胞中に導入するための薬剤482の供給源480を含む。好ましくはポンプ484を含む供給源480は、好ましくは、開口部412を通ってシース410に入る配管460を通って、開口部414に接続される。示されるように、配管460はアバランシェ電極420から分離されてもよい。あるいは、配管460は、例えば接着剤で絶縁体430に取り付けられてもよいし；絶縁体430に埋め込まれてもよいし；または、絶縁体430が配管460およびアバランシェ電極420の両方を包囲するように、絶縁体430によって包囲されてもよい。

好ましい態様において、カテーテルアバランシェ装置400はまた、アバランシェ電極420を使用しない際には開口部414を通して収縮させるための収縮手段470を含む。任意の収縮手段が本発明により使用されてもよい。3種類の収縮手段470の例が、図4B、C、およびDに示される。図4Bにおいて、アバランシェ電極420は、雄ねじ(external thread)432を有する絶縁体430によって覆われている。アバランシェ電極420および絶縁体430は、雌ねじ(internal thread)474を有するスリーブ472によって包囲されている。図に示されるように、スリーブ472が絶縁体430に対して回転する際に(湾曲した矢印で示されるように)、絶縁体474およびアバランシェ電極420がX軸に沿って平行移動するように、雌ねじ474は雄ねじ432と係合する。スリーブ472が回転する方向に依存して、絶縁体430およびアバランシェ電極420は延長されるかまたは収縮されるかのいずれかである。図4Cにおいて、アバランシェ電極420は再び雄ねじ432を有する絶縁体430によって覆われている。しかしながら、この場合は、ねじ付き装置480が雄ねじ432と係合する際に平行移動の動きが引き起こされる。好ましくは、ねじ付き装置480はモーター476によって動力が供給される。図4Cに示される収縮手段もまた、ねじ付き装置480を使用する。しかしながら、この場合は、ねじ付き装置480は絶縁体430上のピン482と係合する。

シリンジアバランシェ装置
図5Aは、本発明によるシリンジアバランシェ装置500の例を図示する。シリンジアバランシェ装置500は、筋肉または皮膚中への薬剤のアバランシェ媒介導入に有用である可能性がある。シリンジアバランシェ装置500は、開口部512および514ならびに内腔516を有する剛性シース510、例えば針を含む。好ましくは、剛性シース510はリターン電極として貢献し、ワイヤー560を通して電圧源570に接続される。絶縁体530によって覆われたアバランシェ電極520は、内腔516の内部に位置する。好ましくは、アバランシェ電極520は、開口部514を通して少量突出する。好ましくは、アバランシェ電極420の絶縁されていない部分は、開口部514から外へ約1 mm〜約1 cm突出する。剛性シース510はシリンジ550に接続される。アバランシェ電極520および絶縁体530はシリンジ550を通して伸長し、電圧源570に接続する。シリンジ550は、細胞中に導入される薬剤556の供給源554として貢献する。シリンジ550はまた、開口部514から薬剤556を放出するためのプランジャー552を含む。プランジャー552は好ましくは、薬剤556がシリンジ550から外へ漏れるのを予防するためにOリング542を含む。

好ましい態様において、シリンジ550はまた、アバランシェ電極520を使用しない際には剛性シース510中に収縮させるための収縮手段580を含む。収縮手段580は、好ましくはアーム582を通して供給源554に接続される。任意の収縮手段が本発明により使用されてもよい。本態様の一つの局面において、収縮手段580はボールペン機構である。本態様の別の局面において、収縮手段580は図5Bに示されるようである。本局面において、絶縁体530によって包囲されたアバランシェ電極520は、次に歯592を有するリング590によって包囲される。リング592は、ケーシング588に取り付けられているばね586に接続される。てこ機構584もまたケーシング588に取り付けられる。てこ機構584が歯592と係合する際に、ばね586が圧縮され、アバランシェ電極520が収縮される。湾曲した矢印によって示されるように、てこ機構584が持ち上げられる際に、ばね586が復元し、リング592がロッド594に接して止まり、アバランシェ電極520が開口部514を通して押し出される。

アバランシェ電極アレイを有するプローブ
図6は、アバランシェ電極610のアレイが基板620上に貼られたプローブのバージョンを示す。図6Aは上面図を示し、図6Bはプローブの側面図を示す。本プローブにおいて、基板620はリターン電極630によって包囲されている。基板620上のアバランシェ電極610のパターンは、プラズマ放電652による電界640と機械的応力波650との間の必要な割合を形成する。図6におけるプローブは、アバランシェ電極610の端612に電界640の特異点を有する。特異点は、プラズマ放電652および機械的応力波650の生成のための点火点として貢献する。図1において、プラズマは蒸気空洞の全体積を占める。対照的に、図6において、薄い電極の端での電界は平坦な部分の前よりもずっと高く、そのため、そこでは蒸発およびイオン化が最初に起こる(または始まる)と考えられる。本実施は単純かつ安価であるが、機械的および電気パルスパラメータを別々に制御するための柔軟性を提供しない。

