JP2009513113A5 - - Google Patents
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Claims (15)
- 以下の工程を含む、NS2/3プロテアーゼを含むサンプルにおけるNS2/3自己切断活性を検出する方法:
a)NS2/3プロテアーゼの少なくとも一部分が自己切断されてNS3プロテアーゼ生成物を生じる条件に前記サンプルを供する工程;
b)工程a)で生成されたNS3プロテアーゼ生成物を含むサンプルを適切な量のNS4A補助因子と、ラウリルジエチルアミンオキシド(LDAO)及びn-ドデシル-β-D-マルトシド(DM)から成る群から選択される適切な界面活性剤及び適切なNS3-基質の存在下、NS3プロテアーゼ生成物がNS3-基質の切断を触媒してそのNS3-基質副生成物を生じさせるために十分な条件下でインキュベートする工程;及び
c)工程b)で生成されたNS3-基質副生成物を検出し、それによりNS3-基質副生成物の検出がサンプル中のNS2/3自己切断活性を示す工程。 - LDAOの濃度が0.2%から2%である、請求項1記載の方法。
- DMの濃度が0.05%から2%である、請求項1記載の方法。
- 前記NS2/3プロテアーゼが、配列番号:1に示されるアミノ酸810から1206に対応するNS2/3プロテアーゼを含む、請求項1記載の方法。
- 前記NS2/3プロテアーゼが、配列番号:2に規定されるアミノ酸907から1206に対応するフラグメントを含む、請求項4記載の方法。
- 前記NS2/3プロテアーゼが、配列番号:3に規定されるアミノ酸904から1206に対応するフラグメントを含む、請求項4記載の方法。
- 前記NS2/3プロテアーゼがさらにアフィニティータグ又は検出可能な標識を含む、請求項4記載の方法。
- 前記NS2/3プロテアーゼが配列番号:4に規定されるとおりである、請求項7記載の方法。
- 前記NS4A補助因子が、本質的に、配列番号:8に規定される配列GSVVIVGRIILSGRを有するペプチドから成る、請求項1記載の方法。
- 前記NS4A補助因子が、配列番号:9に規定される配列KKGSVVIVGRIILSGRKを有する、請求項9に記載の方法。
- 前記NS4A補助因子が、NS3プロテアーゼ生成物に対して1000倍モル過剰で用いられる、請求項9記載の方法。
- 前記NS3基質が、配列(D又はE)XXXXC(A又はS)を含むコンセンサス配列を骨子とし、式中Xは任意のアミノ酸である、請求項1記載の方法。
- 前記NS3基質が、DEMEEC-ASH(配列番号:6)及びDDIVCC-SMSYTW(配列番号:7)から成る群から選択されるデプシペプチドを含む、請求項12記載の方法。
- 前記NS3基質が、本質的に、配列番号:10に規定されるAc-DED(EDANS)EE-Abu-[C(O)-O]ASK(DABCYL)-NH2から成る、請求項12記載の方法。
- 以下の工程を含む、NS2/3プロテアーゼを含むサンプルにおいて、NS2/3自己切断阻害活性について候補化合物をスクリーニングするためのアッセイ法:
a)NS2/3プロテアーゼを含む第一のサンプルを、NS2/3プロテアーゼの少なくとも一部分が自己切断してNS3プロテアーゼ生成物を生じる条件に供する工程;
b)NS2/3プロテアーゼを含む第二のサンプルを、候補化合物の存在下、工程a)の条件と同じ条件に供する工程;
c)第一及び第二のサンプルの各々を十分量のNS4A補助因子と、ラウリルジエチルアミンオキシド(LDAO)及びn-ドデシル-β-D-マルトシド(DM)から成る群から選択される適切な界面活性剤及び適切なNS3-基質の存在下、NS3プロテアーゼ生成物がNS3-基質の切断を触媒してNS3-基質副生成物を生じさせるために十分な時間インキュベートする工程;
d)第一及び第二のサンプルの各々で生成されたNS3-基質副生成物の量を決定しする工程、ここで、第一のサンプルで生成されたNS3-基質副生成物の量と比較して第二のサンプルで生成されたNS3-基質副生成物の量が低下した場合、前記候補化合物がNS2/3自己切断活性の阻害物質でありえることを示す。
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