JP7260933B2 - 微小電極を使用する組織電気泳動転写用デバイス - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、２０１９年２月４日に出願した米国仮出願第６２／８００，７８１号の利益を主張する。上記出願の教示全体は参照により本明細書に組み込まれる。

背景
最近の４０年にわたり、電気穿孔は、外来の生物学的材料（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の因子）を細胞および組織中に送達するための魅力的なアプローチとして出現した。細胞への送達の手段としての電気穿孔についての最初の報告は１９８０年代にあり（１）、１９９０年代初頭には、多くの初期の経皮についての試みが出現した（２～７）。皮膚の皮膚層の電気穿孔、それに続く、受動的拡散性の、皮膚を通じた治療薬のイオン泳動による輸送（４）、または他の貫通機序（８）、電気化学療法（ＥＣＴ）（９～１７）、および遺伝子電気泳動転写（ＧＥＴ）（１８、１９）による、低分子治療薬を全身的吸収のために血流中に経皮送達するための電気穿孔に媒介される送達が調査されてきた。ＤＮＡベースのワクチン、遺伝子編集技法（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９標的化遺伝子編集）、および遺伝子治療用製品のＦＤＡによる承認（すなわち、ＣＡＲ Ｔ細胞療法）の出現と共に、ＧＥＴにおける関心が再び高まっている。

電気穿孔は、多数の医学的適用に関して細胞および組織送達の手段として長く調査されてきた（３４）。電気穿孔の間、細胞または組織は、膜障壁を横切って分子送達を容易にする細胞膜における孔形成を誘導する短時間の、高強度の電場に曝露される。可逆的電気穿孔は、異物を細胞内に送達し、その後細胞回復させる細胞膜の一時的透過化を可能にする。一方、不可逆的電気穿孔（熱的と非熱的の両方）は、細胞を直接死滅させるかまたは細胞のアポトーシスを促進する回復不能な膜損傷を引き起こす。可逆的電気穿孔と不可逆的電気穿孔の両方は、可逆的電気穿孔が治療薬およびベクターの送達のために使用され、不可逆的電気穿孔が、特にがん性腫瘍を処置するために、組織切除技法として使用されることに関して医学的に調査されてきた。経皮的電気穿孔は、典型的には、皮膚の透過障壁を低減させるためのおよび遺伝子電気泳動転写（ＧＥＴ）のためのベクター取り込みを促進する可逆的電気穿孔に焦点を当ててきた。

経皮的電気穿孔は、ＧＥＴによって皮膚細胞を変形させる、または皮膚を通じた治療薬の経皮的透過を増加させる手段として理解されてきた。特に、経皮的電気穿孔の使用は、保護的な免疫学的応答を付与するのに十分な発現および免疫原性を有するＤＮＡベースのワクチン製品を送達する手段として調査されてきた。特に、表皮は、樹状細胞の濃度が高いためにワクチン接種の標的とされている（３５、３６）。注目される遺伝子療法およびＤＮＡベースのワクチン送達のための電気穿孔の臨床的可能性に関する２０１６年の論説として、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ、Ｅａｓｙ Ｖａｘ、ＭｅｄＰｕｌｓｅｒ、Ｔｒｉｇｒｉｄ、Ｄｅｒｍａｖａｘ、ＯｎｃｏＳｅｃ、およびＣｌｉｎｉｐｏｒａｔｏｒを含む開発において、いくつかの商業的電気穿孔ワクチン接種プラットフォームが存在し、デバイスの大多数（６２％）が第Ｉ相臨床試験を受けている（３７）。最も進行した製品は、ＩｎｏｖｉｏによるＣＥＬＬＥＣＴＲＡシステムであり、これは現在、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）ワクチンのＩＭ送達に関して第ＩＩＩ相試験中である（３８）。

経皮的電気穿孔は、伝統的に、表面電極として、または皮膚もしくは筋肉中に挿入される貫通電極として適用されてきた。表面電極が使用される場合、皮膚の最も外側の障壁層である、高度にケラチン化した角質層（ＳＣ）を透過化するために強度の高い電場が必要とされる。しかし、ＳＣが一旦電気穿孔されると、その後、その下にある表皮および皮膚組織は、皮膚刺激、水腫および損傷をもたらし得る制御できないこの高い電場強度に曝露される。貫通電極のセットが使用される場合、これらは、数センチメートル離れて間隔を保ち、皮膚内または皮膚の下の筋肉中に深く挿入されることが多い。電極の周囲の最も大きな組織体積を透過化するために、より高強度のパルスが使用されることも多く、これは、場の強度が最も高い電極周辺の組織損傷ももたらす。さらに、ＧＥＴの間に使用されるＤＮＡベクターは、通常、数百μｌからｍｌの体積の皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）注射を通して送達される。ＤＮＡ注射自体は、注射されたＤＮＡが、電気穿孔を受けている標的組織内に局在化されない可能性のあるトランスフェクション効率の変動性をもたらし得る。例えば、ＩＤ注射を利用する臨床研究は、最小６００μｇのＤＮＡプラスミドを使用し、一様に数ミリグラム程度の量を注射して十分な細胞取り込みを確実にすることが多い。しかし、溶液のかなりの部分は、真皮または表皮層と対照的に、皮下領域に送達され、ＧＥＴに必要とされる多量のＤＮＡのためにより高いコストのワクチンとなる場合がある。

数十年の開発および複数の商業的試みにもかかわらず、経皮電気穿孔は、依然として臨床的に採用するために多くの課題に直面している。対処されるべき主なボトルネックは、１）低い送達／トランスフェクション効率、２）治療レベルで皮膚を貫通することができる物質の限定、３）送達効率の変動性、４）経皮的電気穿孔後の皮膚の刺激、水腫および瘢痕である。経皮的電気穿孔を阻むこれらの障害および持続的問題は、その臨床的使用を制約し（３９）、市場にはＦＤＡに承認された電気穿孔デバイスは現在存在しない。

侵襲が最小限であることおよび非ウイルス細胞トランスフェクション技法であることの利点など、種々の異なる設定において使用するための電気穿孔について多数の利点が存在するが、細胞／組織損傷とトランスフェクション効率の間の固有の妥協点は、経皮的薬物送達プラットフォームとしての電気穿孔の使用を阻んできた（２６）。皮膚電気穿孔の間に遭遇する問題の中で、皮膚刺激および瘢痕と関連する低い送達効率（２７、２８）は、対処されるべき最も顕著な障害である。したがって、組織電気泳動転写の改善された技法に対する継続的需要が存在する。

要旨
本発明による実施形態は、核酸またはタンパク質分子などの生体分子を、一時的な膜透過化によって、皮膚の表皮または真皮層に位置する細胞中に送達するための、局在化した電場である「ホットスポット」を生じるために使用される侵襲性が最小限の貫通微小電極アレイに関する。「ホットスポット」は、特定の領域で貫通微小電極を選択的に絶縁させることによって制御することができる。絶縁コーティングで被覆されていない微小電極の部分は、核酸もしくはタンパク質ワクチンベクター、または送達される他の生体分子でコーティングされていてもよい。皮膚中に挿入される際、アンカー微小電極領域は、組織位置に位置する細胞と生体分子コーティングを選択的に整列させるように標的組織微小電極領域を位置決めするために、貫通微小電極を機械的に係留する。生体分子コーティングは、周囲組織と接触した際に溶解することになる。電気パルスを印加することによって、生体分子は周囲組織中に送達され得る。

本発明による一実施形態では、組織電気泳動転写用微小電極デバイスは、貫通微小電極を含む。貫通微小電極は、（ｉ）組織電気泳動転写によって、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達するための導電性の表面を含む標的組織微小電極領域、および（ｉｉ）生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達するための標的組織微小電極領域を位置決めするために貫通微小電極を機械的に係留するためのアンカー微小電極領域を含む。電気接続部は、貫通微小電極を電圧源に接続する。

さらなる関連する実施形態では、アンカー微小電極領域は、貫通微小電極の遠位端またはその近傍に存在してもよい。微小電極デバイスは、標的組織微小電極領域の導電性の表面とは別の、貫通微小電極の表面に電気的絶縁部を含んでもよい。微小電極デバイスは、アンカー微小電極領域の表面に電気的絶縁部を含んでもよい。微小電極デバイスは、標的組織微小電極領域の表面の少なくとも一部に、選択的に送達される生体分子を含む生体分子コーティングを含んでもよい。組織位置は、皮膚の角質層の下、かつ（ｉ）皮膚の表皮層の少なくとも一部内および（ｉｉ）皮膚の真皮層の少なくとも一部内のうちの少なくとも１つであってもよい。組織位置は、皮膚の表皮層のみの少なくとも一部内であってもよい。アンカー微小電極領域は、バーブを含んでもよく、接着表面コーティングを含んでもよい。生体分子コーティングは、皮膚組織で囲まれた場合に溶解可能であってもよく、核酸およびタンパク質の少なくとも１つを含んでもよい。

