JP2009520683A - 筋傷害の治療における筋線維の再生のための医薬組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明で用いたプロトコールはすべて、米国国立衛生研究所により発行されたThe Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに準拠し、香港中文大学の動物実験倫理委員会により承認されたものである。
本発明の化合物は植物より調製できるが、化学合成を介しても製造可能である。
図1を参照する。中国の貴州省で8月に収穫されたダイコンソウの植物を乾燥させ(10kg)、室温下、3日間の70%エタノール(100L)浸出を2回行った。抽出物を混合し、噴霧乾燥し、固形残渣(1kg)を得た。固形残渣を10リットルのH2O中に懸濁させ、次いで、クロロホルム(10L)で2回、更にn−ブタノール(10L)で2回分配し、対応する画分を得た。n−ブタノール(GJ−B)可溶性画分を濾過し、噴霧乾燥により乾燥して、粉末画分を得た。粉末画分について、細胞培養においてMSCの心原性分化を刺激する特有の能力を有することを下記の方法で確認した。n−ブタノール可溶性画分(GJ−B)が、細胞培養系における培養MSCの増殖及び心原性分化を亢進することができることが示された。GJ−Bを、10%メタノールで平衡化したセファデックスLH−20のカラムにアプライし、メタノール水溶液で、その濃度を上昇させながら溶出し、7画分(GJ−B−1からGJ−B−7)を分離した。すべての溶出画分を、MSC培養系に対する活性に関して試験した。活性試験では、画分6が、培養MSCの心原性分化の亢進の点で最も強力な活性を有することが示された。GJ−B−6から純粋な活性化合物を更に単離した。当該化合物を、本明細書を通じてCMFと呼ぶ。CMFの構造は、NMR分析及び文献との比較により決定され、式(I)のものであることが示された。
MSCをCMF(増殖培地中に10μg/mL)と共に6日間培養した。同時に、対照MSCを、等量の5%DMSOを含有する増殖培地中で培養した。2日目に、内因性リン酸化Akt1の発現を、免疫細胞化学検査及びウエスタンブロットにより評価した。4日目に、筋原性分化を、MEF2に対する免疫細胞化学検査及びウエスタンブロットにより評価し、更に6日目に、それを、MHCに特異的な抗体を用いた免疫組織化学検査及びウエスタンブロットにより確認した。3日目に、CMF予備処理MSC及び対照MSCを、培養中にCM−DiIで標識して移植に備えた。
脛骨/大腿骨をSprague−Dawley(SD)ラットから取り出し、骨髄(BM)を、加熱不活性化した10%FBS(GIBCO)及び1%のペニシリン/ストレプトマイシンを含有するIMDM培地で骨から洗い出した。BMを完全に混合し、1500rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを5mLの増殖培地に懸濁させた。細胞懸濁液を慎重に5mLのFicoll溶液上に置き、200rpmで30分間遠心分離した。BM細胞を含有する第2層をチューブに移し、PBSで2度洗浄して、Ficollを取り除いた(1200rpm、5分間)。細胞ペレットを、加熱不活性化した10%FBS(GIBCO)及び1%のペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質混合物を含有するIMDM培地に再懸濁させた。5%CO2、37℃のインキュベーターで24時間培養後、非接着細胞を捨て、接着細胞を、3日に一度培地交換して培養したところ、細胞は培養14日後にほぼコンフルエントになった。これが、以下でMSCと呼ぶBM細胞であり、本明細書中で実施するインビトロ研究及びインビボ研究に使用したものである。
CMF処理細胞又は対照細胞の全細胞抽出物を、パック細胞容積の3倍量の溶解バッファー(50mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1%ノニデット(Nonidet)P−40、10%グリセリン、200mM NaF、20mM ピロリン酸ナトリウム、10mg/mL ロイペプチン、10mg/mL アプロチニン、200mM フェニルメチルスルホニルフルオリド、及び1mM オルトバナジン酸ナトリウム)で、氷上で30分間細胞を溶解することにより調製した。タンパク質の収率は、Bio−Rad DCタンパク質アッセイキット(Bio−Rad)により定量化した。等量(30μg)の全タンパク質をSDS−PAGEによりサイズ分画し、PVDM膜(Millipore)に転写した。ブロットは、0.1%(体積/体積)Tween20添加リン酸緩衝生理食塩水(PBST)に5%(質量/体積)粉乳を含有させた溶液(PBSTM)で30分間、室温でブロッキングし、ラットリン酸化Akt1(マウス)又はラットMHC(マウス、Sigma−Aldrich)に特異的な一次抗体(PBSTM中で1:1000に希釈)を用いて、60分間プローブした。PBSTで十分に洗浄した後、ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG(Amersham Biosciences)(PBSTM中1/1000希釈、60分間)でプローブし、PBSTで十分に洗浄し、化学発光で発色させた。