機械的応力波750および電界740の別々の制御を可能にするもう一つのプローブの実施が、図7に示される(図7Aは上面図であり、図7Bは側面図である)。本実施において、710および712の二つのタイプの活性電極が基板720上にパターン化され、リターン電極730が基板720を包囲する。電極712は電界740を生成するように駆動されてもよく、一方、電極710はプラズマ752および機械的応力波750を生成するように駆動されてもよい。(示されていないが、プラズマ752はまた付随の電界を生成する。)応力波の振幅および電界の別々の制御は、透過化の最適化のために望ましい可能性がある。同一の電極上でこれらを生成することはこれらの値を互いに依存的にすると考えられ、一方、二つの別々の電極上での生成はこれらの現象の独立的な制御をもたらす可能性がある。

組織培養プレートのためのアバランシェ装置
図8は、本発明による付着細胞または組織への薬剤の分子送達に適するアバランシェ装置800の例を示す。本配置において、細胞810は、組織培養プレートなどの無孔基板830中に配置された付着表面820上に増殖している。付着表面820は、例えば、ポリカーボネートなどの多孔材料で作製された組織培養インサートであってもよい。細胞はまた、無孔基板830上で直接培養され得る。ゼラチン状マトリクスおよび／またはフィーダー層がまた存在してもよい(示されていない)。アバランシェ電極として貢献する柱電極842、表面844、壁846、および電圧源(示されていない)への接続部848を有するプローブ840が、薬剤860を含む溶液850中に持ち込まれる。示された態様において、表面844および壁846がリターン電極を構成する。柱電極842は、細胞810から規定された距離、例えば約1 mmに配置される。この規定された距離は、好ましくは約0.5 mm〜約2 cmの範囲である。壁846は、この規定された距離で電極を支持するために柱電極842の端を越えて伸長してもよい。加えて、柱電極842は、好ましくは約0.5 mm〜約2 cmの間隔である。

アバランシェチャンバー
図9は、本発明による溶液における細胞または組織への薬剤の分子送達に適するアバランシェ装置900の例を示す。本配置において、細胞910は、底部942ならびに側壁944および946を有するチャンバー940において、薬剤930と共に溶液920中に懸濁される。チャンバー940は、リターン電極950、少なくとも一つのアバランシェ電極960のアレイ、および電圧源(示されていない)への接続部970を含む。リターン電極950は、示されるように底部942上にあってもよいし、または、側壁944および946の一つもしくは両方の一部であってもよい。加えて、アバランシェ電極960のアレイは、示されるように両方の側壁944および966の上にあってもよいし、または、一つの側壁のみの上にあってもよい。好ましくは、側壁944および966上のアバランシェ電極960のアレイは、示されるように空間的に互い違いである。また好ましくは、側壁944と966との間の距離は、約0.5 mm〜約2 cmの間である。(一つの電極のアレイのみが使用される場合は、側壁944と966との間の距離は、この距離の約半分であるべきである。)平面電極および柱電極を含むがそれらに限定されない任意のタイプのアバランシェ電極が、本発明により使用されてもよい。アレイにおけるアバランシェ電極は、溶液体積の妥当な適用範囲を提供するために、好ましくは約0.5 mm〜約2 cmの間の間隔で配置される。アバランシェ電極960は、同時に、または代替的に活性を有することができる。好ましくは、チャンバー940はまた、示されるように、角度の付いた壁980および追加的な側壁990を含む。これは、薬剤導入が完了した後に栄養物および追加的な流体がチャンバー940に添加されることを可能にする。

組織のためのアバランシェ装置
図10は、インビボでの組織中への薬剤の導入に適するアバランシェ装置の二つの態様を示す。これらの装置は、経強膜的な適用に特に良好に適合する。装置は、表面1010およびハンドル1020を含む。表面1010は、示されるように、好ましくは二つの領域1012および1014を含む。領域1012はリターン電極として貢献する。領域1014は、好ましくは光学的に透明な材料で作製され、かつアバランシェ電極1030を含む。アバランシェ電極1030は、図10Aに示されるように表面領域1014から突出してもよいし、または、図10Bに示されるように表面領域1014に対して平面であってもよい。表面領域1014はまた、好ましくは光プローブ1050を含む。典型的には、装置はハンドル1020に取り付けられたワイヤーを通して電圧源に接続されると考えられる(示されていない)。図10Cは、図10Bに概略的に示された装置の画像を示す。

