JP2009505981A

JP2009505981A - 特異的に保護された直交ランチオニン技術

Info

Publication number: JP2009505981A
Application number: JP2008526260A
Authority: JP
Inventors: ヒルマン，ジェフリー，ディー．; オラガンティ，ラヴィ，エス．; スミス，ジェイムズ，リーフ
Original assignee: オラジェニックス，インコーポレイテッド
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2026-08-11
Also published as: CA2618066A1; AU2006279749A1; HK1112925A1; US7521529B2; NZ566546A; JP4955001B2; WO2007022012A3; DK1915389T3; EP1915389B1; ATE512158T1; EP1915389A2; WO2007022012A2; US20070037963A1; AU2006279749B2

Abstract

本発明は、少なくとも１つの分子内架橋を含む分子内架橋ポリペプチドの合成法を提供する。本発明は、さらに、２つの分子内架橋を含む分子内架橋ポリペプチドの合成法であって、２つの分子内架橋が重なり合う環、連続する２つの環、または２つの埋め込まれている環の形成法を提供する。本発明は、また、ナイシンＡを含むランチビオティックの合成法を提供する。さらに、本発明は、本明細書に開示された方法によって合成される分子内架橋ポリペプチド、および特異的に保護された直交ランチオニンを提供する。

Description

関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、２００５年８月１２日に出願された米国特許出願第６０／７０８，０８６号、および２００６年５月２６日に出願された米国特許出願第６０／８０８，９０７号に基づく優先権を主張し、これらは両方ともその全体を参照として本明細書に組み入れられる。

抗生物質の開発は、２０世紀後半の医療活動に革命を起こした。この期間に、感染病による死亡率は顕著に減少した（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇｅｔａｌ．，（１９９９）ＰＡＭＡ．２８１，６１−６６）。しかし、感染病に由来する死は、抗生物質耐性病原体の増加に並行して、着実に上昇している。多種多様の医学的に重要な細菌は、臨床感染の治療において通常用いられる抗生物質に対する耐性が上昇しつつある。この現象を実証する何千もの報告および書籍が、過去２０年間の文献にある（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇｅｔａｌ．，（１９９９）ＰＡＭＡ．２８１，６１−６６；Ｄｅｓｓｅｎｅｔａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓＩｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．１，１１−１６；Ｒａｐｐ（２０００）ＳｕｒｇＩｎｆｅｃｔ（Ｌａｒｃｈｍｔ）．１，３９−４７；Ｂｅｎｉｎ＆Ｄｏｗｅｌｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｕｓｅｏｆａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｇｅｎｔｓ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。

抗生物質のより適切な使用を教示する必要があるが、さらに重要なことは、新規の抗生物質が必要とされているということである。バンコマイシンは、多くの重篤な細菌感染に対する最後の砦と考えられている。病原菌のバンコマイシン耐性株の発見は驚くべきことであり、それは、現在利用可能な薬剤で治療できない多剤耐性病原体の発生の前兆となる。新規な抗生物質がすぐに開発されない場合、事実上プレ抗生物質時代まで戻る可能性がある。

ランチビオティック（クラスＩバクテリオシン）と呼ばれる、小さい、構造的に新規なクラスの抗生物質があり、これはそれらの化学および生合成の相違に基づいて、５つのサブクラス、タイプＡ（Ｉ）、タイプＡ（ＩＩ）、タイプＢ、２成分および構造が知られていないものに分類することができる。このクラスの抗生物質は数十年間知られているが、多くのランチビオティックは、強力かつ広範囲の活性を、特にグラム陽性菌に対して有することが知られているにも関わらず、感染病の治療における潜在的有用性については広範に試験されていない。この主な理由は、これらの分子の試験および商品化を可能にするために十分な費用効率の高い量を得ることが一般に困難なためである。

ナイシンＡ（図１）は、ランチビオティック、およびランチビオティックに関連する化学的複雑性の数およびタイプの好例を提供する。ランチビオティックは含硫アミノ酸、ランチオニン（Ｌａｎ、ａｌａ−Ｓ−ａｌａ）、および、しばしば３−メチルランチオニン（Ｍｅｌａｎ、ａｂｕ−Ｓ−ａｌａ）を豊富に含む。Ｌａｎはアラニン残基からなり、これはチオエーテル結合により結合して、生物活性に重要である環構造を形成する。典型的には、ランチビオティック上にこのような環が３〜５あり、多くの環はしばしば、互いに重なり合う。ＬａｎおよびＭｅＬａｎは、常にメソ−立体化学を有すると考えられている。ＬａｎおよびＭｅＬａｎ残基に加え、２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）、２，３−ジデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）、Ｓ−アミノビニル−Ｄ−システイン（ＡｖｉＣｙｓ）およびＳ−アミノ−Ｄ−メチルシステイン等の不飽和ランチオニン誘導体、ならびにＤ−アラニン、２−オキソプロピオニル、２−オキソブチリルおよびヒドロキシプロピオニル残基等の、他の翻訳後修飾アミノ酸（図２）があってもよい。ナイシンＡのケースのように、ＬａｎおよびＭｅＬａｎにより生成された環構造は重なり合っていてもよく（例えば、環ＤおよびＥ）、これはさらに分子に複雑性を加えている。

グラム陽性菌は公知のランチビオティックの生合成に関与している。それらは、リボソームで合成されたプレプロペプチド上で作用する連続的な一連の酵素段階を用いて分子を成熟させる。修飾酵素のコードに関与する遺伝子は、典型的には８〜１０ＫｂのＤＮＡ断片上にクラスター形成され、染色体、プラスミドまたはトランスポゾンの一部として存在する。タイプＡ（Ｉ）のランチビオティックにおいては、ｌａｎＡ遺伝子によりコードされるリボソームで合成されるプレペプチド中の全てのセリンおよびスレオニン残基が、ｌａｎＢ遺伝子によってコードされる酵素によって脱水され、これらの脱水されたアミノ酸は、分子のカルボキシル末端に向かってより近い位置の隣接するシステイン残基とのチオエーテル結合の形成に関与する。この反応は、ｌａｎＣ遺伝子によって発現するタンパク質によって触媒される。エピデルミンおよびミュータシン１１４０等の特定のランチビオティックの場合には、Ｃ−末端のシステインはｌａｎＤ遺伝子によって発現する酵素によってカルボキシル基が除去され、Ｓ−アミノビニル−Ｄ−システインに変換される。ｌａｎＴ遺伝子の生成物による細胞外輸送の後、修飾プレプロペプチドのリーダー配列がｌａｎＰによってコードされる細胞外プロテアーゼによって開裂され、成熟した抗生物質が生成する（Ｒａｅｔａｌ．，（１９９６）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−Ｕｋ．１４２，１２８１−１２８８；Ｋｕｐｋｅ＆Ｇｏｔｚ（１９９６）ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６９，１３９−１５０；Ｋｕｉｐｅｒｓｅｔａｌ．，（１９９６）ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６９，１６１−１６９）。

十分な量または十分な純度でランチビオティックを得るのが難しいことが、治療用途における潜在的有用性を研究する試みの妨げとなっていた。今までに特徴づけられた約４０のランチビオティック（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅｅｔａｌ．，（２００５）ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ．１０５，６３３６８３）のうち、乳連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）によって生成されるタイプＡ（Ｉ）のランチビオティックであるナイシンＡのみが商業量で生成され、過去５０年間、食品防腐剤としての広い用途が見出されてきた。有意な耐性発現のない、ナイシンＡの長期にわたる広範な使用（ＤｅｌｖｅｓＢｒｏｕｇｈｔｏｎｅｔａｌ．，（１９９６）ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６９，１９３−２０２）は、種々の用途のためのさらなるランチビオティックの開発に大きな弾みをつけた。

長年にわたり改良されてきた発酵工程を用いて、ナイシンＡは大量生産される。ナイシンＡの精製プロトコールは、最近、米国特許（ＵＳＰＡ２００４／００７２３３３）として出願された。このプロトコールは、高価なプロテアーゼカクテル、それに続くカラムクロマトグラフィーを用いた。しかし、ナイシンＡ精製のための商業的に実現可能な方法は公表されていない。これは、治療用途のための純粋なナイシンＡおよび他のランチビオティックの適切な生成方法を見出すことに目下の関心が集まっていることを証明する。

種々の潜在的オプションが、ランチビオティックの大量生産のために存在する。材料費の観点から、発酵工程は、議論の余地なく最良の方法である。多くのランチビオティックを発酵させる最近の方法は、１リットルあたりμｇの量で生産するが、薬剤開発のためには十分ではない。

また、ランチビオティック修飾機構を用いたインビトロ生産が、タイプＡ（Ｉ）のランチビオティックにおいて探索された（Ｋｕｐｋｅ＆Ｇｏｔｚ（１９９６）ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６９，３９−１５０；Ｋｕｉｐｅｒｓｅｔａｌ．，（１９９６）ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６９，１６１−１６９）。ＬａｎＤを除いて、ランチビオティックプレプロペプチドの翻訳後修飾に関与する酵素は、無細胞溶解物において、または精製された物質としては活性がない（Ｋｕｐｋｅ＆Ｇｏｔｚ（１９９６）ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６９，１３９−１５０；１０；Ｋｕｐｋｅ＆Ｇｏｔｚ（１９９７）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７２，４７５９−４７６２；Ｋｕｐｋｅｅｔａｌ．，（１９９２）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１７４，５３５４−５３６１；Ｋｕｐｋｅｅｔａｌ．，（１９９３）ＦｅｍｓＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ．１１２，４３−４８；Ｋｕｐｋｅｅｔａｌ．，（１９９５）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７０，１１２８２−１１２８９；Ｋｕｐｋｅｅｔａｌ．，（１９９４）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６９，５６５３−５６５９）。タイプＡ（ＩＩ）のランチビオティックの場合は、ラクチシン４８１のインビトロ合成が可能であることがＳｃｉｅｎｃｅに最近報告されている。このグループおよびタイプＢのランチビオティックに属する分子は、Ｄｈａ、Ｄｈｂ、Ｌａｎ、およびＭｅＬａｎ残基を形成するために、１つのマルチヘッド酵素、ＬａｎＭのみを用いる（Ｘｉｅｅｔａｌ．，（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０３，６７９−６８１）。ラクチシン４８１の生合成に関する報告は、収量および純度に関する詳細な情報を全く提供しなかったが、それらの仕事はナノグラムスケールで実施された。この報告に開示されている進展は小さいが有意義な前進を意味し、これが賞賛を持って広く受け入れられたことは、治療薬としてランチビオティックを緊急に開発する必要性をさらに示している。

ランチビオティックを商業規模で生産するための、適当な発現ベクターにクローニングされたｌaｎ遺伝子クラスターおよび非感受性宿主を用いる第三の選択肢は、システムの複雑さが原因ではないと思われ、関与する種々の遺伝子を異なるように調節する必要があると考えられる。ガリデルミン用のｌaｎ遺伝子クラスターは、この特定のランチビオティックの生産を向上するために、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）中へクローニングされた。しかし、遺伝子の調節部位が種によって異なることが知られていることから、この戦略によって収率が大幅に増すことはなく、全てのランチビオティックに適してはいない。関連するアプローチは、大腸菌（Ｅｓｃｈｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中へクローニングされたミュータシン１１４０についての人工遺伝子を用いた。この人工遺伝子では、チオエーテル結合の形成に関与するセリンおよびスレオニン残基のための天然のコドンをシステインコドンに置換した。この修飾遺伝子はｐＥＴ３２にクローニングされ、ジスルフィド結合を最大にするために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＯｒｉｇａｍｉ株中で発現させた。ジスルフィド基から１つのイオウ原子を押しだし、それによりチオエーテルに変換するための新規な化学的方法が開発された。一般に、この方法は実現可能ではあるが、ジスルフィド結合の組み合わせが多く、活性型を非活性異性体から分離することが困難であるため、得られる収率は低い。