他の関連する実施形態では、電気的絶縁部は、貫通微小電極に堆積した絶縁ポリマーを含んでもよい。微小電極デバイスは、１つ以上の貫通微小電極を含んでもよく、ここで、１つ以上の貫通微小電極の中心間距離は、約３００マイクロメートルから約１．５ミリメートルの間の間隔を含む。貫通微小電極の長さは、約２２５マイクロメートルから約１２５０マイクロメートルの間の長さを含み得る。貫通微小電極は、先細りの先端部を含むニードル、および側面の突出部を含むニードルの少なくとも１つを含んでもよい。貫通微小電極は、約１００マイクロメートルから約５００マイクロメートルの間の直径を含んでもよい。電気接続部は、電圧源からのパルス電圧を貫通微小電極に印加して、皮膚の表皮層および皮膚の真皮層の少なくとも１つにおける組織の細胞膜の一時的透過化を作出することができる。電気接続部は、電圧源からの電圧を貫通微小電極に印加して、貫通微小電極周囲の皮膚組織において１センチメートル当たり約０．１キロボルト（ｋＶ）から１センチメートル当たり約１０キロボルト（ｋＶ）の間の最大電場強度を作出することができる。電気接続部は、フォトリソグラフィーによって画定される接続部を含んでもよく、貫通微小電極は、フォトリソグラフィーによって画定される電極基材を含んでもよく、貫通微小電極は、電気めっきされた金属を含んでもよい。微小電極デバイスは、１つ以上の貫通微小電極を含んでもよく、電気接続部は、１つ以上の貫通微小電極のうちの２つまたはそれより多くに対する電気的に独立した接続部を含んでもよい。デバイスは、それぞれが異なる生体分子を選択的に送達するための１つ以上の標的組織微小電極領域を含んでもよい。

さらなる関連する実施形態では、微小電極デバイスは、組織レベル電場予測モジュールおよび細胞レベルシミュレーションモジュールを含んでもよい、モデリングプロセッサーをさらに含んでもよい。モデリングプロセッサーは、組織電気泳動転写によって、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達すべき組織位置を決定するように構成されていてもよい。モデリングプロセッサーは、電圧源によって貫通微小電極に送達される制御電圧を決定するように構成されていてもよい。

本発明による別の実施形態では、貫通微小電極を用いて組織電気泳動転写を実施する方法は、貫通微小電極のアンカー微小電極領域を使用して、貫通微小電極を係留するステップであって、その結果、導電性の表面を含む貫通微小電極の標的組織微小電極領域が、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達するように位置決めされる、ステップと、電圧を貫通微小電極に印加して、生体分子を組織位置に位置する細胞に送達するステップとを含む。貫通微小電極は、本明細書に教示される微小電極デバイスのいずれかを含み得る。

さらなる関連する実施形態では、本方法は、モデリングプロセッサーを使用して組織レベル電場を予測するステップと、組織位置の細胞レベルシミュレーションを実施するステップとをさらに含んでもよい。モデリングプロセッサーは、組織電気泳動転写によって、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達すべき組織位置を決定することができる。本方法は、電圧源によって貫通微小電極に送達される電圧を制御するためのモデリングプロセッサーを使用することを含んでもよい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
組織電気泳動転写用微小電極デバイスであって、
（ｉ）組織電気泳動転写によって、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達するための導電性の表面を含む標的組織微小電極領域、および（ｉｉ）前記生体分子を前記組織位置に位置する前記細胞に選択的に送達するための前記標的組織微小電極領域を位置決めするために貫通微小電極を機械的に係留するためのアンカー微小電極領域を含む前記貫通微小電極と、
前記貫通微小電極を電圧源に接続するための電気接続部と
を含む微小電極デバイス。
（項目２）
前記アンカー微小電極領域が、前記貫通微小電極の遠位端またはその近傍に存在する、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目３）
前記標的組織微小電極領域の前記導電性の表面とは別個の、前記貫通微小電極の表面に電気的絶縁部を含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目４）
前記アンカー微小電極領域の表面に電気的絶縁部を含む、項目３に記載の微小電極デバイス。
（項目５）
前記標的組織微小電極領域の表面の少なくとも一部に選択的に送達される前記生体分子を含む生体分子コーティングを含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目６）
前記組織位置が、皮膚の角質層の下、かつ（ｉ）皮膚の表皮層の少なくとも一部内および（ｉｉ）皮膚の真皮層の少なくとも一部内の少なくとも１つである、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目７）
前記組織位置が、皮膚の表皮層のみの少なくとも一部内である、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目８）
前記アンカー微小電極領域が、バーブを含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目９）
前記アンカー微小電極領域が、接着表面コーティングを含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目１０）
前記生体分子コーティングが、皮膚組織に囲まれた場合に溶解可能である、項目５に記載の微小電極デバイス。
（項目１１）
前記生体分子コーティングが、核酸およびタンパク質の少なくとも１つを含む、項目５に記載の微小電極デバイス。
（項目１２）
前記電気的絶縁部が、前記貫通微小電極に堆積した絶縁ポリマーを含む、項目３に記載の微小電極デバイス。
（項目１３）
１つ以上の前記貫通微小電極を含み、
前記１つ以上の前記貫通微小電極の中心間距離が、約３００マイクロメートルから約１．５ミリメートルの間の間隔を含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目１４）
前記貫通微小電極の長さが、約２２５マイクロメートルから約１２５０マイクロメートルの間の長さを含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目１５）
前記貫通微小電極が、先細りの先端部を含むニードル、および側面の突出部を含むニードルの少なくとも１つを含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目１６）
前記貫通微小電極が、約１００マイクロメートルから約５００マイクロメートルの間の直径を含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目１７）
前記電気接続部が、前記電圧源からのパルス電圧を前記貫通微小電極に印加して、皮膚の表皮層および皮膚の真皮層の少なくとも１つにおいて、組織の細胞膜の一時的透過化を作出する、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目１８）
前記電気接続部が、前記電圧源からの電圧を前記貫通微小電極に印加して、前記貫通微小電極周囲の皮膚組織において、１センチメートル当たり約０．１キロボルト（ｋＶ）から１センチメートル当たり約１０キロボルト（ｋＶ）の間の最大電場強度を作出する、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目１９）
前記電気接続部が、フォトリソグラフィーによって画定される接続部を含み、前記貫通微小電極が、フォトリソグラフィーによって画定される電極基材を含み、前記貫通微小電極が、電気めっきされた金属を含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目２０）
１つ以上の前記貫通微小電極を含み、前記電気接続部が、前記１つ以上の貫通微小電極のうちの２つまたはそれより多くに対して電気的に独立した接続部を含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目２１）
それぞれが異なる生体分子を選択的に送達するための１つ以上の標的組織微小電極領域を含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目２２）
組織レベル電場予測モジュールおよび細胞レベルシミュレーションモジュールを含むモデリングプロセッサーをさらに含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目２３）
前記モデリングプロセッサーが、組織電気泳動転写によって、生体分子を前記組織位置に位置する細胞に選択的に送達すべき組織位置を決定するように構成されている、項目２２に記載の微小電極デバイス。
（項目２４）
前記モデリングプロセッサーが、前記電圧源によって前記貫通微小電極に送達された制御電圧を決定するように構成されている、項目２２に記載の微小電極デバイス。
（項目２５）
前記電圧源によって前記貫通微小電極に送達された制御電圧を決定するように構成されているモデリングプロセッサーをさらに含む、項目１に記載の微小電極デバイス。
（項目２６）
貫通微小電極を用いて組織電気泳動転写を実施する方法であって、
貫通微小電極のアンカー微小電極領域を使用して、前記貫通微小電極を係留し、導電性の表面を含む前記貫通微小電極の標的組織微小電極領域が、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達するように位置決めされるステップと、
電圧を前記貫通微小電極に印加して、前記生体分子を前記組織位置に位置する前記細胞に送達するステップと
を含む方法。
（項目２７）
モデリングプロセッサーを使用して組織レベル電場を予測するステップと、前記組織位置の細胞レベルシミュレーションを実施するステップとをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記モデリングプロセッサーを用いて、組織電気泳動転写によって、生体分子を前記組織位置に位置する細胞に選択的に送達すべき組織位置を決定するステップをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
モデリングプロセッサーを使用して、電圧源によって前記貫通微小電極に送達された電圧を制御するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
前記電圧源によって前記貫通微小電極に送達された制御電圧を決定するように構成されているモデリングプロセッサーをさらに含む、項目１に記載の微小電極デバイス。

本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、申請および必要な手数料の支払いにより特許庁によって提供される。