皮膚のためのアバランシェ装置
図11は、皮膚適用のために有用である可能性があるアバランシェ装置1100の態様を示す。装置1100は、絶縁体1112を有するワイヤー1110を含む。絶縁体1112は、ワイヤー1110を曝露するために規則的に配置された間隔1114で(好ましくは約0.5 mm〜2 cmの間の間隔で)除去されている。これらの曝露された領域はアバランシェ電極として貢献する。ワイヤー1110は、メッシュ1130を形成するために非導電性連結器1120によって柔軟に接続されている。メッシュ1130は、示されるように、次に手袋1140に組み込まれてもよい。一つの態様において、手袋1140は、基部にリターン電極1150を含む。手袋1140は、当技術分野において公知である任意の手段を通して電圧源(示されていない)に接続されてもよい。

実施例
実施例1：DNA導入における電子なだれ対伝統的なエレクトロポレーションの比較
エレクトロポレーションのプロトコールは異なる組織について変化するため、伝統的なエレクトロポレーションを用いて、発生中のニワトリの卵由来の漿尿膜(CAM)にトランスフェクションするための最適プロトコールを決定する実験を最初に行った。CAMは、生きていて、容易に入手可能であり、かつ安価な組織である。その上皮層は均質であり、かつ高い抵抗性を有するため、網膜色素上皮(RPE)などの上皮細胞層のための良いモデルとなる。本モデル系において、ルシフェラーゼ遺伝子をコードする100μgのpNBL2プラスミドDNAをCAM上にピペットで移し、パルスを印加した。具体的には、250-μs、150-Vの相、続いて同一の極性において5-ms、5-Vの相を印加した。1 Hzで印加された50サイクルで最適の結果が達成された。その後組織を培養して、ルシフェラーゼ生物発光についてアッセイした。本方法を用いたルシフェラーゼ発現は、約10⁴光子／秒であった。

電子なだれトランスフェクションについては、持続時間が250μsおよび振幅が600 Vである各相を有する一連の対称性二相パルスを印加するために、長さが1 mmの直径50-μmのワイヤー微小電極を使用した。微小電極は4-mm²の面積にわたってスキャンされ、およそ50パルスが印加された。図12に示されるように、結果として生じたルシフェラーゼ発現は約10⁹光子／秒であり、従来のエレクトロポレーションで見られるレベルより10,000倍高かった。

実施例2：アバランシェ媒介トランスフェクションの空間的制御
当技術分野において公知であるように、293細胞を10 cmディッシュ1310中で3％血清を加えたDMEMを用いてコンフルエントになるまで培養した。培地を除去し、2 mLのPBSを10 cmディッシュ1310へ加えた。DNAカセットがCMVプロモーターの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む、100マイクロリットルのDNAを添加した。プレートを横切って延びた細い筋において、そしてその後ジグザグパターンにおいて細胞を透過化するために、アバランシェ電極を使用した。DNAを除去し、培地を交換した。細胞を24時間培養して、生物発光の画像化に供した(IVIS 200, Xenogen Corp)。シグナル1320は陰影付けで示され、バックグラウンドはプレートの残り部分である。本実験は、アバランシェ法がインサイチューでトランスフェクションの優秀な空間的制御を提供することを示す。

実施例3：RPE層トランスフェクションのための外科的手順
ウサギの目のRPE層にトランスフェクションするために、図10に示されるような経強膜的エレクトロポレーションのためのプローブを使用した。プローブは、結膜の下でのより良好な貫通のために遠位端で湾曲した非導電性の透明なプラスチックストライプを含んだ。近位端を、アバランシェ電極およびリターン電極のための電気ケーブル、ならびに整列のための光プローブを含むハンドル上に装備した。直径が100マイクロメートルのワイヤー電極を、強膜に向かって面するようにストライプの凹状面上に集合させた。これらの微小電極を、処置のより広い表面を提供するようにアレイとして配置し、リターン電極によって包囲させた。電気刺激による筋肉収縮を回避するため、電界は標的組織の体積内に局在化されるべきである。本目的のために、小さな活性電極がリターン電極によって包囲されるべきである。結果的に、活性微小電極のアレイを包囲する広いリターン電極が電界を微小電極アレイの近傍に限定し、それによって強い筋肉収縮を予防した。一つの実施において、アレイは、タングステン微小電極の3×3アレイであり、表面平板に対して垂直であり、かつ、約0.3 mmプラスチック表面から突出していた。別のプローブは長さが0.5 mmの3個の電極を有し、プローブの表面と同一面内に配置された。

