JP2009501002A - 膵臓β細胞増殖の刺激方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】TMEM27タンパク質をコードする遺伝子調節領域を含んでなる単離された核酸であって、前記調節領域が少なくとも1つのTcf1タンパク質に対する高親和性結合部位を含んでなる単離された核酸。分泌型のTMEM27タンパク質を含んでなる単離されたポリペプチド。またそれらを用いた膵臓β細胞量を増加させる方法、患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法、患者の膵島量を評価する方法、TMEM27タンパク質と相互作用するタンパク質又はその分泌型タンパク質を同定する方法、患者の代謝を変化させる方法。
【選択図】図1
Description
動物:
AUモデル動物を、Laboratory ofAnimal Reserch Center(LARC)(ロックフェラー大学の病原菌フリーの動物収容施設)に収容した。動物を12時間の明/暗サイクルで維持し、標準的な齧歯動物用の食餌を与えた。変異マウスの遺伝子タイピングは、3週齢のマウスから単離したDNAを用いたPCRで実施した。
抗Col−3:
VQSAIRKNRNRINSAFFLD(配列番号:1)
抗Col−4:
GIPCDPLDMKGGHINDGFLT(配列番号:2)
を合成して>90%純度にし、KLHとコンジュゲートし、ウサギ(Bethyl Laboratories,Texas)に免疫した。抗血清をアフィニティ精製し、ウエスタンブロッティング及び免疫組織化学により試験した。アフィニティ精製した抗血清を全ての試験に用いた。イムノブロッティング及び免疫組織化学に用いる他の抗体は、以下の供給源から得た。抗インスリン(Linco社)、抗グルカゴン(Linco社)、抗V5(インビトロゲン社)、ローダミンレッド−コンジュゲート−ロバ抗ギニアピッグ(Jackson Labs社)、Alexa488ロバ抗ウサギ(Molecurlar Probe社)。
MIN6細胞を、25mMのグルコース、15%のウシ胎児血清及び5.5μmの2−メルカプトエタノールを含有するDMEM培地で培養した。INS−1細胞は、25mMのグルコース及び5%のウシ胎児血清及び10mMのHepes(pH7.4)を含有するRPMI1640培地で培養した。HepG2細胞は、25mMのグルコース及び10%のウシ胎児血清を含有するDMEM培地で培養した。
HepG2細胞の場合にはFugene試薬(ロシュ)を、MIN6細胞の場合にはリポフェクトアミン2000(インビトロゲン)を用い、業者の使用説明に従い、トランジェントなトランスフェクションを実施した。0.5μgのルシフェラーゼリポーター構築物、発現ベクター及びCMV−LacZを35mmペトリ皿に添加した。ルシフェラーゼは、対応するβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいてトランスフェクション効率を標準化した(AlamJ.,Cook,J.L.:Reporter genes:Application to the study of mammalian gene transcription.Anal.Biochem.188:245−254,1990)。
MIN6細胞(6枚のウェルプレートにおける90%のコンフルエンシー(細胞密度))を回収し、50μlの反応バッファー及び試薬に再懸濁し、4℃で2時間インキュベートした。50mMのトリス(pH7.4)溶液を添加して氷上で10分間インキュベートし、反応を停止させた。更に細胞をPBSで洗浄し、4℃で15分間プロテアーゼ阻害剤の存在下、RIPAバッファーで溶解させた。細胞溶解液を10,000×gで5分間遠心分離し、上清を還元的及び非還元的SDS−PAGEに供し、イムノブロッティングを行った。架橋試薬及びバッファーの組成は、BMH(Pierce社)をDMSO中に溶解させ、PBS中でインキュベートし、DTBP(Pierce社)を水に溶解させ、0.2Mのトリエタノールアミン(pH8.0)中でインキュベートした。
pV5−TMEM27を発現するMIN6細胞を、DMSO中に溶解させた所定濃度のツニカマイシン(Sigma社)、及びDMSOのみと、37℃で12時間インキュベートした。更に細胞溶解液をSDS−PAGEに供し、抗V5抗体を用いてイムノブロッティングした。
