JP2009526757A - ヒストンデアセチラーゼのインヒビターとしてのピリジン及びピリミジン誘導体 - Google Patents

Abstract

【化１】

本発明は、ヒストンデアセチラーゼ阻害酵素活性をもつ、式（Ｉ）［式中、Ｒ^１、Ｒ^２Ｒ^３及びＸは定義された意味をもつ］の新化合物、それらの調製、それらを含有する組成物並びに医薬としてのそれらの使用を含んでなる。

Description

本発明はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害酵素活性を有する化合物を対象にする。それは更に、それらの製法、それらを含んでなる組成物並びに、ＨＤＡＣを阻害するための、そして医薬としての、例えば、癌及び乾癬のような増殖性状態を抑制するための医薬としての、インビトロ及びインビボ双方のそれらの使用を対象にする。

核のヒストンは、遺伝子の転写並びに、複製、修復、組み換え及び染色体分離のような他のＤＮＡ−テンプレート過程を制御する役目をもつ機構の不可欠な、動的成分として知られる。それらはアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化及びＡＤＰ−リボシル化を包含する翻訳後修飾の対象である。

本明細書で「ＨＤＡＣ」と呼ばれる１種又は複数のヒストンデアセチラーゼは、核のヌクレオソームのヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４を包含する、タンパク質のリシン残基上のアセチル修飾物の除去を触媒する酵素である。ＨＤＡＣは、本明細書で「ＨＡＴ」と呼ばれる１種又は複数のヒストン・アセチルトランスフェラーゼと一緒に、ヒストンのアセチル化レベルを制御する。ヌクレオソームのヒストンのアセチル化の平衡は多数の遺伝子の転写に重要な役割を果たす。ヒストンのアセチル化低下は遺伝子転写の後退をもたらす凝縮されたクロマチン構造を伴ない、他方アセチル化ヒストンは、より開放されたクロマチン構造及び転写の活性化を伴なう。

１１種の構造的に関連したＨＤＡＣが記載されており、２群に分類される。第Ｉ群のＨＤＡＣはＨＤＡＣ１、２、３、８及び１１よりなり、他方第ＩＩ群のＨＤＡＣはＨＤＡＣ４、５、６、７、９及び１０よりなる。第３群のＨＤＡＣのメンバーは第Ｉ群及び第ＩＩ群のＨＤＡＣと構造的には関連していない。第Ｉ／ＩＩ群のＨＤＡＣは亜鉛依存性機序により作動し、他方第ＩＩＩ群のＨＤＡＣはＮＡＤ−依存性である。

ヒストンに加えて、その他のタンパク質、とりわけｐ５３、ＧＡＴＡ−１及びＥ２Ｆのような転写因子；グルココルチコイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、エストロゲン受容体のような核受容体；並びにｐＲｂのような細胞周期制御タンパク質、もまた、アセチル化のための基質であった。タンパク質のアセチル化は、ｐ５３の安定化、コファクターの採用及び増加したＤＮＡ結合のようなタンパク質の安定化と関連付けられてきた。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷のような種々のストレス信号に反応して細胞周期の停止又はアポトーシスを誘発する可能性がある腫瘍サプレッサーである。ｐ５３誘発細胞周期停止の主要標的はｐ２１遺伝子であるように見える。ｐ５３によるその活性化の次に、ｐ２１は、Ｇ１及びＧ２相の両方における細胞周期停止、老衰期間中のその調節過剰及び増殖している細胞核の抗原とのその相互反応をもたらすサイクリン／サイクリン−依存性キナーゼ複合物とのその関連により特定されてきた。

ＨＤＡＣのインヒビターの研究により、それらが細胞周期停止、細胞分化、アポトーシス及び形質転換された表現型の逆転において重要な役割を果たすことが示される。

例えば、インヒビターのトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）はＧ１及びＧ２相の両方において細胞周期停止を誘起し、異なる細胞系列の形質転換表現型を逆転し、そしてフレンド白血病細胞及び他の細胞の分化を誘発する。ＴＳＡ（及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸ＳＡＨＡ）はマウスにおいて、細胞増殖を阻害し、末端の分化（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘発し、そして腫瘍の形成を抑制することが報告された（非特許文献１参照）。

トリコスタチンＡはまた、繊維症、例えば肝繊維症及び肝硬変の処置に有用であることが報告された（特許文献１参照）。

ＨＤＡＣインヒビターの薬作用発生団は、ＨＤＡＣの亜鉛含有活性部位と相互反応する金属結合領域、リンカー領域及び、活性部位の縁上の残基と相互反応する表面認識領域又はキャッピング領域よりなる。

ＨＤＡＣのインヒビターはまた、ｐ２１遺伝子の発現を誘発することが報告されている。これらのインヒビターによるｐ２１遺伝子の転写活性化は、ｐ２１プロモーター領域における、ヒストンＨ３及びＨ４のアセチル化の後のクロマチン再形成により促進される。ｐ２１のこの活性化はｐ５３−非依存性の様態で起り、従ってＨＤＡＣインヒビターは多数の腫瘍の証明の、突然変異ｐ５３遺伝子をもつ細胞中で作用する。

更にＨＤＡＣインヒビターは宿主の免疫反応の増強及び腫瘍脈管形成の抑制のような間接的作用をもつことができ、従って原発腫瘍の増殖を抑制し、転移を妨げることができる（非特許文献２参照）。

以上を考察すると、ＨＤＡＣインヒビターは、突然変異ｐ５３遺伝子をもつ腫瘍を包含する細胞増殖疾患又は状態の処置に大きな可能性をもつことができる。

２００３年８月１４日公開の特許文献２はヒストンデアセチラーゼのインヒビターとしての２環式ヒドロキサメートを開示している（特許文献２参照）。

なかでも２００３年９月１８日に公開された特許文献３、４、５、６、７、８、９、１０はヒストンデアセチラーゼのインヒビターとしての置換ピペラジニルピリミジニルヒドロキサム酸を開示しており、特許文献８は更にＲ３０６４６５を開示している（特許文献３〜１０参照）。

２００３年１０月９日公開の特許文献１１はＨＤＡＣインヒビターとしての、ピペラジン結合を含んでなるカルバミン酸化合物を開示している（特許文献１１参照）。

２００３年１０月２３日公開の特許文献１２はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしての置換ピペラジニルフェニルベンズアミド化合物を開示している（特許文献１２参照）。

２００３年１１月１３日公開の特許文献１３はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのベンズアミドを開示している（特許文献１３参照）。

２００４年１月２９日に公開の特許文献１４はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのアリール基とヒドロキサメート間にアルキルリンカーを含有する誘導体を開示している（特許文献１４参照）。

２００４年２月１２日公開の特許文献１５はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしての、（ヘテロ）アリールアルケニル置換２環式ヒドロキサメートを開示している（特許文献１５参照）。

２００４年６月２４日公開の特許文献１６は薬理学的物質としてのアリーレン−カルボン酸（２−アミノ−フェニル）−アミド誘導体を開示している（特許文献１６参照）。

２００４年７月２９に公開の特許文献１７は抗炎症及び抗腫瘍作用をもつＮ−ヒドロキシ−ベンズアミドの誘導体を開示している（特許文献１７参照）。

２００４年７月２９日公開の特許文献１８はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしての、置換アリールヒドロキサメート誘導体を開示している（特許文献１８参照）。

２００４年、８月１９日に公開の特許文献１９は薬理学的物質としてのモノ−アシル化Ｏ−フェニレンジアミン誘導体を開示している（特許文献１９参照）。

２００４年８月１９日公開の特許文献２０はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのジアミノフェニレン誘導体を開示している（特許文献２０参照）。

２００４年８月２６日公開の特許文献２１はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのベンズアミド誘導体を開示している（特許文献２１参照）。

２００４年８月２６に公開の特許文献２２はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのインドール、ベンズイミダゾール及びナフトイミダゾールを開示している（特許文献２２参照）。

２００４年９月３０日に公開の特許文献２３はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしての非芳香族複素環式環系に結合されたヒドロキサメートを開示している（特許文献２３参照）。

２００４年１０月１４日公開の特許文献２４はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのオキシム誘導体を開示している（特許文献２４参照）。

２００４年１０月２８日に公開の特許文献２５はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのヒドロキサメート誘導体を開示している（特許文献２５参照）。

２００５年、３月３１に公開の特許文献２６はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのベンズイミダゾールを開示している（特許文献２６参照）。

２００５年、４月７日に公開の特許文献２７及び２８はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのベンズアミドを開示している（特許文献２７、２８参照）。

２００５年５月６日に公開された特許文献２９はヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのアシル尿素に結合された及びスルホニル尿素に結合されたヒドロキサメートを開示している（特許文献２９参照）。

２００５年５月６日に公開の特許文献３０はまた、ヒストンデアセチラーゼンヒビターとしての二アリール結合ヒドロキサメートを開示している（特許文献３０参照）。

２００５年８月１８日に公開の特許文献３１は、ヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのチアゾリルヒドロキサム酸及びチアジアゾリルヒドロキサム酸を開示している（特許文献３１参照）。

２００５年９月２２日に公開の特許文献３２は、ヒストンデアセチラーゼンヒビターとしてのヘテロ五環式ヒドロキサム酸を開示している（特許文献３２参照）。

２００５年１０月６日に公開の特許文献３３は、ヒストンデアセチラーゼとしてのアルケニルベンズアミドを開示している（特許文献３３参照）。本発明の化合物は構造、それらの薬理作用及び／又は薬理学的効力において先行技術と異なる。

解決するべき問題は、増加した生体利用能及び／又はインビボの効力を有する、高い酵素活性及び細胞活性をもつヒストンデアセチラーゼンヒビターを提供することである。

本発明の新化合物は前記の問題を解決する。本発明の化合物は優れたヒストンデアセチラーゼ阻害酵素活性及び細胞活性を示すことができる。更に化合物は細胞レベル及びインビボレベルの双方でｐ２１遺伝子を活性化する高い能力を有する。それらは望ましい薬物動態学的プロファイル及びＰ４５０酵素に対する低い親和性をもつことができ、それがより広い安全範囲をも許容する、不都合な薬物−薬物相互作用の危険性を軽減する。

本化合物の有利な特徴は代謝安定性及び／又はｐ２１誘発能である。更にとりわけ、本発明の化合物はヒト肝ミクロソーム中の安定性を増加しそして／又は増加したインビボのｐ２１プロモーター誘発能を有する。
Ｇｅｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，欧州特許第０ ８２７ ７４２号明細書、１９９８年３月１１日公開 欧州特許第１４７２２１６号明細書 欧州特許第１４８５０９９号明細書 欧州特許第１４８５３４８号明細書 欧州特許第１４８５３５３号明細書 欧州特許第１４８５３５４号明細書 欧州特許第１４８５３６４号明細書 欧州特許第１４８５３６５号明細書 欧州特許第１４８５３７０号明細書 欧州特許第１４８５３７８号明細書 欧州特許第１４９２５３４号明細書 欧州特許第１４９５００２号明細書 欧州特許第１５０１５０８号明細書 国際公開出願第０４／００９５３６号パンフレット 欧州特許第１５２５１９９号明細書 欧州特許第１５７２６２６号明細書 欧州特許第１５８１４８４号明細書 欧州特許第１５８５７３５号明細書 欧州特許第１５９２６６７号明細書 欧州特許第１５９０３４０号明細書 欧州特許第１５９２６６５号明細書 国際公開出願第０４／０７２０４７号パンフレット 欧州特許第１６０８６２８号明細書 欧州特許第１６１３６２２号明細書 欧州特許第１６１１０８８号明細書 国際公開出願第０５／０２８４４７号パンフレット 国際公開出願第０５／０３０７０４号パンフレット 国際公開出願第０５／０３０７０５号パンフレット 国際公開出願第０５／０４０１０１号パンフレット 国際公開出願第０５／０４０１６１号パンフレット 国際公開出願第０５／０７５４６９号パンフレット 国際公開出願第０５／０８６８９８号パンフレット 国際公開出願第０５／０９２８９９号パンフレット Ｆｉｎｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０１：１８８−１９３．１９９９ Ｍａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２５：２６１−３０９，２００５

本発明は式（Ｉ）

［式中、
ＸはＮ又はＣＨであり、
Ｒ^１はヒドロキシ又は式（ａ−１）

の基であり、ここで
Ｒ^４はヒドロキシ又はアミノであり、
Ｒ^５は水素、チエニル、フラニル又はフェニルであり、そしてチエニル、フラニル又はフェニルはそれぞれ、場合により１個又は２個のハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、フェニル、Ｃ_１−６アルキル、（ジＣ_１−６アルキル）アミノ、Ｃ_１−６アルキルオキシ、フェニルＣ_１−６アルキルオキシ、ヒドロキシＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、Ｃ_１−６アルキルカルボニル、ポリハロＣ_１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルスルホニル、ヒドロキシカルボニルＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、アミノスルホニル、アミノスルホニルＣ_１−６アルキル、イソオキサゾリル、アミノカルボニル、フェニルＣ_２−６アルケニル、フェニルＣ_３−６アルキニル又はピリジニルＣ_３−６アルキニルで置換されていてもよく、
Ｒ^６、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立して水素、アミノ、ニトロ、フラニル、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、チエニル、フェニル、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルＣ_１−６アルキル又は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_２−Ｒ^９であり、ここで
Ｒ^９は水素、Ｃ_１−６アルキル、ヒドロキシ、アミノ又はＣ_１−６アルキルオキシであり、
Ｒ^２はアミノ、Ｃ_１−６アルキルアミノ、アリールＣ_１−６アルキルアミノ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ_３−７シクロアルキルアミノ、Ｃ_３−７シクロアルキルＣ_１−６アルキルアミノ、グルタルイミジル、マレイミジル、フタルイミジル、スクシンイミジル、ヒドロキシ、Ｃ_１−６アルキルオキシ、フェニルオキシであり、ここで前記フェニルオキシ基中のフェニル部分は場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、シアノ、Ｃ_１−６アルキルオキシカルボニル及びトリフルオロメチルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ^３はフェニル、ナフタレニル又はヘテロシクリルであり、ここで前記フェニル又はナフタレニル基はそれぞれ、場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ_１−６アルキル、アリール、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、Ｃ_１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ_１−６アルキルアミノメチル、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、Ｃ_１−６アルキルアミノスルホニル及びヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよく、
アリールはフェニル又はナフタレニルであり、ここで前記フェニル又はナフタレニル基はそれぞれ、場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、シアノ及びヒドロキシカルボニルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよく、そして
ヘテロシクリルはフラニル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ジオキソリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピリダジリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、トリチアニル、インドリジニル、インドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノオキサリニル又はナフチリジニルであり、ここで
前記ヘテロシクリル基はそれぞれ、場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、シアノ、アミノ及びモノ−もしくはジ（Ｃ_１−４アルキル）アミノからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよい］
の化合物、それらのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容できる付加塩及び立体化学的異性体形態を対象とする。