Sprague−Dawley(SD)ラットを使用した。すべての動物実験手順は、動物保護に関する大学動物委員会に承認されたものである。各ラットに対して、腹腔内ペントバルビタール(50mg/kg)で麻酔し、挿管し、Harvard人工呼吸器(model683)を用いて室内空気で人工呼吸させた。左開胸の後、冠動脈左前下行枝(LAD)の永久結紮により心筋梗塞を誘発させた。生理食塩水に懸濁させた5×105のDiI標識CMF予備処理MSC(ラット32匹)を、結紮後直ちに、結紮動脈より遠位の心筋(虚血領域)の3つの部位の各々に注入した(試験群)。対照ラットについては、生理食塩水に懸濁させた等量のDiI標識未処理対照MSC(ラット32匹)を、同じ部位に同じタイミングで注入した。シャム虚血(ラット32匹)に関しては、LAD結紮を行わずに開胸を実施した。未処理の16匹のラットを標準対照として設定した。
32匹のSDラットを無作為に、標準群、シャム群、CMF処理群及び未処理対照群(各群につきラット8匹)、の4群に分けた。ラットに対して、腹腔内ペントバルビタール(50mg/kg)で麻酔し、挿管し、Harvard人工呼吸器(model683)を用いて室内空気で人工呼吸させた。左開胸の後、冠動脈左前下行枝(LAD)の永久結紮により心筋梗塞を誘発させた。8匹のラットにおいて、5%DMSO(0.1mL。0.1mgCMF含有)中のCMFを、結紮動脈より遠位の心筋(虚血領域)に、結紮後直ちに注入した(CMF処理群)。他の8匹のラットについては、等量の5%DMSOを同じ部位に同じタイミングで注入し、これを未処理対照群とした。シャム虚血に関しては、8匹のラットに対して、LAD結紮を行わずに開胸を実施した。いかなる処理も行っていない更に別の8匹のラットを、標準群として設定した。
MSCを10μg/mLのCMFで24時間処理して、遺伝子発現を活性化/アップレギュレートし、次いで、十分に洗浄して残留CMFを取り除いた。その後、5mLの新鮮増殖培地を培養物に加え、更に3日間の培養後回収した。ここで回収した培地は馴化培地と呼ぶ。5mLの馴化培地を1mLの容積に濃縮し、上述の心筋梗塞動物モデルの処置剤として使用した。簡潔には、左開胸及びLAD結紮後直ちに、0.2mLの馴化培地を結紮部より遠位の部分に注入した。新鮮増殖培地を対照として使用した。
16匹の5週齢SDラットを用いて骨髄移植を行った。移植ラットを、137Cs供給源(Elite Grammacell 1000)から1.140Gy/分で9.5Gyのγ線を照射することにより刺激して、ラットの骨髄由来幹細胞を完全に破壊した。そして、刺激後2時間内に、DiI標識MSC(0.3mL PBS中に懸濁させた2×108個の細胞)を、27ゲージ針を用いて尾静脈から注入した。刺激及び移植の1週間後、DiI標識骨髄を有するラットを、CMFで直接処理した群及び未処理の対照群、の2群に分けた。心筋梗塞の手術及び処置計画を、上述のように実施した。実験を、手術及び処置後14日目に終了させて、更なる評価を行った。屠殺したラットの心臓標本を得た。心臓型トロポニンI(Santa Cruz)及びPCNA(Dako)に対する特異的抗体を用いた免疫組織化学的染色により、DiI陽性細胞及びそれらの心筋原性分化に関して、すべての標本を追跡した。アルカリホスファターゼ結合特異的二次抗体(Santa Cruz)を用いて、陽性染色細胞を可視化した。DiI陽性シグナルは、蛍光顕微鏡(Laica)を用いて観察した。
14日目に屠殺した実験ラットの左心室を取り出し、心尖部から心基部までをスライスして3つの横断切片を得た。切片をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。左心室の切片(厚さ20μm)をマッソントリクロームで染色した。これにより、コラーゲンは青色に、心筋は赤色に標識される。これらの切片をデジタル化し、全青色染色を形態計測学的に定量化した。個々の切片の梗塞容積(mm3)を切片の厚みを基に算出した。全切片の梗塞組織の容積を足し合わせて、個々の心臓の全梗塞容積を算出した。すべての検査は、盲検的に病理学者により行われた。