しばしば重なり合う環構造は、ナイシンＡおよび他のランチビオティックの生物活性に重要だが、合成的に克服するのが難しい。インビトロ合成法が、生物活性ペプチドを含む種々のランチオニンおよびランチビオティック合成のために広く研究されてきた。ランチビオティック合成という挑戦は骨の折れるものであり、今までのところ、総合的な合成方法は開発されていない。ランチオニン合成のいくつかの方法は文献に報告されている。これらは、塩基のまたは求核の条件を用いて、構築済みのペプチド中のシスチン単位をインサイチューで脱硫することを含む（Ｇａｌａｎｄｅｅｔａｌ．，（２００３）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（ＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ）７１，５４３−５５１；Ｇａｌａｎｄｅ＆Ｓｐａｔｏｌａ（２００１）ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ．８，２４７−２５１）。脱硫法は、ジアステレオ選択性の欠如および低収率のため、商業的には実現可能ではない。また、予め形成されたペプチド中にＤｈａ残基を生成し、続いてマイケル付加反応によりランチオニン環を形成する生体模倣法も用いられた。ペプチドの予備的構築は、おそらくジアステレオ選択的なマイケル付加をもたらす（Ｂｕｒａｇｅｅｔａｌ．，（２０００）ＣｈｅｍｉｓｔｒｙＡＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ．６，１４５５−１４６６）。直交的に保護されたランチオニンを含む直鎖ペプチドを合成し、環化し、環状ペプチド生成物を開裂する、オキシム樹脂上でのペプチド環化も用いられている（Ｍｅｌａｃｉｎｉｅｔａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０，２２５２−２２５８；Ｏｓａｐａｙｅｔａｌ．，（１９９７）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．４０，２４４１−２２５１）。こうした方法は前途有望であるが、重なり合うチオエーテル環を有するランチビオティックを生成することはできない。大半の既知のランチビオティックが重なり合う環を含むことを考慮すれば、このことは特に重要となる。

概念的に、生物学的アプローチおよび生物模倣法に関連する固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法の修飾を含む、インビトロ合成法を開発する明らかな利点がある。第一に、分子組成物は生理学的なアミノ酸の正常なセットに限定されない。アミノ酸類似体の設計が可能であり、確立されている固相合成法を用いてそれを組み込むことができる。また、平行合成を加えることができ、これにより、劇的に候補基質数を増加させる。この方法はもっぱらインビトロで実施され、生物活性分子のインビボ合成から生じる多くの懸念は払拭される。例えば、発酵中の生産物の分解も、生産微生物における生物活性分子の細胞毒性も問題にならない。

インビトロ合成という目的を達成するため、潜在的に適切な保護基を有する直交ランチオニンが、予め形成されたＤｈａへのシステインのマイケル付加等の種々のアプローチを用いて、ＳＰＰＳに合わせて設計されている（Ｐｒｏｂｅｒｔｅｔａｌ．，（１９９６）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ．３７，１１０１−１１０４）。この方法はジアステレオマーの１：１混合物をもたらし、それ故、商業的価値がないことがわｋった。保護システインによるセリンラクトンの開環も報告されているが、これはランチオニンおよびチオエステルの混合物をもたらす。アジリジンの開環が研究されてきたが、これはαおよびβ部位におけるアジリジンの開環によるレジオ異性体混合物を生産すると思われる（Ｄｕｇａｖｅ＆Ｍｅｎｅｚ（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ−Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ．８，１４５３−１４６５；Ｓｗａｌｉｅｔａｌ．，（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．５８，９１０１−９１０９）。最近の報告は、保護β−ブロモアラニンを用いて、適切に保護されたシステインをアルキル化することによりランチオニンを合成しうることを示唆するが、この方法では重なり合う環を有する分子は構築できない（Ｚｈｕ（２００３）ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０，４０６２−４０７２）。

市販のＳＰＰＳのＦｍｏｃ／Ｂｏｃ保護類似体は、合成ランチビオティックおよび他の立体配座制限生物活性ペプチドの課題を解決するのに十分ではないため、当該技術分野には、複数の環構造、および重なり合う構造を有する本質的な環構造を形成する、分子内架橋を有するペプチド合成が必要とされている。特に、大規模なランチビオティック合成のためのインビトロ法が必要である。

従って、本発明は、下記工程を含む、少なくとも１つの分子内架橋を含む、分子内架橋したポリペプチドの合成法を提供する。
ａ）下記式
（式中、Ｌ^ｎは共有結合したアミノ酸側鎖を表し、Ｄ、ＥおよびＧは、それぞれが異なる反応条件下で選択的に除去される保護基であり、保護基Ｄを除去するための反応条件は、ポリペプチド鎖の残りのアミノ酸のアミノ保護基を除去するための反応条件とは異なる）
で表される、特異的に保護された直交分子内架橋のフリーのカルボキシ末端を、固相担体、または任意に固相担体に結合していてもよいアミノ酸またはポリペプチドのフリーのアミノ末端に結合させる工程、
ｂ）保護基Ｅを除去してフリーのアミノ末端を形成する工程、
ｃ）フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで、アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を得る工程、
ｄ）任意にｃ）を１回以上繰り返す工程、
ｅ）保護基Ｇを除去してフリーのカルボキシ末端を形成する工程、
ｆ）ｅ）のフリーのカルボキシ末端をフリーのアミノ末端に結合する工程、
ｇ）保護基Ｄを除去してフリーのアミノ末端を形成する工程、および
ｈ）任意に、フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いでアミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を得る工程、および
ｉ）任意にｈ）を１回以上繰り返す工程。

本発明は、さらに、下記工程を含む、２つの重なり合う分子内架橋を含む、分子内架橋ポリペプチドの合成法を提供する。
ａ）下記式
（式中、Ｌ^ｎは共有結合したアミノ酸側鎖を表し、Ｄ、ＥおよびＧは、それぞれが異なる反応条件下で選択的に除去される保護基であり、保護基Ｄを除去するための反応条件は、ポリペプチド鎖の残りのアミノ酸のアミノ保護基を除去するための反応条件とは異なる）
で表される、第一の特異的に保護された直交分子内架橋のフリーのカルボキシ末端を、
固相担体、または固相担体に場合により結合するアミノ酸またはポリペプチドのフリーのアミノ末端に共有結合させる工程、
ｂ）保護基Ｅを除去してフリーのアミノ末端を形成する工程、
ｃ）フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで、アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を得る工程、
ｄ）任意にｃ）を１回以上繰り返す工程、
ｅ）下記式
（式中、Ｌ^ｎは前述の通りであり、Ｍ、ＱおよびＴは、それぞれが異なる反応条件下で選択的に除去される保護基であり、ＤおよびＭは異なる条件下でのみ除去され、ＧおよびＴは異なる条件下でのみ除去され、保護基Ｍを除去するための反応条件は、ポリペプチド鎖の残りのアミノ酸のアミノ保護基を除去するための反応条件とは異なり、ＥおよびＱは、Ｄを除去する反応条件およびＭを除去する条件とは異なる条件下で除去される）
で表わされる、第二の特異的に保護された直交分子内架橋のフリーのカルボキシ末端を、フリーのアミノ末端に共有結合させる工程、
ｆ）保護基Ｑを除去してフリーのアミノ末端を形成する工程、
ｇ）任意に、フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いでアミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を得る工程、
ｈ）任意にｇ）を１回以上繰り返す工程、
ｉ）第一の特異的に保護された直交分子内架橋の保護基Ｇを除去してフリーのカルボキシ末端を形成する工程、
ｊ）フリーのカルボキシ末端をフリーのアミノ末端に結合する工程、
ｋ）第一の特異的に保護された直交分子内架橋の保護基Ｄを除去してフリーのアミノ末端を形成する工程、
ｌ）任意に、フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いでアミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を得る工程、
ｍ）任意にｌ）を１回以上繰り返す工程、
ｎ）第二の特異的に保護された直交分子内架橋の保護基Ｔを除去してフリーのカルボキシ末端を形成する工程、
ｏ）フリーのカルボキシ末端をフリーのアミノ末端に結合する工程、
ｐ）第二の特異的に保護された直交分子内架橋の保護基Ｍを除去してフリーのアミノ末端を形成する工程、
ｑ）任意に、フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いでアミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を得る工程、および
ｒ）任意にｑ）を１回以上繰り返す工程。

さらに、本発明は、２つの分子内架橋を含む分子内架橋したポリペプチドの合成法であって、２つの分子内架橋が、本明細書に定義されるように、連続して２つの環を形成する方法、または２つの埋め込み環を形成する方法を提供する。本発明は、さらに、ナイシンＡを含むランチビオティックの合成法を提供する。

他の態様においては、本発明は、本明細書に開示された方法で合成された、分子内架橋したポリペプチドを提供する。

さらなる態様においては、本発明は、下記式
（式中、ＤおよびＥは異なる保護基であり、例えば、Ｆｍｏｃ、ＡｌｌｏｃまたはＩｖＤｄｅであり、Ｇは保護基であり、例えば、プロパルギルエステルまたはベンジルエステルである）
で表わされる、特異的に保護された直交分子架橋のランチオニンを提供する。

固相ペプチド合成のための特異的に保護された直交ランチオニン技術（ＤＰＯＬＴ）が本明細書に開示される。この技術は、その活性カルボキシルおよびアミノ保護基が特異的に除去される、種々の直交保護ペプチド架橋の大量生産に依存する。直交保護ペプチド架橋を、例えば固相ペプチド合成において用いて、分子内架橋形成環構造を含む、立体配座制限生物活性ペプチドを生成することができる。特に、ＤＰＯＬＴを用いて、２以上の分子内架橋を有し、重なり合う環構造を有するポリペプチドを合成することができる。

限定されるものではないが、ＤＰＯＬＴは、複雑な構造を有するランチビオティック（重なり合う環構造を含む）を商業的に実現可能な方法でインビトロで生成することを可能にする。ランチビオティックペプチドの合成は、例えば、通常の固相ペプチド合成法を用いて、特異的に除去することができる保護基でその活性カルボキシルおよびアミノ基が直交的に保護されているランチオニン類似体をペプチドに取り込むことにより実施される。この方法は、例えば、治療用途のための新規な抗生物質を定常的に提供することを可能にする。

略語
本明細書で用いられる場合、以下の略語は以下の意味を有する。
Ａｌｌｏｃ＝アリルオキシカルボニル
Ｂｏｃ＝ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＭＡＰ＝ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＭＢＣ＝異核多重結合相関
ＨＭＱＣ＝異核多重量子相関
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー
ｉｖＤｄｅ＝１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソ−シクロヘキシリデン）−３−メチル−ブチル
ＬＣ−ＭＳ＝液体クロマトグラフィー−質量分析
ＭＳ＝質量分析
ＮＭＲ＝核磁気共鳴スペクトロスコピー
ＮＯＥＳＹ＝核オーバーハウザー効果スペクトロスコピー
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＴＯＣＳＹ＝全相関分光法

分子内架橋ポリペプチド
本明細書に開示される方法は、ランチビオティックを含むがこれらに限定されない、分子内架橋ポリペプチドを合成するために用いることができる。本明細書で用いられる場合、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」は、アミノ結合により結合したアミノ酸モノマーの鎖を含むポリマーを意味する。ポリペプチドは、１つのアミノ酸のα−炭素カルボキシル基と他のアミノ酸のアミノ基との縮合またはカップリング反応によって形成できる。そのため、鎖の１つの末端（アミノ末端）における末端アミノ酸はフリーのアミノ基を有するが、鎖のもう１つの末端（カルボキシ末端）における末端アミノ酸はフリーのカルボキシル基を有する。本発明の分子内架橋ポリペプチドは、任意に、アミノおよび／またはカルボキシ末端を含む種々の官能基または保護基によって、修飾または保護される。

本明細書で用いられる場合、用語「分子内架橋ペプチド」または「分子内架橋ポリペプチド」は、少なくとも１つの分子内架橋を有するペプチド鎖を意味する。本明細書で用いられる場合、用語「分子内架橋」、「ペプチド架橋」、「分子内架橋部分」または「架橋」は、１つのペプチド鎖中に含まれるか、または１つのペプチド鎖中に取り込ませるために用意される２つのアミノ酸残基が、それらの側鎖を通じて相互に共有結合している場合に形成される構造を意味する。このような結合は内部架橋ポリペプチドを生成する。本明細書で用いられる場合、用語「環」または「環構造」は、分子内架橋したポリペプチドの架橋部分、すなわち、共有結合した２つのアミノ酸残基およびこれらの間のポリペプチド鎖、ならびにそれらの側鎖によって形成される共有結合を含む構造を意味する。

本発明の分子内架橋ペプチドは一般式
（式中、ＡはＨまたはアミノ末端保護基であり、ＺはＨまたはカルボキシ末端保護基であり、Ｘ^ｎは共有結合、１つのアミノ酸、または少なくとも２アミノ酸長のペプチド鎖であり、Ｒ^ｎは、その側鎖を通して分子内架橋を形成するアミノ酸残基である）
を有する。１つの「Ｘ」ペプチド鎖中の側鎖、または異なる「Ｘ」ペプチド鎖中に位置するアミノ酸の間に、さらに分子内架橋があってもよい。