上記内容は、添付の図面で例証されるように、例示的実施形態についての以下のより詳細な説明から明らかになり、これらの図面では、同様の参照符号は、異なる図を通して同じ部品を指す。これらの図面は、必ずしも正確な縮尺を表すものではなく、それよりもむしろ、実施形態を例証することに重点を置いている。

図１は、本発明の実施形態に従う、組織電気泳動転写用微小電極デバイスの概略図である。

図２は、本発明の実施形態に従う、アンカー微小電極領域に対する代替物を含む、組織電気泳動転写用微小電極デバイスの概略図である。

図３は、本発明の実施形態に従う、貫通微小電極の例示的寸法を含む、組織電気泳動転写用微小電極デバイスの概略図である。

図４は、本発明の実施形態に従う、皮膚の表皮層および皮膚の真皮層の少なくとも１つにおける組織の細胞膜の一時的透過化を作出するために、電圧源から貫通微小電極に印加されたパルス電圧を例示するグラフである。

図５は、本発明の実施形態に従う、微小電極の基材および先端部の貫通微小電極の選択的電気的絶縁部を例示し、標的化組織電気泳動転写のために微小電極によって生じた局在化した電場強度のシミュレーションの結果を示す図である。

図６は、本発明の実施形態に従う実験において、皮内注射および直接的な電流パルスの印加後にブタの皮膚における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現の画像を示す図である。

図７は、本発明の実施形態に従う、貫通微小電極アレイの写真および概略図を示す図である。

図８は、本発明の実施形態に従う、皮膚の角質層、表皮層および真皮層、ならびにこれらの層に挿入された貫通微小電極の概要を示す図である。

図９は、本発明の実施形態に従うシミュレーションにおいて、皮膚モデル中に挿入された１６本の貫通微小電極のアレイを囲む局在化した電場強度のシミュレーションの結果を示す図である。

図１０は、本発明の実施形態に従うシミュレーションにおいて、２．０ｋＶ／ｃｍの印加電場における表皮ケラチノサイトのパック細胞モデル１０５６、（上部）部分的に電気穿孔した状態を示す０．８３ｋＶ／ｃｍおよび（下部）完全に電気穿孔した状態を示す１．０ｋＶ／ｃｍの電場のパック細胞モデルの二次元投影１０５８、ならびに配向に依存する電気穿孔を示すシミュレーションされた皮膚線維芽細胞内の（上部）膜電位差および（下部）電場の画像１０６０を示す図である。

図１１は、本発明の実施形態に従う実験において、貫通微小電極へのパルス電気穿孔電圧の印加前後の測定における組織インピーダンスの変化を示すグラフである。

図１２は、本発明の実施形態に従う実験において、貫通微小電極アレイと共に使用される電気システムの概略の概略図である。

図１３は、本発明の実施形態に従う実験において、ローダミンを用いる電気的透過化試験の結果の画像を示す図である。

図１４は、本発明の実施形態に従う実験において、ヨウ化プロピジウムを用いる透過化試験に使用されるプロトコールの概要である。

図１５は、図１４の実験において、区分化された皮膚画像の例の画像を示す図である。

図１６は、図１４の実験において、画像分析の結果を示す図である。

図１７は、本発明の実施形態に従う、複数の電極が１つの群としてアドレス指定される貫通微小電極アレイの電極構造の概略図である。

図１８は、本発明の実施形態に従う、電気接続部を与えるプリント回路基板を使用する貫通微小電極アレイデバイスを示す図である。

図１９は、本発明の実施形態に従う実験において、プリント回路基板を使用する貫通微小電極アレイデバイスの試験結果の画像を示す図である。

図２０は、本発明の実施形態に従う、フォトリソグラフィーを使用して製作された貫通微小電極アレイの概略図である。

図２１は、本発明の実施形態に従う、フォトリソグラフィーを使用して貫通微小電極アレイを製作するために使用されるウェハー上のダイスの画像である。

図２２は、本発明の実施形態に従う、１つ以上の標的組織微小電極領域の多重化を使用する組織電気泳動転写用微小電極デバイスの概略図である。

図２３は、本発明の実施形態に従う、静電スプレーによって貫通微小電極アレイ上に堆積したＤＮＡ複合物の画像である。

図２４は、本発明の実施形態に従う、絶縁誘電体コーティングのコンフォーマル層で絶縁した貫通微小電極の画像である。

図２５は、本発明の実施形態に従う、モデリングプロセッサーを組み込む、組織電気泳動転写用微小電極デバイスの概略図である。

詳細な説明
例示的実施形態の説明が以下に続く。

本発明による実施形態は、核酸またはタンパク質などの生体分子の皮膚の別個の層への標的化送達に用いる侵襲性が最小限の貫通微小電極アレイを提供する。表皮は、真皮層よりも高い細胞密度および高濃度の樹状細胞を含有し、したがって、核酸またはタンパク質ベクターなどの生体分子の送達に対する魅力的な標的である。貫通微小電極アレイは、表皮または真皮に対して特異的な、効率的な標的化組織遺伝子電気泳動転写（ＧＥＴ）を達成することができる。表皮トランスフェクションは、表皮細胞密度がより高いことに起因して、最も度合いの高いトランスフェクションを実証することができる。ベクター送達および組織トランスフェクションなどの生体分子の標的化送達は、アレイの貫通微小電極を選択的に絶縁させること、およびこれらをプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ベクター（または核酸もしくはタンパク質などの他の生体分子）でコーティングし、その後、皮膚の表皮および／または真皮層内に配置された電極を囲む集束電場「ホットスポット」の組織を効率的に電気穿孔することによって達成することができる。このことは、同じ組織体積への生体分子の送達と電気パルスの両方を同時に局在化させて、皮膚のＧＥＴ効率または他の生体分子送達を改善させる。一部の実施形態では、パルス印加の前、およびその後に、組織インピーダンスをモニターすることによって、細胞透過化およびその次の組織ＧＥＴの度合いを、使用した電気パルスの大きさに比例する組織インピーダンスの下降を通してモニターすることができる。

本発明の実施形態に従い、このアプローチは、より低い電圧および電場強度の使用を可能にし、生きた真皮および表皮の最外層内で、組織トランスフェクションなどの生体分子送達を局在化させながら組織損傷を制限する。したがって、実施形態は、低いトランスフェクション効率および皮膚刺激を回避しながら、標的化組織トランスフェクション効率を実質的に改善することができる。

図１は、本発明の実施形態に従う、組織電気泳動転写用微小電極デバイス１００の概略図である。微小電極デバイス１００は、皮膚組織を貫通するのに十分に鋭い先細りの先端部を有するニードルなどの貫通微小電極１０２を含む。貫通微小電極１０２は、組織電気泳動転写によって、貫通微小電極１０２を囲む皮膚組織などの組織位置に位置する細胞に生体分子を選択的に送達する、導電性金属表面などの導電性の表面１０６を含む標的組織微小電極領域１０４を含む。貫通微小電極１０２は、組織位置に位置する細胞に生体分子を選択的に送達するための標的組織微小電極領域１０４を位置決めするために貫通微小電極１０２を機械的に係留するためのアンカー微小電極領域１０８も含む。例えば、アンカー微小電極領域１０８は、例えば、皮膚組織内で貫通微小電極１０２の動きに対して十分な摩擦を与えることによって、貫通微小電極１０２が挿入される皮膚組織内に貫通微小電極１０２を保持する助けとなるコーティング（本明細書においてさらに議論されるものなど）を有してもよい。電気接続部１１０は、貫通微小電極１０２を電圧源１１２に接続する。例えば、貫通微小電極１０２は、導電性金属から構成されてもよく（またはそれから構成されるコアもしくは他の部分を有してよく）、電気接続部１１０は、電気回路基板または他の取付け枠１１４上の導電性トレースまたは他の電気接続部であってもよい。電圧源１１２は、例えば、本明細書でさらに教示されるパルス電圧を含む電圧を送達するために構成される電源であってもよい。