用語「ヒストンデアセチラーゼンヒビター」又は「ヒストンデアセチラーゼのインヒビター」は、ヒストンデアセチラーゼと相互反応することができ、その活性、より具体的にはその酵素活性を阻害することができる化合物を特定するために使用される。ヒストンデアセチラーゼ酵素活性を阻害する方法は、ヒストンからアセチル基を除去するヒストンデアセチラーゼの能力を減少させる方法を意味する。このような阻害は好ましくは特異的である、すなわちヒストンデアセチラーゼンヒビターが何か他の、無関係の生物学的効果をもたらすために要するインヒビターの濃度より低い濃度で、ヒストンからアセチル基を除去するためのヒストンデアセチラーゼの能力を低下させる。

以上の定義及び以後に使用される、ハロはフルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを包含し、Ｃ_１−２アルキルは例えばメチル又はエチルのような１又は２個の炭素原子を有する直鎖飽和炭化水素基を定義し、Ｃ_１−６アルキルはＣ_１−２アルキル並びに、例えばプロピル、ブチル、１−メチルエチル、２−メチルプロピル、ペンチル、２−メチルーブチル、ヘキシル、２−メチルペンチル等のような、３〜６個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖飽和炭化水素基を定義し、ポリハロＣ_１−６アルキニルは３個の同一の又は異なるハロ置換基を含有するＣ_１−６アルキル、例えばトリフルオロメチルを定義し、Ｃ_２−６アルケニルは、例えば、エテニル、２−プロペニル、３−ブテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、３−メチル−２−ブテニル、等のような、１個の二重結合を含有し、そして２〜６個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖炭化水素基を定義し、Ｃ_３−６アルキニルは例えば２−プロピニル、３−ブチニル、２−ブチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、３−ヘキシニル、等のような、１個の三重結合を含有し、そして３〜６個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖の炭化水素基を定義し、Ｃ_３−７シクロアルキルはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル等のような３〜７個の炭素を有する環式炭化水素基を包含する。

製薬学的に許容できる付加塩は、製薬学的に許容できる酸付加塩及び製薬学的に許容できる塩基の付加塩を包含する。前記の製薬学的に許容できる酸付加塩は、式（Ｉ）の化合物が形成することができる治療的に有効な無毒の酸付加塩形態を含んでなることを意味する。塩基性を有する式（Ｉ）の化合物は、前記の塩基形態を適当な酸で処理することにより、それらの製薬学的に許容できる酸付加塩に転化させることができる。適当な酸は例えば、ハロゲン化水素酸（例えば塩酸又は臭化水素酸）、硫酸、硝酸、リン酸等の酸のような無機酸、あるいは例えば酢酸、トリフルオロ酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、琥珀酸（すなわちブタンジオン酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノ−サリチル酸、パモエ酸等の酸のような有機酸を含んでなる。酸性を有する式（Ｉ）の化合物は、前記の酸形態を適当な有機又は無機塩基で処理することにより、それらの製薬学的に許容できる塩基付加塩に転化させることができる。適当な塩基塩形態は例えば、アンモニウム塩、アルカリ及びアルカリ土類金属塩（例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム塩等）、有機塩基との塩（例えばベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩）及び、例えばアルギニン、リシン等のようなアミノ酸との塩を含んでなる。

用語の「酸又は塩基付加塩」はまた、式（Ｉ）の化合物が形成することができる水和物及び溶媒付加物形態を含んでなる。このような形態の例は例えば、水和物、アルコラート等である。

本明細書で使用される用語「式（Ｉ）の化合物の立体化学的異性体形態」は、式（Ｉ）の化合物が所有することができる、同一配列の結合により結合された同一原子よりなるが、互換性でない異なる三次元構造を有するすべての可能な化合物を定義する。別に言及され又は示されない限り、化合物の化学名は、該化合物が所有することができるすべての可能な立体化学的異性体形態の混合物を包含する。該混合物は該化合物の基礎分子構造のすべてのジアステレオマー及び／又はエナンチオマーを含有することができる。純粋な形態又は相互に混合された、双方の、式（Ｉ）の化合物のすべての立体化学的異性体形態が本発明の範囲内に包含されることが意図される。

式（Ｉ）の化合物のＮ−オキシド形態はそこで、１個又は複数の窒素原子がいわゆるＮ−オキシド、特にその１個又は複数のピペリジン−、ピペラジン又はピリダジニル−窒素がＮ−酸化されているＮ−オキシドに酸化されている、式（Ｉ）化合物を含んでなることを意味する。

幾つかの式（Ｉ）化合物はまた、それらの互変異性体形態で存在することができる。前記の式中には明白に記載されていないが、このような形態は本発明の範囲内に包含されることが意図される。

用語「式（Ｉ）の化合物」はまた、以後使用される時はいつも、製薬学的に許容できる付加塩及びすべての立体異性体形態をも包含することを意味する。

本明細書で使用される用語「ヒストンデアセチラーゼ」及び［ＨＤＡＣ］は、ヒストンのＮ−末端のリシン残基のε−アミノ基からアセチル基を除去する酵素の１族のいずれか１個を表すことが意図される。文脈により別に示されない限り、用語「ヒストン」はあらゆる種からのＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４及びＨ５を包含するいずれかのヒストンタンパク質を表すことを意味する。ヒトのＨＤＡＣタンパク質又は遺伝子生産物はそれらに限定せずに、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、ＨＤＡＣ−８、ＨＤＡＣ−９、ＨＤＡＣ−１０及びＨＤＡＣ−１１を包含する。ヒストンデアセチラーゼはまた、原生動物又はカビ・真菌源から誘動することができる。

興味深い化合物の第１の群は、Ｒ^１がヒドロキシである式（Ｉ）の化合物よりなる。

興味深い化合物の第２の群は、Ｒ^５が水素以外である式（Ｉ）の化合物よりなる。

興味深い化合物の第３の群は、１個又は複数の以下の制限が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）ＸがＮであり、
ｂ）Ｒ^１がヒドロキシ又は式（ａ−１）の基であり、ここでＲ^４がアミノであり、Ｒ^５が水素又はチエニルであり、そしてＲ^６、Ｒ^７及びＲ^８がそれぞれ水素であり、
ｃ）Ｒ^２がアミノ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノ、フタルイミジル、スクシンイミジル又はフェニルオキシであり、ここで前記フェニルオキシ基中のフェニル部分は場合によりハロ（例えばフルオロ）置換基で置換されていてもよく、そして
ｄ）Ｒ^３が、場合によりハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ及びポリハロＣ_１−６アルキルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよいフェニルである。

興味深い化合物の第４の群は、１個又は複数の以下の制限が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）ＸがＮであり、
ｂ）Ｒ^１がヒドロキシであり、
ｃ）Ｒ^２がアミノ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノ、フタルイミジル、スクシンイミジル又はフェニルオキシであり、ここで前記フェニルオキシ基中のフェニル部分は、場合によりハロ（例えばフルオロ）置換基で置換されていてもよく、そして
ｄ）Ｒ^３が、場合によりハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ及びポリハロＣ_１−６アルキルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよいフェニルである。

興味深い化合物の更なる群は、そのＲ^３がフェニル又はナフタレニルであり、ここで前記フェニル又はナフタレニル基はそれぞれハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ_１−６アルキル、アリール、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、Ｃ_１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ_１−６アルキルアミノメチル、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、Ｃ_１−６アルキルアミノスルホニル及びヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されている、式（Ｉ）の化合物よりなる。

好ましい化合物の１つの群は、１個又は複数の以下の制限が適用される式（Ｉ）の化合物よりなる：
ａ）ＸがＮであり、
ｂ）Ｒ^１がヒドロキシであり、
ｃ）Ｒ^２がアミノであり、そして
ｄ）Ｒ^３が場合により、ハロ、好ましくはフルオロ及びＣ_１−６アルキルオキシ、好ましくはメトキシから選択される１個の置換基で置換されていてもよいフェニルである。

式（Ｉ）の特に好ましい化合物は以下を意味する化合物Ｎｏ．２である。

式（Ｉ）の化合物、それらの製薬学的に許容できる塩及びＮ−オキシド及び立体化学的異性体形態は、従来の方法で調製することができる。出発材料及び幾つかの中間体は知られた化合物であり，そして市場で入手することができるか又は当該技術分野で一般に知られた従来の反応方法に従って又は欧州特許出願第１４８５０９９号、第１４８５３４８号、第１４８５３５３号、第１４８５３５４号、第１４８５３６４号、第１４８５３６５号、第１４８５３７０号及び第１４８５３７８号明細書中に記載されたように調製することができる。幾つかの製法が以下に更に詳細に説明される。式（Ｉ）の最終化合物を得る他の方法は実施例中に説明される。

式（Ｉ）の化合物の調製の特定の方法は以下に説明される：
ａ）本明細書で式（Ｉ−ａ）の化合物と呼ばれ、そのＲ^１がヒドロキシである式（Ｉ）のヒドロキサム酸は、式（ＩＩ）の中間体を、例えばトリフルオロ酢酸のような適当な酸と反応させることにより調製することができる。該反応は例えばメタノール又はジクロロメタンのような適当な溶媒中で実施される。

ｂ）本明細書で式（Ｉ−ｂ）の化合物と呼ばれ、そのＲ^１が式（ａ−１）の基である式（Ｉ）の化合物は、例えばベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）のような適当な試薬の存在下で、式（ＩＩＩ）（ここでＭは水素又はアルカリ金属、例えばナトリウム又はリチウムを表す）の中間体を式（ＩＶ）の中間体と反応させることにより調製することができる。該反応は、ジクロロメタン及びテトラヒドロフランの混合物のような適当な溶媒中で、トリエチルアミンのような塩基の存在下で実施することができる。

式（ＩＩ）の中間体は、Ｎ’−（エチルカルボンイミドイル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン一塩酸（ＥＤＣ）及び１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）のような適当な試薬の存在下で、式（ＩＩＩ）の中間体を式（Ｖ）の中間体と反応させることにより調製することができる。その反応はジクロロメタン及びテトラヒドロフランの混合物のような適当な溶媒中で、トリエチルアミンのような塩基の存在下で実施することができる。

式（Ｉ）の化合物はまた、分子中の他の基の感受性に応じて、当該技術分野で知られた反応又は官能基転化、例えば対応するカルボン酸又はアルコールへのカルボン酸エステルの加水分解により相互に転化することができ、アルコールはエステル及びエーテルに転化させることができ、第一級アミンは第二級又は第三級アミンに転化することができ、第一級又は第二級アミンはアミド又はスルホンアミドに転化することができ、フェニル基上のヨードラジカルは適当なパラジウム触媒の存在下で一酸化炭素の挿入によりエステル基に転化させることができる。

式（ＩＩＩ）の中間体は、式（ＶＩ）の中間体を、適当な溶媒、例えば、エタノール又はプロパノールのようなアルコール、あるいはＴＨＦ中で、適当な酸性溶液、例えば塩酸、又は適当なアルカリ金属塩基、例えば水酸化ナトリウムと反応させることにより調製することができる。

本明細書で式（ＩＩ−ａ）の中間体と呼ばれ、そのＲ^２がアミノである式（ＩＩ）の中間体は、式（ＶＩＩ）の中間体を、適当な溶媒、例えばジクロロメタン中でピペリジンと反応させることにより調製することができる。

式（ＶＩＩ）の中間体は、Ｎ’−（エチルカルボンイミドイル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、一塩酸（ＥＤＣ）及び１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）のような適当な試薬の存在下で、式（ＶＩＩＩ）の中間体を式（Ｖ）の中間体と反応させることにより調製することができる。その反応はジクロロメタン及びテトラヒドロフランの混合物のような適当な溶媒中でトリエチルアミンのような塩基の存在下で実施することができる。

式（ＶＩＩＩ）の中間体はテトラヒドロフランのような適当な溶媒中で、式（ＶＩ−ｂ）の中間体を水酸化ナトリウムと反応させ、次に塩酸による中和、炭酸ナトリウムの添加及び式（ＩＸ）の中間体の添加により調製することができる。

そのＲ^２がＣ_１−６アルキルカルボニルアミノ基である式（ＶＩ）の中間体は、適当な溶媒、例えばジクロロメタン中でトリエチルアミンのような塩基の存在下で、式（ＶＩ−ｂ）の中間体を、ハロゲン化物、例えば塩化物のような適当なＣ_１−６アルキルアシル化剤と反応させることにより調製することができる。

式（ＶＩ）の新中間体は、ジクロロメタンのような溶媒中で、式（Ｘ）の中間体を、ジイソプロピル・アゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ），トリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＰＢｕ_３）及び適当な求核物質Ｒ^２Ｈ（ＸＩ）と反応させることにより調製することができる。

そのＲ^２が場合により置換されていてもよいフェニルオキシ基である式（ＶＩ）の化合物は、式（Ｘ）の中間体を、対応する、場合により置換されていてもよいフェノール化合物と反応させることにより調製することができる。そのＲ^２がフタルイミジル基である式（ＶＩ）の化合物はまた、式（Ｘ）の中間体をフタルイミドと反応させることにより調製することができる。あるいはまた、そのＲ^２がスクシンイミジル基である式（ＶＩ）の化合物は、式（Ｘ）の中間体をスクシンイミドと反応させることにより調製することができる。

式（ＶＩ−ｂ）の前記の中間体は、（ａ）ジクロロメタンのような適当な溶媒中で式（Ｘ）の中間体をジイソプロピル・アゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＰＢｕ_３）及びフタルイミドと反応させて、式（ＶＩ−ｃ）の中間体を形成し、そして（ｂ）エタノールのような適当な溶媒中で、生成された式（ＶＩ−ｃ）の中間体をヒドラジン一水和物と反応させることにより調製することができる。

あるいはまた、式（ＶＩ−ｃ）の中間体は、例えばＴＨＦのような適当な溶媒中で、式（ＸＩＩ）の中間体を、Ｓｙｎｌｅｔｔ，２００２（８）１２６５−１２６８に記載された方法に従って調製された式（ＸＩＩＩ）の適当なエポキシドと反応させて、式（ＸＩＶ）の中間体を形成し、次にそれを、ジクロロメタンのような適当な溶媒中でジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）、トリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＰＢｕ_３）及びフタルイミドと反応させて、式（ＶＩ−ｃ）の中間体に転化させることにより調製することができる。