本明細書で用いられる場合、用語「アミノ末端保護基」および「カルボキシ末端保護基」は、反応部位に付加することができ、かつ任意に反応部位本発明においては、それぞれアミノ基およびカルボキシ基）から除去することができ、反応部位以外の部位で化学物質を操作することを可能とする任意の化学部分を意味する。

本発明の分子内架橋ポリペプチドのアミノ酸には、２０種の天然に生ずるアミノ酸、ならびに非天然アミノ酸、アミノ酸類似体およびペプチド模倣薬が含まれてもよい（Ｓｐａｔｏｌａ，（１９８３）ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄ．，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐ．２６７）。本発明において用いられるアミノ酸はすべて、Ｄ−またはＬ−光学異性体のいずれであってもよい。好適な実施形態においては、本発明の分子内架橋ポリペプチドには、任意の組み合わせで以下の残基の１つ以上が含まれる：２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）、（Ｚ）−２，３−ジデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）、ヒドロキシプロピオニル、２−オキソブチリル、および２−オキソプロピオニル（図２参照）。

本発明の分子内架橋ペプチドが、２以上の分子内架橋を有し、広範囲の可能な構造を形成しうることが当業者によって理解されるだろう。例えば、２つの分子内架橋を含む分子内架橋ポリペプチドについては、分子内架橋は、以下に示すように、連続型、埋め込み型または重なり合い型であってもよい。

２つの分子内架橋が重なり合っている場合、これは第二の分子内架橋の１つのアミノ酸が、一次アミノ酸配列において、第一の分子内架橋の２つのアミノ酸の間にあり、第二の分子内架橋のもう１つのアミノ酸が、第一の分子内架橋の両方のアミノ酸の前または後ろのいずれかにあることを意味する。２つの分子内架橋が連続している場合、これは第二の分子内架橋の両方のアミノ酸が、一次アミノ酸配列において、第一の分子内架橋の両方のアミノ酸の前または後ろにあることを意味する。２つの分子内架橋が埋め込まれている場合、これは第二の分子内架橋の両方のアミノ酸が、一次アミノ酸配列において、第一の分子内架橋の２つのアミノ酸の間にあることを意味する。

分子内架橋ペプチドが３つ以上の分子内架橋を有する場合、より多くの可能な構造が形成され得る。例えば、複数の重なり合う環が存在し得る。非限定的な具体例において、分子内架橋ポリペプチドは５つの分子内架橋を有してもよく、５つの架橋のうち２つが重なり合う環構造を形成し、残りの３つの架橋が、互いに連続し、環と重なり合っている。ランチビオティックナイシンＡはこのような構造を表す（図１参照）。

好適な実施形態においては、本発明の分子内架橋ポリペプチドはランチビオティックペプチドである。さらに好適な実施形態においては、本発明の分子内架橋ポリペプチドはナイシンＡおよびその類似体である。

特異的に保護される直交分子内架橋
本発明の直交的に保護される分子内架橋は以下の一般式
（式中、Ｌは共有結合アミノ酸側鎖を表し、ＤおよびＥは水素またはアミノ末端保護基であり、ＧおよびＪは水素またはカルボキシ末端保護基である）
を有する。

アミノ酸側鎖を含む結合は、チオエーテル、ジスルフィド、アミドまたはエーテルであってもよいが、これらに限定されない。好適な実施形態においては、分子内架橋はチオエーテル結合を含む。

ポリペプチド合成における「特異的に保護された」または「直交的に保護された」分子内架橋の取り込みは、他の分子内架橋を含むペプチド鎖の他の部分の保護基の除去とは別に、その保護基の選択的な除去をもたらす。言い換えれば、特定の分子内架橋の保護基は、その開裂条件がポリペプチドの他の保護基または官能基の安定性を妨害することがないように選択される。これらの基の脱保護中の交差反応性は最小であり、標準的な質量分析技術によって監視できる。所望の生成物は、それらの不純物から、標準的なＨＰＬＣまたは他の技術によって精製することができる。開裂は、任意の選択された優先順位で行うことができる。

保護基、および保護基を導入および除去する方法は、例えば、“ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，”ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎ．Ｙ．１９７３および“ＭｅｔｈｏｄｅｎｄｅｒｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎＣｈｅｍｉｅ，”Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ，４ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１５／１，Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ１９７４およびＴｈｅｏｄｏｒａＷ．Ｇｒｅｅｎｅ，“ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，”ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ１９８１に開示されている。多くの保護基の特徴は、容易に除去できること、すなわち、望ましくない二次反応の発生なく、例えば、溶媒分解、還元、光分解により、有機パラジウムおよび有機コバルト触媒等の有機金属触媒の使用により、または生理的条件下で実施できることである。

当該技術分野において多数の保護基が知られている。実例となる、非限定的な保護基のリストとしては、メチル、ホルミル、エチル、アセチル、ｔ−ブチル、アニシル、ベンジル、トリフルオロアセチル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンゾイル、４−メチルベンジル、チオアニジル、チオクレジル、ベンジルオキシメチル、４−ニトロフェニル、ベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンゾイル、２−ニトロフェニルスルフェニル、４−トルエンスルホニル、ペンタフルオロフェニル、ジフェニルメチル、２−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４，５−トリクロロフェニル、２−ブロモベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、および２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロマン−６−スルホニルが挙げられる。種々の異なるタイプのアミノ保護基およびカルボキシ保護基については、例えば、米国特許第５，２２１，７６３号(１９９３年６月２２日発行)、米国特許第５，２５６，５４９号(１９９３年１０月２６日発行)、米国特許第５，０４９，６５６号(１９９１年９月１７日発行)、および米国特許第５，５２１，１８４号(１９９６年５月２８日発行)を参照。

標的の分子内架橋ポリペプチドの合成中に選択的に除去できる保護基であれば、保護基のどのような組み合わせをも用いることができる。好適な実施形態においては、アミノ末端保護基は、Ｆｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、およびＩｖＤｄｅからなる群から選択される。他の好適な実施形態においては、カルボキシ末端保護基は、プロパルギルエステルおよびベンジルエステルからなる群から選択される。

好適な実施形態においては、直交的に保護される分子内架橋は、直交的に保護されるランチオニンまたはランチオニン誘導体である。さらに好適な実施形態においては、直交的に保護される分子内架橋は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端保護ランチオニン（Ｌａｎ）、β−メチルランチオニン（ＭｅＬａｎ）、Ｓ−［（Ｚ）−２−アミノビニル］−Ｄ−システイン（ＡｖｉＣｙｓ）、またはＳ−［（Ｚ）−２−アミノビニル］−２−メチル−Ｄ−システインである（図２参照）。このような直交的に保護される分子内架橋は、当該技術分野における既知の方法で合成できる。

さらに好適な実施形態においては、分子内架橋はランチオニンである。保護ランチオニンは、通常の方法を用いて、図３に示すように逆合成的に合成できる。ランチオニン生成物の立体化学は、この段階で、適切なアミノ酸、例えばシステインおよびセリンの正確な立体異性体から開始することにより確認できる。

さらに好適な実施形態においては、分子内架橋は、ランチオニン１またはランチオニン２：
であり、これらは例えば、それぞれ図５および図６に概説するように合成できる。簡単には、図５を参照すると、ランチオニン１については、Ｄ−セリンをそのアミノ末端保護Ａｌｌｏｃ誘導体に変換し、次いで、カルボキシ末端保護プロパルギルエステルに変換する。Ｎ（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−セリンプロパルギルエステルをその対応するβ−ブロモアラニン誘導体に変換する。この変換は、例えば、Ｎ（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−セリンプロパルギルエステルをジクロロメタンに溶解し、この溶液を１当量の四臭化炭素およびトリフェニルホスフィンで処理することにより実施できる。この反応は非常に穏やかであり、ヒドロキシルを臭化物に変換するために通常用いられている（Ｚｈｕ（２００３）ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０，４０６２−４０７２）。あるいは、合成は、トルエンまたはジクロロメタン等の溶媒中で三臭化リンを用い、その後弱塩基性の後処理を行って、所望のＤ−β−ブロモアラニンを得る（Ｏｌａｈｅｔ．ａｌ．（１９８０）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｇａｎｉｃＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．４５，１６３８−１６３９）。他の方法も用いることができる。最終的に、β−ブロモアラニン誘導体は、適切なアルキル化条件下でＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓと反応させ、ランチオニン１を形成する。ランチオニン２は、図６に概説するように、同様に合成できる。

分子内架橋されたポリペプチドの合成
本発明の分子内架橋ポリペプチドは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）、溶液相ペプチド合成、天然の化学的連結、インテイン媒介タンパク質連結、および化学的連結またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない、直交的に保護される分子内架橋の使用および取り込みを与える任意の手段により合成できる。好適な実施形態においては、本発明の分子内架橋ポリペプチドは、標準的ＳＰＰＳの改良版により合成できる。本発明の分子内架橋ポリペプチドは、手動のＳＰＰＳによっても、市販の自動化ＳＰＰＳシンセサイザを用いることによっても合成できる。

ＳＰＰＳは、１９６０年代前半より当該技術分野において知られており（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４，１９６３）、広く用いられている。一般的アプローチにおいていくつか既知の変形がある（例えば、“ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”(c)１９９５ｂｙＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ３ａｎｄＷｈｉｔｅ（２００３）ＦｍｏｃＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＡｐｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄを参照）。簡単には、固相ペプチド合成において、所望のＣ−末端アミノ酸残基を固相に結合させる。ペプチド鎖に加えるべき次のアミノ酸を、そのアミノ末端においてＢｏｃ、Ｆｍｏｃ、または他の適切な保護基で保護し、そのカルボキシ末端を標準的なカップリング試薬で活性化する。担体に結合したアミノ酸のフリーのアミノ末端を、次のアミノ酸と反応させ、２つのアミノ酸を結合する。伸長しつつあるペプチド鎖のアミノ末端を脱保護し、所望のポリペプチドが完成するまでこの工程を繰り返す。

本発明の方法によれば、標準的ＳＰＰＳに、特異的に保護される直交分子内架橋を組み込むことにより、分子内架橋ペプチドを合成できる。分子内架橋の一部ではないポリペプチド鎖の部分は、当該技術分野で既知の標準的ＳＰＰＳ技術により合成できる。好適な実施形態においては、アミノ末端をＦｍｏｃ−またはＢｏｃ−保護したアミノ酸が用いられる。さらに好適な実施形態においては、Ｆｍｏｃ系のＳＰＰＳが用いられる。特異的に保護される直交分子内架橋は、その活性アミノおよびカルボキシ基の選択的脱保護により、ポリペプチド鎖中に取り込まれる。

本発明の方法は、一般式ＩＩＩ
（式中、Ａ、Ｘ^ｎ、およびＲ^ｎは式Ｉについて上で定義した通りである）
で表わされるような１つの分子内架橋を有する、分子内架橋ポリペプチドを合成するために用いることができる。このようなポリペプチドは、一般式ＩＶ
（式中、Ｌは共有結合アミノ酸側鎖を表し、ＤおよびＥはアミノ末端保護基であり、Ｇはカルボキシ末端保護基である）
で表わされる１つの分子内架橋を用いて生成される。

簡単には、分子内架橋は、そのフリーのカルボキシ末端を介して固相担体に結合したペプチド鎖に、または固相担体に直接結合される。さらなるアミノ酸を分子内架橋のフリーのアミノ末端に結合させ、次いでこれを脱保護する（Ｅの除去）。分子内架橋の残りのカルボキシ基の保護基（Ｇ）を除去し、カルボキシ基を、このように形成されたポリペプチド鎖のフリーのアミノ末端に結合させる。任意に、さらなるアミノ酸を順番に残りのアミノ基に加えてもよい。

本発明のポリペプチドの合成中、任意の時点で、伸長しつつあるペプチド鎖上に、唯一の「フリーのアミノ末端」、およびこの前記フリーのアミノ末端に結合させるべき１つの「フリーのカルボキシ末端」が存在する。アミノ酸が追加され、脱保護されるたびに、フリーのアミノ末端は、追加されたアミノ酸によって遮断され、次に新しく追加されたアミノ酸が脱保護されると、新しいフリーのアミノ末端が形成される。当業者は、こうした状況では、１つのアミノ末端のみが存在することを理解するだろう。