梗塞後7日に、組織切片において、高倍率視野(HPF)(×400)の下で光学顕微鏡を用いて梗塞領域内の血管の数を数えることにより、血管密度を測定した。梗塞領域内の、重複しない無作為の6つのHPFを用いて、すべての実験心臓の各切片における全新生血管を数えた。各HPF中の血管の数の平均を求め、HPF当たり血管数で表した。
結紮後7日にCMF予備処理MSC移植群及び未処理MSC移植群の双方から得た切片を、Ki67又はミオシン重鎖(MHC)抗体で染色して、再生心筋を同定した。アルカリホスファターゼ結合特異的二次抗体を用いて、陽性染色を可視化した。簡潔には、パラフィン包埋切片を0.1M EDTA緩衝液中でマイクロ波にかけ、ラットKi67に対して特異性のあるポリクロナールウサギ抗体(1:3000希釈)(Sant Cruz Biotechnology)で用いて染色し、4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、切片を、1:200希釈のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG二次抗体(Sigma)と共に30分間インキュベートし、陽性核を、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸−p−トルイジン−ニトロブルーテトラゾリウム基質キット(Dako)で暗青色に可視化した。対応するパラフィン組織ブロックに隣接した切片を、1:50希釈のウサギ抗ラットMHC(MF20、Developmental Hybridoma Bank, University of Iowa)抗体中で、4℃で一晩インキュベートし、更に、1:100希釈のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG(Sigma)中で、室温で30分間インキュベートした。1mg/mLの3,3’−ジアミノベンジジン(DAB;0.02%H202添加)と共にインキュベートした後、スライドを顕微分析により検査した。再生心筋領域を、投影視野内で、42のサンプリングポイントを含むグリッドにより線引きした。各切片において、個々の再生心筋の境界に沿った約30〜60の計算点を選択した。上記グリッドにより62,500μm2の非圧縮組織領域が画定され、これを用いて、各切片の選択された30〜60の計算点を測定した。梗塞の中心領域における再生心筋の形状及び容積を、約70の切片の各切片(50μm間隔)において、再生心筋が占める部分の形状及び面積、並びに切片の厚さを測定することにより決定した。これらの変数を用いて積分計算することによって、立体構造を割り出し、また、各切片内の梗塞の中心領域における個々の再生心筋の容積を求めた。個々の組織ブロックの全切片の値及び立体構造を統合して、再生心筋の全容積及び全立体構造を得た。
心エコー検査を、15MHzリニアアレイトランスデューサーと共にSequoia C256 System(Siemens Medical)を用いて実施した。実験ラットの胸部を剃毛し、動物を保温パッド上に仰臥位に置き、ECG肢電極を配置し、制御麻酔下で心エコー検査を記録した。各実験ラットは、実験開始前にベースラインの心エコー検査を受けた。2次元誘導Mモード及び2次元(2D)心エコー検査画像を胸骨傍の長軸方向及び短軸方向から記録した。左室(LV)の収縮末期及び拡張末期のサイズ、並びに収縮末期及び拡張末期の壁厚を、American Society of Echocardiographyの最新の手法を用いてMモード図から測定した。LV拡張末期(LVDA)及びLV収縮末期(LVSA)の面積を胸骨傍の長軸方向からプラニメーターで測定し、LV拡張末期及びLV収縮末期の容積(LVEDV及びLVESV)をMモード法により算出した。LV駆出分画(LVEF)及び内径短縮率(FS)を、2D短軸像におけるLV断面積から導出した。EF=[(LVEDV−LVESV)/LVEDV]×100%;FS=[(LVDA−LVSA)/LVDA]×100%。心エコー検査の計算には標準公式を用いた。すべてのデータは、検査終了時に、超音波システム内のソフトウェアを用いてオフラインで分析した。測定・計算された指数はすべて、3〜5回の連続した測定の結果の平均で示した。
すべての形態計測データを無差別に収集し、実験終了時にコードを破棄した。結果は、各心臓から得られた平均測定値から算出した平均±SDで示す。2つの測定値間の比較の統計的有意性は、対応のない両側スチューデントt検定を用いて判定した。P<0.05の値を有意とみなした。