式（Ｘ）の新中間体は、適当な溶媒、例えばエタノールのようなアルコール中で、式（ＸＩＩ）の中間体を、１，４−ジオキサン−２，５−ジオール及び、そのＲ^３が前記の定義のとおりである式（ＸＶ）の適当なボロン酸と反応させることにより一工程で調製することができる。

式（ＸＩＩ）の中間体は、適当な溶媒、例えばアセトニトリル中で、炭酸カリウムのような塩基の存在下で、そのＬ^３が有機スルホニル基、例えばメタンスルホニル基のような離脱基である式（ＸＶＩ）の中間体をピペラジン（ＸＶＩＩ）と反応させることにより調製することができる。

本発明はまた、そのＱがＣ_１−２アルキルオキシカルボニル、ＭＯ_２Ｃ（ここでＭは水素又はアルカリ金属である）又はテトラヒドロピラニルオキシアミノカルボニルであり、Ｒ^２ａがＲ^２に対して定義されたとおりであるかあるいはまた、ヒドロキシメチルであり、そしてＸ及びＲ^３が式（Ｉ）について定義されたとおりである、集合的に式（Ｂ）の化合物と呼ばれる、前記の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＶＩ）及び（Ｘ）の中間体並びにそれらのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容できる付加塩及び立体化学的異性体形態を対象とする。

興味深い、好ましい、より好ましいそしてもっとも好ましい化合物の群は、式（Ｉ）の化合物について定義された群に従って前記の中間体に対し定義することができる。

式（Ｉ）の化合物及び幾つかの中間体はそれらの構造中に少なくとも１個のステレオジェン中心をもつかも知れない。このステレオジェン中心はＲ又はＳ形態で存在することができる。

前述の方法で調製される式（Ｉ）の化合物は一般に、当該技術分野で知られた分割法に従って相互から分割することができる、エナンチオマーのラセミ混合物である。式（Ｉ）のラセミ化合物は適当なキラル酸との反応により、対応するジアステレオマー塩形態に転化させることができる。該ジアステレオマー塩形態を次に、例えば選択的又は分別結晶化により分離して、エナンチオマーをアルカリによりそれらから遊離させる。式（Ｉ）の化合物のエナンチオマー形態を分離する代りの方法は、キラル固定相を使用する液体クロマトグラフィーを伴なう。該純粋な立体化学異性体形態はまた、その反応が立体特異的に起る場合は、適当な出発材料の、対応する純粋な立体化学的異性体形態から誘動することができる。特定の立体異性体が所望される場合は、該化合物は好ましくは立体特異的調製法により合成されるであろう。これらの方法は有利にはエナンチオマーとして純粋な出発材料を使用するであろう。

式（Ｉ）の化合物、それらの製薬学的に許容できる酸付加塩及び立体異性体形態は、それらがヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害効果を有するという貴重な薬理学的特性を有する。

本発明は、有効量の本発明の化合物を投与することにより、形質転換細胞を包含する細胞の異常増殖を抑制する方法を提供する。細胞の異常増殖は正常な制御機構と独立した細胞増殖（例えば接触阻止の喪失）を表す。これは直接には癌細胞の増殖の停止、末端分化及び／又はアポトーシスを誘発することによる、そして間接的には、腫瘍の新生血管形成を抑制する双方による、腫瘍増殖の抑制を包含する。

本発明はまた、有効量の本発明の化合物をこのような処置を要する被験体、例えば哺乳動物（そしてより具体的にはヒト）に投与する方法による、腫瘍の増殖を抑制する方法を提供する。とりわけ本発明は、有効量の本発明の化合物の投与による腫瘍の増殖を抑制する方法を提供する。抑制することができる腫瘍の例は、限定せずに、肺癌（例えば腺癌及び非小細胞肺癌を包含する）、膵臓癌（例えば外分泌膵癌のような膵癌）、結腸癌（例えば結腸腺癌及び結腸腺腫のような、例えば結腸直腸癌）、進行疾患を包含する前立腺癌、リンパ系の造血器官腫瘍（例えば急性リンパ性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、ブルキットリンパ腫）、骨髄性白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、甲状腺濾胞腺癌、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、間葉細胞源の腫瘍（例えば繊維肉腫及び横紋筋肉腫）、メラノーマ、奇形癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、皮膚の良性腫瘍（例えば、角化棘細胞腫）、乳癌（例えば進行乳癌）、腎臓癌、卵巣癌、膀胱癌及び表皮癌である。

本発明に従う化合物は、他の治療目的、例えば、
ａ）癌を処置するための腫瘍の放射線照射前、その間又はその後に本発明に従う化合物を投与することにより放射線治療に対して腫瘍を感受性化させる、
ｂ）関節リューマチ、変形性関節炎、若年性関節炎、痛風、多発性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎及び全身性エリテマドーデスのような関節症及び骨病理状態を処置する、
ｃ）血管増殖障害、アテローム性動脈硬化症及び再狭窄を包含する平滑筋細胞増殖を抑制する、
ｄ）潰瘍性大腸炎、クローン病、アレルギー性鼻炎、移植片対宿主病、結膜炎、喘息、ＡＲＤＳ、ベーチェット病、移植拒絶、蕁麻疹、アレルギー性皮膚炎、円形脱毛症、強皮症、発疹、湿疹、皮膚筋炎、ニキビ、糖尿病、全身性エリテマドーデス、川崎病、多発性硬化症、気腫、嚢胞性繊維症及び慢性気管支炎のような炎症状態及び皮膚状態を処置する、
ｅ）子宮内膜症、子宮筋腫、不正子宮出血及び子宮内膜増殖症を処置する、
ｆ）網膜及び脈絡膜血管に影響する血管疾患を包含する眼科血管形成を処置する、
ｇ）心機能不全を処置する、
ｈ）ＨＩＶ感染症の処置のような免疫抑制状態を抑制する、
ｉ）腎機能不全を処置する、
ｊ）内分泌障害を抑制する、
ｋ）糖新生の機能不全を抑制する、
ｌ）神経病理、例えばパーキンソン病あるいは、認識障害、例えばアルツハイマー病又はポリグルタミン関連神経疾患をもたらす神経病理を処置する、
ｍ）精神障害、例えば精神分裂病、双極性障害、鬱病、心配症及び精神病を処置する、
ｎ）神経筋肉病理、例えば筋萎縮性側索硬化症を抑制する、
ｏ）脊髄筋萎縮症を処置する、
ｐ）遺伝子の発現を強化することにより、処置に敏感な他の病理学的状態を処置する、
ｑ）遺伝子治療を高める、
ｒ）脂質生成を抑制する、
ｓ）マラリアのような寄生虫症を処置する、
のために、使用することができる。

従って、本発明は、医薬としての使用のための式（Ｉ）の化合物並びに、１種又は複数の前記の状態を処置するための医薬の製造のための、式（Ｉ）のこれらの化合物の使用を開示する。

式（Ｉ）の化合物、それらの製薬学的に許容できる酸付加塩及び立体異性体形態は、それらを、標識化合物とＨＤＡＣ間の複合体の形成を検出又は測定する方法を含んでなる、生体サンプル中のＨＤＡＣを検出又は特定するために使用することができるという貴重な診断的特性を有することができる。

検出又は特定法は、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、等のような標識物質で標識される化合物を使用することができる。放射性同位元素の例は^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３Ｈ及び^１４Ｃを包含する。酵素は通常、順次検出可能な反応を触媒する適当な基質の共役により検出可能にさせられる。それらの例は、例えばベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びマレートデヒドロゲナーゼ、好ましくはホースラディッシュのペルオキシダーゼを包含する。発光物質は例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、エクオリン及びルシフェラーゼを包含する。

生体サンプルは体組織又は体液と定義することができる。体液の例は脳脊髄液、血液、血漿、血清、尿、喀痰、唾液等である。

それらの有用な薬理学的特性を考慮すると、主題化合物は投与目的のための種々の製薬学的剤形に調合することができる。

本発明の製薬学的組成物を調製するためには、有効成分として有効量の、塩基又は酸付加塩形態の特定の化合物を、投与に所望される調製物の形態に応じて広範な形態を採ることができる、製薬学的に許容できる担体と密接な混合物に組み合わせる。これらの製薬学的組成物は望ましくは、好ましくは経口、直腸内、経皮的又は非経口注射による投与に適した単一の投与剤形にある。例えば、経口投与剤形の組成物を調製する際には、懸濁物、シロップ、エリキシル及び液剤のような経口液体調製物の場合には、例えば水、グリコール、油、アルコール、等のようないずれかの通常の製薬学的媒質、あるいは散剤、ピル、カプセル及び錠剤の場合にはデンプン、糖、カオリン、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等のような固形担体を使用することができる。

それらの投与の容易さのために錠剤及びカプセルがもっとも有利な経口投与単位剤形を表し、その場合には明らかに固形の製薬学的担体が使用される。非経口組成物のための担体は、例えば溶解性を補助するための他の成分を包含することはできるが、通常は、少なくとも大部分は滅菌水を含んでなるであろう。例えば、その担体が生理食塩水、ブドウ糖液又は生理食塩水とブドウ糖液の混合物を含んでなる注射液を調製することができる。適当な液体担体、懸濁剤等を使用することができる注射用懸濁液もまた調製することができる。経皮的投与に適した組成物中では、担体は、場合により、皮膚に対して有意な有害効果を誘発しない、少量の、あらゆる性状の適当な添加剤と組み合わせてもよい浸透促進剤及び／又は適当な湿潤化剤を場合により含んでなる。該添加剤は皮膚に対する投与を容易にし、そして／又は所望の組成物を調製する補助になることができる。これらの組成物は種々の方法で、例えば経皮的パッチとして、スポットオン剤として又は軟膏として投与することができる。

投与の容易さ及び用量の均一性のために、前記の製薬学的組成物を投与単位剤形に調合することは特に有益である。本明細書及び請求項に使用される投与単位剤形は、各単位が、必要な製薬学的担体と一緒に、所望の治療効果をもたらすように計算された、前以て決定された量の有効成分を含有する、単一投与物として適した物理的に分割された単位を表す。このような投与単位剤形の例は錠剤（刻み目付き錠剤又はコート錠）、カプセル、ピル、散剤分包、ウエファー、注射液又は懸濁物、小匙１杯、大匙１杯等並びにそれらの分離された複数物である。

当業者は、以後に提示される試験結果から、容易に有効量を決定することができるであろう。概括的に治療的有効量は０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、そしてとりわけ０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であろうと推測される。必要量を１日に適当な間隔を空けて２、３、４又は５回以上の分割量として投与することが適当かも知れない。該分割量は例えば、単位投与剤形当たり０．５〜５００ｍｇ、そしてとりわけ１０ｍｇ〜５００ｍｇの有効成分を含有する単位投与剤形として調合することができる。

本発明のもう１つのアスペクトとして、特に医薬としての使用のための、より具体的には癌又は関連疾患の処置における、もう１種の抗癌剤とのＨＤＡＣ−インヒビターの組み合わせ物が想定される。

前記の状態の処置のために、本発明の化合物を有利には、１種又は複数の他の医薬、より具体的には他の抗癌剤と組み合わせて使用することができる。抗癌剤の例は、
−白金配位化合物、例えばシスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチン、
−タキサン化合物、例えばパクリタキセル又はドセタキセル、
−カンプトテシン化合物のようなトポイソメラーゼＩインヒビター、例えばイリノテカン又はトポテカン、
−抗癌性ポドフィロトキシン誘導体のようなトポイソメラーゼＩＩインヒビター、例えばエトポシド又はテニポシド、
−抗腫瘍ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン又はビノレルビン
−抗腫瘍ヌクレオシド誘導体、例えば５−フルオロウラシル、ゲンシタビン又はカペシタビン、
−ナイトロジェン・マスタード又はニトロソ尿素のようなアルキル化剤、例えばシクロホスホアミド、クロランブシル、カルムスチン又はロムスチン、
−抗腫瘍、アントラサイクリン誘導体、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン又はミトキサントロン、
−ＨＥＲ２抗体、例えばトラストズマブ、
−エストロゲン受容体アンタゴニスト又は選択的エストロゲン受容体モジュレーター、例えばタモキシフェン、トレミレン、ドロルオキシフェン、ファスロデックス又はラルオキシフェン、
−エキセメスタン、アナストロゾール、レトラゾール及びボロゾールのようなアロマターゼインヒビター、
−レチノイド、ビタミンＤ及びレチノイン酸代謝阻害剤（ＲＡＭＢＡ）のような分化剤、例えばアキュタン、
−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビター、例えばアザシチジン、
−キナーゼインヒビター、例えばフラボペリドール、イマチニブメシレート又はゲフィチニブ、
−ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター、
−他のＨＤＡＣインヒビター、
−ユビキチン−プロテアソム経路のインヒビター、例えばＶｅｌｃａｄｅ、あるいは
−Ｙｏｎｄｅｌｉｓ、
である。

用語「白金配位化合物」は本明細書では、イオンの形態の白金を提供するいずれかの腫瘍細胞増殖阻害白金配位化合物を表すために使用される。

用語［タキサン化合物］はタキサン環系を有し、特定の種のイチイの木（Ｔａｘｕｓ）からの抽出物に関連した又はそれから誘動される化合物の１クラスを示す。

用語「トポイソメラーゼインヒビター」は真核細胞中のＤＮＡ位相を変えることができる酵素を示すために使用される。それらは重要な細胞機能及び細胞増殖に必須である。真核細胞には２種のトポイソメラーゼ、すなわちＩ型及びＩＩ型がある。トポイソメラーゼＩは約１００，０００の分子量のモノマー酵素である。この酵素はＤＮＡに結合して、一時的な単鎖分解を誘動し、二重らせんを解き（又は解かせ）、そして次にＤＮＡ鎖から解離する前にその分解を再シールする。トポイソメラーゼＩＩはＤＮＡ鎖分解物の導入又は遊離ラジカルの形成に関与する、同様な作用機序を有する。

用語「カンプトテシン化合物」は中国茶のカンプトテシン・アクミナタ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ ａｃｕｍｉｎａｔａ）及びインドの木のノタポヂテ・フェチダ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ ｆｏｅｔｉｄａ）から誘動される非水溶性アルカロイドである親カンプトテシン化合物に関連した、又はそれから誘動される化合物を表すために使用される。