結合バッファー(20mMのHepes(pH7.9)、10%のグリセロール、150mMのNaCl、1mMのDTT)中で、全細胞抽出液10μgを用いてEMSA分析を実施した。全細胞抽出液を、野生型若しくは変異型のHNF−I結合部位を含んでなるTMEM27プロモーターの32P−ラベル二本鎖オリゴヌクレオチドプローブとインキュベートした。配列番号3:5’−GGAGATTTTCGTAAATAACTGACA−3’、配列番号4:5’−GGGCGTTAATTATTAAACCTTTTA−3’、配列番号5:5’−GGGCAGAGATTATTAAACCTTTTA−3’。抗Tcf1抗体(Geneka Biotechnology社、モントリオール、カナダ)を用いてスーパーシフトを実施した。C57/B6マウス又はMIN6細胞から単離した初代肝細胞を使用し、製造業者(Upstate Cell Signaling Solutions,Lake Placid,NY)のChIPアッセイキットのプロトコルに従い、ChIP分析を実施した。Tcf1を抗−HNF−1α抗体で沈殿させ、DNAをプライマーx及びyを使用して増幅した。配列番号6:5’−ACAGGAGGCAGGTGGGAGGCTTCT−3’、配列番号7:5’−CCCGGATTAGGGTATCGGAGAA−3’。apoMのプライマーは以下の通りである。配列番号8:5’−GGGCTCAGCTTTCCTCCTA−3’、配列番号9:5’−CTCCGCCTTAACTGTTCTCTGATG−3’。
MIN6細胞を、150mmの組織培養皿で90%の集密度(コンフルエンシー)となるまで増殖させた。細胞を一度氷冷PBSで洗浄し、3mlのPBSで掻き取った。細胞を4,000×gで4分間遠心分離し、2倍容の高塩濃度の抽出バッファー(400mMのKCl、20mMのトリス(pH7.5)、20%のグリセロール、2mMのDTT、1×コンプリート(商標)プロテアーゼ阻害剤(Boehringer Manheim社)及び20μg/mLアプロチニンに再懸濁した。細胞溶解液を凍結・解凍させ、細胞破片を4℃で10分間16,000×gで遠心分離して除去した。
インスリン及びグルカゴンを、酸性エタノール(無水エタノール中の10%氷酢酸)で膵臓から抽出し、10分間超音波破壊し、4℃、12,000×gで10分間、2回遠心分離した。上清を回収し、−20℃保存し、感受性インスリン又はグルカゴンRIAキット(Linco Research社)を用いてインスリン濃度を測定した。
膵島を6〜8週間齢のマウスから単離した。コラゲナーゼによる消化及びフィコール勾配による遠心分離を使用した。更に全RNAを、TRIzol試薬(Gibco−BRL社)を使用して、製造業者の指示に従い抽出した。混入するゲノムDNAを、RNA5μgあたり1μlのRNaseフリーDNase−I(Boehringer社)を使用して除去した。
膵臓をパラホルムアルデヒドで固定し、上記の通りにインスリン及びグルカゴンに関して染色した。全ての膵臓断面(7μm)を採取し、全ての第6断面を形態観察に使用した。オーバーラップしない少なくとも288の画像(ピクセルサイズ:0.88μm)を、共焦レーザー読取り顕微鏡(Zeiss LSM510、ドイツ)を使用してスキャンした。この実験で測定されるパラメータを、Metamorph Software Package(Universal Imaging社、PA)の統合形態観察装置を使用して分析した。インスリン又はグルカゴンで着色した細胞で覆われた視野に、3ピクセルより大きいサイズの染色物質を使用して取り込ませた。
全RNAをTRIZOL試薬(Invitrogen社)を使用して抽出し、10μgのRNAを5UのRNaseフリーのDNase−I(Ambion社)で処理した。dNTPs及びランダム六量体プライマー(Invitrogen社)で、Moloney白血病ウイルス逆転写酵素を使用してcDNAを合成した。上記cDNAsを使用し、[α−32P]dCTP及びTaqポリメラーゼの存在下で、特異的なプライマーを使用したPCR用の鋳型とした(Shih DQ,Screenan S,Munoz KN,Philipson L,Pontoglio M,Yaniv M,Polonsky KS,Stoffel M.(2001)Loss of HNF−I alpha function in mice leads to abnormal expression of genes involved in pancreatic islet development and metabolism.Diabetes 50:2472−80を参照)。