図１を参照して続けると、アンカー微小電極領域１０８は、貫通微小電極１０２の遠位端１１６において、またはその近傍に存在し得る。本明細書で使用される場合、貫通微小電極１０２の「遠位端」１１６は、皮膚組織中に最も深く挿入される貫通微小電極１０２の末端であるが、「近位端」１１８は、取付け枠１１４に最も近い反対側の末端である。微小電極デバイス１００は、標的組織微小電極領域１０４の導電性の表面１０６とは別個である貫通微小電極１０２の表面に電気的絶縁部１２０ａを含んでもよい。電気的絶縁部１２０ａは、図５の実施例と併せて以下に議論されるように、例えば、化学蒸着（ＣＶＤ）によって蒸着したパリレン（ポリ（ｐ－キシリレン））フィルムなどの貫通微小電極上に蒸着した絶縁ポリマーを含んでもよい。例えば、電気的絶縁部１２０の１つ以上の別個の領域１２０ａ、１２０ｂは、それらの間に、導電性の表面１０６を有する標的組織微小電極領域１０４を規定する。電気的絶縁部は、アンカー微小電極領域１０８の表面１２０ｂ上にあってもよく、電気的絶縁部としてと、貫通微小電極１０２が挿入される皮膚組織内で貫通微小電極１０２を保持する助けとなるアンカー微小電極領域１０８のコーティングとしての両方の機能を果たし得る。例えば、化学蒸着（ＣＶＤ）によって蒸着したパリレン（ポリ（ｐ－キシリレン））のコーティングは、電気的絶縁部として、および皮膚組織内での貫通微小電極１０２の動きに対して十分な摩擦を与える微小電極を係留するための両方の機能を果たし得る。微小電極デバイスは、標的組織微小電極領域１０４の表面全体であり得る標的組織微小電極領域１０４の表面の少なくとも一部に選択的に送達される生体分子を含む生体分子コーティング１２２を含んでもよい。生体分子コーティング１２２は、例えば、核酸（以下でより詳細に定義されるように、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質を含んでもよい。生体分子コーティング１２２は、皮膚組織に囲まれた場合に溶解可能であってもよい。標的組織微小電極領域１０４の表面全体が生体分子コーティング１２２でコーティングされる場合、標的組織微小電極領域１０４は、生体分子コーティング１２２が皮膚組織に囲まれた場合に溶解された後に、十分に導電性の表面１０６を有し、その結果、電気穿孔が標的組織微小電極領域１０４によって実施され得る。一例では、生体分子コーティング１２２は、電気穿孔によって周囲組織に位置する細胞に送達されるプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）ベクターを含んでもよい。生体分子が送達される細胞を含有する組織位置は、皮膚の角質層１２４の下、かつ皮膚の表皮層１２６、皮膚の真皮層１２８、または表皮層１２６と真皮層１２８の両方のうちのいずれかの中に選択的に存在してもよい。一例では、組織位置は、皮膚の表皮層１２６のみの中に選択的に存在する。

図２は、本発明の実施形態に従う、アンカー微小電極領域２０８に対する代替物を含む組織電気泳動転写用微小電極デバイス２００の概略図である。アンカー微小電極領域２０８は、周囲組織に対して有害性が最小限であることが想定されるが、一部の実施形態では、アンカー微小電極領域２０８は、バーブ２３０、または係留する助けとなる他の構造を含んでもよく、係留の助けとなる追加の接着表面コーティング２３２を含んでもよい。バーブ２３０は、例えば、約５００マイクロメートルまたはそれより短い長さを有してもよい、生体吸収性のバーブであってもよい。貫通微小電極は、先細りの先端部を含むニードル（図１におけるように）、バーブ２３０（図２の）のような側面の突出部を含むニードル、またはその両方であってもよい。

図３は、本発明の実施形態に従う、貫通微小電極の例示的寸法を含む、組織電気泳動転写用微小電極デバイス３００の概略図である。微小電極デバイス３００は、１つ以上の貫通微小電極の中心間距離３３４が約３００マイクロメートルから約１．５ミリメートルの間の間隔を有する１つ以上の貫通微小電極を含んでもよい。貫通微小電極の長さ３３６は、約２２５マイクロメートルから約１２５０マイクロメートルの間の長さを含んでもよい。貫通微小電極は、約１００マイクロメートルから約５００マイクロメートルの間の直径３３８を含んでもよい。

図２２は、本発明の実施形態に従う、１つ以上の標的組織微小電極領域の多重化を使用する組織電気泳動転写用微小電極デバイス２２００の概略図である。この実施形態では、デバイスは、それぞれが異なる生体分子を選択的に送達するための１つ以上の標的組織微小電極領域を含む。図２２の例を参照して、１つ以上の標的組織微小電極領域２２０４ａ～ｄが使用され、ここで、異なる標的微小電極領域は１つ以上の異なる生体分子コーティング２２２２ａ～ｄを含む。例えば、同じ貫通微小電極２２０２ｃ上の１つ以上の異なる標的微小電極領域２２０４ｃおよび２２０４ｄは、１つ以上の異なる生体分子コーティング２２２２ｃおよび２２２２ｄでコーティングされてもよい。別の例では、同じデバイス内の１つ以上の異なる貫通微小電極２２０２ａおよび２２０２ｂは１つ以上の異なる標的組織微小電極領域２２０４ａおよび２２０４ｂを有してもよく、これらは、１つ以上の異なる生体分子コーティング２２２２ａおよび２２２２ｂでコーティングされてもよい。例えば、異なる生体分子は、図２２に例示されるタイプの配置のうちの１つまたは複数を使用して、皮膚の表皮層の少なくとも一部内の１つの生体分子および皮膚の真皮層の少なくとも一部内の異なる生体分子などの皮膚の異なる層に送達されてもよい。

図４は、本発明の実施形態に従う、皮膚の表皮層および皮膚の真皮層の少なくとも１つにおいて組織の細胞膜の一時的透過化を作出するために、電圧源（図１の１１２を参照のこと）から貫通微小電極に印加されたパルス電圧４４０を例示するグラフである。電気接続部（図１の１１０を参照のこと）は、電圧源（図１の１１２を参照のこと）から貫通微小電極にパルス電圧を印加し、皮膚の表皮層および皮膚の真皮層の少なくとも１つの組織の細胞膜の一時的透過化を作出することができる。図４を参照して、電気接続部は、電圧源から貫通微小電極に電圧を印加し、貫通微小電極の周囲の皮膚組織に１センチメートル当たり約０．１キロボルト（ｋＶ）から１センチメートル当たり約１０キロボルト（ｋＶ）の間の最大電場強度４４２を作出することができる。

図２５は、本発明の実施形態に従う、モデリングプロセッサー２５６２を組み込む、組織電気泳動転写用微小電極デバイス２５００の概略図である。ここで、モデリングプロセッサー２５６２は、組織レベル電場予測および標的組織の細胞密度を説明する細胞レベルシミュレーションを組み込むマルチスケール皮膚電気穿孔モデルを使用することによって、電気穿孔ホットスポットを決定するためのモデリングモジュールを含む。このモジュールを実施するために、モデリングプロセッサー２５６２は、組織レベル電場予測モジュール２５６４および細胞レベルシミュレーションモジュール２５６６を含む。組織レベル電場予測モジュール２５６４は、例えば、組織の電場を決定するためのモデルを使用することができる。細胞レベルシミュレーションモジュール２５６６は、例えば、組織内の細胞密度をシミュレートすることができる。これらのモジュールを使用して、モデリングプロセッサー２５６２は、組織電気泳動転写によって、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達すべき組織位置を決定することができる。加えて、これらのモジュールを使用して、モデリングプロセッサー２５６２は、電圧源２５１２によって貫通微小電極２５０２に送達される制御電圧２５６８を決定することができる。さらに、モデリングプロセッサー２５６２の出力を使用して、標的組織内のアンカー微小電極領域２５０８および標的組織微小電極領域２５０４の位置を決定すること、ならびにこのような貫通微小電極２５０２のアレイにおいて使用される貫通微小電極２５０２の形式、間隔および寸法を決定することができる。加えて、モデリングプロセッサー２５６２を使用して、モデリングプロセッサー２５６２が組織レベル電場予測モジュール２５６４および細胞レベルシミュレーションモジュール２５６６を含むか否かにかかわらず、電圧源によって貫通微小電極に送達される制御電圧を決定することができる。

本明細書に示される様々な技法は、モデリングプロセッサー２５６２、組織レベル電場予測モジュール２５６４および細胞レベルシミュレーションモジュール２５６６などのコンピューター実施構成要素を含んでもよい（図２５を参照のこと）。このような構成要素は、ハードウェアを使用して実施することができ、例えば、１つまたは複数の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、１つまたは複数のプロセッサーで実行するアプリケーションソフトウェアを含むことができる１つまたは複数のプロセッサー；ならびに電気シグナルを本明細書に示されるシステムにおよびそのシステムから送達するセンサーおよび／または制御接続部（図２５の電圧源２５１２および貫通微小電極２５０２など）であって、シグナルは、電気シグナルを本明細書に示される構成要素内の動作中の構成要素におよびその構成要素から送達することができる、センサーおよび／または制御接続部を含むことができる。この構成要素は、ユーザー入力を受容するための構成要素（プロセッサーおよびメモリーに接続したキーボード、タッチパッド、および関連する電子装置など）を含むことができるユーザー入力モジュールを含むことができる。モデリングプロセッサー２５６２および電圧源２５１２などの構成要素は、情報を保存し、コンピューターハードウェアおよびソフトウェアの制御下で手順を実施するためのメモリーも含むことができる。他の制御ハードウェアおよびソフトウェアが使用されてもよいことが認識されるであろう。ハードウェア、ソフトウェアまたはこの組合せを使用して技法を実施することができる。ソフトウェアで実施される場合、ソフトウェアコードは、単一のコンピューターで提供されるかまたは複数のコンピューター間で分散されるかにかかわらず、いずれかの好適なプロセッサーまたはプロセッサーの集合で実行することができる。