さらに具体的には、１つの分子内架橋を有する分子内架橋ポリペプチドの合成において、Ｄは、保護基Ｄの除去のための反応条件が、ＥまたはＧ、および／またはポリペプチド鎖の残りのアミノ酸のアミノ保護基の除去をもたらさないよう選択される。また、逆も適用される。言い換えると、非限定的な具体例として、Ｆｍｏｃ系のＳＰＰＳを用いてポリペプチドを合成する場合、Ｄは、Ｅ、Ｇおよび／またはＦｍｏｃを除去しない条件下で選択的に開裂することができるよう選択される。同様に、ＤおよびＧは、Ｆｍｏｃ除去のための条件がＤまたはＧの開裂をもたらさないように選択される。好適な実施形態において、アミノ保護基Ｅは、ポリペプチド鎖の、分子内架橋の一部ではないアミノ酸のアミノ保護基と同等である。従って、例えば、Ｆｍｏｃ系のＳＰＰＳが用いられる場合、Ｅは好ましくはＦｍｏｃである。

分子内架橋ポリペプチドの合成は、Ｃ−末端アミノ酸の固相担体への結合によって開始する。用語「固相担体」は、その上でポリペプチドが合成される任意の固相材料を意味する。固相担体は、「樹脂」、「固相」および「担体」等の用語を包含する。固相担体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、さらにそれらのコポリマーおよびグラフト等の有機ポリマーから構成することができる。固相担体は、また、ガラス、シリカ、多孔性ガラス（ＣＰＧ）、または容易な方法でアミノ酸が結合および開裂できる、適切な基を有する逆相シリカ等の無機物であってもよい。固相担体の立体配座は、ビーズ、球、粒子、顆粒、または表面であってもよい。表面は、平面、ほぼ平面、または非平面であってもよい。固相担体は多孔性または非孔性であってもよく、膨潤性または非膨潤性の特徴を有していてもよい。固相担体は、ウェル、くぼみまたは他の容器の形態に構成されていてもよい。複数の固相担体をアレイ状に構成してもよく、これは、ロボットによる試薬の送達のために、またはレーザー照射、および共焦点または偏向光収集による走査などの検出手段によりアドレス可能であってもよい。多数の固層担体が市販されている。最初のアミノ酸の固層担体への結合は、当該技術分野で既知の分析により、その完了を監視することができる。

好適な実施形態においては、Ｆｍｏｃアミノ酸を用いて、ポリペプチド鎖を合成する。Ｆｍｏｃアミノ酸は市販されているか、当該技術分野において既知の方法により合成できる。標準的なＳＰＰＳ法を用いて、追加のアミノ酸をポリペプチド鎖に追加できる。例えば、Ｆｍｏｃアミノ酸が用いられる場合、Ｃ末端アミノ酸のＦｍｏｃアミノ保護基は、樹脂に結合した後に、例えば、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンに暴露することによって除去できる。次のＦｍｏｃアミノ酸は、標準的カップリング化学を用いてポリペプチド鎖に結合できる。反応性側鎖を有するアミノ酸は、目的とする分子内架橋ポリペプチドの合成の間にその側鎖が保護されたままであるように、適切な保護基を用いて保護することができる。カップリングおよび脱保護の工程は、適切なアミノ酸を用いて所望のように繰り返してもよい。このことにより、一般式ＩＩＩのＸ^３の合成が完了する。

分子内架橋は、標準的カップリング化学により、伸長しつつあるポリペプチド鎖に結合させる。あるいは、分子内架橋が、分子内架橋ポリペプチドのＣ−末端に位置する場合、分子内架橋は、そのフリーのカルボキシ基を介して樹脂に直接結合できる。次いで、保護基Ｅを適切な条件下、例えば、ＥがＦｍｏｃである場合にはＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、選択的に除去する。一般式ＩＩＩを参照すると、まずＲ^２をポリペプチド鎖に結合させる。順次的な結合および脱保護により、１以上のアミノ酸が続いてポリペプチド鎖に追加され得る（一般式ＩＩＩのＸ^２）。

次に、適切な条件下で保護基Ｇを選択的に除去する。好適な実施形態において、Ｇは、ジクロロメタン中のジコバルトオクタカルボニルを用いて開裂できるプロパルギル基、またはジクロロメタン中の木炭上のパラジウムおよびシクロヘキサジエンを用いる水素化プロトコールを用いて開裂できるベンジルエステルのいずれかである。このことにより、一般式ＩＩＩのＲ^１の付加は完了し、それにより、分子内架橋がポリペプチド中に完全に組み込まれ、環構造が形成される。

次いで、適切な条件下で保護基Ｄを選択的に脱保護する。好適な実施形態において、Ｄは、ジクロロメタン中の２０ｍｏｌ％のＰｄ（ＰＰｈ_３）_４および２０〜２５当量のＰｈＳｉＨ_３を用いて開裂できるＡｌｌｏｃ、またはＤＭＦ中の２〜１０％ヒドラジンにより開裂できるｉｖＤｄｅである。次いで、分子内架橋ポリペプチドは連続的な結合および追加のアミノ酸（一般式ＩＩＩ中のＸ^１）の脱保護により、伸長することができる。

連続して複数の環を有する、すなわち２以上の分子内架橋を有する分子内架橋ポリペプチドは、１つの特異的に保護された分子内架橋を用いて同様に合成できる。任意に、その保護基のみが相互に異なる、特異的に保護された２以上の分子内架橋を用いて、複数の環を有するポリペプチドを合成することができる。その側鎖構造（例えば、ＬａｎおよびＭｅＬａｎ）において異なる複数の特異的に保護された分子内架橋を用いて、種々の分子内架橋部分を取り込むこともできる。このような、次の架橋における保護基は、ポリペプチド鎖に組み込まれた第一の分子内架橋における保護基と同一であっても異なってもよい。複数の環を連続して有する分子内架橋ポリペプチドは、第一の分子内架橋をポリペプチド鎖中に完全に組み込み、第一環構造を形成し、末端アミノ保護基を除去し、任意に追加のアミノ酸の順次の結合および脱保護によってポリペプチド鎖を伸長し、カルボキシ末端を介して第二の分子内架橋（第一の分子内架橋と同一または異なる）を完全に組み込み、任意にポリペプチドを伸長し、そして、所望によりこれらの工程を繰り返して標的の分子内架橋ポリペプチドを合成することにより、合成することができる。

重なり合っているか、または埋め込まれている複数の環を有する、分子内架橋ポリペプチドについては、２以上の直交的に保護された分子内架橋を用いる必要がある。複数の、直交的に保護される分子内架橋の側鎖構造は同一であっても異なってもよいが、保護基は、それぞれのアミノおよびカルボキシ基の選択的脱保護を可能にするために特異的に直交的に保護されなければならない。そのような架橋の数は、重なり合うかまたは埋め込まれた環の数により異なる。例えば、分子内架橋されたポリペプチドの２つの環が互いに重なり合う場合、または１つが他方に埋め込まれている場合には、２つの異なる選択的に保護された直交分子内架橋が用いられる。例えば、３つの環が互いに重なり合う場合、または互いに埋め込まれている場合、３つの異なる特異的に保護された直交分子内架橋が用いられる。

非限定的な具体例においては、目的とする分子内架橋ポリペプチドが２つの重なり合う環を有する場合、一般式ＶおよびＶＩ
（式中、Ｌ^１およびＬ^２は共有結合したアミノ酸側鎖（Ｌ^１はＬ^２と同一であっても異なっていてもよい）を表し、Ｄ、Ｍ、ＥおよびＱはアミノ末端保護基であり、ＧおよびＴはカルボキシ末端保護基であり、ＤおよびＭは異なる条件下でのみ開裂し、ＥおよびＱは同じ条件下で開裂してもよく、ＥおよびＱは、Ｄを開裂する条件およびＭを開裂する条件とは異なる条件下で開裂し、ＧおよびＴは異なる条件下でのみ開裂する）
で表わされる２つの特異的に保護された直交分子内架橋が用いられる。好適な実施形態においては、アミノ保護基ＥおよびＱは、分子内架橋の一部ではないポリペプチド鎖のアミノ酸のアミノ保護基と同等である。従って、例えば、Ｆｍｏｃ系のＳＰＰＳを用いる場合、ＥおよびＱは好ましくはＦｍｏｃであるが、これに限定されない。このような状況では、ＥおよびＱは、例えばＢｏｃであってもよい。

本発明の方法によれば、２つの重なり合う環を含む分子内架橋ポリペプチドは、まず、Ｃ−末端アミノ酸を固相担体に結合させることにより合成できる。追加のアミノ酸を、任意に、標準的なＳＰＰＳ法を用いてポリペプチド鎖に結合してもよい。好適な実施形態においては、ポリペプチド鎖の合成にはＦｍｏｃアミノ酸が用いられる。反応性側鎖を有するアミノ酸は、目的とする分子内架橋ポリペプチドの合成の間中、その側鎖が保護されたままであるように適切な保護基で保護される。所望により、適切なアミノ酸を用いて、結合および脱保護の工程を繰り返してもよい。次いで、一般式Ｖで表わされる分子内架橋を、そのフリーのカルボキシ基を介して伸長しつつあるペプチド鎖に結合し、次いでＥを開裂する。ＤおよびＧは影響を受けない。好適な実施形態において、ＥはＦｍｏｃである。次いで、任意に、標準的なＳＰＰＳに従って、結合および脱保護工程を繰り返すことにより、１つ以上のアミノ酸を順番にポリペプチドのフリーのアミノ末端に結合させることができる。次いで、一般式ＶＩで表わされる分子内架橋を、そのフリーのカルボキシ基を介して伸長しつつあるペプチドに結合し、次いでＱを開裂する。Ｄ、Ｇ、ＭおよびＴは影響を受けない。好適な実施形態において、ＱはＦｍｏｃである。再び、任意に、１つ以上のアミノ酸をポリペプチドのフリーのアミノ末端に順番に結合させてもよい。次いで、第一の環を形成するため適切な脱保護化学を用いてＧを開裂し、得られたフリーのカルボキシ基を、ポリペプチド鎖のフリーのアミノ末端に結合する。保護基Ｄ、ＭおよびＴは影響を受けない。次いで、保護基Ｄを適切な条件下で除去し、フリーのアミノ基を暴露する。Ｄの開裂中、保護基ＭおよびＴは影響を受けない。次いで、任意に、追加のアミノ酸をポリペプチドのＮ−末端のフリーのアミノ基に結合してもよい。第二の環を形成し、それによって重なり合う環を形成するためには、適切な条件下でＴを開裂し、得られたフリーのカルボキシ基をポリペプチド鎖のフリーのアミノ末端に結合させる。次いで、適切な条件下でＭを開裂し、追加のアミノ酸を順番に結合させることにより、ポリペプチド鎖をさらに伸長させることができる。

本発明の方法によれば、２つの埋め込まれた環を含む分子内架橋ポリペプチドは、一般式ＶおよびＶＩで表わされる２つの特異的に保護された直交分子内架橋を用いて同様に合成できる。２つの埋め込まれた環を含む分子内架橋ポリペプチドの合成は、２つの重なり合う環を含む分子内架橋ポリペプチドの合成と同様であるが、式ＶおよびＶＩで表わされる分子内架橋の脱保護および結合の順番においてのみ異なる。詳細には、式Ｖで表わされる分子内架橋は、そのカルボキシ末端を介して固相担体に結合したペプチド鎖のフリーのアミノ末端に結合させるか、または、式Ｖで表わされる分子内架橋を直接固相担体に結合させる。次いでＥを開裂し、次いで、標準的なＳＰＰＳに従って、結合および脱保護工程を繰り返すことにより、１つ以上のアミノ酸を順番にポリペプチドのフリーのアミノ末端に結合させることができる。次いで、一般式ＶＩで表わされる分子内架橋を、そのフリーのカルボキシ基を介して伸長しつつあるペプチド鎖に結合し、次いでＱを開裂する。再び、任意に、１つ以上のアミノ酸をポリペプチドのフリーのアミノ末端に順番に結合してもよい。第一の環を形成するためには、適切な脱保護化学を用いてＴを開裂し、得られたフリーのカルボキシ基をポリペプチド鎖のフリーのアミノ末端に結合する。次いで、適切な条件下で保護基Ｍを除去し、フリーのアミノ基を暴露させる。次いで、任意に追加のアミノ酸をポリペプチドのＮ−末端のフリーのアミノ基に結合させることができる。第二の環を形成し、それによって埋め込まれた環を形成するためには、適切な条件下でＧを開裂し、得られたフリーのカルボキシ基をポリペプチド鎖のフリーのアミノ末端に結合させる。次いで、適切な条件下で保護基Ｄを開裂し、追加のアミノ酸を順番に結合させることにより、ポリペプチド鎖をさらに伸長させることができる。