実験手順は以下のようであった。100マイクロリットルのDNAを30Gの針を用いて網膜下の空間中にインジェクションし、水疱を形成させた。水疱の下で全領域を均一に処置するために、電極に対して垂直の方向でプローブを強膜の下でスキャンさせた。両方のプローブ(すなわち、図10Aおよび10Bのプローブ)は、RPEおよび網膜へ良好なトランスフェクション効果を与え、かつ目に見える損傷を与えなかった。プローブ上の光源を、水疱の近傍において整列のために使用した。

図14は、図10A(14A)および10B(14B)におけるようなプローブを用いて、本発明の本態様により得られた結果を示す。アバランシェ法は、非常に高い効率のエレクトロトランスフェクションをもたらした。さらに、本技術はRPEおよび網膜へのいかなる目に見える損傷も無く有効であり、網膜は24時間以内に再接着されて健康に見えた。

実施例4：ルシフェラーゼ遺伝子を用いた結膜組織のトランスフェクション
本明細書において説明された方法を支持して研究を行い、ルシフェラーゼマーカー遺伝子を結膜組織中にトランスフェクションした。結膜組織を成体のニュージーランドホワイトウサギから外植し、組織培養ディッシュに置いた。すべての試料を、CMVプロモーター下にルシフェラーゼ遺伝子をコードする100マイクログラムのプラスミドDNAとともに1 mLのリン酸緩衝食塩溶液中に置いた。すべての試料を、10％血清および抗菌剤／抗真菌剤を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中でトランスフェクション後24時間培養した。その後、試料をルシフェリン基質(1 ml培地あたり150マイクログラムのルシフェリン)で処置し、IVIS-200システム(Xenogen Corp.)を用いて画像化した。

ルシフェラーゼマーカー遺伝子での電子なだれ媒介トランスフェクションを用いて、結膜の繊維芽細胞を含む結膜組織にトランスフェクションした。組織の対照試料を、電子なだれ媒介トランスフェクションの非存在下でルシフェラーゼ遺伝子と接触させた。トランスフェクションの24時間後に、生物発光を測定した。図15に示されるように、電子なだれ媒介トランスフェクションでトランスフェクションされた組織は、電子なだれ媒介トランスフェクションの非存在下でトランスフェクションされた細胞(4.6×10³光子／秒)よりも2桁多い、2.2×10⁵光子／秒を放出した。バックグラウンドの放出は3.7×10³光子／秒と測定された。

当業者が認識するであろうように、本発明の原理から逸脱することなく種々の変化、置換、および改変を作製することができ、または実施することができる。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその法律上の同等物によって決定されるべきである。

目的および利点を共に有する本発明は、添付の図面と共に上記の説明を読むことで理解される。
本発明によるアバランシェ法を示す。ワイヤー電極を有する本発明によるアバランシェ法の使用を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による装置の例を示す。本発明による方法および装置を用いたDNA導入の例を示す。本発明による方法および装置を用いたDNA導入の例を示す。本発明による方法および装置を用いたDNA導入の例を示す。本発明による方法および装置を用いたDNA導入の例を示す。