図１２は、本発明の実施形態に従う実験において、貫通微小電極アレイと共に使用される電気システムの概略の概略図である。この実験では、電気的特性は、導電性流体と皮膚組織の両方で実施される。概略は、関数発生器、増幅器および電気穿孔チップを含む。ここで、貫通微小電極は、プリント回路基板に取り付けられたニードルであり、１．３ｍｍの中心間距離を有する長さ２ｍｍのものである。

図１３は、本発明の実施形態に従う実験において、ローダミンを用いる電気的透過化試験の結果の画像を示す図である。この実験では、１．５ｋＶ／ｃｍ、１０ｍ秒のＤＣパルスを印加した。長さ３ｍｍのニードルを使用した。角質層はパルセーションで克服した。画像は、明視野および出現した赤色チャネル画像を示す。パルス無しのニードルに関する結果が左であり、パルス有りのニードルに関する結果が右である。

図１４は、本発明の実施形態に従う実験において、ヨウ化プロピジウムを用いる透過化試験に使用されるプロトコールの概要である。

図１５は、図１４の実験において、区分化された皮膚画像の例の画像を示す図である。

図１６は、図１４の実験において、画像分析の結果を示す図である。右下のグラフは、Ge et al., 2010, "The viability change of pigskin in vitro," Burns, 36 (2010)からのものである。

図１７は、本発明の実施形態に従う、複数の電極が１つの群としてアドレス指定される貫通微小電極アレイの電極構造の概略図である。この実施例では、「１」と標識された電極は、「２」、「３」および「４」と標識された電極と同様に、１つの群としてアドレス指定される。他の配置を使用することができること、および個々にアドレス指定可能な電極を使用することができることが認識されるであろう。この図に示されるように、微小電極デバイスは、１つ以上の貫通微小電極を含むことができ、電気接続部は、１つ以上の貫通微小電極のうちの２つまたはそれより多くに電気的に独立した接続部を含むことができる。

図１８は、本発明の実施形態に従う、電気接続部を与えるプリント回路基板を使用する貫通微小電極アレイデバイスを示す図である。

図１９は、本発明の実施形態に従う実験において、プリント回路基板を使用して貫通微小電極アレイデバイスの試験結果の画像を示す図である。ヨウ化プロピジウムの「ホットスポット」は、ニードル挿入部位の周辺に見ることができる。

図２０は、本発明の実施形態に従う、フォトリソグラフィーを使用して製作された貫通微小電極アレイの概略図である。この図に示されるように、電気接続部は、フォトリソグラフィーによって画定される接続部を含むことができ、貫通微小電極は、フォトリソグラフィーによって画定される電極基材を含むことができ、貫通微小電極は、電気めっきされた金属を含むことができる。一例では、貫通微小電極アレイは、ＵＶ ＬｉＧＡ技法を使用して製作することができ、ここで、「ＬｉＧＡ」は、リソグラフィー（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）、電気めっき（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｌａｔｉｎｇ）およびモールディング（Ｍｏｌｄｉｎｇ）を示すドイツ語の頭字語に由来する。フォトリソグラフィーを使用して、電気メッキ用のトレース、貫通微小電極基材、モールドを定義することができる。金属の電気めっきを使用して固体ポストを作出することができる。電気化学エッチングまたは湿式エッチングを使用して、貫通微小電極の形状を規定することができる。この後に、モールディング材料の除去と、ウェハーのダイシングを行って、別々のチップを作出することができる。図２１は、本発明の実施形態に従う、フォトリソグラフィーを使用して貫通微小電極アレイを製作するために使用されるウェハー上のダイスの画像である。

本発明による実施形態は、貫通微小電極の選択的絶縁および貫通微小電極のＤＮＡベクター（または他の生体分子）によるコーティングを使用して、ベクターと強度の低い電気パルスを電極に隣接する同時発生的「ホットスポット」区画に送達する。大きな組織体積をトランスフェクトする試みとは対照的に、実施形態は、電場「ホットスポット」内の電極に隣接する組織をトランスフェクトすることのみに焦点を当てるため、効率的な表皮および真皮の遺伝子電気泳動転写（ＧＥＴ）、または他の生体分子送達のために、より低いパルスの電場強度を使用することができる。このアプローチによって、ベクターおよび電気エネルギーを「ホットスポット」により効率的に送達することにより、ＧＥＴにおける安全性、忍容性および有効性の問題に対処することによって、経皮的電気穿孔の臨床解釈に対する主要なボトルネックの多くを克服することができ、その結果、皮膚ＥＰのより低い閾値が得られ、ベクター送達が透過化される皮膚の一部を直接的に標的とし、標的化真皮層トランスフェクションが得られると考えられる。パルス印加の前後の皮膚のインピーダンスモニタリングと組み合わせたこれらの利益によって、貫通微小電極アレイが、電極挿入とパルスプロトコールの両方からの組織刺激を最小限にする一方で最大のＤＮＡ送達（または他の生体分子送達）およびＧＥＴ発現を得ることが可能になる。

本発明による実施形態は、ベクターまたは他の生体分子があまり制御されずに皮膚下に注射される他の貫通電気穿孔プラットフォームとは対照的であり、長い、深く貫通する電極が使用され、その結果、電極の一部が皮膚の下に存在する。これらのアプローチは、電極周辺の組織のより大きな体積を透過化するために、より高い強度のパルスも使用する。ベクター注射は、多量のベクターが、効率的に透過化されていない区画の組織中に分配されることを意味し、高強度のパルスと組み合わせた深い電極の貫通によって、電極に隣接する切除を伴う不可逆的電気穿孔組織損傷の原因となる。このことにより、ＧＥＴトランスフェクション効率の変動性および有害な組織損傷がもたらされる。投与部位選択、電極設計、およびパルスパラメーターに関する臨床プロトコールは、安全性、忍容性および有効性に関して注意深く評価されなければならない。（２０、４０、４１）特に、本発明による実施形態は、ＧＥＴにより活性化され得る高濃度のケラチノサイトおよび樹状細胞により、生きた表皮を標的とする。

他の実施形態では、ベクターの送達およびトランスフェクションの選択的表皮および真皮の標的化は、電気化学療法（ＥＣＴ）、非熱的不可逆的電気穿孔（Ｎ－ＴＩＲＥ）または皮膚以外の組織の集束トランスフェクション（ｆｏｃｕｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）などの他の臨床レジメンにおいても使用することができる。他の生体分子送達も実施することができることが認識されるであろう。

図５は、本発明の実施形態に従う、微小電極の基材および先端部の貫通微小電極の選択的電気的絶縁部を例示し、標的化組織電気泳動転写のために微小電極によって生じた局在化した電場強度のシミュレーションの結果を示す図である。図５の実施形態では、貫通微小電極は、別個の真皮層に対して組織「ホットスポット」に集束するために、選択的に絶縁される。次いで、制御された低電圧電気穿孔は、貫通微小電極の領域にわたる選択的絶縁を使用して特定の真皮層に対して標的化される。この目的を達成するために、本発明の実施形態に従う一実験では、貫通微小電極アレイは、パリレン（ポリ（ｐ－キシリレン））フィルムの化学蒸着（ＣＶＤ）によりコーティングされる。パリレンＣＶＤでは、公知の質量の固体パリレンダイマーがガス相に昇華され、ここで、次いでこれらは熱分解され、ダイマーを切断してモノマー分子とする。次いで、パリレンモノマーを蒸着チャンバー中に導入し、ここで、これらは多量体化し、曝露された貫通微小電極アレイ表面をコンフォーマルにコーティングする。パリレンは、その生物学的不活性性について公知のＵＳＰクラスのＶＩポリマーであり、数十年もの間、医学的デバイスおよび医学的電子装置のための封入材料として使用されてきた。１００～１０００ｎｍ厚の絶縁パリレン層を貫通微小電極アレイ上に蒸着した。パリレンは、機械的摩耗またはより正確に除去するための集束ＣＯ_２エキシマレーザーアブレーションによって、貫通微小電極の基材または先端部のいずれかから選択的に除去される。次いで、これらの貫通微小電極を、ニードル当たり予測値０．１５～１５μｇのＤＮＡをコーティングしたことが以前に報告されたように、１％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースおよび０．５％（ｗ／ｖ）のＬｕｔｒｏｌ Ｆ－６８ ＮＦ（ＢＡＳＦ、Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ、ＵＳＡ）溶液中で安定化したｐＤＮＡ溶液でコーティングする。インクジェットプリントまたはエレクトロスプレーなどの、マイクロニードルをコーティングするために使用された代替のコーティング技法を含む他のコーティング技法も利用することができ、他の生体分子も使用することができることが認識されるであろう。