当業者は、さらに複雑な分子を前述の方法の変形によって同様に生成できることを認識するだろう。例えば、２つの重なり合う環および３つの追加の環を順番に有するポリペプチドは、重なり合う環を含む分子内架橋ポリペプチドの合成のために開示された方法と、連続した環を有する分子内架橋ポリペプチドの合成のために開示された方法とを組み合わせることによって合成できる。

分子内架橋ポリペプチドの合成の間、任意に、合成の進行および精度を、ＭａｌｄｉおよびＬＣ−ＭＳを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の種々の技術によって監視してもよい。合成が完了した後、分子内架橋ポリペプチドは、適切な環境下で固相担体から開裂される。合成ペプチドが相当量のイオウを含む場合（例えば、ランチオニンを含むポリペプチド）、ＴＦＡ／チオアニソール／水／フェノール／エタンジチオール（８２．５／５／５／５／２．５）カクテルを用いてもよい。開裂反応の進行は、ＬＣ−ＭＳまたは他の適切な技術によって周期的に監視してもよい。選択された側鎖保護基により、それらの開裂は樹脂からのポリペプチドの開裂の間に行ってもよく、または分離工程で行ってもよい。最終生成物は、例えば冷エーテルからの沈殿によって分離し、逆相ＨＰＬＣを含むがこれに限定されない既知の方法により精製できる。

本発明の分子内架橋ポリペプチドは、既知の技術によって、構造的におよび生化学的機能について解析できる。構造解析は、２次元ＮＭＲおよびＸ線結晶学を含むがこれらに限定されない技術によって実施できる。分子内架橋ポリペプチドは、６０ｍｓの混合時間にて獲得される２次元ＮＭＲＴＯＣＳＹ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｌｅｒ＆Ｅｒｎｓｔ（１９８３），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ５３，５２１−５２８）、および２００ｍｓ、４００ｍｓ、４５０ｍｓにて獲得されるＮＯＥＳＹ（Ｋｕｍａｒｅｔ．ａｌ．（１９８０），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９５，１−６．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｌ．（２００２）Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｌｏｒｉｄａ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ．Ｓｍｉｔｈｅｔ．ａｌ．（２０００），ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６７，６８１０−６８１６）を用いて構造的に首尾よく解析される。

好適な実施形態において、本発明の方法は、１以上のランチオニンまたはランチオニン誘導体を含む分子内架橋ポリペプチドの合成に用いられる。さらに好適な実施形態において、本発明の方法はランチビオティックの合成に用いられる。さらに好適な実施形態において、本発明の方法はナイシンＡおよびその類似体の合成に用いられる。

ナイシンＡおよびその類似体は、既知の方法（Ｈｉｌｌｍａｎｅｔａｌ．（１９８４），ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ４４，１４１−１４４；Ｈｉｌｌｍａｎｅｔ．ａｌ．（１９９８），ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｙ６６，２７４３−２７４９）を用いて生物学的活性を測定できる。本発明の方法によって合成されたナイシンＡおよびその類似体の構造解析は、先に、ＶａｎＤｅＹｅｎら（１９９１，ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０２，１１８１−１１８８）によりＮＭＲによって決定された、生物学的に生成されたナイシンＡの三次元構造との比較により補助することができる。この初期の共有結合の構造決定の作業から得られたアミノ酸配置から、本発明の方法によって合成されたナイシンＡおよびその類似体の構造決定のために共有結合を迅速に特徴づけ、全ての関連する長距離ＮＯＥを識別することが可能である。

ＤＰＯＬＴ技術の応用
ＤＰＯＬＴは、多くの専門分野にわたるアプローチから発生するプラットフォーム技術である。この技術を魅力のあるものにするいくつかの利点がある。第一に、その解析のための発酵および精製方法を工夫するために大量の時間および費用を供することなく、治療薬の領域における潜在用途についての相当数の候補ランチビオティックおよび他の生物活性ペプチドの急速な合成およびスクリーニングを可能にする。重なり合うチオエーテル架橋を含む約５０種のランチビオティックがあり、毎年さらに発見されており、これらは本明細書に開示される方法によって合成できる。これらのランチビオティックには、Ａ型（Ｉ）ランチビオティックナイシンＡ、ナイシンＺ、サブチリン、エリシンＳ、エリシンＡ、ストレプチン、エピデルミン、［Ｖａｌｌ−Ｌｅｕ６］−エピデルミン、ガリデルミン、ミュータシン１１４０、ミュータシンＢ−Ｎｙ２６６、ミュータシンＩＩＩ、ミュータシンＩ、Ｐｅｐ５、エピランシンＫ７、およびエピシジン２８０、Ａ型（ＩＩ）ランチビオティックラクチシン４８１、バリアシン、ミュータシンＩＩ、ストレプトコッキンＡ−Ｆ２２、サリバリシンＡ、［Ｌｙｓ２−Ｐｈｅ７］−サリバリシンＡ、プランタリシンＣ、サブランシン１６８、およびブチリビブリオシンＯＲ７９Ａ、Ｂ型ランチビオティックシンナマイシン、デュラマイシン、デュラマイシンＢ、デュラマイシンＣ、クラマイシンＣ、アンコベニン、メリサシジン、アクタガルジン、Ａｌａ（Ｏ）−アクタガルジン、およびサブチロシンＡ、二成分ランチビオティックラクチシン３１４７Ａｌ、ラクチシン３１４７Ａ２、スタフィロコッキンＣ５５α、スタフィロコッキンＣ５５β、プランタリシンＷα、プランタリシンＷβ、サイトリシンＬ_Ｌ、サイトリシンＬｓ；およびルミノコッキンＡ、カルノシンＵＩ４９、マセドシン、ボビシンＨＪ５０、ヌカシンＩＳＫ−１、およびＳａｐＢモルフォゲン等の他のランチビオティックが含まれる（例えば、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅｅｔａｌ．，２００５．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０５，６３３−８３を参照）。

過去の経験から、多くのランチビオティックを発酵および精製する多くの方法はすぐに実施されないと思われる。５０年以上前に発見されたナイシンＡは、治療薬としての開発のための急速かつ適切な精製方法を発見するため、精力的に研究されている。最近の米国特許出願（米国特許出願２００４／００７２３３３）はこの目的を達成することを試みているが、種々の高価なプロテアーゼおよび複数の精製工程を用いている。ＤＰＯＬＴによって用いられるＳＰＰＳ法は、費用効率のさらに高い方法で所望の目的を達成するようである。現在、オキシトシン、サンドスタチンおよびフューゼオン等のＳＰＰＳ法を用いて合成される３５種類以上の生物活性分子が市販されており、長期にわたる需要は確実に増えている。ＤＰＯＬＴの使用は、意図された目的のための新規かつ改良された治療薬を発見するための最適な方法を提供するコンビナトリアルライブラリアプローチであっても、アミノ酸およびそれらの類似体の部位特異的置換を可能にする。この点について、ＤＰＯＬＴは、重なり合う環を有する分子を合成する唯一存在する技術であり、種々の用途における使用のために、ランチビオティックに加え、種々の生物活性分子を生成する可能性を有する。ＤＰＯＬＴはインビトロ生成、例えば、通常の固相ペプチド合成法を用いて、商業的に実現可能な様式で生成される複雑な構造のランチビオティック（重なり合う環構造を有するものを含む）の生成を可能にする。

ＤＰＯＬＴは、市販用途の新規ランチビオティックのスクリーニングおよび開発において２つの重要な利点をもたらす。発酵アプローチは、生成のための材料費の観点から明らかに好ましいが、このような方法を最適化するのに必要な時間および労力は、薬剤の発見の初期段階においてひどく高い。さらに、ナイシンＡの場合のように、高収率発酵物の精製は容易に達成できない。最終生成物の精製は、通常、ＳＰＰＳにおいて重要な問題ではない。ＤＰＯＬＴは、臨床試験のために急速な方法で、多くの潜在的に有用な化合物のスクリーニングを可能にするという利点を有する。有望と思われる化合物に関して、ＤＰＯＬＴは市場投入を早くし、また、発酵法の開発のために必要な時間および労力を提供することにより供給することができるかもしれない。活性の幅があまり広くない、薬物動態に欠点がある、毒性問題がある等の、さらなる開発のために必要な特徴を欠く化合物に関しては、ＤＰＯＬＴは、これらの化合物を急速かつ効率的に考慮から除くこと可能にする。最終的に、ＤＰＯＬＴは固相ペプチド合成に依存するため、菌耐性を克服する等の改良特性を有する類似体のスクリーニングおよび開発は簡単であろう。従って、この方法は、目的とする他のランチビオティックおよびペプチドに応用し、機能的に好ましくかつ経済的に有利な特性を有するものを特定することができる。

ＤＰＯＬＴおよび本発明の方法によって合成されるランチビオティックについての最も順当な用途は、細菌感染の医学および獣医学的治療である。他にいくつか潜在用途もある。ランチビオティックは、食品保存および化粧品において用いるのに他の殺菌剤より定評ある魅力的な代替手段である（ＤｅｌｖｅｓＢｒｏｕｇｈｔｏｎｅｔａｌ．，（１９９６）ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６９，１９３−２０２；Ｒｏｌｌｅｍａｅｔａｌ．，（１９９５）ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６１，２８７３−２８７８；Ｌｉｕ＆Ｈａｎｓｅｎ，（１９９０）ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５６，２５５１−２５５８；Ｈｕｏｔｅｔａｌ．，（１９９６）ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２２，７６−７９；Ｄｅｌｖｅｓｂｒｏｕｇｈｔｏｎ，（１９９０）ＦｏｏｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４４，１００；Ｄｅｌｖｅｓｂｒｏｕｇｈｔｏｎ（１９９０）ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＳｏｃｉｅｔｙｏｆＤａｉｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．４３，７３−７６；Ｄｅｌｖｅｓｂｒｏｕｇｈｔｏｎｅｔａｌ．，（１９９２）ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．１５，１３３−１３６；Ｔｈｏｍａｓ＆Ｗｉｍｐｅｎｎｙ（１９９６）ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．６２，２００６−２０１２；Ｓａｈｌ＆Ｂｉｅｒｂａｕｍ（１９９８）ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５２，４１−７９）。さらに、ランチビオティックは、局所的な殺菌剤、特に口腔衛生を促進するためのマウスリンスとして研究され、ある程度成功している（Ｈｏｗｅｌｌｅｔａｌ．，（１９９３）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＰｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ．２０，３３５−３３９）。

ランチビオティック薬剤は大きな可能性を有しており、おそらく医学界で非常に好評であろう。抗生物質使用のための市場は高いままであり、感染病が存在する限り存在するが、変異および菌耐性のために、ほとんどの抗生物質の全体的なライフサイクルは短い。ランチビオティックのタイプの抗生物質の利点は、それらが細菌の適応に比較的耐性であるという折り紙付きの業績を有し、他の構成物質に耐性のある多くの病原菌に対して強力な殺菌作用を有することがわかっていることである。

本明細書の随所で参照された全ての特許、特許出願、および他の化学的または技術的文章は、全体として参考文献に組み入れられる。好適な実施形態の、現在代表的であるとして本明細書に開示された方法および組成物は、例示であって、本発明の範囲を限定するものとして意図されない。変形および他の用途は当業者に明らかであろう、本発明の精神に含まれる。本明細書に適切に例示して記載された本発明は、本明細書で特に開示されていない要素、限定のいずれかの非存在下で実施できる。従って、例えば、本明細書の各例においては、用語「含む」、「本質的に含む」および「から成る」は、慣習的な意味を変更せずに、他の２つの用語と置換できる。用いられる用語および表現は、説明の用語として限定なしで用いられ、提示および開示され、またはその一部である特徴の同等物を除外するような用語および表現の使用を意図しないが、種々の修飾が請求の範囲に記載されている本発明の範囲内で可能であると認識される。従って、本発明は実施形態および最適な特徴によって特異的に開示されているが、本明細書で開示された概念の修飾および変更は、明細書および添付した請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられることを理解すべきである。

さらに、本発明の特徴または態様が、マーカッシュグループまたは代替え手段の他のグルーピングの点から記載される場合、当業者は、本発明はまた、マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループのすべてについて記載されることを認識するだろう。

以下の実施例に照らして本発明をよりよく理解できるが、これは説明のみを目的とし、多少なりとも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。