サイトソル中のタンパク質抽出物をSDS−PAGE(4〜15%)で分離し、エレクトロブロッティングを行いニトロセルロース膜(Schleicher&Schuell社)に転写した。TMEM27を抗−Col3及び抗Col4抗血清(1:500)により検出した。4℃で一晩、一次抗体を用いて膜をインキュベートした。二次抗体を含んでなるインキュベーションを室温で1時間実施した。非還元的SDS−PAGEは、DTTをサンプルバッファから除外することにより実施した。
MIN6細胞を、0.1Mのカコジル酸バッファー(pH7.4)中の4%のパラホルムアルデヒド及び0.02%のグルタルアルデヒドで固定した。細胞をPBSで洗浄し、10%のゼラチンに包埋し、上記と同様に再度固定した。細胞ペレットをPBS中の2Mスクロース溶液を使用してクリオ保護し、使用までの間サンプルを液体窒素中で保存した(Tokuyasu,K.T.1973.J.Cell.Biol.57−551−565)。クリオ極薄切片を、Reichert−Jung FC−4E cryoultramicrotomeのガラスナイフを使用して調製した。Formvar−カーボンコーティングニッケルグライドに切片を回収し、1%のBSA−PBSでブロッキングし、1:10希釈した抗col4でインキュベートした。PBSで2回(各15分)洗浄してインキュベーションを終了させた。更に切片を、10nm金粒子(Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgGでインキュベートした。グライドを、Griffithsら、1983.Methods Enzymol.96:466−485に記載の方法従って処理し、染色した。
24ウェル培養プレート上の5×104細胞/ウェルにおける、[3H]チミジン取り込みを以下の通りにアッセイした。エレクトロポレーションの48時間後に細胞を更に24時間、成長停止培地(0.5%FCS)中でインキュベートし、更に通常の成長培地で24時間インキュベートした。インキュベーションの最後の4時間において、0.5μCi/ウェルで[3H]エチルチミジン(Perkin Elmer社)を添加した。添加後、細胞を氷冷PBSで二回リンスし、20分間氷上で、10%のトリクロロ酢酸(TCA)でインキュベートした。10%のTCAで洗浄した後、細胞を室温で10分間、0.2MのNaOH/1%のSDSで溶解させた。TCA不溶性物質を0.2MのHClで中和し、液体シンチレーションカウンタにより放射能を測定した。
合成siRNAsは、Dharmacon Research(Lafayette、CO)により合成された。マウスのTMEM27(NM020626)、PC1/3(NM013628)、PC2(NM008792)、furin(NM011046)及びカルボキシペプチダーゼE(NM013494)配列に対するsiRNAsを設計した。1×106のMIN6細胞に対して各siRNAの3μgをエレクトロポレーションした。
平均±SDとして結果を提供した。統計分析はスチューデントt検定を用いて実施し、帰無仮説を0.05のレベルで拒絶した。
膵臓β細胞中の分裂促進因子を同定するため、Tcf1−/−野生型同腹仔から単離した膵島細胞の遺伝子発現を、Affymetrix(商標)オリゴヌクレオチド発現配列を使用して比較した。この分析により膜貫通型タンパク質(TMEM27)をコードする遺伝子が同定され、コントロールと比較し、Tcf1−/−マウスでは発現レベルが16倍減少していた。この結果は、独立した動物群のRT−PCRにより確認された(図1a)。Tcf1がTMEM27転写の直接的な活性化物質であるかどうかを検討するため、TMEM27プロモーターを解析し、2つの保存された高親和性結合部位がその調節領域に存在することを確認した(図1b)。ヒト(配列番号10)及びマウス(配列番号11)の上流側調節領域はそれぞれ、ヒトではTcf結合部位の約−117〜約−102(配列番号12及び配列番号13)、及びマウスでは−62〜約−47(配列番号14及び配列番号15)であった。