図５は、本発明の実施形態に従う、真皮または表皮のいずれかにおいて、貫通微小電極を選択的に絶縁し、「ホットスポット」を局在化させる作用を予測するシミュレーション結果も示す。皮膚電気穿孔が様々な印加電圧で生じる場所を正確に予測することができるため、組織損傷を最小限にしながら皮膚の別個の層でＤＮＡベクター遺伝子電気泳動転写（ＧＥＴ）（または他の生体分子送達）を標的とすることができる。真皮または表皮の皮膚層に対してホットスポットに集束することによって、表皮トランスフェクションが、より高い表皮細胞密度に起因するより高い度合いのトランスフェクションを実証することが期待され、このことには、ＤＮＡベースのワクチンが保護的な免疫学的応答を付与する樹状細胞活性化のために十分な発現を有することを確実にする助けとなるであろう。同様の利点は、他の生体分子の送達により達成され得る場合がある。

本発明による実施形態は、ＤＮＡ（または他の生体分子、例えば核酸またはタンパク質）の送達および電極周辺の電場ホットスポットを局在化させる侵襲が最小限の貫通微小電極アレイを提供する。本発明の実施形態に従う実験では、皮膚内の電気穿孔閾値を超える電場分布を予測することができる皮膚電気穿孔モデルとその後、組織内の細胞の電気穿孔が組織の残りの部分内の電場分布をどのように変化させるかを予測することができるパック細胞モデルの両方の開発によって、貫通電極の寸法および間隔についての情報を得る。高濃度のｐＤＮＡベクター（または他の生体分子）を貫通微小電極アレイ上に直接コーティングすることによって、ＤＮＡは、挿入後に、電極表面に隣接する組織内に局所的に再構成され、その結果、ベクターおよび電気エネルギーは、標的化組織トランスフェクションを得るために皮膚内の所望の「ホットスポット」位置に送達される。

本発明による実施形態は、標的化皮膚電気穿孔のための貫通微小電極の選択的絶縁を提供する。絶縁ポリマーを貫通微小電極表面に付着させ、貫通微小電極の一部（例えば、先端部対基材）にわたり絶縁を選択的に除去することによって、貫通微小電極の部分が絶縁され、その結果、ベクターおよび電気エネルギーは、標的化皮膚層トランスフェクションを得るために皮膚内の所望の「ホットスポット」位置に送達され得る。

本発明のおよび本明細書に記載の実施形態に従って構築された実験は、異なる貫通電極の幾何学に由来する皮膚モデル内の電場分布のコンピューターモデリング、パック細胞組織モデル内の透過化分布のコンピューターモデリング、貫通微小電極アレイの開発、貫通微小電極の選択的絶縁、および別個の真皮層へのベクターの送達と電気パルスエネルギーを同時に標的とするための貫通微小電極アレイのＤＮＡベクターコーティングによる真皮電気穿孔効率の改善のための多面的アプローチを用いる。

実施例１：

図７は、本発明の実施形態に従う、貫通微小電極アレイの写真および概略図を示す図である。本発明の実施形態に従う実験では、図７を参照して、プリント回路基板（ＰＣＢ）アレイ中にアセンブルされたオーステナイト系３１６外科用ステンレス鋼鍼灸ニードルからなる貫通微小電極アレイを開発した。各貫通微小電極は、６．１２９°のテーパー角度で７４５μｍの先端部長にわたり細い点へと先細りする１６０μｍの直径のニードルである。各ニードルを、電極が貫通する公知の厚さのプラスチックシリコンゴムのスペーサーを使用して制御された貫通微小電極の貫通長を有するめっきされたスルーホールを通してＰＣＢ中に配置する。貫通微小電極アレイの全体的貫通深さは、１／４ｍｍ程度に短い可能性のある曝露された貫通微小電極長によって制御される。貫通微小電極のアセンブリー後に、ニードルの背部を挟み、次いで、はんだ槽内のディップはんだ付けによりＰＣＢにはんだ付けする。ＰＣＢを電機励起のためのリボンケーブルに接続する。プロトタイプ貫通微小電極アレイは、０．７５ｍｍの中心間距離を有する１６個の電極を支持し、図７に示されるように、典型的に１ｍｍ突出している。貫通微小電極アレイの設計は、組織レベル電場予測ならびに真皮および表皮の細胞密度を説明する細胞レベルシミュレーションを電気穿孔がシミュレーションされる電極周辺の「ホットスポット」を特定するための電気穿孔回路モデルに関連させるマルチスケール皮膚電気穿孔モデルの開発によって情報を得る。このマルチスケールモデルは、貫通微小電極アレイの設計とインプリメンテーションに情報を与えて、最適な貫通微小電極アレイの幾何学とパルスパラメーターを決定する。このようなマルチスケールモデルは、例えば、本明細書の図２５と比較して記載されるモデリングプロセッサーによって実施され得る。

実施例２：

図８は、本発明の実施形態に従う、皮膚の角質層、表皮層および真皮層、およびこれらの層に挿入された貫通微小電極の概略を示す図である。本発明の実施形態に従って行われる実施調査では、図８を参照して、皮膚形態が、現実的な表面トポグラフィーおよび表皮の厚さを有する真皮表皮接合部（ＤＥＪ）を描写する組織学的画像から抽出されたコンピューター皮膚組織レベルのモデルが開発された。図８では、画像８４８は、ＤＥＪを描写するＨ＆Ｅ染色した皮膚を示し、画像８５０は、２Ｄ皮膚モデル中に抽出された表皮厚さを示し、画像８５２は、周期的隆起を有する３Ｄ皮膚モデル中に突出した２Ｄモデルを示し、画像８５４は、皮膚組織学から抽出した波状表面を有する３Ｄ皮膚モデルを示す。挿入した貫通微小電極の対を画像８５４に示す。このシミュレーションにおいて使用した物理的特性（厚さ、導電性など）は文献（２８、４２）に見出された。この全体的皮膚モデルを使用して、０．５ｋＶ／ｃｍの透過化電場強度閾値が達成される場所を特定するために、組織内の電場分布を決定する。このモデルを使用して、皮膚内の電場分布を、透過化電場のすべてが、２０Ｖの印加で角質層内に局在化し、５０Ｖおよびそれより高い電圧で真皮層中にのみ貫通する表面電極を使用して、シミュレーションした。シミュレーションをアップデートして、透過化閾値に達した場合に、角質層（ＳＣ）の導電性の増加を反映する。これには、１００Ｖの電圧と皮膚中へのより深い電場貫通が必要とされるが、実験中に制御可能なプロセスではない。したがって、貫通微小電極の設計に焦点を当てることを決定した。

実施例３：

図９は、本発明の実施形態に従うシミュレーションにおいて、皮膚モデル中に挿入された１６本の貫通微小電極のアレイを囲む局在化した電場強度のシミュレーションの結果を示す図である。貫通微小電極を使用する場合、図９に示されるように、シミュレーションによって電極周辺の「ホットスポット」を予測することができる。このシミュレーションによって、シミュレーションされたニードル周辺の電場分布を予測することができ、ニードルの間隔、挿入の深さおよび印加電圧を変更する。図９は、電場が、組織電気穿孔に対して期待される最小電場である、０．５ｋＶ／ｃｍの値を超える電極周辺の体積を描写することによって、このような１つのシミュレーションの結果を示す。特に、電場は、電極面積が低下した、電気力線を集束する鋭い先端部に起因して、貫通微小電極の先端部で増加する。このように、貫通微小電極の連続する反復は、必要に応じて合理的に設計することができる。