図2を参照する。培養物中でCMF(10μg/mL)により2日間処理した後、リン酸化Akt1の発現が、未処理対照と比較して顕著にアップレギュレートされた。これは、リン酸化Akt1に特異的な抗体を用いた、細胞の免疫組織化学的染色(陽性細胞では、主として細胞質が赤く染色される。)により示されている(図2a−1)。ウエスタンブロットでは、リン酸化Akt1の発現が、未処理細胞と比較して最大3〜4倍増加していたことが確認された(図2b−5A)。リン酸化Akt1でアップレギュレートされたMSCのうち、90%以上のものが、更に2日間培養することにより、筋細胞エンハンサー因子2(MEF2)に特異的な抗体で陽性に染色されるようになった。MEF2は、心原性細胞系譜の最も早い段階のマーカーの1つである。陽性細胞では核がオレンジに染色され(図2a−2)、また、陽性細胞はウエスタンブロットにより確認された(図2b−6A)。これらは、心原性分化へのMSCの関与を示唆している。青色の核の存在により示唆されるように、培養MSCのすべてが抗MEF2抗体により陽性に染色されたわけではない(図2a−2)ことが注目される。これは、すべての培養MSCが、CMFにより心原性分化経路に沿って転換されるわけではないこと、或いは、MSCの調製物中に微量の不純物が存在していたこと、によるものと思われる。同様に、培養MSCの大部分が、心臓型ミオシン重鎖に特異的な抗体で陽性に染色された。陽性細胞では細胞質が赤く染色され(図2a−3)、また、陽性細胞は、CMF存在下で6日間培養して得た培養物に対するウエスタンブロットにより確認された(図2b−7A)。他方、対照細胞は、3つの特異的抗体のすべてによりネガティブ染色された(図2a−4及び図2b−B)。続いて起こったMEF2及びMHCの発現誘導により、生体外におけるCMF誘発性のMSCの心原性分化の進展が裏付けられた。図2bにおいて、AはCMF処理試料を、Bは未処理対照を表す。
移植に先立ってCMFで処理されたMSCにおいて、生体外(ex vivo)で示された生存能力及び心原性分化効率の増大が、インビボでのMI修復において顕著な改善をもたらすか否か、或いは言い換えれば、CMFの生体外効果が治療的価値を有するか否かを判定するために、MI動物モデルを用いた細胞移植実験を実施した。実験では、CMFで予備処理されたMSCを梗塞領域に移植した。移植細胞のホーミング、生存、増殖、心筋原性分化及び成熟を、梗塞及び細胞移植後7日及び14日の心臓から得た切片において、DiI蛍光の陽性シグナルにより、或いは、Ki67及びMHCに関する免疫組織化学的染色により追跡した。図3に示されるように、7日目に、試験心筋群では、心筋細胞の特徴的表現型を有するDiI陽性細胞(図3−1)が梗塞の全領域に渡って観察され、それらがドナー細胞に由来し、また、全梗塞域に分布することが示唆された。対照群(CMF未処理)では、梗塞境界の周囲に散在するDiIシグナルのみが見られた(図3−2)。共焦点顕微鏡観察により、全梗塞域において、DiIシグナル(赤)及び心臓特異的トロポニンI発現(緑)の共局在が観察された(図3−3〜−5)。DiI陽性(赤)と心臓特異的マーカートロポニンI発現(緑)との統合画像では、同一細胞において黄色−赤色−緑色が重複していたが、これにより、生体外でCMFにより予備処理された移植MSCの、インビボでの心筋原性分化及び成熟が確認された。また、トロポニンI陽性細胞(緑)のいくつかはDiI陽性でなかった(図3−3及び−5)ことが注目されるが、これは、移植されたDiI標識MSCに由来しない再生筋細胞が存在していたことによるものと考えられる。同様に、明るい青の円の中に示されているいくつかのDiI陽性細胞(図3−4及び−5)は、トロポニンI免疫染色において陰性であった。これは、少数の移植細胞がインビボでの心原性分化に関与していなかったこと、或いはMSCの調製物中に不純物が含有されていたことを示唆している。
図5を参照する。MIモデルにCMFを局所的に直接注入すると、梗塞から2週間後に、対照群(CMF処理なし)において、結紮部位より遠位部の心筋が、虚血性壊死のために外観上実質的に白くなったことが判明した(図5−2)。これに対して、CMF処理心臓の同等部分は、恐らく新血管形成のために外観上比較的赤く(図5−1)、その点では心臓の非虚血部分と同様であったが、梗塞サイズは対照心臓の梗塞サイズよりもかなり小さかった(図5−2)。更に、梗塞領域の横断面では、CMF処理心臓の左室壁(図5−3)は、対照心臓の左室壁よりもかなり厚かった(図5−4)。組織学的観察により、CMF処理心臓(n=8)の梗塞サイズが、対照心臓(n=8)の梗塞サイズに対して平均して約1/3〜1/2であることが明らかになった。