用語［ポドフィロトキシン化合物］はマンドレークの植物から抽出される、親ポドフィロトキシンに関連した、又はそれから誘動される化合物を示すために使用される。

用語「抗腫瘍ビンカアルカロイド」はツルニチソウ（Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ）の抽出物に関連した、又はそれから誘動される化合物を示すために使用される。

用語「アルキル化剤」は生理学的条件下で、ＤＮＡのような生物学的に必須の高分子にアルキル基を与える能力を有するという共通の特徴をもつ広範な化学薬品の群を包含する。大部分はナイトロジェンマスタード及びニトロソ尿素のような、より重要な物質であるが、有効なアルキル化部分は、複雑な分解反応（その幾つかは酵素による）後にインビボで生成される。アルキル化剤のもっとも重要な薬理学的作用は、細胞増殖、とりわけＤＮＡ合成及び細胞分裂に関与する基本的機序を乱すことである。急速に増殖している組織中のＤＮＡ機能及び結合性を阻害するアルキル化剤の能力が、それらの治療的適用及び多数のそれらの毒性の基礎を提供する。

用語「抗腫瘍アントラサイクリン誘導体」は、グリコシド結合により結合された稀有な糖のダウノスアミンをもつテトラサイクリン環構造をもつことを特徴とする、カビ・真菌のＳｔｒｅｐ．ｐｅｕｔｉｃｕｓ ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓから得られる抗生物質及びそれらの誘導体を含んでなる。

原発性乳癌におけるヒト表皮増殖因子受容体２タンパク質（ＨＥＲ２）の増殖は、特定の患者に対する低い臨床予後と関連することが示された。トラストズマブはＨＥＲ２受容体の細胞外領域に高い親和性及び特異性をもって結合する、著しく精製された組み換えＤＮＡ−誘動ヒト化モノクローナルＩｇＧ１カッパ抗体である。

多数の乳癌はエストロゲン受容体を有し、これらの腫瘍の増殖はエストロゲンにより刺激され得る。用語「エストロゲン受容体アンタゴニスト」及び「選択的エストロゲン受容体モジュレーター」は、エストロゲン受容体（ＥＲ）に結合するエストラジオールの競合的インヒビターを示すために使用される。選択的エストロゲン受容体モジュレーターはＥＲに結合されると、受容体の三次元形態に変化を誘発し、ＤＮＡ上のエストロゲン反応性要素（ＥＲＥ）に対するその結合を変化させる。

閉経後の女性においては、循環エストロゲンの主要な生成源は、末梢組織におけるアロマターゼ酵素による、副腎及び卵巣のアンドローゲン（アンドロステンジオン及びテストステロン）のエストロゲン（エストロン及びエストラジオール）への転化からである。アロマターゼ阻害又は不活性化によるエストロゲンの剥奪はホルモン依存性乳癌をもつ何人かの閉経後患者に対する有効な選択的処置である。

用語「抗エストロゲン剤」は本明細書では、エストロゲン受容体アンタゴニスト及び選択的エストロゲン受容体モジュレーターのみならずまた、前記のようなアロマターゼインヒビターを包含するために使用される。

用語「分化剤」は種々の方法で、細胞増殖を阻害し、分化を誘発することができる化合物を包含する。ビタミンＤ及びレチノイドは、広範な正常及び悪性の細胞タイプの増殖及び分化を制御するのに重要な役割を果たすことが知られている。レチノイン酸代謝阻害剤（ＲＡＭＢＡ）は、レチノイン酸のチトクロームＰ４５０−媒介異化作用を阻害することにより内在レチノイン酸のレベルを増加する。

ＤＮＡメチル化の変化はヒト新生物におけるもっとも一般的な異常の１つである。選択される遺伝子のプロモーター内のメチル化亢進は通常、関与する遺伝子の不活性化を伴なう。用語「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビター」は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの薬理学的阻害及び腫瘍サプレッサーの遺伝子発現の再活性化により作用する化合物を示すために使用される。

用語「キナーゼインヒビター」は細胞周期の進行及びプログラムされたアポトーシス（アポトーシス）に関与するキナーゼの強力なインヒビターを含んでなる。

用語「ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター」はＲａｓ及び他の細胞内タンパク質のファルネシル化を抑制するようにされた化合物を示すために使用される。それらは悪性細胞の増殖及び生存に影響をもつことが示されている。

用語「他のＨＤＡＣインヒビター」は、限定せずに、
−カルボキシレート、例えばブチレート、桂皮酸、４−フェニルブチレート又はバルプロ酸、
−ヒドロキサム酸、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ピペラジン含有ＳＡＨＡ類似体、二アリールヒドロキサメートＡ−１６１９０６及びそのカルボゾリルエーテル−、テトラヒドロピリジン−及びテトラロン−類似体、二環式アリール−Ｎ−ヒドロキシカルボキシアミド、ピロキシアミド、ＣＧ−１５２１、ＰＸＤ−１０１、スルホンアミドヒドロキサム酸、ＬＡＱ−８２４、ＬＢＨ−５８９、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、オキサムフラチン、スクリプタイド、スクリプタイド関連三環式分子、ｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸（ＣＢＨＡ）、ＣＢＨＡ−様ヒドロキサム酸、トラポキシン−ヒドロキサム酸類似体、ＣＲＡ−０２４７８１、Ｒ３０６４６５及び関連ベンゾイル−及びヘテロアリール−ヒドロキサム酸、アミノスベレート及びマロニルジアミド、
−環式テトラペプチド、例えばトラポキシン、アピジシン、デプシペプチド、スピルコスタチン−関連化合物、ＲｅｄＦＫ−２２８、スルフヒドリル−含有環式テトラペプチド（ＳＣＯＰ）、ヒドロキサム酸含有環式テトラペプチド（ＣＨＡＰ）、ＴＡＮ−１７４及びアズムアミド、
−ベンズアミド、例えばＭＳ−２７５又はＣＩ−９９４、あるいは
−デプデシン
を含んでなる。

用語「ユビキチン−プロテアソム経路のインヒビター」は細胞周期の制御タンパク質を包含するプロテアソム中の細胞タンパク質の標的とされた破壊を阻害する化合物を特定するために使用される。

癌の処置のためには、本発明に従う化合物を、放射線照射と一緒に前記のような患者に投与することができる。放射線照射はイオン化光線、そしてとりわけガンマ光線、特に線形加速器により又は今日一般に使用されている放射性核種により放出されるものを意味する。放射性核種による腫瘍の照射は外部からでも内部からでもよい。

本発明はまた、抗癌剤及び本発明に従うＨＤＡＣインヒビターの本発明に従う組み合わせ物を対象にする。

本発明はまた、例えば腫瘍細胞の増殖を抑制するための医学的治療における使用のための本発明に従う組み合わせ物を対象とする。

本発明はまた、腫瘍細胞の増殖を抑制するための本発明に従う組み合わせ物を対象とする。

本発明はまた、有効量の本発明に従う組み合わせ物を被験体に投与する方法を含んでなる、ヒトの被験者における腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を対象とする。

本発明は更に、有効量の本発明に従う組み合わせ物を投与する方法により、形質転換細胞を包含する細胞の異常増殖を抑制する方法を提供する。

他の医薬及びＨＤＡＣインヒビターは同時に（例えば別の組成物又は単一組成物中で）又はどんな順序でも連続的に投与することができる。後者の場合には、２種の化合物は有益な又は相乗的効果が確実に達成されるのに十分な期間内そして量及び方法で投与されるであろう。投与の好ましい方法及び順序並びに組み合わせ物の各成分それぞれの投与量及び計画は、投与される特定のその他の医薬及びＨＤＡＣインヒビター、それらの投与経路、処置される特定の腫瘍及び処置される特定の宿主に左右されるであろう。投与の最適な方法及び順序並びに投与量及び計画は、従来の方法を使用し、そして本明細書に提示された情報を考慮して当業者により容易に決定されることができる。

白金配位化合物は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき１〜５００ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、例えば５０〜４００ｍｇ／ｍ^２、特にシスプラチンに対しては約７５ｍｇ／ｍ^２、そしてカルボプラチンに対しては約３００ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

タキサン化合物は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき５０〜４００ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、例えば７５〜２５０ｍｇ／ｍ^２、特にパクリタキセルに対しては約１７５〜２５０ｍｇ／ｍ^２、そしてドセタキセルに対しては約７５〜１５０ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

カンプトテシン化合物は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき０．１〜４００ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、例えば１〜３００ｍｇ／ｍ^２、特にイリノテカンに対しては約１００〜３５０ｍｇ／ｍ^２、そしてトポテカンに対しては約１〜２ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき３０〜３００ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、例えば５０〜２５０ｍｇ／ｍ^２、特にエトポシドに対しては約３５〜１００ｍｇ／ｍ^２、そしてテニポシドに対しては約５０〜２５０ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

抗腫瘍ビンカアルカロイドは有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき２〜３０ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、特にビンブラスチンに対しては約３〜１２ｍｇ／ｍ^２、ビンクリスチンに対しては約１〜２ｍｇ／ｍ^２、そしてビノレルビンに対しては約１０〜３０ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

抗腫瘍ヌクレオシド誘導体は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき２００〜２５００ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、例えば７００〜１５００ｍｇ／ｍ^２、特に５−ＦＵに対しては約２００〜５００ｍｇ／ｍ^２、ゲムシタビンに対しては約８００〜１２００ｍｇ／ｍ^２、そしてカペシタビンに対しては約１０００〜２５００ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

ナイトロジェンマスタード又はニトロソ尿素のようなアルキル化剤は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき１００〜５００ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、例えば１２０〜２００ｍｇ／ｍ^２、特にシクロホスホアミドに対しては約１００〜５００ｍｇ／ｍ^２、クロランブシルに対しては約０．１〜０．２ｍｇ／ｍ^２、カルムスチンに対しては約１５０〜２００ｍｇ／ｍ^２、そしてロムスチンに対しては約１００〜１５０ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

抗腫瘍アントラサイクリン誘導体は有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき１０〜７５ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、例えば１５〜６０ｍｇ／ｍ^２、特にドキソルビシンに対しては約４０〜７５ｍｇ／ｍ^２、ダウノルビシンに対しては約２５〜４５ｍｇ／ｍ^２、そしてイダルビシンに対しては約１０〜１５ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

トラストズマブは有利には、１コースの処置当たり、体表面積１平方メーターにつき１〜５ｍｇ（ｍｇ／ｍ^２）、特に２〜４ｍｇ／ｍ^２の用量で投与される。

抗エストロゲン剤は有利には、特定の薬剤及び処置される状態に応じて１日に約１〜１００ｍｇの用量で投与される。タモキシフェンは有利には５〜５０ｍｇ、好ましくは１０〜２０ｍｇを１日２回の用量で経口投与され、治療効果を達成し、維持するために十分な期間、治療を継続する。トレミフェンは有利には１日１回約６０ｍｇの用量で経口投与され、治療効果を達成し、維持するために十分な期間治療を継続する。アナストロゾールは有利には１日１回約１ｍｇの用量で経口投与される。ドロロキシフェンは有利には１日１回約２０〜１００ｍｇの用量で経口投与される。ラロキシフェンは有利には１日１回約６０ｍｇの用量で経口投与される。エキセメスタンは有利には１日１回約２５ｍｇの用量で経口投与される。

これらの用量は１コースの処置当たり例えば１回、２回又は３回以上投与することができ、それを例えば７、１４、２１又は２８日毎に反復することができる。

それらの有用な薬理学的特性を考慮すると、本発明に従う組み合わせ物の成分、すなわち他の医薬及びＨＤＡＣインヒビターは、投与目的のための種々の製薬学的剤形に調合することができる。成分は個々の製薬学的組成物中に別々に又は両成分を含有する単一の製薬学的組成物中に調合することができる。

従って、本発明はまた、１種又は複数の製薬学的担体と一緒に、他の医薬及びＨＤＡＣインヒビターを含んでなる製薬学的組成物を対象とする。

本発明はまた、１種又は複数の製薬学的担体と一緒に、抗癌剤及び本発明に従うＨＤＡＣインヒビターを含んでなる製薬学的組成物の形態の本発明に従う組み合わせ物を対象とする。

本発明は更に、腫瘍細胞の増殖を抑制するための製薬学的組成物の製造における本発明に従う組み合わせ物の使用を対象とする。

本発明は更に、癌を罹患する患者の処置における、同時の、別々の又は連続的使用のための組み合わせ調製物としての、第１の有効成分としての本発明に従うＨＤＡＣインヒビター及び第２の有効成分としての抗癌剤を含有する製品を対象とする。

実験部門
以後、「Ｋ_２ＣＯ_３」は炭酸カリウム、「Ｎａ_２ＣＯ_３」は炭酸ナトリウム、「ＣＨ_２Ｃｌ_２」はジクロロメタン、「ＭｇＳＯ_４」は硫酸マグネシウム、「ＤＩＰＥ」はジイソプロピルエーテル、「ＤＩＡＤ」はビス（１−メチルエチル）エステル・ジアゼンジカルボン酸、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフラン、「ＨＯＢＴ」は１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール、「ＥＤＣ」はＮ’−（エチルカルボンイミドイル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン一塩酸、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチル、「Ｅｔ_３Ｎ」はトリエチルアミン、「ＮＨ_４ＯＨ」は水酸化アンモニウムを意味する。

Ａ．中間体化合物の調製
実施例Ａ１

ａ）中間体１の調製

２−（１−ピペラジニル）−５−ピリミジンカルボン酸、エチルエステル（０．０１６９モル）、（２−フェニルエテニル）−ボロン酸（０．０１６９モル）及び１，４−ジオキサン−２，５−ジオール（０．０１６９モル）混合物（２５０ｍｌのエタノール中）を室温で２日間撹拌し、次に溶媒を蒸発（真空）させた。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２及びＨ_２Ｏ中に取り、有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（１５〜４０μｍ）（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９７／１）により精製した。純粋な画分を蒸発させると、４ｇ（６１％）の中間体１（Ｍ．Ｐ．：１２８℃；Ｅ配置）を収穫した。

ｂ）中間体２の調製

トリブチルホスフィン（０．００３９モル）、次にＤＩＡＤ（０．００３９モル）を、中間体１（０．００２６モル）及び１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（０．００３９モル）の溶液（５０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に、５℃、Ｎ_２流下で滴下した。混合物を室温で１５時間撹拌した。トリブチルホスフィン（０．００３９モル）及びＤＩＡＤ（０．００３９モル）を５℃で添加した。混合物を室温で２４時間撹拌し、氷上に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９９／１；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．８４ｇ（５２％）の中間体２（Ｍ．Ｐ．：５０℃；Ｅ配置）を収穫した。