実施例１：特異的に保護された直交ランチオニンの合成
Ａ．Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓの合成
図４に概説したように、Ｆｍｏｃ保護システイン（図３、構造Ｂ）を、連続した２段階でＬ−シスチンから合成した。炭酸ナトリウム（４．６ｇ，４３．６ｍｍｏｌ）およびＬ−シスチン（５．０ｇ，２０．８ｍｍｏｌ）を水（２００ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を１０℃に冷却した。ＦｍｏｃＣｌ（１１．８５ｇ，４５．８ｍｍｏｌ）をジオキサン（８０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を、Ｌ−シスチン溶液に滴下して加えた。溶液を１０℃で２時間撹拌し、徐々に室温まで加温した。高粘度の白色沈殿物を得、焼結ガラス漏斗で濾過した。生成物をジエチルエーテル（５０ｍＬ）で粉砕し、真空下で２日間乾燥させた。白色粉末、Ｎ，Ｎ’−ビス（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−シスチン（１４．０ｇ、収率９８％）が得られた。

Ｎ，Ｎ’−ビス（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−シスチン（１２．０ｇ，１７．５ｍｍｏｌ）をメタノール（３００ｍＬ）に溶解した。粒状亜鉛（１２．０ｇ）をこの溶液に加え、得られた混合物をマグネティックスターラーで激しく撹拌した。反応混合物に、トリフルオロ酢酸（７５ｍＬ、１ｍｏｌ）を２時間かけて滴下して加え、室温で１２時間撹拌した。反応をＣ−１８逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ、クロロホルム／メタノール／酢酸＝３０：１：０．１、ｖ／ｖ）により監視した。Ｎ，Ｎ’−ビス（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−シスチンの消失時に、反応混合物を濾過し、ロータリーエバポレータで濃縮し、容量を約１００ｍＬまで減少させた。ジクロロメタン（４００ｍＬ）を加え、混合物を２Ｎ塩化水素水溶液で洗浄した。水層をジクロロメタンで抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶液の濃縮により、白色粉末、Ｎ−（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−システインを得た（８．８ｇ、７３％）（図３および４、構造Ｂ）。

Ｂ．Ｎ−（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−セリンプロパルギルエステルの合成
Ｎ−（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−セリンプロパルギルエステル（図３、構造Ａ）の合成は以下のように実施した（図５参照）。Ｄ−セリン（１０．５ｇ、１００ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１１．１ｇ、１０５ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶解した。アセトニトリル（５０ｍＬ）をこの溶液に加え、混合物を氷浴中で５℃まで冷却した。クロロギ酸アリル（１１．７ｍＬ、１３．３ｇ、１１０ｍｍｏｌ）を３０分かけて滴下して加えた。反応混合物を徐々に室温まで加温し１２時間撹拌した。混合物を真空で約１００ｍＬまで濃縮してアセトニトリルを除去し、残留物を０〜５℃に冷却した。濃厚ＨＣｌ水溶液（約１０ｍＬ）を加えることにより、溶液のｐＨを２．０に調整した。酢酸エチル（５×４０ｍＬ）で生成物を抽出し、抽出物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ロータリーエバポレータで溶媒を真空除去し、淡黄色の油状物質、Ｎ−（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−セリン（１６．９ｇ、８９％）を得た。

Ｎ−（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−セリン（１６ｇ、８５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液に重炭酸ナトリウム（７．９ｇ、９４ｍｍｏｌ）を加えた。臭化プロパルギル（トルエン中８０％、１０．５ｍＬ、９４ｍｍｏｌ）を室温で２０分かけて滴下して加えた。反応混合物を室温で２日間撹拌した。反応混合物を、ロータリーエバポレータで真空濃縮し、残留物を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解した。溶液を重炭酸ナトリウム水溶液（２×５０ｍＬ）および水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ロータリーエバポレータで溶媒を真空除去し、Ｎ−（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−セリンプロパルギルエステルを得た（１８ｇ、収率９３％）。

Ｃ．Ｎ−（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−セリン（ベンジル）エステルの合成
Ｎ−（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−セリン（図３、構造Ｃ）は、Ｄ−セリン、および以前に報告された方法（Ａｋｈｒｅｍ，Ａ．Ａ．，ｅｔａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１９７８，９２５）を用いて、ピリジンの存在下でのジメドンと塩化イソバレリルとのＯ−アシル化、次いで形成された５，５−ジメチル−３−オキソシクロヘキサ−１−エニル３−メチルブタノエートの塩化アルミニウムでの転位によって合成されたｉｖＤｄｅ−ＯＨから生成した。特に、ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の塩化イソバレリル（１３．５ｍＬ、１３．３ｇ、１１０ｍｍｏｌ）溶液を、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中のジメドン（１４ｇ、１００ｍｍｏｌ）およびピリジン（９．７ｍＬ、９．５ｇ、１２０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１５分かけて滴下して加えた。反応混合物を１．５時間撹拌し、２Ｎ塩酸水溶液（２×５０ｍＬ）、水および飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、次いで硫酸マグネシウムで乾燥した。ロータリーエバポレータで溶媒を真空除去し、淡黄色の油状物質、５，５−ジメチル−３−オキソシクロヘキサ−１−エニル３−メチルブタノエートを得た（２２．４ｇ、収率１００％）。氷浴中で冷却した、ジクロロメタン（１００ｍL）中の塩化アルミニウム（１６．０ｇ、１２０ｍｍｏｌ）の撹拌した懸濁液に、５，５−ジメチル−３−オキソシクロヘキサ−１−エニル３−メチルブタノエート（１１．２ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液を３０分かけて滴下して加えた。反応混合物を室温まで加温し、１時間撹拌した。次いで、反応混合物を、氷上で冷却しながら、３７％塩酸水溶液（５０ｍＬ）および氷（１５０ｇ）の混合物に、温度が５℃を超えないようにゆっくりと注いだ。食塩水（２００ｍＬ）を混合物に加え、生成物をジクロロメタン（６×５０ｍＬ、抽出の完全性はＴＬＣで確認した）を用いて抽出した。抽出物を食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ロータリーエバポレータで真空濃縮した。粗生成物をヘキサン〜酢酸エチル：ヘキサン（１：１０）の勾配を用いたシリカゲルによるカラムクロマトグラフィーで精製し、淡黄色の油状物質、ｉｖＤｄｅ−ＯＨを得た（１０．５ｇ、９４％）。

次いで、Ｎ−（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−セリンを以下のように合成した。メタノール（５０ｍＬ）中のｉｖＤｄｅ−ＯＨ（１．１ｇ，５ｍｍｏｌ）およびＤ−セリン（０．６ｇ，５．７５ｍｍｏｌ）の混合物に、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン（３．４ｍＬ，２．６ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加えた。還流しながら、反応混合物を一晩撹拌した。ＴＬＣ試験（酢酸エチル／ヘキサン１：４）は、フリーのｉｖＤｄｅ−ＯＨがないことを示した。反応混合物を還流しながら一晩撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、ロータリーエバポレータで溶媒を真空除去した。残留物を水（４０ｍＬ）に溶解し、５〜１０℃に冷却し、２Ｎ塩酸水溶液を滴下して加えることにより、ｐＨ２まで酸性化した。混合物を室温で３０分撹拌し、沈殿を濾過し、水で洗浄し、真空で乾燥して、白色の微結晶、Ｎ−（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−セリンを得た（１．５ｇ、９６％）。

Ｎ−（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−セリンベンジルエステルは以下のように生成した。ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のＮ−（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−セリン（０．９３ｇ、３ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（０．３４ｇ、４ｍｍｏｌ）の混合物に、臭化ベンジル（０．４３ｍＬ，０．６２ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２４時間撹拌した。混合物をロータリーエバポレータで真空濃縮し、残留物を酢酸エチル（４０ｍＬ）に溶解した。溶液を水で洗浄し、水層を酢酸エチル（２×３０ｍＬ）で抽出した。複合有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×４０ｍＬ）、および水（４０ｍＬ）で洗浄した。有機層を炭酸マグネシウムで乾燥し、ロータリーエバポレータで溶媒を真空除去し白色の針状物質、Ｎ−（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−セリンベンジルエステルを得た（１．０３ｇ、８６％）。

Ｄ．Ｎ−（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−β−ブロモアラニンプロパルギルエステルおよびＮ−（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−β−ブロモアラニンベンジルエステルの合成
対応する、Ｎ−（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−セリン（プロパルギル）エステルのβ−ブロモアラニン誘導体およびＮ（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−セリン（ベンジル）エステルを、ジクロロメタン（または同様の非プロトン性溶媒）中の１当量の適切なエステルに溶解し、この溶液を、１当量の四臭化炭素およびトリフェニルホスフィンで処理、合成する。ＴＬＣによって観察されるように、反応が完了するまで、反応物を室温で撹拌し、所望のβ−ブロモアラニン誘導体をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。あるいは、トルエンまたはジクロロメタン等の溶媒中の三臭化リンを用い、次いで軽い簡単な処理を施すことで合成を行い、所望のＤ−β−ブロモアラニンを得る。ブロミル化に加え、トシル化または他の脱離基を、最終的に保護されたランチオニン生成のための以下に記載したアルキル化工程に用いてもよい。

Ｅ．ランチオニン１および２の合成
ランチオニン１は、Ｎ（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−β−ブロモアラニンプロパルギルエステルを（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−システインでアルキル化することにより合成する（図５）。ランチオニン２は、Ｎ（ｉｖＤｄｅ）−Ｄ−β−ブロモアラニンベンジルエステルを（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−システインでアルキル化することにより合成する（図６）。

それぞれのβ−ブロモアラニンは、（Ｆｍｏｃ）−Ｌ−システインを用いて以下のようにアルキル化する。１当量のβ−ブロモアラニンをジクロロメタン（または同様の非プロトン性溶媒）に溶解し、臭化テトラブチルアンモニウム、ヨウ化テトラブチルアンモニウム、またはＡｌｉｑｕａｔ３３６等の相間移動触媒の存在下、（Ｆｍｏｃ）システインで処理する。必要な触媒の量は５〜５０ｍｏｌ％であり、最も効果的に良好な反応速度および混じりけのない生成物の形成を最適化できる。反応温度は、また１０〜５０℃の範囲に最適化できる。

このようにして得られた生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製し、生成物の純度および同一性を、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、質量分析および／またはＴＬＣにより測定した。ランチオニン１および２の合成経路は比較的容易であり、生成物は、スケールアップおよび大量合成（＞１０ｇ）が容易に達成できるように、安定していると予想される。

実施例２：ランチオニン１および２を用いた、ランチビオティックナイシンＡ類似体の合成
Ａ．ナイシンＡ類似体の固相ペプチド合成
本発明によるナイシンＡ類似体（配列番号：２）は、以下に概説するように合成する。類似体は、位置３３にデヒドロブタリンのアラニン置換、位置３０および２にデヒドロアラニンを含む。天然のナイシンＡと比べ、生成物の抗菌力スペクトラムおよび抗力に有意な効果のないことを示すエビデンスが相当数ある（Ｋｕｉｐｅｒｓｅｔａｌ．，（１９９６）；Ｄｅｖｏｓｅｔａｌ．（１９９５），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１７，４２７−４３７；Ｓａｈｌｅｔａｌ．（１９９５），ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２３０，８２７−８５３；Ｂｉｅｒｂａｕｍｅｔａｌ．（１９９６），ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ６２，３８５−３９２）。