実施例４：

組織レベルモデルに加えて、本発明の実施形態に従う実験において、局所パック細胞モデルを開発して、皮膚の様々な層においてどのような透過化が起こるかを理解した。この局所モデルは、シミュレーションした電位を、０．５Ｖの膜貫通電圧（ＴＭＶ）が達成された場合に、電気穿孔中に組織においてコンダクタンスが有意に下降するレジスターと並行して、細胞膜がキャパシターとして処理される細胞の局所等価回路モデルに関連付ける。次いで、電場分布をアップデートして、１つの細胞が受けている電気穿孔の影響が、その近隣のＴＭＶにどうような影響を及ぼすか（故に、電気穿孔に対する傾向）を示すために局所細胞インピーダンスのこの下降を反映する。２つのモデルを開発した。１つ目は、表皮に見られる高いケラチノサイト密度を反映するパック球体モデル１０５６である。図１０は、本発明の実施形態に従うシミュレーションにおいて、２．０ｋＶ／ｃｍの印加電場における表皮ケラチノサイトのパック細胞モデル１０５６を示す図である。画像１０５８は、（上部）部分的に電気穿孔した状態を示す０．８３ｋＶ／ｃｍおよび（下部）完全に電気穿孔した状態を示す１．０ｋＶ／ｃｍの電場のモデル１０５６の二次元投影である。イメージ１０６０は、（上部）膜貫通電位を示し、（下部）配向に依存する電気穿孔を示すシミュレーションした皮膚線維芽細胞内の電場を示す。図１０の画像１０５６に示されるように、高強度の電場を印加した場合、すべての細胞が完全に電気穿孔される。図１０の画像１０５８は、部分的に電気穿孔された状態から完全に電気穿孔された状態を反映する、中程度から高い印加電場におけるパック細胞の二次元中心線投影を示す。部分的に電気穿孔された状態では、１つの細胞の透過化によって、その近隣の局所電位が増加され得る。図１０の画像１０６０は、皮膚線維芽細胞の細胞密度および分布を反映する様々な配向における楕円形細胞のより低い細胞密度のシミュレーションを示す（４３）。より低い細胞密度は別として、このシミュレーションは、電気穿孔の度合いが、より度合いの高い電気穿孔を有する電場で整列させた細胞に関する細胞の配向と強く相関することを示す。これらのシミュレーションは、表皮内の標的化電気穿孔が、より高い細胞密度およびより低い配向依存性の作用に起因して、より度合いの高い細胞電気穿孔をもたらすという仮定を導いた。これらのシミュレーションを使用して、貫通微小電極アレイの設計を進め、パルスパラメーターを最適化することもできる。皮膚電気穿孔が様々な印加電圧で生じる場所を正確に予測することができ、その結果、組織損傷を最小限にしながら皮膚の別個の層でＤＮＡベクターＧＥＴ（または他の生体分子送達）を標的とすることができる。電気穿孔は、貫通微小電極の領域にわたり選択的絶縁を使用して、特定の真皮層に対して標的化することができる。このようなシミュレーション、ならびに結果として生じる制御、設計、および最適化は、本明細書の図２５と併せて記載されるものなどの、モデリングプロセッサーを使用して実施することができる。

実施例５：

本発明の実施形態に従う別の実験では、ブタの皮膚における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現についての研究を実施し、図６を参照して議論することになる。これらの研究は、Ｒｕｔｇｅｒｓ ＩＡＣＵＣ委員会（ＰＲＯＴＯ２０１７０２６１０－Ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｋｉｎ ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）によって承認されたプロトコールの下で実施した。皮膚は、３から５週齢の子ブタから新たに回収し、７０％のエタノールで注意深く清浄化し、次いで毛を剃り、脱毛した。皮膚組織をおよそ１×１ｃｍの小さな四角片に切断した。皮下脂肪および組織を外科用メスで注意深く除去した。１×ＰＢＳ溶液中の２０μｇ／ｍｌのｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、電気穿孔処理前に、ＭｉｃｒｏｎＪｅｔ６００マイクロニードル（ＮａｎｏＰａｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｎｅｓ Ｚｉｏｎａ、Ｉｓｒａｅｌ）によって注射した。予備的な貫通微小電極アレイを使用して、電気パルスを印加した。ＧＦＰ ｐＤＮＡを浅型ＩＤマイクロニードル注射によって注射し、それに続いて、５Ｖまたは５０Ｖ １０ｍｓの電気穿孔パルスを与えた。電気穿孔処理の後に、皮膚試料を、インキュベーターのロッカー上で３７℃の改変イーグル培地（ＭＥＭ）中に直ちに入れた。選択した時点（パルセーションの８、１６、２４、および４８時間後）で、皮膚試料を、注射部位の中心から横断面に沿ってスライスし、次いで、ＰＢＳで洗浄した。スライスは１～１．５ｍｍ厚であり、倒立型落射蛍光顕微鏡を使用することによって画像化した。図６は、新たに切除されたブタの皮膚において実証された貫通微小電極の先端部に局在化した２４時間での緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現を示す。ＧＦＰ発現は、皮内ＩＤ注射ならびにパネル６４４では５Ｖ、１０ｍｓのＤＣパルス、およびパネル６４６では５０Ｖ、１０ｍｓのＤＣパルス後のブタの皮膚において示される。パネル６４４では、ＧＦＰ発現は、皮膚表面から８００μｍのニードルの先端部および貫通微小電極アレイの寸法（１０００μｍ長、７５０μｍ離れている）に一致して６５０μｍの間隔を空けて局在化する。パネル６４４）の５Ｖのパルスは、鋭い貫通微小電極の先端部に起因して電場が最大であることが期待される貫通微小電極先端部の「ホットスポット」における局在化を示すが、一方、パネル６４６の５０Ｖのパルスは、より拡散した組織の蛍光を示す。

実施例６：

さらに、組織電気穿孔の度合いは、細胞が透過化された場合に、組織インピーダンスの下降によってモニターすることができ、本発明の実施形態に従う実験では、５Ｖ程度の低い電圧で組織レベル電気穿孔のエビデンスが示されている（図６、パネル６４４）。図１１は、本発明の実施形態に従う実験において、電気穿孔パルスの印加の前後の切除されたブタの皮膚のインピーダンスを示す。組織インピーダンスをモニターすることによって、組織電気穿孔の度合いを評価することができ、インピーダンスの変化は、ｐＤＮＡ発現（または送達された他の生体分子に関連する発現または他の現象）および組織損傷と相関し得る。図１１における、５Ｖまたは５０Ｖ １０ｍｓ電気穿孔パルスの前（測定１～３）および後（測定４～５）の連続的組織インピーダンスの測定。５Ｖのパルスは、組織インピーダンスの１％の変化を示し、一方、５０Ｖのパルスは、５％の下降を示す。

実施例７：

図２３は、本発明の実施形態に従う実験において、静電スプレーによって貫通微小電極アレイ上に堆積したＤＮＡ複合体の画像である。これは、微小電極デバイスの標的組織微小電極領域の表面の少なくとも一部に選択的に送達される生体分子を含む生体分子コーティングの例を例示する。静電スプレーは、貫通微小電極アレイ上にＤＮＡ複合体を付着させるために用いられ、これは、ニードルマイクロアレイとして実施される。ＧＦＰ ＤＮＡプラスミドを溶液中で調製し、次いで、高圧に保たれたニードルから接地型マイクロアレイにスプレーした。顕微鏡の合成画像は、０．１ｍＬ／時の流速で２０分のスプレーの後のニードルを示す。

実施例８：

図２４は、本発明の実施形態に従う実験において、絶縁誘電体コーティングのコンフォーマル層で絶縁した貫通微小電極の画像である。これは、微小電極デバイスの貫通微小電極上に蒸着された絶縁ポリマーを含む電気的絶縁部の例を示す。微小電極は、使用されるパリレンダイマー前駆体の質量に応じて１００ｎｍから２ｍｍの範囲で、化学蒸着（ＣＶＤ）によって蒸着されたポリ（パラキシレン）（パリレン）のコンフォーマル層で絶縁される。パリレンは、生体適合材料としてＦＤＡに認められたＵＳＰ Ｃｌａｓｓ ＶＩポリマーである。蒸着されたパリレンは、ヒトの移植に好適な疎水性の絶縁誘電体コーティングとして作用する。ニードル先端部の近接写真（上部右側）は、パリレン層のエッジを示す（白色の矢印）。

定義

本明細書で使用される場合、「貫通微小電極」は、皮膚組織を貫通するのに十分鋭い先細りの先端部を有するニードルなどの、皮膚組織を貫通することが可能である微小電極である。

本明細書で使用される場合、「貫通微小電極アレイ」は１つ以上の貫通微小電極のアレイである。

本明細書で使用される場合、貫通微小電極の「標的組織微小電極領域」は、組織電気泳動転写によって、生体分子を、貫通微小電極周囲の皮膚組織などの組織位置に位置する細胞に選択的に送達する、導電性金属表面などの導電性の表面を含む、貫通微小電極の領域である。

本明細書で使用される場合、貫通微小電極の「アンカー微小電極領域」は、例えば、皮膚内の貫通微小電極の動きに対して十分な摩擦を与えることによって、微小電極が挿入される皮膚組織内に貫通微小電極を保持するのを補助するコーティングを有することなどによって、貫通微小電極が挿入される皮膚組織内の貫通微小電極を機械的に係留するのを補助する貫通微小電極の領域である。