Claims

a)薬剤を細胞の外部に提供する段階；ならびに
b)アバランシェ電極と該細胞の周囲の導電性流体との間に蒸気泡およびプラズマ放電を生成する段階であって、該蒸気泡および該プラズマ放電により該薬剤が該細胞中へ導入される、段階
を含む、薬剤を細胞中に導入する方法。
蒸気泡およびプラズマ放電が電界および機械的応力波を生成し、該電界を該機械的応力波と組み合わせて該細胞へ印加することにより該細胞が透過化され、かつ、該透過化により該薬剤が該細胞中へ導入される、請求項1記載の方法。
生成する段階が、アバランシェ電極に約100 V〜約10 kVの範囲の電圧を印加する段階を含む、請求項1記載の方法。
生成する段階が、アバランシェ電極に約0.1 kV/cm〜約100 kV/cmの範囲の電界を生成する段階を含む、請求項1記載の方法。
生成する段階が、約100 ns〜約1 msの範囲の時間、電圧を印加する段階を含む、請求項1記載の方法。
生成する段階が、二相または単相電圧パルスを印加する段階を含む、請求項1記載の方法。
生成する段階が、1〜100の間の電圧パルスを印加する段階を含む、請求項1記載の方法。
生成する段階が、約0.1 Hz〜約1 kHzの間の周波数で電圧パルスを印加する段階を含む、請求項1記載の方法。
生成する段階が、アバランシェ電極とリターン電極との間に不平等電界を生成する段階を含み、該アバランシェ電極の周りの該電界が、プラズマ放電および蒸気泡を生成するのに十分である、請求項1記載の方法。
細胞が、真核細胞、原核細胞、初代細胞、細胞株であるか、または組織の一部である、請求項1記載の方法。
薬剤が、タンパク質、ペプチド、RNA分子、DNA分子、siRNA、色素、オリゴヌクレオチド、治療剤、または低分子の少なくとも一つである、請求項1記載の方法。
薬剤がプラスミドDNA分子である、請求項11記載の方法。
a)細胞の近くに配置され、かつ、プラズマ放電の間、融解に抵抗性であるのに十分高い融解温度の材料を含む、アバランシェ電極；
b)リターン電極；
c)該リターン電極と該アバランシェ電極との間に電圧を供給する電圧源であって、該電圧が該アバランシェ電極と該リターン電極との間に不平等電界を生成し、かつ、該アバランシェ電極の周りの該不平等電界の一部が、該アバランシェ電極と該細胞の周囲の導電媒質との間に蒸気泡およびプラズマ放電を生成するのに十分な強度である、電圧源；ならびに
d)該電圧源、該アバランシェ電極、および該リターン電極を接続し、かつ、該蒸気泡および該プラズマ放電を生成するのに十分なレベルで電流を伝導することが可能である回路
を含む、薬剤を細胞中に導入するための装置であって、
該蒸気泡および該プラズマ放電が電界および機械的応力波を生成し；
該電界が該機械的応力波との組み合わせで該細胞を透過化するのに十分であり；かつ
該透過化が、該細胞の外部に配置された薬剤を該細胞中へ導入するのに十分である、装置。
リターン電極が、アバランシェ電極よりも細胞から遠くに配置される、請求項13記載の装置。
リターン電極がアバランシェ電極よりも大きい、請求項13記載の装置。
材料が、チタン、モリブデン、またはタングステンである、請求項13記載の装置。
アバランシェ電極の幅が約500μm未満である、請求項13記載の装置。
アレイに配置された複数のアバランシェ電極を含む、請求項13記載の装置。
アレイにおけるアバランシェ電極が、約0.5 mm〜約2 cmの間の間隔で配置される、請求項18記載の装置。
チャンバーが二つの側壁および底部を有し、該側壁の各々が第一側面および第二側面を有し、該第一側面が互いに向かい合い、かつ、アバランシェ電極のアレイが該側壁の該第一側面の一つの上に位置している該チャンバーをさらに含む、請求項18記載の装置。
リターン電極が、側壁の第二側面の少なくとも一つの上、または底部の上に位置している、請求項20記載の装置。
平行した側壁の第一側面の反対上に位置している、アバランシェ電極の第二アレイをさらに含む、請求項20記載の装置。
第一アレイおよび第二アレイの位置が互いに対して互い違いである、請求項22記載の装置。
リターン電極を含む表面をさらに含む、請求項18記載の装置。
アバランシェ電極のアレイが表面に対して平面である、請求項22記載の装置。
アバランシェ電極のアレイが表面から突出する、請求項22記載の装置。
アバランシェ電極の突出末端を越えて表面から規定された距離伸長する二つの壁をさらに含む、請求項24記載の装置。
規定された距離が約0.5 mm〜約2 mmの範囲である、請求項25記載の装置。
表面が第一領域および第二領域を含み、該第一領域がリターン電極を含み、かつ、該第二領域がアバランシェ電極のアレイを含む、請求項22記載の装置。
第二領域が光学的に透明な材料を含む、請求項27記載の装置。
第二領域が光プローブをさらに含む、請求項27記載の装置。
アバランシェ電極のアレイが柔軟に接続されている、請求項16記載の装置。
アレイが手袋の一部である、請求項30記載の装置。
内腔および二つの末端を有するシースをさらに含み、アバランシェ電極が該内腔中に位置し、該シースが該末端の各々に開口部を有する、請求項13記載の装置。
アバランシェ電極を開口部の一つを通して伸長させるための手段、および、該伸長したアバランシェ電極を該開口部の該一つを通して収縮させるための手段をさらに含む、請求項32記載の装置。
薬剤の供給源をさらに含む、請求項32記載の装置。
内腔が供給源と流体接続している、請求項34記載の装置。
薬剤を開口部の一つを通して放出するための手段をさらに含む、請求項34記載の装置。
シースが柔軟または剛性である、請求項32記載の装置。
シースが針またはカテーテルである、請求項32記載の装置。
薬剤の供給源をさらに含む、請求項13記載の装置。