特に示さない限り、全てのプロトコールは文献（Ｗｈｉｔｅ（２００３）ＦｍｏｃＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＡｐｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）に報告された標準的なＦｍｏｃＳＰＰＳ法である。ナイシンＡは、段階的な方法でそのカルボキシ末端から合成される（図１参照）。
１．Ｎ^α−Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−Ｎ^ε−ｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジンのカルボキシルをＣＬＥＡＲ−ＡｃｉｄＲｅｓｉｎ（登録商標）（ＰｅｐｔｉｄｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に結合する。樹脂を、反応完了を証明するためニンヒドリンで確認する。
２．ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、室温でリジンのアミドに位置するＦｍｏｃ基の脱保護を実施する。
３．それぞれの（市販）ＦｍｏｃＬ−アミノ酸を用いて、アラニン、バリン、ヒスチジン、イソロイシンおよびセリン（残基２〜６）の順に結合させるため、結合および脱保護の工程（１〜２）を繰り返す。ヒスチジン、リジンおよびセリン等のアミノ酸は、その置換基を保護するために、それぞれの反応性側鎖に結合したｔ−ブチル基を有する。
４．次の結合は直交ランチオニン１を用いて実施し、その後、直交ランチオニン１のＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて除去する。
５．Ｆｍｏｃヒスチジン（残基８）を結合する。
６．ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いてＦｍｏｃヒスチジンを脱保護し、ヒスチジンを直交ランチオニン２に結合する。
７．ジクロロメタン中の二コバルトオクタカルボニルで直交ランチオニン１のプロパルギル基を開裂する。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて、直交ランチオニン２のＦｍｏｃアミノ末端を脱マスキングする。直交ランチオニン１の脱マスキングしたＣ−末端および直交ランチオニン２の脱マスキングしたＮ−末端を結合する。環Ｅの合成はこの工程で完了する。
８．ジクロロメタン中の２０ｍｏｌ％のＰｄ（ＰＰｈ_３）_４および２０〜２５当量のＰｈＳｉＨ_３でペプチジル樹脂を１５〜２０分間処理することにより、ランチオニン１のＮ（Ａｌｌｏｃ）基を除去する。
９．脱マスクしたＮ−末端をＦｍｏｃアラニン（残基１１）と結合する。アラニンのＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いて脱保護する。
１０．ジクロロメタン中の木炭上のパラジウムおよびシクロヘキサジエンを用いた移動水素化プロトコールを用いてランチオニン２の残りのＣ−末端を脱保護する。
１１．ランチオニン２の脱マスキングしたＣ−末端およびアラニンのＮ−末端（残基１１）を結合する。重なり合う環ＥおよびＤの合成はこの工程で完了する。正しい生成物が合成されたことを確認するため、少量の樹脂を取り、開裂カクテル（後述）を用いてペプチドを開裂する。得られたペプチドを、ＭａｌｄｉおよびＬＣ−ＭＳにより解析する。
１２．ＤＭＦ中の２〜１０％ヒドラジンを用いてランチオニン２のｉｖＤｄｅを除去し、得られたフリーのアミノ末端をＦｍｏｃ保護されたリジン、メチオニンおよびアスパラギン（残基１３、１４および１５）で順番に伸長する。
１３．ランチオニン１を、脱保護されたアスパラギンのＮ−末端に結合する（ランチオニン１またはランチオニン２のいずれかを、環Ｃ、ＢおよびＡの合成を完了するために用いることができる）。
１４．ランチオニン１のＦｍｏｃ基を脱保護し、Ｆｍｏｃグリシン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびグリシン（残基１７〜２１）と順番に結合させ、環Ｃを形成する。
１５．１当量の二コバルトオクタカルボニルを用いて、ランチオニン１のＣ−末端のプロパルギル基を除去し、グリシン（残基２１）のＮ−末端と結合し、環Ｃを完成する。
１６．ランチオニン１のＮ末端のＡｌｌｏｃ基を、工程８に記載の方法で除去し、Ｆｍｏｃリジン（残基２３）と結合する。
１７．リジンのＮ−末端を脱保護し、ランチオニン１をリジンのＮ−末端に結合する。
１８．ランチオニン１のＦｍｏｃ基を脱保護し、ＦｍｏｃグリシンおよびＦｍｏｃプロリン（残基２５および２６）と順番に結合する。
１９．１当量の二コバルトオクタカルボニルを用いてランチオニン１のＣ−末端のプロパルギル基を除去し、プロリンの脱保護したＮ−末端と結合し、環Ｂを形成する。
２０．前述の方法に従ってランチオニン１のＮ末端のＡｌｌｏｃ基を除去し、ランチオニン１と結合する。
２１．ランチオニン１のＦｍｏｃ基を脱保護し、Ｆｍｏｃロイシン、アラニンおよびイソロイシン（残基２９〜３１）と順番に結合する。
２２．１当量の二コバルトオクタカルボニルを用いてランチオニン１のＣ−末端のプロパルギル基を除去し、イソロイシンの脱保護したＮ−末端と結合し、環Ａを形成する。
２３．前述の方法に従って、ランチオニン１のＮ末端のＡｌｌｏｃ基を除去し、
Ｆｍｏｃアラニンおよびイソロイシン（残基３３および３４）と順番に結合した。これにより、ナイシンＡ類似体の合成が完了する。

Ｂ．合成ペプチドの樹脂からの開裂
合成ペプチドは相当量のイオウを含むため、ＴＦＡ／チオアニソール／水／フェノール／エタンジチオール（８２．５／５／５／５／２．５）を含むカクテルを、樹脂（Ｗｈｉｔｅ２００３）からのペプチドの開裂に用いた。樹脂をジクロロメタンで完全に洗浄し、微量のＤＭＦおよび他の残りの有機物を除去し、前述のカクテルで処理した。開裂のための時点の最適化は、樹脂１５〜２０ｍｇでの反応を実施し、それに続く１８時間以内の１時間おきのＬＣ−ＭＳによって達成される。至適条件は、開裂のスケールアップに用いられる。開裂ペプチドを、冷エーテルに徐々に注ぎ、ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを冷エーテルで洗浄し、乾燥させた。

開裂ペプチドの精製
１％ＴＦＡを含む水中で再構成することにより、ペプチドを精製する。溶液を、アセトニトリル：水の勾配、およびクォードテック検出器を有するＢｉｏｒａｄＨＰＬＣを用いるＣ−１８逆相カラムにかける。ピークを収集し、Ｍａｌｄｉｔｏｆにより解析し、生成物の同一性を確認する。所望のペプチドを含む分画を収集し、凍結乾燥して精製された生成物を得る。純度は、ＨＰＬＣ、ＭＳおよびＮＭＲで測定される。

実施例３：精製ナイシンＡ類似体の構造的および生物学的解析
Ａ．ナイシンＡ類似体のバイオアッセイ
このようにして合成され、実施例１および３に示すように精製されたランチビオティックを等分し凍結乾燥した。得られた生成物の重量を測定し最終収率を計算した。ナイシンＡ類似体の生物活性を、当該技術分野で既知の、ナイシンＡ類似体の最小抑制および殺菌濃度の測定を可能にする遅延アンタゴニズムアッセイによって測定する（Ｈｉｌｌｍａｎｅｔ．ａｌ．（１９８４），ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ４４，１４１−１４４；Ｈｉｌｌｍａｎｅｔ．ａｌ．（１９９８），ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ６６，２７４３−２７４９）。天然のナイシンＡと比較し、それぞれに固有の活性の特定を可能にする。バイオアッセイは以下のように実施する。

ナイシンＡ活性について試験される分画の試料（２０μＬ）を、９６ｗｅｌｌマイクロタイタープレート中のアセトニトリル：水（８０：２０）を用いて連続的に２倍希釈する。濃度範囲は２０〜０．０８μｇ／ｍＬである。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ株ＡＴＣＣ２７２ＬＳ（ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬに対して自然に耐性である）の一晩培養物を、トリプチカーゼソイブロス（Ｄｉｆｃｏ）に１：１０００（約１０^６ｃｆｕ／ｍＬ）に希釈し、３７℃で、ＯＤ_６００＝０．２になるまで培養した。細胞６００μＬを、４５℃まで冷却した１５ｍＬのトリプチカーゼソイブロストップアガー（０．７５％寒天）に加え、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ（ストレプトマイシンは、存在するナイシンＡの活性量を測定する能力に影響を及ぼさずに存在する可能性のある汚染物の増殖を防止する）を含むトリプチカーゼソイアガーを含む大きなシャーレの表面に注いだ。表面の寒天をセットした後、試験される画分の２倍希釈の試料５μＬをプレートの表面にスポットし、空気乾燥させる。

プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、指示菌の増殖阻害ゾーンを調べた。試料の力価を、指示菌Ｍ．ｌｕｔｅｕｓの明らかな増殖阻害をもたらす最高希釈の相互関係として取る。コントロールとして、真正ナイシンＡを希釈し、前述のようにスポットする。濃度範囲は２０〜０．０８μｇ／ｍＬである。これにより以前の工程で確立したようなこれらの化合物の純度のレベルをベースにした割合として、天然のナイシンＡと関連する合成類似体の生物活性の測定を可能にする。

合成および天然のナイシンＡを用いたバイオアッセイは、多剤耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｌｉｓ、およびＬｉｓｔｅｒｉａｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む、少なくとも１２種類のグラム陽性菌について実施される。試験を行う標的種として適している１以上の他の抗生物質も、比較のために並行して実施される。

Ｂ．ナイシンＡ類似体の構造解析
ナイシンＡ類似体の三次元構造を、ＴＯＳＣＹおよびＮＯＥＳＹＮＭＲを用いて、天然のナイシンＡとの比較により決定する。合成および天然のナイシンＡ試料（３〜５ｍＭ）をＨ_２Ｏ／Ｄ_２Ｏ／３−（トリメチルシリル）−プロピオン酸−Ｄ４中で、全量７００μＬで、ナトリウム塩（ＴＳＰ）（９０．０：９．９：０．１％）を用いて作成する。ＮＭＲデータを、２５℃で、冷凍器ＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて６００ＭＨｚで収集し、搬送周波数を、遅延弛緩１．５秒中のプレ飽和によって抑制される水の共鳴に集中する。ＴＯＣＳＹ実験は、ＭＬＥＶ−１７配列を用いた６０秒の混合時間で獲得される（Ｂａｘ＆Ｄａｖｉｓ（１９８５），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ６５，３５５−３６０）。ＮＯＥＳＹ実験は、２００ｍｓ、４００ｍｓおよび４５０ｍｓの混合時間で獲得される。ＨＭＱＣおよびＨＭＢＣ実験において逆位相コヒーレンスを生成または再び焦点を合わせるための遅延時間は、それぞれ３．５ｍｓ（１４０Ｈｚカップリング）および６０ｍｓ（８．５Ｈｚカップリング）に調整される。

全ての２Ｄデータは、獲得次元において２０４８の複合ポイントで、間接次元については２５６〜５１２の複合ポイントで収集する。全ての実験について位相敏感間接検波は、Ｓｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ法（Ｍａｒｉｏｎｅｔ．ａｌ．（１９８９），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ８５，３９３−３９９）を用いて実施する。^１Ｈ化学シフトはＴＳＰを基準とする。四角形の余弦関数、または６０°シフトを有する四角形の余弦関数（ＨＭＢＣの^１Ｈ次元について）による両方の次元における、逆重畳積分、データの増加、いったんゼロ化し、フーリエ変換、基準線補正することにより、最初に残留する水のシグナルを除去することにより、データは、ＮＭＲｐｉｐｅ（Ｄｅｌａｇｌｉｏｅｔ．ａｌ．（１９９５），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＮＭＲ６，２７７−２９３）で処理される。データを、対話型コンピュータプログラムＮＭＲＶｉｅｗ（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｂｌｅｖｉｎｓ（１９９４），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＮｍｒ４，６０３−６１４）を用いて解析する。^１Ｈ共鳴は、ＴＯＣＳＹ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｌｅｒ＆Ｅｒｎｓｔ（１９８３），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ５３，５２１−５２８）およびＮＯＥＳＹ（Ｋｕｍａｒｅｔ．ａｌ．（１９８０），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９５，１−６）実験を用いる標準的方法（Ｗuｔｈｒｉｃｈ，Ｋ．（１９８６）ＮＭＲｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ）に従って割り当てられる。ＨＭＱＣ（Ｂａｘｅｔ．ａｌ．（１９８３），ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅ５５，３０１−３１５；Ｍｕｌｌｅｒ（１９７９），ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ１０１，４４８１−４４８４）およびＨＭＢＣ（Ｂａｘ＆Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８６），ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ１０８，２０９３−２０９４）実験を、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹスペクトルにおいて、あいまいないくつかの領域を明らかにするために用いる。

リジン、イソロイシン、ロイシン、グリシンおよびアスパラギン残基は異なっており、２ＤのＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ実験における割り当てを容易にする^１Ｈスピン共鳴パターンを容易に特徴づける。これらの残基は最初に特定される。チオエーテル結合パターンは、長距離のβプロトンのＮＯＥ結合パターンによって証明される。長距離ＮＯＥは、おそらく、位置３および７、８および１１、１３および１９、２３および２６、並びに２５および２８における残基間で識別可能である。長距離ＮＯＥ（＞ｉ^＋２）は、Ｓｍｉｔｈら、２００２（ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＬａｎｔｉｂｉｏｔｉｃＭｉｉｔａｃｉｎ１１４０，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＦｌｏｒｉｄａ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ）に開示されるように、３次元モデルのために用いられる。

ＮＯＥ交差ピーク強度はＮＭＲＶｉｅｗで測定される。距離は、関係式ｒ_ａｂ ^６＝ｒ_ｃａｌ ^６（Ｖ_ｃａｌ／Ｖ_ａｂ）を用いて計算される。式中、ｒ_ａｂは原子ａｂ間の距離であり、Ｖ_ａｂはＮＯＥＳＹａおよびｂ交差ピーク容積であり、ｒ_ｃａｌは既知の距離であり、ｖ_ｃａｌはＮＯＥＳＹ校正交差ピークの対応する容積である。校正のために用いられる距離はイソロイシンのβプロトンである。残基間ＮＯＥ交差ピークは計算の距離制限として用いられる。エネルギー井戸は、１ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Å^２のより大きい、およびより小さい力定数を用いて定義される。