これは、結紮後14日目に左室自由壁の梗塞容積を測定することにより計算されたものである。マッソントリクローム染色により、CMF処理心臓において、筋細胞様の細胞集団が、梗塞心筋又は周辺の生存心筋とほぼ同じ配向で配列し、全梗塞領域の大部分に分布していることが判明した(図5−5)。これに対して、対照心臓の梗塞領域はほぼ完全に線維組織の置換で占められ、心筋細胞再生のためのスペースはほとんど残っていなかった(図5−6)。高倍率視野の下において、対照群では、線維性瘢痕が全体的に青く染色されていた(図5−8)が、これとは著しく対照的に、CMF処理群では、全梗塞領域が、形のよい心筋形態を呈する再生筋細胞集団で満たされ、合間には線維組織がほとんど存在しなかった(図5−7)。これらの再生筋細胞のサイズは周辺の既存の筋細胞より小さかったが、これは、未だ成熟途上にあるためと考えられる。
CMFで活性化されたMSCにより分泌された特定の誘導タンパク質を含有する馴化培地が、梗塞領域へのCMFの直接適用又はCMF予備処理MSCの移植と同様の効果をもたらすか否かを判定するために、馴化培地を、MSC培養物及び心筋梗塞動物モデルの双方を用いて試験した。図6aを参照する。馴化培地で24時間処理後、MSCの増殖率は、対照培地(新鮮増殖培地)と比較して120%に増加した。図6bを参照する。MIモデルの虚血領域に馴化培地を局所注入すると、心筋細胞の再生が観察された。簡潔には、対照における線維性置換(図6b−1)と比較すると、全梗塞域において、多くの再生心筋細胞、及び血液細胞で満たされた多くの新生血管が観察された(図6b−2)。
図7を参照する。DiI標識MSCで骨髄置換を行ったMIモデルの研究により、再生心筋の細胞供給源が骨髄MSCであることの直接証拠が提供された。骨髄置換の1週間後、心筋梗塞手術を上述のように実施した。梗塞後14日に、CMF処理心臓の全梗塞領域が、DiI標識細胞で十分に占領されていることが判明した。DiI標識細胞は、既存の生存心筋細胞が存在する非梗塞領域にはほとんど存在しなかった。これらのDiI陽性細胞は集合して一群となり、心筋様形態を呈していたが、既存の心筋細胞と比較するとサイズが小さかった(図7−1)。これに対して、対照の梗塞心臓では、ごく少数のDiI陽性細胞の散在のみが梗塞境界域に沿って観察された(図7−2)。十分に組織化されたそれらのDiI陽性細胞が再生心筋であることを確認するために、トロポニンI及びPCNAに特異的な抗体を用いた免疫組織化学検査を実施した。全梗塞域に分布する多数のDiI陽性細胞が、トロポニンI(図7−3)又はPCNA(図7−4)に対する特異的抗体により陽性に染色されていることが判明した。これらのDiI陽性及びトロポニンI若しくはPCNA陽性染色細胞は、CMF処理心臓の全梗塞域において心筋様組織に組織化されていた(図7−3及び−4)。高倍率視野の下において、これらの再生心筋様組織は心筋の典型的な形態を示し、再生筋細胞間には明瞭な介在板結合が存在していた。個々の再生筋細胞が超微細構造的に成熟して心筋に統合されたことが示唆された(図7−5)。再生筋細胞間、及び再生心筋と既存の生存心筋との間、の構造的統合がなければ、機能的統合及び同調的な機械的活動は保証されないであろう。これらの再生心筋は、梗塞後14日に、全梗塞容積の平均69.3%を占めていた。これに対して、6つの対照心臓では、ごく少数の細胞のみがトロポニンI及びDiIの双方に陽性であり、また、血管の周囲に散在し、他方、梗塞域が主として線維性瘢痕で占領されていた(図7−6)。これらの結果により、CMF誘導再生心筋が機能的であり、また、骨髄MSCに由来することが示された。
有効な化合物が同定され、当該化合物の部分的又は実質的に純粋な調製物が、植物等の天然資源からの化合物の単離又は化学合成により得られれば、当産業の既存の方法又は将来開発される方法を用いて、種々の医薬組成物又は医薬製剤を、部分的又は実質的に純粋な化合物から製造することができる。化合物から医薬製剤及び医薬品剤形(錠剤、カプセル剤、注射剤、シロップ剤を含むが、これらに限定されない。)を製造する特定の方法は、本発明の一部を成すものではなく、医薬品産業の当業者は、本発明の実施に、当産業において確立された1つ又は複数の方法を適用することができる。或いは、本発明の化合物をより適合させるために、当業者は従来の既存の方法を改変してもよい。例えば、米国特許商標庁(USPTO)の公式ウェブサイトが提供する特許又は特許出願のデータベースには、有効な化合物からの医薬製剤及び医薬製品の製造に関する豊富な情報が含まれている。有用な情報源としては、他に、Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations(編集:Sarfaraz K.Niazi、販売:Culinary & Hospitality Industry Publications Services)が挙げられる。