ｃ）中間体３の調製

中間体２（０．００７２モル）及びヒドラジン一水和物ブロミド（０．００２１モル）の混合物（１０ｍｌのエタノール中）を６５℃で３時間撹拌し、次に室温に戻し、濾過した。濾液を蒸発させた。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２中に取った。有機層をＨ_２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させると、２．７ｇの中間体３（Ｅ配置）を収穫した。

ｄ）中間体４の調製

塩化アセチル（０．００２３モル）の溶液（１ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）を中間体３（０．００１５モル）及びＮ，Ｎ−ジエチルエタンアミン（０．００１３モル）の溶液（１３ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に５℃、Ｎ_２流下で滴下した。混合物を５℃で３０分間撹拌し、次に室温で１時間３０分間撹拌した。有機層をＨ_２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ ９９／１／０．１；１０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．３３ｇ（４０％）の中間体４（Ｅ配置）を収穫した。

ｅ）中間体５の調製

中間体４（０．０００７モル）及び水酸化リチウム（０．００１５モル）の混合物（２５ｍｌのＴＨＦ及び８ｍｌのＨ_２Ｏ中）を室温で１５時間撹拌し、ＨＣｌ（１Ｎ）により酸性化した。ＴＨＦを蒸発させた。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にＤＩＰＥで洗浄し、乾燥すると、０．３２ｇ（８３％）の中間体５を塩酸塩（．ＨＣｌ）（Ｅ配置）として収穫した。

ｆ）中間体６の調製

ＥＤＣ（０．００１１モル）及びＨＯＢＴ（０．００１１モル）を中間体５（０．０００７モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ヒドロキシルアミン（０．００１１モル）及びＮ，Ｎ−ジエチルエタンアミン（０．００２２モル）の溶液（４０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２／ＴＨＦ（５０／５０）中）に室温、Ｎ_２流下で添加した。混合物を室温で３６時間撹拌し、Ｈ_２Ｏ中に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をジエチルエーテルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．３４ｇ（９２％）の中間体６（Ｍ．Ｐ．：１９８℃；Ｅ配置）を収穫した。

実施例Ａ２
ａ）中間体７の調製

中間体３（０．００２６モル）及び水酸化リチウム（０．００３９モル）の混合物（３０ｍｌのＴＨＦ及び１５ｍｌのＨ_２Ｏ中）を室温で１５時間撹拌し、ＨＣｌ（１Ｎ）を中和するまで添加した。ＴＨＦを蒸発させた。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると、０．９ｇの中間体７（Ｅ配置）を収穫した。

ｂ）中間体８の調製

Ｎａ_２ＣＯ_３（０．００７６モル）を中間体７（０．００２５モル）の混合物（３０ｍｌのＴＨＦ及び３０ｍｌのＨ_２Ｏ中）に添加した。混合物を１０分間撹拌した。１−［［９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］オキシ］−２，５−ピロリジンジオン（０．００２５モル）を分割添加した。混合物を室温で１８時間撹拌し、次に５℃に冷却した。ＨＣｌ（１Ｎ）を中和するまで添加した。ＴＨＦを蒸発させた。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると、１．２ｇ（８２％）の中間体８（Ｅ配置）を収穫した。

ｃ）中間体９の調製

ＨＯＢＴ（０．００３１モル）、次にＥＤＣ（０．００３１モル）を中間体８（０．００２モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ヒドロキシルアミン（０．００３１モル）及びＮ，Ｎ−ジエチルエタンアミン（０．００６２モル）の溶液（１３０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２／ＴＨＦ（５０／５０）中）に室温で添加した。混合物を室温で４８時間撹拌し、Ｈ_２Ｏ中に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９８／２；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、１．０７ｇ（７６％）の中間体９（Ｅ配置）を収穫した。

ｄ）中間体１０の調製

ピペリジン（０．００３９モル）を中間体９（０．００１２モル）の溶液（２５ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に添加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。有機層をＨ_２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ ９６／４／０．２；１５〜４０μｍ）により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．３２ｇ（５６％）の中間体１０（Ｅ配置）を収穫した。

実施例Ａ３
ａ）中間体１１の調製

トリブチルホスフィン（０．００４７モル）、次にＤＩＡＤ（０．００４７モル）を中間体２（０．００１５モル）及び２，５−ピロリジンジオン（０．００４７モル）の溶液（３０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に５℃で添加した。混合物を室温で４８時間撹拌した。ピロリジンジオン、トリブチルホスフィン及びＤＩＡＤを添加した。混合物を室温で１５時間撹拌し、氷上に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９９／１；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＥｔＯＡｃ ８０／２０；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．５５ｇ（７６％）の中間体１１（Ｍ．Ｐ．：１５８℃；Ｅ配置）を収穫した。

ｂ）中間体１２の調製

中間体１１（０．０００８モル）及び水酸化リチウム（０．００２２モル）の混合物（４０ｍｌのＴＨＦ及び２０ｍｌのＨ_２Ｏ中）を室温で１５時間撹拌し、次にＨＣｌ（３Ｎ）で中和した。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると、０．２６ｇ（６５％）の中間体１２（Ｅ配置）を収穫した。

ｃ）中間体１３の調製

中間体１２（０．０００５モル）の混合物（４ｍｌの酢酸中）を１００℃で７時間撹拌した。Ｈ_２Ｏ及び氷を添加した。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると、０．２２ｇ（７７％）の中間体１３（Ｅ配置）を酢酸塩（．ＣＨ_３ＣＯＯＨ）として収穫した。

ｄ）中間体１４の調製

ＨＯＢＴ（０．０００６モル）、次にＥＤＣ（０．０００６モル）を中間体１３（０．０００４モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ヒドロキシルアミン（０．０００６モル）及びＮ，Ｎ−ジエチルエタンアミン（０．００１７モル）の溶液（３０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２／ＴＨＦ（５０／５０）中）に室温，Ｎ_２流下で添加した。混合物を室温で１５時間撹拌し、Ｈ_２Ｏ中に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ ９９／１／０．１〜９０／１０／０．５；３〜５μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．１９ｇ（８３％）の中間体１４（Ｅ配置）を収穫した。

実施例Ａ４
ａ）中間体１５の調製

トリブチルホスフィン（０．００３１モル）、次にＤＩＡＤ（０．００３１モル）を中間体１（０．００１５モル）及び４−フルオロフェノール（０．００３１モル）の溶液（３０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に５℃、Ｎ_２流下で滴下した。混合物を室温で１５時間撹拌した。４−フルオロフェノール（０．００３１モル）、トリブチルホスフィン（０．００３１モル）及びＤＩＡＤ（０．００３１モル）を再添加した。混合物を室温で２４時間撹拌し、氷水中に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発、乾燥させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９９／１；１５〜４０μｍ）により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ７５／２５；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．５４ｇ（７２％）の中間体１５（油；Ｅ配置）を収穫した。

ｂ）中間体１６の調製

中間体１５（０．００１モル）及び水酸化リチウム（０．００２６モル）の混合物（５０ｍｌのＴＨＦ及び２５ｍｌのＨ_２Ｏ中）を室温で１５時間撹拌し、ＨＣｌ（３Ｎ）で酸性化した。ＴＨＦを蒸発させた。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると、０．４７ｇ（９２％）の中間体１６（Ｅ配置）を塩酸塩（．ＨＣｌ）として収穫した。

ｃ）中間体１７の調製

ＨＯＢＴ（０．００１４モル）及びＥＤＣ（０．００１４モル）を中間体１６（０．０００９モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）ヒドロキシルアミン（０．００１４モル）及びＮ，Ｎ−ジエチルエタンアミン（０．００３８モル）の溶液（６０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２／ＴＨＦ（５０／５０）中）に室温，Ｎ_２流下で添加した。混合物を室温で１５時間撹拌し、Ｈ_２Ｏ中に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ ９９／１／０．１〜９０／１０／０．５；３〜５μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．２ｇ（３８％）の中間体１７（Ｅ配置）を収穫した。

実施例Ａ５
ａ）中間体１８の調製

中間体２（０．００１１モル）及び水酸化リチウム（０．００２３モル）の混合物（３０ｍｌのＴＨＦ及び１５ｍｌのＨ_２Ｏ中）を室温で１５時間撹拌し、ＨＣｌ（３Ｎ）で中和した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．５１ｇの中間体１８（Ｅ配置）を収穫した。

ｂ）中間体１９の調製

中間体１８（０．００１９モル）の混合物（１５ｍｌの酢酸中）を１００℃で５時間撹拌し、次に蒸発乾燥した。残渣をＨ_２Ｏ中に取り、次にＫ_２ＣＯ_３で中和した。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると、０．８ｇ（８６％）の中間体１９（Ｅ配置）を収穫した。

ｃ）中間体２０の調製

塩化チオニル（０．００２１モル）を中間体１９（０．０００２モル）の溶液（４ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に室温で滴下した。混合物を１５時間、撹拌還流し、次に蒸発乾燥すると塩酸塩（．ＨＣｌ）としての中間体２０（Ｅ配置）を収穫した。

ｄ）中間体２１の調製

中間体２０（０．０００２モル）の溶液（２ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）を［２−アミノ−４−（２−チエニル）フェニル］−１，１−ジメチルエチルエステルカルバミン酸（０．０００３モル）の溶液（６ｍｌのピリジン中）に５℃で滴下した。混合物を室温で１５時間撹拌した。ピリジンを蒸発させた。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２中に取った。有機層をＨ_２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた残渣（０．２ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９８／２；１５〜４０μｍ）により精製した。所望の画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．１２ｇの中間体２１（Ｅ配置）を収穫した。

実施例Ａ６
ａ）中間体２２の調製

１，４−ジオキサン−２，５−ジオール（０．００９３モル）を［２−（４−フルオロフェニル）エテニル）ボロン酸（０．００９３モル）の溶液（２００ｍｌのエタノール中）に添加した。６−（１−ピペラジニル）−３−ピリジンカルボン酸エチルエステル（０．００８５モル）を添加した。混合物を室温で１５時間撹拌し、濾過した。濾液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ中に取った。有機層を飽和塩化ナトリウムで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。この画分（３．３ｇ）をジエチルエーテルに溶解した。ＨＣｌ（５〜６Ｎ）（２ｍｌ）を５℃で滴下した。沈殿物を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥した。この画分（３ｇ）をＨ_２Ｏ中に取り、Ｋ_２ＣＯ_３を添加した。混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させると、２．７ｇ（７９％）の中間体２２（Ｅ配置）を収穫した。

ｂ）中間体２３の調製

トリフェニルホスフィン（０．００６モル）、次にＤＩＡＤ（０．００６モル）を中間体２２（０．００４モル）及び１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（０．００６モル）の溶液（８０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に５℃、Ｎ_２流下で滴下した。混合物を室温で１５時間撹拌した。１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン（０．００６モル）、トロフェニルホスフィン（１．５当量）、次にＤＩＡＤ（１．５当量）を５℃で添加した。混合物を室温で１５時間撹拌し、氷上に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。この画分（１１．４ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：シクロヘキサン／ＥｔＯＡｃ ７０／３０；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させた。この画分（３．７ｇ）をトルエン／２−プロパノール（９６／４）中に取った。沈殿物を濾取し、乾燥した。この画分（１．２ｇ、５７％）をＤＩＰＥ／ジエチルエーテルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．９３ｇ（Ｍ．Ｐ．：１３２℃；Ｅ配置）の中間体２３を収穫した。

ｃ）中間体２４の調製

中間体２３（０．００１８モル）及びヒドラジンモノヒドロブロミド（０．００５６モル）の混合物（１００ｍｌのエタノール中）を６５℃で４時間撹拌した。エタノールを蒸発させた。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２中に取った。有機層をＨ_２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。この画分（０．９５ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ／ＮＨ_４ＯＨ ９６／４／０．１；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．５４ｇ（７２％）の中間体２４（Ｅ配置）を収穫した。

ｄ）中間体２５の調製

塩化メタンスルホニル（０．０００６モル）を中間体２４（０．０００４モル）及びＥｔ_３Ｎ（０．００１３モル）の溶液（１０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に５℃で滴下した。混合物を室温で１５時間撹拌した。有機層をＨ_２Ｏで洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。この画分（０．２５ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９９／１；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると、０．２ｇの中間体２５（Ｅ配置）を収穫した。

ｅ）中間体２６の調製

中間体２５（０．０００３モル）及び水酸化リチウム（０．００１８モル）の混合物（１８ｍｌのＴＨＦ及び９ｍｌのＨ_２Ｏ中）を室温で２４時間撹拌し，ＨＣｌ（３Ｎ）で酸性化した。ＴＨＦを蒸発させた。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると、塩酸塩（．ＨＣｌ）（Ｅ配置）としての０．１１ｇの中間体２６を収穫した。

ｆ）中間体２７の調製

ＨＯＢＴ（０．０００３モル）、次にＥＤＣ（０．０００３モル）を中間体２６（０．０００２モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．０００３モル）及びＥｔ_３Ｎ（０．０００９モル）の溶液（１５ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２／ＴＨＦ中）に室温で添加した。混合物を室温で１５時間撹拌し、Ｈ_２Ｏ中に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。この画分（０．１５ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９８／２；１０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させると０．０７ｇ（５６％）の中間体２７（Ｅ配置）を収穫した。

実施例Ａ７
ａ）中間体２８の調製

中間体１８（０．０００７モル）の混合物（５ｍｌの酢酸中）を１００℃で７時間撹拌し、次に蒸発させた。残渣をＨ_２Ｏ中に取った。沈殿物を濾取し、Ｈ_２Ｏ、次にジエチルエーテルで洗浄し、乾燥すると、０．２５ｇ（６４％）の中間体２８を酢酸塩（．ＣＨ_３ＣＯＯＨ）（Ｅ配置）として収穫した。

ｂ）中間体２９の調製

ＨＯＢＴ（０．０００６モル）、次にＥＤＣ（０．０００６モル）を中間体２８（０．０００４モル）、Ｏ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）−ヒドロキシルアミン（０．０００６モル）及びＥｔ_３Ｎ（０．００１８モル）の溶液（４０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２／ＴＨＦ中）に室温で添加した。混合物を室温で２４時間撹拌し、Ｈ_２Ｏ中に注入し、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。この画分（０．４ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９８／２；４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させた。この画分（０．２４ｇ）をＤＩＰＥ／ジエチルエーテルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．２３ｇ（９２％）の中間体２９（Ｅ配置）を収穫した。