免疫組織化学的な分析を行い、マウス膵臓成長の間のTMEM27の発現パターンを観察した。新生児及び成体の膵臓において、TMEM27の発現は膵島β細胞のみに限定された。膵臓の成長の間、ホルモン陽性が顕著である場合(主にグルカゴン陽性細胞)には、TMEM27は最も初期の時期に発現していた。胚時期のE11.5及びE12.5日において、TMEM27発現は、グルカゴン及びインスリン発現細胞において局所的であった。内分泌細胞の膨張ピーク時期(胎児期13.5〜18.5日)において、TMEM27は主に、E18.5日(出生の直前)までグルカゴンと共局所化しており、またインスリン陽性細胞においても検出された。新生児及び成体の膵臓では、TMEM27は膵島のα−細胞においてはもはや検出されず、発現はβ細胞に限定されていた(図2)。
TMEM27は、アミノ酸残基76及び93において2つの予想N−グリコシル化部位を含んでなる。MIN6細胞をツニカマイシンで処理し、それによりN−グリコシル化が阻害された。ツニカマイシンの濃度を増加させて細胞をインキュベートし、タンパク質抽出物を調製し、SDS−PAGEにより分析し、イミムノブロッティングを行った。ツニカマイシン処理を行った場合、電気泳動移動度の増加した2つのバンドが出現し、一方高分子量側のタンパク質が消失した(図3a)。この結果は、N−グリカナーゼ(完全なN結合グリカンを放出させる酵素)を使用したin vitroアッセイにより確認した。この酵素でインキュベートしたMIN6細胞抽出液のウエスタンブロット分析において、ツニカマイシン処理と同様の結果が示された(図3b)。
TMEM27は、N末端の細胞外領域を有する膜貫通タンパク質であると予測された。タンパク質の細胞外及び細胞内領域のペプチドを認識する2つの抗体(α−Col−3及びα−Col−4)をそれぞれ調製した。ウエスタンブロット実験において、α−Col−4ではMIN6細胞(図4a)の全細胞溶解液において2つのバンドが検出された。グリコシル化された全長タンパク質の予測された分子量に対応するバンドが、高分子量側に存在した。低分子量側にバンド(≒25kD)が検出されたが、C末端V5−Tag融合タンパク質を発現するベクター(p−TMEM27.V5−His)によるトランスフェクション、及び抗V5抗体(図4b)を用いた細胞溶解液のウエスタンブロットにより検出できたことより、特異的なものである。
抗Col−3及び4の抗体を使用した免疫蛍光アッセイにより、膵臓β細胞におけるTMEM27の局在化が示された。MIN6細胞をスライド上で増殖させ、固定し、一次抗体を透過させた。特異的な染色が、原形質膜のみならず、核周辺領域及び顆粒において検出された(図5a)。この結果は、TMEM27がインスリン分泌顆粒において局所化し、それがこれらの小嚢を経て原形質膜に運搬されることと整合する。免疫・金−標識抗−Col−4抗体を使用した電子顕微鏡観察により、インスリン分泌顆粒内でTMEM27の局在化が示された(図5b)。ナノ金粒子は小嚢/膜融合現象(図5c)の付近で原形質膜と結合し、これはTMEM27がインスリン分泌顆粒と共に共共局在化する形質膜タンパク質であることを示すものである。
コントロールと比較した、ob/ob及びaP2−Srebp−lcトランスジェニックマウスの肥大した膵島におけるTMEM27の相対的な発現量を評価した。6〜8週齢のマウスから膵島を単離し、遺伝子発現レベルをそれらの野生型同腹仔と比較した。半定量的RT−PCRアッセイにより、コントロール値(図6a及び6b)と比較して、ob/ob及びaP2−Srebp−1c膵島においてTMEM27レベルのそれぞれ2.1倍及び1.7倍の増加が確認された。更にob/ob及びaP2−Srebp−1cマウスから単離した膵島では、野生型同腹仔(図6c、データ示さず)における通常のサイズの膵島と比較し、切断されたTMEM27の培地中への分泌が顕著に増加した。TMEM27が膵臓β細胞複製を刺激するか否かを解析するため、MIN6細胞におけるTMEM27発現の急激な増加による効果を評価した。細胞を、プラスミドpTMEM27又はTMEM27を標的とするsiRNAsと共に電気泳動した。細胞の複製は、細胞を計数し、エレクトロポレーションの48時間後における[3H]チミジンの取込を測定することにより評価した(図6d−g)。pTMEM27でトランスフェクションしたMIN6細胞ではpcDNA3でトランスフェクションした細胞と比較し約5倍の過剰発現が示され、[3H]チミジン取込が約3倍増加し、プレーティングの48時間後において細胞密度の増加が確認された(図6e、g)。一方、siRNA処理後のタンパク質発現の顕著な減少を示すMIN6細胞では、顕著に低い[3H]チミジン取込及び細胞密度を示した(図6d、f)。更に、TMEM27の発現の増減にも関わらず、細胞のアポトーシスには変化が観察されず(データ示さず)、これはその発現が細胞死に影響を及ぼさないことを示すものである。これらの結果は、TMEM27がMTN6細胞の細胞増殖を制御することを示す。