全ての立体配座モデリングは、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩソフトウェア（Ａｃｃｅｒｌｙｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて実施する。分子力学シミュレーションは、交差項を有するｃｖｆｆ力場、モースポテンシャル、および４０Åのカットオフ距離を用い、誘電率４．０、５００Ｋで真空にて実施される。ペプチドは、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩにビルダ関数を用いて構成される。最初に、直鎖ペプチドが最小化され、次いで、制限されない分子力学が１０ｐｓ実施される。この後、ｉ＋２またはそれ以上の距離制限のみが加えられる。ｉ＋２を超える距離制限が各チオエーテル環を生成する残基を充足する場合、分子力学シミュレーションは周期的に停止する。環Ａが最初に形成され、次いで、環Ｂおよび環Ｃ、次いで絡み合った環ＤおよびＥが形成される。チオエーテル環がいったん形成されると、ｉ＋１の距離制限が、ｉ＋２またはそれ以上の距離制限に加えられ、分子力学シミュレーションが、交差項を有するｃｖｆｆ力場、モースポテンシャルを用いて誘電率４．０、５００Ｋで５ｎ秒実施される。次いで、分子力学シミュレーションを、全ての制限とともにさらに２０ｎ秒間実施される。

力学由来の履歴ファイルは、１０ｐ秒毎に記述される。１ｎ秒から開始し１００ｐ秒毎に間隔があく履歴ファイルからの２００の構造は、２０００ステップを用いた全てのＮＭＲ制限で、次いで、共役勾配およびニュートン−ラフソンにより、０．０１ｋｃａｌ／モル／Åのエネルギーの二乗平均平方根（ＲＭＳ）勾配が到達するまで最小化されたエネルギーである。２００のエネルギーが最小化された構造を、ＮＭＲ制限妨害について確認する（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，Ｒｕｌｌｍａｎｎ，Ｊ．Ａ．Ｃ．，ＭａｃＡｒｔｈｕｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｋａｐｔｅｉｎ，Ｒ．＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）ＡＱＵＡａｎｄＰＲＯＣＨＥＣＫ−ＮＭＲ：ＰｒｏｇｒａｍｓｆｏｒｃｈｅｃｋｉｎｇｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｓｏｌｖｅｄｂｙＮＭＲ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒＮｍｒ．８，４７７−４８６）。エネルギーが最小化された構造は、Ｘクラスタープログラムを用いてファミリーにグループ分けされる（Ｓｈｅｎｋｉｎ，Ｐ．Ｓ．＆ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｑ．（１９９４）Ｃｌｕｓｔｅｒ−ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ−Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ．１５，８９９−９１６）。立体配置は、ＶａｎＤｅｖｅｎら、１９９１（ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０２，１１８１−１１８８）に決定されたナイシンの天然構造と比較する。

図１は、環Ｅを形成する残基７と１０との間、環Ｄを形成する残基９と１２との間、環Ｃを形成する残基１６と２２との間、環Ｂを形成する残基２４と２７との間、環Ａを形成する残基２８と３２との間の分子内架橋を含むナイシンＡ［配列番号：１］の構造を示す。環Ａ、ＢおよびＣは連続する環構造を例示し、環ＤおよびＥは重なり合う環を例示する。また、合成したナイシンＡ類似体［配列番号：２］を示す。図２は、翻訳後に修飾されるアミノ酸の非限定的な具体例を示す。図３は、特異的に保護されたランチオニンを生成するための逆合成方法を示す。図４は、Ｆｍｏｃ−保護システインの合成方法を示す。図５は、Ｎ（Ａｌｌｏｃ）−Ｄ−β−ブロモアラニンプロパルギルエステルの合成を含む、直交的に保護されたランチオニン１の合成方法を示す。図６は、Ｎ（ｉｖｄＤｅ）−Ｄ−β−ブロモアラニンベンジルエステルの合成を含む、直交的に保護されたランチオニン２の合成方法を示す。

Claims

少なくとも１つの分子内架橋を含む、分子内架橋したポリペプチドを合成する方法であって、
ａ）下記式
（式中、Ｌ^ｎは共有結合したアミノ酸側鎖を表し、Ｄ、ＥおよびＧは、それぞれが異なる反応条件下で選択的に除去される保護基であり、保護基Ｄを除去するための反応条件は、ポリペプチド鎖の残りのアミノ酸のアミノ保護基の除去のための反応条件とは異なる）
で表される、特異的に保護された直交分子内架橋のフリーのカルボキシ末端を、固相担体、または固相担体に結合していてもよいアミノ酸またはポリペプチドのフリーのアミノ末端に結合させ、
ｂ）保護基Ｅを除去してフリーのアミノ末端を形成し、
ｃ）前記フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで、前記アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を生成し、
ｄ）任意にｃ）を１回以上繰り返し、
ｅ）保護基Ｇを除去してフリーのカルボキシ末端を形成し、
ｆ）ｅ）のフリーのカルボキシ末端をフリーのアミノ末端に結合させ、
ｇ）保護基Ｄを除去してフリーのアミノ末端を形成し、および
ｈ）任意に、前記フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで前記アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を生成し、および
ｉ）任意にｈ）を１回以上繰り返す、
の各工程を含む方法。
２つの重なり合う分子内架橋を含む、分子内架橋ポリペプチドを合成する方法であって、
ａ）下記式
（式中、Ｌ^ｎは共有結合したアミノ酸側鎖を表し、Ｄ、ＥおよびＧは、それぞれが異なる反応条件下で選択的に除去される保護基であり、保護基Ｄを除去するための反応条件は、ポリペプチド鎖の残りのアミノ酸のアミノ保護基の除去のための反応条件とは異なる）
で表される、第一の特異的に保護された直交分子内架橋のフリーのカルボキシ末端を、
固相担体、または固相担体に結合していてもよいアミノ酸またはポリペプチドのフリーのアミノ末端に共有結合させ、
ｂ）保護基Ｅを除去してフリーのアミノ末端を形成し、
ｃ）前記フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで、前記アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を生成し、
ｄ）任意にｃ）を１回以上繰り返し、
ｅ）下記式
（式中、Ｌ^ａは前述した通りであり、Ｍ、ＱおよびＴは、それぞれが異なる反応条件下で選択的に除去される保護基であり、ＤおよびＭは異なる条件下でのみ除去され、ＧおよびＴは異なる条件下でのみ除去され、保護基Ｍを除去するための反応条件は、ポリペプチド鎖の残りのアミノ酸のアミノ保護基の除去のための反応条件とは異なり、ＥおよびＱは、Ｄを除去する反応条件およびＭを除去する条件とは異なる条件下で除去される）
で表わされる、第二の特異的に保護された直交分子内架橋のフリーのカルボキシ末端を、フリーのアミノ末端に共有結合させ、
ｆ）保護基Ｑを除去してフリーのアミノ末端を形成し、
ｇ）任意に、前記フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで前記アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を生成し、
ｈ）任意にｇ）を１回以上繰り返し、
ｉ）第一の特異的に保護された直交分子内架橋の保護基Ｇを除去してフリーのカルボキシ末端を形成し、
ｊ）前記フリーのカルボキシ末端を前記フリーのアミノ末端に結合させ、
ｋ）第一の特異的に保護された直交分子内架橋の保護基Ｄを除去してフリーのアミノ末端を形成し、
ｌ）任意に、前記フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで前記アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を生成し、
ｍ）ｌ）を１回以上任意に繰り返し、
ｎ）第二の特異的に保護された直交分子内架橋の保護基Ｔを除去してフリーのカルボキシ末端を形成し、
ｏ）前記フリーのカルボキシ末端を前記フリーのアミノ末端に結合させ、
ｐ）第二の特異的に保護された直交分子内架橋の保護基Ｍを除去してフリーのアミノ末端を形成し、
ｑ）任意に、前記フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで前記アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を生成し、および
ｒ）任意にｑ）を１回以上繰り返す、
の各工程を含む方法。
さらに、
ａ）固相担体に結合したポリペプチドのアミノ末端保護基を除去してフリーのアミノ末端を形成し、
ｂ）下記式
（式中、Ｌ^ｎは共有結合したアミノ酸側鎖を表し、Ｄ、ＥおよびＧは、それぞれが異なる反応条件下で選択的に除去される保護基であり、保護基Ｄを除去するための反応条件は、ポリペプチド鎖の残りのアミノ酸のアミノ保護基の除去のための反応条件とは異なる）
で表わされる、特異的に保護された直交分子内架橋を、フリーのアミノ末端に結合させ、
ｃ）保護基Ｅを除去してフリーのアミノ末端を形成し、
ｄ）前記フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで、前記アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を生成し、
ｅ）任意にｄ）を１回以上繰り返し、
ｆ）保護基Ｇを除去してフリーのカルボキシ末端を形成し、
ｇ）ｆ）のフリーのカルボキシ末端をフリーのアミノ末端と結合させ、
ｈ）保護基Ｄを除去してフリーのアミノ末端を形成し、
ｉ）任意に、前記フリーのアミノ末端にアミノ保護されたアミノ酸を加え、次いで前記アミノ酸を脱保護して新規なフリーのアミノ末端を生成し、
ｊ）任意にｉ）を１回以上繰り返し、および
ｋ）任意に工程ｂ）〜ｊ）を繰り返す、
の各工程を含む、請求項２記載の方法。
ポリペプチドが２つの分子内架橋を含む、請求項１記載の方法。
２つの分子内架橋が、連続して２つの環を形成する、請求項４記載の方法。
２つの分子内架橋が、２つの環を形成し、１つの環が他方に埋め込まれている、請求項４記載の方法。
特異的に保護された直交分子内架橋がランチオニンである、請求項２記載の方法。
分子内架橋されたポリペプチドがランチビオティックである、請求項２記載の方法。
Ｄ、Ｅ、ＭおよびＱが、Ｆｍｏｃ、ＡｌｌｏｃおよびＩｖＤｄｅから選択される、請求項２記載の方法。
ＧおよびＴが、プロパルギルエステルおよびベンジルエステルからなる群から選択される、請求項２記載の方法。
分子内架橋が、β−メチルランチオニン（ＭｅＬａｎ）、Ｓ−［（Ｚ）−２−アミノビニル］−Ｄ−システイン（ＡｖｉＣｙｓ）、およびＳ−［（Ｚ）−２−アミノビニル］−２−メチル−Ｄ−システインからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
ランチビオティックが、ナイシンＡ、ナイシンＺ、サブチリン、エリシンＳ、エリシンＡ、ストレプチン、エピデルミン、［Ｖａｌ１−Ｌｅｕ６］−エピデルミン、ガリデルミン、ミュータシン１１４０、ミュータシンＢ−Ｎｙ２６６、ミュータシンＩＩＩ、ミュータシンＩ、Ｐｅｐ５、エピランシンＫ７、エピシジン２８０、ラクチシン４８１、バリアシン、ミュータシンＩＩ、ストレプトコシンＡ−ＦＦ２２、サリバリシンＡ、［Ｌｙｓ２−Ｐｈｅ７］−サリバリシンＡ、プランタリシンＣ、サブランシン１６８、ブチリビブリオシンＯＲ７９Ａ、シンナマイシン、デュラマイシン、デュラマイシンＢ、デュラマイシンＣ、クラマイシンＣ、アンコベニン、メルサシジン、アクタガルジン、Ａｌａ（０）−アクタガルジン、スブチロシンＡ、ラクチシン３１４７Ａ１、ラクチシン３１４７Ａ２、スタフィロコッシンＣ５５α、スタフィロコッシンＣ５５β、プランタリシンＷα、プランタリシンＷβ、サイトリシンＬ_Ｌ、およびサイトリシンＬ_Ｓからなる群から選択される、請求項８記載の方法。
ランチビオティックがナイシンＡまたはその類似体である、請求項１２記載の方法。
請求項１記載の方法により形成される、分子内架橋ポリペプチド。
請求項２記載の方法により形成される、分子内架橋ポリペプチド。
請求項３記載の方法により形成される、分子内架橋ポリペプチド。
下記式：
（式中、ＤおよびＥは異なる保護基であり、Ｆｍｏｃ、ＡｌｌｏｃおよびＩｖＤｄｅからなる群から選択され、Ｇはプロパルギルエステルおよびベンジルエステルからなる群から選択される保護基である）
で表される、特異的に保護された直交ランチオニン。