Ｂ．化合物の調製
実施例Ｂ１
化合物１の調製

トリフルオロ酢酸（１．４ｍｌ）を中間体６（０．０００５モル）の溶液（２８ｍｌのＣＨ_３ＯＨ中）に５℃で添加した。混合物を室温で４８時間撹拌し、次に蒸発、乾燥させた。残渣をアセトニトリル／ジエチルエーテルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．２７ｇ（９２％）の化合物１（Ｍ．Ｐ．：１６６℃；Ｅ配置）をトリフルオロ酢酸塩（．０．８３ＣＦ_３ＣＯＯＨ ．０．６２Ｈ_２Ｏ）として収穫した。

実施例Ｂ２
化合物２の調製

中間体１０（０．０００７モル）の混合物（１．６ｍｌのトリフルオロ酢酸及び３２ｍｌのＣＨ_３ＯＨ中）を室温で７２時間撹拌し、次に蒸発乾燥した。残渣をジエチルエーテルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．３７５ｇ（８７％）の化合物２（Ｍ．Ｐ．：１２４℃；Ｅ配置）をトリフルオロ酢酸塩（．２．１１ＣＦ_３ＣＯＯＨ）として収穫した。

実施例Ｂ３
化合物３の調製

トリフルオロ酸（０．８５ｍｌ）を中間体１４（０．０００３モル）の溶液（１７ｍｌのＣＨ_３ＯＨ中）に５℃で滴下した。混合物を室温で４８時間撹拌し、次に蒸発乾燥した。残渣をジエチルエーテル／アセトニトリルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．１５ｇ（８２％）の化合物３（Ｍ．Ｐ．：１４８℃；Ｅ配置）をトリフルオロ酢酸塩（．０．８ＣＦ_３ＣＯＯＨ．０．８４Ｈ_２Ｏ）として収穫した。

実施例Ｂ４
化合物４の調製

トリフルオロ酢酸（０．８５ｍｌ）を中間体１７（０．０００３モル）の溶液（１７ｍｌのＣＨ_３ＯＨ中）に５℃で滴下した。混合物を室温で４８時間撹拌し、次に蒸発、乾燥させた。残渣をジエチルエーテルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．１４５ｇ（７９％）の化合物４（Ｍ．Ｐ．：１１５℃；Ｅ配置）をトリフルオロ酢酸塩（０．８７ＣＦ_３ＣＯＯＨ．０．７９Ｈ_２Ｏ）として収穫した。

実施例Ｂ５
化合物５の調製

トリフルオロ酢酸（０．５ｍｌ）を中間体２１（０．０００１モル）の溶液（３ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中）に５℃で滴下した。混合物を５℃で２時間撹拌した。氷及び水を添加した。Ｋ_２ＣＯ_３を添加した。混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で２回抽出した。有機層を分離し、乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた残渣（０．１５ｇ）をシリカゲル上カラムクロマトグラフィー（溶離剤：ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ ９８／２；１５〜４０μｍ）により精製した。純粋な画分を回収し、溶媒を蒸発させた。この画分（０．０８２ｇ）をＤＩＰＥ／２−プロパノンから結晶化させた。沈殿物を濾取し、乾燥すると０．０７２ｇ（５９％）の化合物５（Ｍ．Ｐ．：１２０℃；Ｅ配置）を収穫した。

実施例Ｂ６
化合物６の調製

トリフルオロ酢酸（０．３３モル）を中間体２７（０．０００１モル）の溶液（７ｍｌのＣＨ_３ＯＨ中）に５℃で滴下した。混合物を室温で２４時間撹拌し、次に蒸発乾燥させた。残渣をジエチルエーテルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．０６２ｇ（８８％）の化合物６（Ｍ．Ｐ．：１３１℃；Ｅ配置）をトリフルオロ酢酸塩（．９８ＣＦ_３ＣＯＯＨ）として収穫した。

実施例Ｂ７
化合物７の調製

トリフルオロ酢酸（１ｍｌ）を中間体２９（０．０００３モル）の溶液（２１ｍｌのＣＨ_３ＯＨ中）に５℃で滴下した。混合物を室温で４８時間撹拌し、次に蒸発乾燥させた。残渣をジエチルエーテル／アセトニトリルから結晶化した。沈殿物を濾取し、乾燥すると、０．１９ｇ（８６％）の化合物７（Ｍ．Ｐ．：１４０℃；Ｅ配置）をトリフルオロ酢酸塩（０．９ＣＦ_３ＣＯＯＨ．８４Ｈ_２Ｏ）として収穫した。

表Ｆ−１は前記の実施例の１つに従って調製された化合物を記載する。

Ｃ．薬理学的実施例
ヒストンデアセチラーゼ阻害のインビトロアッセイ（実施例Ｃ．１参照）は、式（Ｉ）の化合物により得られるＨＤＡＣ酵素活性の阻害を測定する。

式（Ｉ）の化合物の細胞活性は、細胞毒性又は生存率に対し、比色法を使用して、Ａ２７８０腫瘍細胞について測定した（Ｍｏｓｍａｎｎ Ｔｉｍ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３，１９８３）（実施例Ｃ．２参照）。

化合物の溶解度は溶液中に滞留する化合物の能力を測定する。第１の方法において、希釈時ニ水溶液中に滞留する化合物の能力を測定する（実施例Ｃ．３．ａ参照）。ＤＭＳＯ−ストック溶液を異なる連続工程で単一のバッファー水性溶媒で希釈する。次にこの方法（Ｃ．３．ａ．）で混合物を沈殿の発生に対してＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ Ｓｃａｎｎｅｒでスキャンする。第２の方法において、異なるｐＨにおける化合物の溶解度を化学発光窒素検出計の使用により測定することができる（実施例Ｃ．３．ｂ参照）。

薬剤の透過性は１つの媒質からもう１つの媒質中へ又はそれを通って移動するその能力を表す。特に、腸膜を通って血流中へそして／又は血流から標的中へ移動するその能力を表す。透過性（実施例Ｃ．４参照）はフィルター固定された人工膜のリン脂質の２層の形成により測定することができる。フィルター固定人工膜アッセイにおいては、システムがバッファー水溶液と接触する時に、多層状の２層がフィルターチャンネルの内側に形成する条件下で、各複合体のウェルが、ジオレオイルホスファチジル−コリンの２％（ｗｔ／ｖ）のドデカン溶液でコートされた、１２５μｍの微細フィルターディスク（０．４５μｍの孔）により分離された、底部に供与体溶液そして上部に受容体溶液を含む２室に分けられるように、９６−ウェルの微量滴定プレート及び９６−ウェルフィルタープレートにより「サンドイッチ」が形成される。この人工膜を通る化合物の透過性はｃｍ／秒で測定される。その目的は２種の異なるｐＨ、４．０と７．４における平行な人工膜を通る薬剤の透過性を求めることである。化合物の検定は２５０と５００ｎｍ間の最適な波長でＵＶ−分光分析により実施される。

薬剤の代謝は、脂溶性の生体異物又は生物体内生化合物が１種又は複数の極性の、水溶性の、そして排泄可能な代謝物に酵素により転化されることを意味する。薬剤代謝の主要器官は肝臓である。代謝生成物はしばしば、親薬剤より活性が低いか又は非活性である。しかし、いくつかの代謝物は高められた活性又は毒性効果を有することがある。従って薬剤代謝は「解毒」及び「中毒」過程双方を包含する可能性がある。薬剤及び化学薬品を処理する生物の能力を決定する主要な酵素系の１つは、ＮＡＤＰＨ依存性酵素であるチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼにより代表される。化合物の代謝安定性は細胞以下のヒト組織の使用によりインビトロで決定することができる（実施例Ｃ．５．参照）。ここで化合物の代謝安定性はミクロソームとのこれらの化合物の１５分間のインキュベート後に代謝された薬剤の％として表される。

ＤＮＡ損傷剤及びヒストンデアセチラーゼンヒビターを包含する広範な抗腫瘍剤がｐ２１タンパク質を活性化することが示された。ＤＮＡ損傷剤は腫瘍サプレッサーｐ５３によりｐ２１遺伝子を活性化し、他方ヒストンデアセチラーゼンヒビターは転写因子Ｓｐ１によりｐ２１遺伝子を転写により活性化する。従って、ＤＮＡ損傷剤はｐ５３反応性要素によりｐ２１プロモーターを活性化し、他方、ヒストンデアセチラーゼンヒビターはｓｐ１部位（ＴＡＴＡボックスに対して−６０ｂｐ〜＋４０ｂｐ領域に位置する）によりｐ２１プロモーターを活性化し、両者がｐ２１タンパク質の増加した発現をもたらす。細胞中のｐ２１プロモーターがｐ５３反応性要素を含まないｐ２１の１３００ｂｐプロモーターフラグメントよりなる時は、それに従ってＤＮＡ損傷剤に非反応性である。

ｐ２１を誘発する化合物の能力は、細胞レベルのＨＤＡＣ阻害の結果としてのｐ２１を誘発する化合物の能力を試験することにより評価することができる。細胞はｐ５３反応性要素を含有しないｐ２１の１３００ｂｐプロモーターフラグメントを含有する発現ベクトルで安定にトランスフェクションすることができ、そこで対照レベルに比較して、リポーター遺伝子発現の増加が化合物をｐ２１誘発能をもつものと特定する。リポーター遺伝子は蛍光タンパク質であり、リポーター遺伝子の発現は発光される蛍光の量として測定される（実施例Ｃ．６．ａ．参照）。

第２の方法は化合物の製薬学的活性をスクリーニングするためにマウスを使用するインビボ法である。前記の安定に形質転換された腫瘍細胞を、腫瘍を生成するのに十分量をマウスに投与することができる。腫瘍細胞が腫瘍を形成するのに十分な時間を経過した後に、有効な可能性のある化合物を動物に投与し、腫瘍細胞に対する前記化合物の効果をリポーター遺伝子の発現を測定することにより評価する。製薬学的に有効な化合物とともにインキュベートすると、対照レベルに比較してリポーター遺伝子発現の増加をもたらすであろう（実施例Ｃ．６．ｂ．参照）。

特異的ＨＤＡＣインヒビターは豊富なＣＹＰ Ｐ４５０タンパク質のような他の酵素を阻害するべきではない。ＣＹＰ Ｐ４５０（大腸菌発現）タンパク質３Ａ４、２Ｄ６及び２Ｃ９はそれらの特異的基質を蛍光分子に転化させる。ＣＹＰ３Ａ４タンパク質は７−ベンジルオキシ−トリフルオロメチルクマリン（ＢＦＣ）を７−ヒドロキシ−トリフルオロメチルクマリンに転化させる。ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質は３−［２−（Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−メチルアミノ）エチル］−７−メトキシ−４−メチルクマリン（ＡＭＭＣ）を３−［２−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）エチル］−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン塩酸に転化し、そしてＣＹＰ２Ｃ９タンパク質は７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＭＦＣ）を７−ヒドロキシ−トリフルオロメチルクマリンに転化させる。酵素反応を阻害する化合物は蛍光信号の減少をもたらすであろう（実施例Ｃ．７参照）。

実施例Ｃ．１．
蛍光−標識基質によるヒストンデアセチラーゼの阻害に対するインビトロアッセイ
ＢｉｏｍｏｌのＨＤＡＣ蛍光活性アッセイ／薬剤発見キット（カタログ番号：ＡＫ−５００−０００１）を使用した。ＨＤＡＣ蛍光活性アッセイはＦｌｕｏｒ ｄｅ Ｌｙｓ（Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅＡｃｅｔｙｌａｓｅ Ｌｙｓｙｌ（蛍光発生ヒストンデアセチラーゼリシル））基質及び発色剤の組み合わせ物に基づく。Ｆｌｕｏｒ ｄｅ Ｌｙｓ基質はアセチル化リシン側鎖を含んでなる。その基質の脱アセチル化は、第２工程において、Ｆｌｕｏｒ ｄｅ Ｌｙｓ発色剤による処理が発蛍光団を生成するように基質を感受性にさせる。ＨｅＬａ核抽出物（供給会社：Ｂｉｏｍｏｌ）を７５μＭの基質とともに６０μｇ／ｍｌにおいてインキュベートした。Ｆｌｕｏｒ ｄｅ Ｌｙｓ基質を２５ｍＭのトリス、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ及び１ｍＭのＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏを含有するバッファー（ｐＨ７．４）中に添加した。３０分後、１容量の発色剤を添加した。発蛍光団を３５５ｎｍ光線で励起し、発光（４５０ｎｍ）を蛍光プレート読み取り装置上で検定した。各実験につき、対照（ＨｅＬａ核抽出物及びバッファーを含有）、ブランクインキュベート（バッファーを含有するが、ＨｅＬａ核抽出物を含まない）及びサンプル（ＤＭＳＯに溶解され、更にバッファー中に希釈された化合物及びＨｅＬａ核抽出物を含有）を平行して実施した。第１に、化合物を１０^−５Ｍの濃度で試験した。化合物が１０^−５Ｍで活性を示した時に、そこで化合物が１０^−５Ｍと１０^−９Ｍの間の濃度で試験される濃度−反応曲線を作成した。すべてのサンプルを４回試験した。各試験において、ブランク値を対照及びサンプル値の両方から差し引いた。対照サンプルは１００％の基質の脱アセチル化を表した。各サンプルに対する蛍光は対照の平均値の百分率として表した。適当なＩＣ_５０−値（代謝物の量を対照の５０％に減少させるために要する薬剤濃度）を漸増データに対するｐｒｏｂｉｔ分析を使用して計算した。ここで試験化合物の効果はｐＩＣ_５０（ＩＣ_５０−値のマイナス対数値）として表される（表Ｆ−２参照）。

