JP2009526768A - 臍帯血から分離または、増殖された細胞を含む進行性、慢性肺疾患治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
赤色:PKH26標識の治療用細胞成分
赤色:Pro SP−C標識で2型肺細胞
黄色:ヒトHLA−DRおよび、Pro SP−Cが共に同時標識(投与された治療用細胞が肺の実質細胞に分化していることを示す)
<実施例1>細胞の分離・培養
本発明の治療用細胞、つまり、間葉幹細胞(Mesenchymal stem cell)を、以下のようにヒト臍帯血から分離・培養した(Yang, Ha et al. 2004)。
<1−1>臍帯血(umbilical cord blood, UCB)の取得
具体的に、臍帯血のサンプルは、産婦の同意を得て出産時に臍静脈(umbilical vein)から取得するが、23mlのCPDA−1抗凝固剤(Greencross Co., Korea)を含むUCB収集バックの16−ゲージの注射針を臍静脈に挿入しUCBが重力によって収集バックに集まるようにした。全ての臍帯血取得物は、収集後24時間内に処理して生存率は90%以上であった。
<1−2>間葉幹細胞の分離および増幅
単核球細胞は、Ficoll Hypaque gradient(密度 1.077 g/cm3, Sigma, USA)で遠心分離して取得し、分離した単核球細胞は、洗浄後10%FBS(HyClone, USA)が添加された最小基本培地(a-MEM, Gibco BRL, USA)に懸濁してから5×106cells/cm2の濃度で接種した。これを、37.8℃、5%CO2を含む湿潤大気で一週間に2回ずつ培地を交換しながら培養した。培養後、繊維芽細胞と類似した付着力のある細胞が観察され、1〜3週後に間葉幹細胞コロニーの単一層が80%の集密(confluence)を示した際、細胞にトリプシン(0.25% trypsin, HyClone)を処理し、洗浄して、培養培地(10%のFBSが添加されたa-MEM)に懸濁してから5×104cells/cm2の濃度で接種した。これを、連続した体外(exvivo)増殖により数を増加させた(Yang SE et al., Cytotherapy, 6(5): 476-86, 2004)。
<実施例2>高濃度酸素注入−気管支肺異形性症モデル
全ての動物実験は、三星(サンスン)生命科学研究所の実験動物委員会(Research Animal Laboratory Committee of Samsung Biomedical Research Institute, Korea)により承認を得て、機関のガイドラインに沿った。気管支肺異形性症モデルを作るために、在胎期間が正確に分かる妊娠したスプラグダウレイラット(Daihan Biolink Co., Korea)を購入し実験動物飼育施設で出産前の少なくとも1週間以上飼育した。それから生まれた新生ラットに出生直後(出産後10時間以内)から高濃度酸素を14日間投与して、具体的に69.5×50.0×32.0cm大きさのアクリルケージ(密閉されたプレキシグラスケージ)にラットのケージを入れ、1気圧下で十分な湿度(40〜60%)と温度(23〜26℃)を保ちながら100%の酸素を最初の10分間は10?/minに飽和させ、酸素濃度分析器(model 572, Servomex, USA)によって測定して、95%以上に酸素飽和度が達すれば、以降100%の酸素を2.5?/minに還流させながら酸素飽和度を測定し続けて95%以上を保つようにした。親ラットの酸素毒性による肺浮腫を防ぐため24時間周期で親ラットを交換しながら14日間続けた。
<実施例3>臍帯血間葉幹細胞の投与
前記実施例1で取得した臍帯血間葉幹細胞の気道内投与は、前記実施例2で高濃度酸素に晒された出生5日目のラットに26ゲージ針を用いて首の中央部位にて空気の逆流を確認した後、5.83×105cells/0.05mlを気道内に投与した。
<実施例4>動物犠牲後組織準備
実験14日目、新生ラットにペントバルビタールを腹腔内注射して麻酔を施した後、四肢を固定してから胸郭を切開し心臓と肺組織を露出させ、23ゲージ針を左心室に固定して、右心房を穿刺し生理食塩水を還流した。左側主気管支をしっかり結紮した後、左側の肺を摘出し液体窒素に凍結して気管支に管を入れて残りの右側の肺に4%のフォルムアルデヒド固定液を入れて20cmH2O圧力で一定に膨らませた後一晩中同一の固定液で固定した。
<実施例5>繊維化程度、RACおよびMLI測定