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Claims (23)
- 心臓組織の損傷に起因する心疾患の治療に当該組成物が有用である旨の情報が添付された、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記心臓組織の損傷が虚血性心疾患に起因する、請求項2に記載の医薬組成物。
- 医薬品剤形に製剤化され、
容器に収納され、
前記情報が、前記容器に、又は前記容器内に含まれている添付文書若しくはパンフレットに表示されている、請求項3に記載の医薬組成物。 - 前記剤形が、錠剤、カプセル剤、注射剤、懸濁剤、液剤、散剤及びシロップ剤からなる群より選択される、請求項4に記載の医薬組成物。
- 心筋傷害に罹っている哺乳動物個体の心臓において、筋細胞又は心筋を再生させる方法であって、
請求項1中で規定される式(I)の骨格構造を有する化合物、又は前記化合物の機能的誘導体、を使用するステップを含む方法。 - 前記化合物が、置換なしの前記骨格構造自体である、請求項6に記載の方法。
- 前記心筋傷害が虚血性イベントに起因する、請求項9に記載の方法。
- 前記虚血性イベントが心筋梗塞である、請求項10に記載の方法。
- 前記筋細胞又は心筋が、
(a)筋原性前駆細胞の生存能力を増加させて、前記前駆細胞を、絶対的虚血期間を通じて生存可能にするステップ、
(b)筋傷害が位置する心臓領域において、損傷した血液供給ネットワークを再構成するステップ、及び
(c)心臓の細胞系譜に沿った前記前駆細胞の心筋原性分化効率を高めるステップ、
のうちの1つ又は複数を含むプロセスであって、前記ステップが同時に、又は任意の特定の順序で実施されるプロセス、で再生される、請求項6に記載の方法。 - 前記筋原性前駆細胞が、血液循環を介して移動した骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項12に記載の方法。
- 前記化合物が、置換なしの前記骨格構造自体である、請求項2に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載の医薬組成物と、容器と、前記医薬組成物の使用法に関する情報と、を含む医薬製品。
- 前記情報が、前記容器の外側表面に示されている医薬製品。
- 前記情報が、前記容器内に含まれているパンフレット又は添付文書に示されている医薬製品。
- (a)複数の幹細胞を得るステップと、
(b)前記幹細胞を、前記化合物又は前記機能的誘導体と一定期間接触させるステップと、
(c)前記細胞を、前記哺乳動物個体の梗塞した心臓組織に移植するステップと、
を更に含む、請求項6に記載の方法。 - (a)前記化合物又は前記機能的誘導体を剤形に製剤化するステップと、
(b)前記化合物又は前記機能的誘導体を、前記剤形で前記哺乳動物個体に全身投与するステップと、
を更に含む、請求項6に記載の方法。 - 前記剤形が、錠剤、カプセル剤、注射剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤及び散剤からなる群より選択される、請求項21に記載の方法。
- (a)複数のMSC又は内皮細胞を、前記化合物又は前記機能的誘導体を含有する培地で一定期間培養するステップと、
(b)前記MSC又は内皮細胞からの分泌タンパク質を含有する前記培地を回収するステップと、
(c)前記培地を梗塞領域内の心臓組織に投与又は送達するステップと、
を更に含む、請求項6に記載の方法。
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Brofman et al. | Functional analysis and histopathological study of the effects of intra-myocardium transplantation of skeletal myoblasts, bone marrow mesenchymal stem cells, and co-culture of these both cells in adult rat in ischemic cardiomyopathy |
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