実施例Ｃ．２．
Ａ２７８０細胞に対する抗増殖作用の測定
試験されるすべての化合物をＤＭＳＯに溶解し、更に培養培地中に希釈した。細胞増殖アッセイにおける最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％（ｖ／ｖ）を決して超えなかった。対照は化合物を含まずにＡ２７８０細胞及びＤＭＳＯを含有し、そしてブランクはＤＭＳＯを含有したが、細胞を含まなかった。ＭＴＴをＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌに溶解した。ＮａＯＨ（１Ｎ）でｐＨ１０．５にバッファーされた、０．１Ｍのグリシン及び０．１ＭのＮａＣｌよりなるグリシンバッファーを調製した（すべての試薬はＭｅｒｃｋから購入した）。ヒトＡ２７８０卵巣ガン細胞（Ｔ．Ｃ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ博士［Ｆｏｘ Ｃｈａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ＵＳＡ］からの提供品）を、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１０％のウシ胎仔血清を添加されたＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。細胞を３７℃の湿潤化５％ＣＯ_２雰囲気内で単層培養物として定常的に維持した。細胞は１：４０の分離比率のトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用して、毎週１回処理した（ｐａｓｓａｇｅｄ）。すべての培地及び補助物はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。細胞はＧｅｎ−Ｐｒｏｂｅ マイコプラズマ組織培養キット（供給会社：ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を使用して決定されるようにマイコプラズマ汚染はなかった。細胞をＮＵＮＣ^ＴＭ９６−ウェル培養プレート（供給会社：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に播種し、１晩プラスチックに付着させた。プレート付着に使用された密度は，２００μｌの培地総量でウェル当たり１５００の細胞であった。プレートに対する細胞付着後に、培地を変え、薬剤及び／又は溶媒を２００μｌの最終容量まで添加した。４日間のインキュベート後、培地を２００μｌの新鮮な培地と交換し、細胞密度及び生存性をＭＴＴ−基質のアッセイを使用して測定した。各ウェルに対し、２５μｌのＭＴＴ溶液を添加し、細胞を更に３７℃で２時間インキュベートした。次いで培地を注意して吸引し、青色のＭＴＴ−フォルマザン生成物を、２５μｌのグリシンバッファー、次いで１００μｌのＤＭＳＯの添加により可溶化させた。微量試験プレートを微量プレートシェーカー上で１０分間震盪し、５４０ｎｍにおける吸収をＥｍａｘ ９６−ウェル分光比色計（供給会社：Ｓｏｐａｃｈｅｍ）を使用して測定した。１回の実験中、各実験条件に対する結果は３回の重複ウェルの平均である。最初のスクリーニングの目的のためには、化合物を１０^−６Ｍの単一の固定濃度で試験した。有効化合物に対しては実験を反復して、完全な濃度−反応曲線を確立した。各実験に対し、対照（薬剤を含まない）及びブランクインキュベート（細胞も薬剤も含まない）を平行して実施した。ブランク値をすべての対照及びサンプル値から差し引いた。各サンプルに対し、細胞増殖に対する平均値（吸収単位における）は対照の細胞増殖の平均値の百分率として表された。適当な場合には、ＩＣ_５０−値（対照の５０％まで細胞増殖を減少させるために要する薬剤の濃度）を漸増データに対するｐｒｏｂｉｔ分析を使用して計算した（Ｆｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｂｉｔ Ａｎａｌｙｓｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｈａｐｔｅｒ １０，Ｇｒａｄｅｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ １９６２）。ここで試験化合物の効果はｐＩＣ_５０（ＩＣ_５０−値のマイナス対数値）として表される（表Ｆ−２参照）。

実施例Ｃ．３．
溶解度／安定性
Ｃ．３．ａ．水性媒質中の動力学的溶解度
５０００−９．８μＭ（１／２希釈物）からのＤＭＳＯ−ストック溶液を９６ウェルストック溶液プレート中でＤＭＳＯ中に調製する（２００μｌ／ウェル）。各希釈後、サンプルを混合する。次にこれらのＤＭＳＯ溶液のアリコート（２μｌ）を、２００μｌ／ウェルの水性バッファーを含有する２個の他の９６ウェルバッファープレートに移す。各バッファープレートは水性バッファー（ｐＨ７．４）又は水性バッファー（ｐＨ４．０）のいずれかを含有する。最後の希釈後、バッファープレートを混合し、サンプルを１／２時間室温で安定化する。偶発的誤差を排除するために各化合物に対して希釈を二重に実施する。次に混合物を沈殿の発生に対してＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ Ｓｃａｎｎｅｒにおいてスキャンする。混合物中の沈殿物の不在／存在に基づき、動力学的溶解度を外挿により計算する。３クラスへの評価を実施する。高い溶解度をもつ化合物は３の評価を与えられ、そして５０μＭ以上の溶解度を有する。中程度の溶解度をもつ化合物は２の評価を与えられ、１０μＭを超え、５０μＭ未満の溶解度を有する。低い溶解度をもつ化合物は１の評価を与えられ、これらの化合物に対して、溶解度は１０μＭ以下である。

４種の化合物が試験された：２種はアッセイの両ｐＨ値で１の評価を受け、２種は４．０のｐＨ値で２の評価を受けた。

Ｃ．３．ｂ．ｐＨ２．３における溶解度／安定性
ｐＨ２．３における化合物の溶解度はまた、化学発光窒素検出計の使用により測定することができる（表Ｆ−２を参照）。

実施例Ｃ．４
平行な人口膜の透過性の分析
ストックサンプル（１００％ＤＭＳＯ中５ｍＭのストック溶液の１０μｌのアリコート）をｐＨ４又はｐＨ７．４の水性バッファー系の２ｍｌ含有ディープウェルプレート又はプレミックスプレート中に希釈した（ＰＳＲ４ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ｐＩＯＮ））。サンプルを対照プレートに添加する前に、１５０μｌのバッファーをウェルに添加し、ブランクのＵＶ−測定を実施した。その後、バッファーを廃棄し、そのプレートを対照プレートとして使用した。すべての測定をＵＶ−抵抗性プレート（供給会社：Ｃｏｓｔａｒ又はＧｒｅｉｎｅｒ）において実施した。

対照プレートのブランク測定後、１５０μｌの希釈サンプルを対照プレートに添加し、２００μｌの希釈サンプルを供与体プレート１に添加した。受容体フィルタープレート（供給会社：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，タイプ：ＭＡＩＰ Ｎ４５）を４μｌの人口膜形成溶液（０．１％の２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノールを含有するドデカン中１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセル−３−ホスホコリン）でコートしそして供与体プレート１の上部に配置して、「サンドイッチ」を形成した。バッファー（２００μ）を上部の受容体ウェル中に分配した。サンドイッチを蓋でカバーし、暗所、室温で１８時間保存した。

受容体プレート２のブランク測定を、ウェルに１５０μｌのバッファーを添加し、次にＵＶ−測定により実施した。受容体プレート２のブランク測定後、バッファーを廃棄し、１５０μｌの受容体溶液を受容体フィルタープレート１から受容体プレート２に移した。次に受容体フィルタープレート１をサンドイッチから外した。供与体プレート２のブランク測定後（前記参照）、１５０μｌの供与体溶液を供与体プレート１から供与体プレート２に移した。供与体プレート２、受容体プレート２及び対照プレートウェルのＵＶスペクトルをスキャンした（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ １９０）。すべてのスペクトルをＰＳＲ４ｐ Ｃｏｍｍａｎｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅにより処理して、透過性を計算した。すべての化合物を三重測定した。カルバマゼピン、グリセオフルビン、アシクログアニシン、アテノロール、フロセミド及びクロロチアジドを各実験の標準物として使用した。化合物を低い透過性（平均効果＜０．５×１０^−６ｃｍ／秒；評価１）、中程度の透過性（１×１０^−６ｃｍ／秒＞平均効果≧０．５×１０^−６ｃｍ／秒；評価２）又は高い透過性（≧１×１０^−６ｃｍ／秒；評価３）をもつ３分類に評価した。

実施例Ｃ．５
代謝の安定性
細胞以下の組織調製物をＧｏｒｒｏｄ等（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ ５：４５３−４６２．１９７５）に従って、組織の機械的ホモジネート化後の遠心分離により調製した。肝組織を氷冷した０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファー中ですすいで、過剰な血液を洗浄した。次に組織をブロット乾燥し、秤量し、外科用はさみを使用して粗く刻んだ。組織片を、Ｔｅｆｒｏｎ乳棒の付いたＰｏｔｔｅｒ−Ｓ（Ｂｒａｕｎ，Ｉｔａｌｙ）又はＳｏｒｖａｌｌ Ｏｍｎｉ−Ｍｉｘホモジナイザーのいずれかを使用して、７×１０秒間、３容量の氷冷０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中にホモジナイズした。双方の場合に、容器はホモジナイズ工程中氷中／上に維持された。組織ホモジネートをＳｏｒｖａｌｌ遠心分離装置又はＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを使用して４℃で２０分間９０００×ｇで遠心分離した。生成された上澄みを−８０℃で保存し、「Ｓ９」と記号を付けた。Ｓ９画分を更に、Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離装置を使用して６０分間（４℃）１００．０００×ｇで遠心分離することができる。生成された上澄みを注意して吸引し、アリコートし、「シトソール」と記号を付けた。ペレットを０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に再懸濁させて、０．５ｇの最初の組織重量に対して１ｍｌの最終容量にし、「ミクロソーム」と記号を付けた。

すべての細胞以下の画分をアリコートし、液体窒素中で瞬間凍結し、使用まで−８０℃で保存した。

試験されるサンプルとして、インキュベート混合物はＰＢＳ（０．１Ｍ）、化合物（５μＭ）、ミクロソーム（１ｍｇ／ｍｌ）及びＮＡＤＰＨ−生成系（０．８ｍＭのグルコース−６−リン酸、０．８ｍＭの塩化マグネシウム及び０．８単位のグルコース−６−リン酸脱水素酵素）を含有した。対照サンプルは同様な物質を含有したが、ミクロソームは熱不活性化（９５℃で１０分間）ミクロソームで置き換えられた。対照サンプル中の化合物の回収は常に１００％であった。

混合物を３７℃で５分間プレインキュベートした。反応は０．８ｍＭのＮＡＤＰの添加により時点ゼロ（ｔ＝０）で開始し、サンプルを１５分間（ｔ＝１５）インキュベートした。反応を２容量のＤＭＳＯの添加により終結した。次にサンプルを９００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを分析まで２４時間を超えないように室温で保存した。すべてのインキュベートを二重に実施した。上澄みの分析をＬＣ−ＭＳ分析により実施した。サンプルの溶離をＸｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８（５０×４．６ｍｍ、５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳ）上で実施した。Ａｌｌｉａｎｃｅ ２７９０（供給会社：Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳ）ＨＰＬＣシステムを使用した。溶離液は２．４ｍｌ／分の流速の、バッファーＡ（Ｈ_２Ｏ／アセトニトリル（９５／５）中２５ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．２））、アセトニトリルの溶媒Ｂ及びメタノールの溶媒Ｃを使用した。使用した勾配は、有機相濃度を０％から、５分間にわたる５０％のＢ及び５０％のＣを超えて、１分間にわたる１００％Ｂまでの直線状に増加し、有機相濃度は更に１．５分間一定に維持された。サンプルの総注入容量は２５μｌであった。

検出計として、ＥＳＩ源を備えたＱｕａｔｔｒｏ（供給会社：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）トリプル四極子質量分析装置を使用した。エネルギー源及び解析温度はそれぞれ１２０及び３５０℃に設定され、ネブライザー及び乾燥ガスとして窒素を使用した。データをポジティブスキャンモード（単一イオン反応）で獲得した。コーン電圧を１０Ｖに設定し、滞留時間は１秒であった。

代謝安定性は活性ミクロソーム（Ｅ（ａｃｔ））の存在下で１５分間のインキュベート後の化合物の代謝％として表した、
代謝％＝１００％−［（ｔ＝１５におけるＥ（ａｃｔ）の総イオン流（ＴＩＣ）／
ｔ＝０におけるＥ（ａｃｔ）のＴＩＣ）］×１００。
２０％未満の代謝率を有する化合物は著しく代謝的に安定であるものと定義された。２０〜７０％の間の代謝を有する化合物は中程度に安定であると定義され、７０％を超える代謝率を示す化合物は低い代謝安定と定義された。代謝安定性のスクリーニングが実施される時は３種の対照化合物が常に包含された。べラパミルは低い代謝安定性（代謝％＝７３％）をもつ化合物として包含された。シサプリドは中程度の代謝安定性（代謝％＝４５％）をもつ化合物として包含され、そしてプロパノールは中程度から高い代謝安定性（２５％の代謝）をもつ化合物として包含された。これらの対照化合物は代謝安定性アッセイの有効性を証明するために使用された。

実施例Ｃ．６
ｐ２１誘発能

実施例Ｃ．６．ａ．
細胞法
Ａ２７８０細胞（ＡＴＣＣ）を３７℃の、５％ＣＯ_２を含む湿潤化インキュベーター内の、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及びゲンタマイシンを添加されたＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。すべての細胞培養液はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）により提供される。他の材料はＮｕｎｃにより提供される。

ゲノムＤＮＡを、増殖しているＡ２７８０細胞から抽出し、ｐ２１プロモーターのネスト化されたＰＣＲ単離物のテンプレートとして使用した。第１の増殖を、テンプレートとしてゲノムＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド対ＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧ及びＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣを使用して５５℃のアニーリング温度で２０周期につき実施した。ＴＡＴＡボックスに対して−４５５１〜＋８８フラグメントを含有する生成された４．５ｋｂのフラグメントを、８８℃のアニーリングにより２０周期、オリゴヌクレオチドＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧ及びＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣで再増殖させて４．５ｋｂフラグメントを生成し、次いで８８℃のアニーリングにより２０周期、オリゴヌクレオチド対ＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣ及びＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣにより再増殖させて、ＴＡＴＡボックスに対して−１３００〜＋８８フラグメントを含有する１．３ｋｂフラグメントをもたらした。オリゴヌクレオチド中に存在する制限部位ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ（下線配列）をサブクローン生成に使用した。

ルシフェラーゼリポーターをＫｐｎＩ及びＸｂａＩ制限部位においてｐＧＬ３−塩基性から除去し、ＺｓＧｒｅｅｎリポーター（ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミドから）により置き換えた。ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ部位のｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ中へのヒトｐ２１プロモーター領域の前記の１．３ｋｂフラグメントの挿入により、ｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００を構成した。すべての制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ（ドイツ）により提供される。Ａ２７８０細胞を２×１０^５細胞の密度で６−ウェルのプレートに添加し、２４時間インキュベートし、製造業者により説明されるようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，ベルギー）を使用することにより、２μｇのｐＧＬ３−塩基性−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００及び０．２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏベクトルによりトランスフェクションさせた。トランスフェクション細胞はＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）により１０日間選択し、単一の細胞懸濁物を増殖させた。３週後、単一のクローンを得た。

Ａ２７８０の選択されたクローンを増量させ（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、９６−ウェルのプレート中にウェル当たり１００００細胞で播種した。播種の２４時間後に、細胞を化合物（近位のｐ２１プロモーター領域中のｓｐ１部位に影響する）とともに更に２４時間処理した。次いで、細胞を３０’間、４％のＰＦＡで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔの染料により対比染色した。ＺｓＧｒｅｅｎ生産及び従って蛍光をもたらすｐ２１プロモーターの活性化をＡｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，ベルギー）によりモニターした。