本明細書で使用される場合、「組織電気泳動転写」は、電気化学療法（ＥＣＴ）および遺伝子電気泳動転写（ＧＥＴ）を含む任意の電気穿孔に媒介される経皮送達を含み得る。

本明細書で使用される場合、「生体分子」は、核酸、タンパク質もしくは本明細書に教示される技法に従って組織トランスフェクションによって送達される任意の他の生体分子、またはこのような核酸、タンパク質もしくは他の生体分子の組合せを含み得る。例えば、生体分子は、以下のうちの１つまたは複数を含み得る：核酸またはタンパク質のワクチンベクター、核酸およびタンパク質のワクチンベクター、アンカーベクター、核酸生体分子（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ／プラスミドベクター、ＤＮＡワクチン、ＤＮＡ／プラスミドベクターワクチン）ならびにタンパク質（例えば、ペプチド／タンパク質、ペプチド／タンパク質ワクチン）。加えて、「生体分子」は、（１）抗体、例えばモノクローナル抗体、または別のリガンド特異的分子、および（２）生体活性および／もしくは細胞活性を有してもよい、または生体活性および／もしくは細胞活性に影響を及ぼし得る、送達される他の分子を含んでもよい。

本明細書で使用される場合、「核酸」は、モノマーヌクレオチドの鎖（ポリマーまたはオリゴマー）から構成される高分子を指す。最も一般的な核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）である。本発明が、とりわけ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ）などの人工核酸を含有する生体分子に対して使用され得ることがさらに理解されるべきである。本発明の様々な実施形態では、核酸は、とりわけ、細菌、ウイルス、ヒト、および動物などの種々の供給源、ならびに植物および真菌などの供給源に由来してもよい。供給源は、病原体であってもよい。あるいは、供給源は、合成生物であってもよい。核酸は、遺伝子、染色体外または合成であってもよい。用語「ＤＮＡ」が本明細書で使用される場合、当業者は、本明細書に記載の方法およびデバイスが、他の核酸、例えばＲＮＡまたは上述のものに適用され得ることを認識するであろう。加えて、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むがこれらに限定されない任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むために本明細書で使用される。これらの用語間に長さでの区別は意図されない。さらに、これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。よって、ある特定の実施形態では、これらの用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ＰＮＡ、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含んでもよい。これらは、メチル化によるおよび／またはキャッピングによるなどの修飾、ならびにポリヌクレオチドの未修飾形態も含んでもよい。より詳細には、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド主鎖を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、Ｏｒｅｇ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．からＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）ポリマー、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ中に見られるように、ポリマーが塩基対合および塩基スタッキングを可能にする立体配置中に核酸塩基を含有する場合には、他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。加えて、「核酸」は、プラスミドＤＮＡベクターなどのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含んでもよい。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、アミノ酸の１つまたは複数の鎖からなる生体分子である。タンパク質は、主に、コード遺伝子のヌクレオチド配列によって指定されるそのアミノ酸の配列において互いに異なる。ペプチドは、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基の間のペプチド結合によって一緒に結合した２つまたはそれより多いアミノ酸の単一の線状ポリマー鎖であり、鎖内の複数のペプチドはポリペプチドと称されてもよい。タンパク質は、１つまたは複数のポリペプチドから構成されてもよい。合成後間もなく、または合成中でも、タンパク質の残基は、翻訳後修飾によって化学的に修飾されることが多く、これは、タンパク質の物理化学的特性、フォールディング、安定性、活性、および最終的にはその機能を変更する。タンパク質は、結合した非ペプチド基を有することもあり、これは、補欠分子族または補因子と呼ばれる場合がある。

加えて、本明細書において使用される生体分子は、非天然の塩基および残基、例えば、生物学的配列中に挿入された非天然のアミノ酸を含むことができる。

参照文献

本明細書において引用されるすべての特許、公開された出願および参照文献の教示は、参照によりその全体が組み込まれる。

実施例の実施形態が詳細に示され記載されているが、形式上および詳細な様々な変更が、添付の特許請求の範囲に包含される実施形態の範囲を逸脱することなくなされ得ることが当業者によって理解されるであろう。

Claims (24)

1. 組織電気泳動転写用微小電極デバイスであって、
   （ｉ）組織電気泳動転写によって、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達するための導電性の表面を含む標的組織微小電極領域、および（ｉｉ）前記生体分子を前記組織位置に位置する前記細胞に選択的に送達するための前記標的組織微小電極領域を位置決めするために貫通微小電極を機械的に係留するためのアンカー微小電極領域を含む前記貫通微小電極と、
   前記貫通微小電極を電圧源に接続するための電気接続部と、
   組織レベル電場予測モジュールを備えるモデリングプロセッサーと
   を含み、
   前記モデリングプロセッサーが、細胞密度を説明する細胞レベルシミュレーションモジュールを備え、前記モデリングプロセッサーが、組織電気泳動転写によって、生体分子を前記組織位置に位置する細胞に選択的に送達すべき組織位置を決定するように構成されている、微小電極デバイス。
2. 前記アンカー微小電極領域が、前記貫通微小電極の遠位端またはその近傍に存在する、請求項１に記載の微小電極デバイス。
3. 前記標的組織微小電極領域の前記導電性の表面とは別個の、前記貫通微小電極の表面に電気的絶縁部を含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
4. 前記アンカー微小電極領域の表面に電気的絶縁部を含む、請求項３に記載の微小電極デバイス。
5. 前記標的組織微小電極領域の表面の少なくとも一部に選択的に送達される前記生体分子を含む生体分子コーティングを含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
6. 前記組織位置が、皮膚の角質層の下、かつ（ｉ）皮膚の表皮層の少なくとも一部内および（ｉｉ）皮膚の真皮層の少なくとも一部内の少なくとも１つである、請求項１に記載の微小電極デバイス。
7. 前記組織位置が、皮膚の表皮層のみの少なくとも一部内である、請求項１に記載の微小電極デバイス。
8. 前記アンカー微小電極領域が、バーブを含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
9. 前記アンカー微小電極領域が、接着表面コーティングを含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
10. 前記生体分子コーティングが、皮膚組織に囲まれた場合に溶解可能である、請求項５に記載の微小電極デバイス。
11. 前記生体分子コーティングが、核酸およびタンパク質の少なくとも１つを含む、請求項５に記載の微小電極デバイス。
12. 前記電気的絶縁部が、前記貫通微小電極に堆積した絶縁ポリマーを含む、請求項３に記載の微小電極デバイス。
13. １つ以上の前記貫通微小電極を含み、
    前記１つ以上の前記貫通微小電極の中心間距離が、約３００マイクロメートルから約１．５ミリメートルの間の間隔を含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
14. 前記貫通微小電極の長さが、約２２５マイクロメートルから約１２５０マイクロメートルの間の長さを含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
15. 前記貫通微小電極が、先細りの先端部を含むニードル、および側面の突出部を含むニードルの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
16. 前記貫通微小電極が、約１００マイクロメートルから約５００マイクロメートルの間の直径を含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
17. 前記電気接続部が、前記電圧源からのパルス電圧を前記貫通微小電極に印加して、皮膚の表皮層および皮膚の真皮層の少なくとも１つにおいて、組織の細胞膜の一時的透過化を作出する、請求項１に記載の微小電極デバイス。
18. 前記電気接続部が、前記電圧源からの電圧を前記貫通微小電極に印加して、前記貫通微小電極周囲の皮膚組織において、１センチメートル当たり約０．１キロボルト（ｋＶ）から１センチメートル当たり約１０キロボルト（ｋＶ）の間の最大電場強度を作出する、請求項１に記載の微小電極デバイス。
19. 前記電気接続部が、フォトリソグラフィーによって画定される接続部を含み、前記貫通微小電極が、フォトリソグラフィーによって画定される電極基材を含み、前記貫通微小電極が、電気めっきされた金属を含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
20. １つ以上の前記貫通微小電極を含み、前記電気接続部が、前記１つ以上の貫通微小電極のうちの２つまたはそれより多くに対して電気的に独立した接続部を含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
21. それぞれが異なる生体分子を選択的に送達するための１つ以上の標的組織微小電極領域を含む、請求項１に記載の微小電極デバイス。
22. 前記モデリングプロセッサーが、前記電圧源によって前記貫通微小電極に送達された制御電圧を決定するように構成されている、請求項１に記載の微小電極デバイス。
23. 組織電気泳動転写を実施する方法において使用するための、貫通微小電極を含むシステムであって、前記方法が、
    前記貫通微小電極のアンカー微小電極領域を使用して、前記貫通微小電極を係留し、導電性の表面を含む前記貫通微小電極の標的組織微小電極領域が、生体分子を組織位置に位置する細胞に選択的に送達するように位置決めされるステップを含み、
    前記システムが、電圧を前記貫通微小電極に印加して、前記生体分子を前記組織位置に位置する前記細胞に送達するための電気接続部を含み、
    前記システムが、組織レベル電場を予測するための、および前記組織位置の細胞密度を説明する細胞レベルシミュレーションを実施するためのモデリングプロセッサーをさらに含み、
    前記モデリングプロセッサーが、組織電気泳動転写によって、生体分子を前記組織位置に位置する細胞に選択的に送達すべき組織位置を決定する、システム。
24. 前記モデリングプロセッサーが、電圧源によって前記貫通微小電極に送達された電圧を制御する、請求項２３に記載のシステム。

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