4%のフォルムアルデヒドに24時間固定された肺組織切片をパラフィンに埋めて4umの厚さで切りヘマトキシリン・エオシン染色して光学顕微鏡で観察し、中性白血球の数、繊維化の程度と肺胞中隔および肺間質の細胞数、厚さ増加の程度、肺浮腫の有無を確認して、新たに形成される嚢と肺胞を反映する放射状の肺胞数(radial alveolar count, RAC; Husain AN and Hassel RG Pediatr Pathol.,?13:475-484, 1993)と肺胞の大きさを測定する平均線状区分(mean linear intercept, MLI; Dunnill MS., Thorax 17:320-328, 1962)を測定した。繊維化程度の定量はStocker JT(Stocker, J.T, Hum?Pathol., 17:943-961, 1986)の方法を若干変えて、少なくとも1匹当たり30肺フィールドを10倍の倍率にて観察し、繊維化程度がなければ0点、若干肺胞中隔繊維化の所見が観察されれば1点、中等度で観察されれば2点、非常に重度の場合を3点として点数をつけ平均した。RACは、末端細気管支から最も近い維管束中隔(fibrovascular septum)まで垂直の線を引き、その間の全ての嚢胞(saccule)の数を測定して、光学顕微鏡の40倍の倍率にて組織を観察した。MLIは、1mmのルーラを用いてその間に跨る隔膜(septum)の個数を測定し計算した。それぞれの場合、顕微鏡でランダムな部位を各々10回検査して、これらの平均値から統計的分析を行った。
<実施例6>MPO活性
好中球蓄積の指標である骨髄細胞型過酸化酵素(myeloperoxidase, MPO)は、Gray et al.(Gray K.D. et al., Am J Surg., 186(5):526-530, 2003)の方法を変えて測定した。肺組織は、リン酸塩緩衝溶液(pH7.4)で均質化した後30,000×gで30分間遠心分離して、ペレットは、0.5%のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドが添加された他のリン酸塩緩衝溶液(50mM、pH6.0)で再懸濁した。再懸濁したペレットで、MPO活性は0.167mg/ml、O-ジアニシジンヒドロクロライドと0.0005%過酸化水素を用いて460nmで吸光度の変化を測定し確認して、MPO活性1unitは1μmolの過酸化物を1分で分解する酵素の量と定義した。データは、平均±SDで示して、なお、統計的分析は、ANOVAに続きSAS enterprise guide version of three(SAS Institute, Cary, NC)を用いてMann-Whitney testまたは、Kruska-Wallisを行った(0.05以下の全てのp値は有意のものとみなす)。
MPO活性の測定結果、高濃度の酸素に晒されたラットの肺組織において、MPO活性は、室内空気に晒された動物に比べ相当増加した。間葉幹細胞を気道内に投与した場合には、高濃度酸素に晒されたラットに比べMPO活性は相当減少した(図7)。
<実施例7>二重標識免疫蛍光組織化学染色
本発明者等は、肺に移植された間葉幹細胞が装着してどのように分化するかを調べるために顕微鏡検査を行った。
Claims (8)
- 臍帯血から分離、または、増殖した細胞を含む進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
- 請求項1において、
細胞は、臍帯血から分離した自家造血母細胞および、間葉幹細胞を始とする単核球細胞、および、臍帯血から分離した間葉幹細胞から継代培養され増幅した間葉幹細胞からなる群の中から選ばれた一つ以上の細胞であることを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。 - 請求項1において、
分離または、増殖された細胞を培養している培地をさらに含む、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。 - 請求項3において、
前記培地は、DMEM,MEM、alpha-MEM, McCoys 5A培地(Gibco), Eagle's basal培地、CMRL培地、Glasgow最小必需培地、Ham's F-12培地、Iscove's modified Dulbecco's培地、Liebovitz' L-15培地、RPMI1640培地からなる群から選ばれることを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。 - 請求項1において、
前記組成物は、患者の気道内に投入されることを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。 - 請求項1において、
進行性、慢性肺疾患は、嚢胞性繊維症、慢性閉鎖性肺疾患、および、肺異形成症であることを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。 - 請求項1において、
前記組成物は、血清、抗生剤および、抗真菌剤でなる群から選ばれる一つ以上の補助成分を含むことを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。 - 請求項1において、
前記組成物は、胎児牛血清、馬血清、人血清、ペニシリンG(Penicillin G)、ストレプトマイシンスルフェート(streptomycin sulfate)、アムホテリシンB(amphotericin B)、ゲンタマイシン(gentamycin)、および、ナイスタチン(nystatin)でなる群から選ばれる一つ以上の補助成分を含むことを特徴とする、進行性、慢性肺疾患の治療用組成物。
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