各実験につき、対照（薬剤を含まない）及びブランクインキュベート（細胞も薬剤も含まない）を平行して実施した。ブランク値をすべての対照及びサンプル値から差し引いた。各サンプルにつき、ｐ２１誘発の値は、対照中に存在するｐ２１の値の百分率として表した。１３０％を超える誘動百分率を有意な誘発と定義した。

実施例Ｃ．６．ｂ．
インビボ法
選択されたクローンをヌードマウスの脇腹に皮下注射し（１０^７細胞／２００μｌ）、１２日後に、カリパー測定可能な腫瘍を得た。１２日から、動物に溶媒及び２０〜４０ｍｐｋの化合物（各４〜１０匹の動物）を６日間毎日経口又は静脈内投与した。腫瘍を社内で開発されたＡｕｔｏｍａｔｅｄ Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｄｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（自動化全身撮影システム）（ＧＦＰフィルターを備え、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ^（Ｒ）からのＩＭＡＱ Ｖｉｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅに基づくソフトウエアパッケージにより制御されるＣＣＤカメラタイプのＪＡＩ^（Ｒ） ＣＶ−Ｍ９０に接続された蛍光立体顕微鏡タイプのＯｌｙｍｐｕｓ^（Ｒ）ＳＺＸ１２）により蛍光を評価した。対照として化合物Ｒ３０６４６５（国際公開出願第０３／７６４２２号パンフレット）を使用した。化合物を不活性（測定可能な蛍光なし）、Ｒ３０６４６５より弱い、それと同等又はそれより強いものに評価された。

実施例Ｃ．７
Ｐ４５０阻害能
試験されたすべての化合物をＤＭＳＯ（５ｍＭ）に溶解し、アセトニトリル中に５ １０^−４Ｍに更に希釈した。アッセイバッファー（０．１ＭのＮａＫリン酸バッファー、ｐＨ７．４）中に更に希釈し、最終溶媒濃度は２％を決して超えなかった。

ＣＹＰ３Ａ４タンパク質のアッセイは、１００μｌの総アッセイ容量中に、ウェル当たり１５ｐモルのＰ４５０／１ｍｇのタンパク質（０．０１ＭのＮａＫリン酸バッファー＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成系（アッセイバッファー中、３．３ｍＭのグルコース−６−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、１．３ｍＭのＮＡＤＰ及び３．３ｍＭのＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ）及び化合物を含んでなる。３７℃で５分間のプレインキュベート後に、アッセイバッファー中に１５０μＭの蛍光プローブ基質ＢＦＣの添加により酵素反応を開始した。室温で３０分間のインキュベート後に、２容量のアセトニトリルの添加後に反応は終結した。４０５ｎｍの励起波長及び５３５ｎｍの発光波長で蛍光の測定を実施した。本実験における対照化合物としてケトコナゾール（ＩＣ_５０−値＝３×１０^−８Ｍ）を包含した。

ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質のアッセイは、１００μｌの総アッセイ容量において、ウェル当たり、６ｐモルのＰ４５０／１ｍｇのタンパク質（０．０１ＭのＮａＫリン酸バッファー＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成系（アッセイバッファー中、０．４１ｍＭのグルコース−６−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、０．００８２ｍＭのＮＡＤＰ及び０．４１ｍＭのＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ）及び化合物を含んでなる。３７℃で５分間のプレインキュベート後に、アッセイバッファー中に３μＭの蛍光プローブ基質ＡＭＭＣの添加により酵素反応を開始した。室温で４５分間のインキュベート後に、２容量のアセトニトリルの添加後に反応を終結した。４０５ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長で蛍光の測定を実施した。本実験の対照化合物としてキニジン（ＩＣ_５０−値＜５×１０^−８Ｍ）を包含した。

ＣＹＰ２Ｃ９タンパク質のアッセイは、１００μｌの総アッセイ容量において、ウェル当たり、１５ｐモルのＰ４５０／１ｍｇのタンパク質（０．０１ＭのＮａＫリン酸バッファー＋１．１５％のＫＣｌ中）、ＮＡＤＰＨ生成系（アッセイバッファー中、３．３ｍＭのグルコース−６−リン酸、０．４Ｕ／ｍｌのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、１．３ｍＭのＮＡＤＰ及び３．３ｍＭのＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ）及び化合物を含んでなる。３７℃で５分間のプレインキュベート後に、アッセイバッファー中に２００μＭの蛍光プローブ基質ＭＦＣの添加により酵素反応を開始した。室温で３０分間のインキュベート後に、２容量のアセトニトリルの添加後に反応は終結した。４０５ｎｍの励起波長及び５３５ｎｍの発光波長で蛍光の測定を実施した。本実験の対照化合物としてスルファフェナゾール（ＩＣ_５０−値＝６．８×１０^−７Ｍ）を包含した。

最初のスクリーニングの目的のためには、化合物は１×１０^−５Ｍの単一の固定濃度で試験された。有効な化合物に対しては、全体の濃度−反応曲線を確立するために実験を反復した。各実験につき、対照（薬剤を含まない）及びブランクインキュベート（酵素も薬剤も含まない）を平行して実施した。すべての化合物を４重実験で測定した。ブランク値をすべての対照及びサンプル値から引いた。各サンプルにつき、サンプルのＰ４５０活性の平均値（相対的蛍光単位で）を対照のＰ４５０活性の平均値の百分率として表した。抑制百分率は１００％引く、サンプルのＰ４５０活性の平均値として表した。適当な場合には、ＩＣ_５０−値（対照の５０％までＰ４５０活性を減少させるために要する薬剤の濃度）を計算した。

表Ｆ−２：実施例Ｃ．１、Ｃ．２及びＣ．３．ｂに従って試験された化合物の結果を示す（ブランクは関連化合物に対して利用可能な値がないことを示す）

Ｄ．組成物実施例：フィルムコート錠
錠剤コアの調製
１００ｇの式（Ｉ）の化合物、５７０ｇのラクトース及び２００のデンプンの混合物を十分混合し、その後、５ｇのナトリウムドデシルスルフェート及び１０ｇのポリビニル−ピロリドンの溶液（約２００ｍｌの水中）で湿潤化する。湿った粉末混合物をふるい、乾燥し、再度ふるう。次いで１００ｇの微細結晶セルロース及び１５ｇの水素化植物油を添加する。全体を十分に混合し、打錠すると、各１０ｍｇの式（Ｉ）の化合物を含んでなる１０．０００錠を与える。

コーティング
１０ｇのメチルセルロースの溶液（７５ｍｌの変性エタノール中）に５ｇのエチルセルロースの溶液（１５０ｍｌのジクロロメタン中）を添加する。次いで７５ｍｌのジクロロメタン及び２．５ｍｌの１，２，３−プロパントリオールを添加する。１０ｇのポリエチレングリコールを融解し、７５ｍｌのジクロロメタン中に溶解する。後者の溶液を前者に添加し、次に２．５ｇのマグネシウムオクタデカノエート、５ｇのポリビニルピロリドン及び３０ｍｌの濃厚色素懸濁液を添加し、全体をホモジネート化する。コーティング装置内で、錠剤のコアをこのように得た混合物でコートする。

Claims (12)

1. 式（Ｉ）
   

   

   ［式中、
   ＸはＮ又はＣＨであり、
   Ｒ^１はヒドロキシ又は式（ａ−１）
   

   

   の基であり、ここで
   Ｒ^４はヒドロキシ又はアミノであり、
   Ｒ^５は水素、チエニル、フラニル又はフェニルであり、そしてチエニル、フラニル又はフェニルはそれぞれ、場合により１個又は２個のハロ、アミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、フェニル、Ｃ_１−６アルキル、（ジＣ_１−６アルキル）アミノ、Ｃ_１−６アルキルオキシ、フェニルＣ_１−６アルキルオキシ、ヒドロキシＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシカルボニル、Ｃ_１−６アルキルカルボニル、ポリハロＣ_１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルスルホニル、ヒドロキシカルボニルＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、アミノスルホニル、アミノスルホニルＣ_１−６アルキル、イソオキサゾリル、アミノカルボニル、フェニルＣ_２−６アルケニル、フェニルＣ_３−６アルキニル又はピリジニルＣ_３−６アルキニルで置換されていてもよく、
   Ｒ^６、Ｒ^７及びＲ^８はそれぞれ独立して水素、アミノ、ニトロ、フラニル、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、チエニル、フェニル、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルＣ_１−６アルキル又は−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ_２−Ｒ^９であり、ここで
   Ｒ^９は水素、Ｃ_１−６アルキル、ヒドロキシ、アミノ又はＣ_１−６アルキルオキシであり、
   Ｒ^２はアミノ、Ｃ_１−６アルキルアミノ、アリールＣ_１−６アルキルアミノ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノ、Ｃ_３−７シクロアルキルアミノ、Ｃ_３−７シクロアルキルＣ_１−６アルキルアミノ、グルタルイミジル、マレイミジル、フタルイミジル、スクシンイミジル、ヒドロキシ、Ｃ_１−６アルキルオキシ、フェニルオキシであり、ここで前記フェニルオキシ基中のフェニル部分は場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、シアノ、Ｃ_１−６アルキルオキシカルボニル及びトリフルオロメチルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよく、
   Ｒ^３はフェニル、ナフタレニル又はヘテロシクリルであり、ここで前記フェニル又はナフタレニル基は、それぞれ、場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、ポリハロＣ_１−６アルキル、アリール、ヒドロキシ、シアノ、アミノ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、Ｃ_１−６アルキルオキシカルボニル、ヒドロキシＣ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシメチル、アミノメチル、Ｃ_１−６アルキルアミノメチル、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノメチル、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノメチル、アミノスルホニル、Ｃ_１−６アルキルアミノスルホニル及びヘテロシクリルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよく、
   アリールはフェニル又はナフタレニルであり、ここで前記フェニル又はナフタレニル基はそれぞれ、場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、トリフルオロメチル、シアノ及びヒドロキシカルボニルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよく、そして
   ヘテロシクリルはフラニル、チエニル、ピロリル、ピロリニル、ピロリジニル、ジオキソリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピラゾリル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピラニル、ピリジニル、ピペリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピリダジリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピペラジニル、トリアジニル、トリチアニル、インドリジニル、インドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、キノリジニル、キノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノオキサリニル又はナフチリジニルであり、ここで
   前記ヘテロシクリル基はそれぞれ、場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ、シアノ、アミノ及びモノ−もしくはジ（Ｃ_１−４アルキル）アミノからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよい］
   の化合物、そのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容できる付加塩及び立体化学的異性体形態。
2. ａ）ＸがＮであり、
   ｂ）Ｒ^１がヒドロキシであり、
   ｃ）Ｒ^２がアミノ、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルキルスルホニルアミノ、フタルイミジル、スクシンイミジル又はフェニルオキシであり、ここで前記フェニルオキシ基中のフェニル部分は場合によりハロ置換基で置換されていてもよく、そして
   ｄ）Ｒ^３が場合により、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルキルオキシ及びポリハロＣ_１−６アルキルからそれぞれ独立して選択される１個又は２個の置換基で置換されていてもよいフェニルである、
   請求項１記載の化合物。
3. ａ）ＸがＮであり、
   ｂ）Ｒ^１がヒドロキシであり、
   ｃ）Ｒ^２がアミノであり、そして
   ｄ）Ｒ^３が場合により、ハロ及びＣ_１−６アルキルオキシから選択される１個の置換基で置換されていてもよいフェニルである、
   請求項１記載の化合物。
4. 化合物が以下：
   

   

   を意味する化合物Ｎｏ．２である、請求項１記載の化合物。
5. 製薬学的に許容できる担体及び、有効成分として、治療的有効量の、請求項１〜４のいずれかに請求の化合物を含んでなる製薬学的組成物。
6. 製薬学的に許容できる担体及び請求項１〜４のいずれかに請求の化合物が密接に混合される、請求項５に請求の製薬学的組成物を製造する方法。
7. 医薬として使用のための請求項１〜４のいずれかに請求の化合物。
8. 増殖性疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれかに請求の化合物の使用。
9. 抗癌剤及び請求項１〜４のいずれかに請求のＨＤＡＣインヒビターの組み合わせ物。
10. ａ）式（ＩＩ）の中間体を適当な酸と反応させて、式（Ｉ−ａ）の化合物を形成し、
    

    

    ｂ）そのＭが水素又はアルカリ金属を表す式（ＩＩＩ）の中間体を式（ＩＶ）の中間体と反応させて、式（Ｉ−ｂ）の化合物を形成する方法、
    

    

    を特徴とする、請求項１に請求の化合物の製法。
11. ＱがＣ_１−２アルキルオキシカルボニル、ＭＯ_２Ｃ（ここでＭは水素又はアルカリ金属である）又はテトラヒドロピラニルオキシアミノカルボニルであり、Ｒ^２ａがＲ^２に対して定義されたとおりであるかあるいはまた、ヒドロキシメチルであり、そしてＸ及びＲ^３が式（Ｉ）に対して定義されたとおりである式（Ｂ）の化合物並びにそのＮ−オキシド形態、製薬学的に許容できる付加塩及び立体化学的異性体形態。
    

    
12. ａ）式（ＩＩＩ）の中間体を式（Ｖ）の中間体と反応させて、以下の式（ＩＩ）により表され、そのＱがテトラヒドロピラニルオキシアミノカルボニルである式（Ｂ）の中間体を形成し、
    

    

    ｂ）式（ＶＩ）の中間体を適当な酸性溶液又は適当なアルカリ金属の塩基と反応させて、以下の式（ＩＩＩ）により表され、そのＱがＭＯ_２Ｃである式（Ｂ）の中間体を形成し、
    

    

    ｃ）式（Ｘ）の中間体をジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ），トリ−ｎ−ブチルホスフィン（ＰＢｕ_３）及び適当な求核物質Ｒ_２Ｈ（ＸＩ）と反応させて、以下の式（ＶＩ）により表され、そのＱがＣ_１−２アルキルオキシカルボニルである式（Ｂ）の中間体を形成し、
    

    

    ｄ）式（ＸＩＩ）の中間体を、１，４−ジオキサン−２，５−ジオール及び、そのＲ^３が前記に定義のとおりである式（ＸＶ）の適当なボロン酸と反応させて、以下の式（Ｘ）により表され、そのＱがＣ_１−２アルキルオキシカルボニルであり、そしてＲ^２ａがヒドロキシメチルである式（Ｂ）の中間体を形成する方法、
    

    

    を特徴とする、請求項１１に請求の化合物の製法。