マウスTMEM27 cDNAをマウスインスリンプロモータの制御下となるようなベクター中に挿入し、その構築物を前核マイクロインジェクションし、膵臓β細胞特異的なトランスジェニックマウスを作製した。RT−PCR及びイムノブロット分析により、野生型の同腹仔と比較して、TMEM27発現がトランスジェニックマウスにおいて4倍増加したことが示された(図7A)。8〜12週齢のトランスジェニック動物の膵島形態観察によって膵島質量を解析した。トランスジェニックマウスでは通常の膵島の形態(免疫組織化学を使用したインスリン/グルカゴン共染色に基づく)を示したが、野生型同腹仔と比較し、膵島質量の約2倍の増加が見られた(図7B及び7C)。更に膵島質量の増加を、トランスジェニック及び野生型マウスにおける総インスリン含有量を測定することによって確認した。総インスリン含有量は、TMEM27(図7D)を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいても顕著に増加した。空腹時及び食後の血漿中グルコース及びインスリン濃度は、トランスジェニックマウスとコントロールマウスにおいて同様であり、これはトランスジェニックマウスの膵臓β細胞ではグルコースの大きな異常が検出できなかったことを示す(データ示さず)。これらのデータから、TMEM27が膵島成長をin vivoで制御することが明らかとなった。
膵臓β細胞系のMEM6細胞を、25mMのグルコース、15%のウシ胎児血清及び5.5μM 2−メルカプトエタノールを含有するDMEM培地で培養した。MIN6細胞を12ウェルプレート中で50%の集密度(コンフルエンシー)となるようにプレーティングし、24時間インキュベートした。細胞をOPTI−MEM(Invitrogen社)で洗浄し、37℃で15分間、OPTT−MEM中にDMSO又はプロテアーゼ阻害剤BB94(1μM)を添加してインキュベートした。上記のインキュベーション後、OPTI−MEM中にDMSO、PMA(SigmaP8139)、BB94又はPMA+BB94を添加し、細胞を2時間インキュベートした。上清を各30μlサンプリングし、SDS−PAGEに供した。TMEM27(図8)のN末端(切断部分)を認識する抗TMEM27抗体を使用してイムノブロッティングを実施した。抗V5抗体(TMEM27のC末端(細胞内)部分を認識する)をコントロールとして使用してイムノブロッティングを行った結果、PMA及びBB94がTMEM27(図8)の発現レベルを変化させないことが示された。BB94(PMAでない)では、TMEM27のC末端の発現レベルは一定であったが、TMEM27のN末端の発現レベルは減少した(図8)。BB94はセリンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼの周知の阻害剤であるため、TMEM27がセリンプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼのファミリーに属するプロテアーゼの基質であることを示唆すると考えられる。
Claims (75)
- TMEM27タンパク質をコードする遺伝子調節領域を含んでなる単離された核酸であって、前記調節領域が少なくとも1つのTcf1タンパク質との高親和性結合部位を含んでなる単離された核酸。
- 前記調節領域が配列番号10又は11に一致するか、又は相同性を有する核酸配列を有する、請求項1記載の単離された核酸。
- 前記結合部位が配列番号12、13、14又は15に一致するか、又は相同性を有する核酸配列を含んでなる、請求項1記載の単離された核酸。
- 請求項1記載の核酸を含んでなる細胞。
- 前記細胞が膵臓β細胞である、請求項4記載の細胞。
- 請求項1記載の核酸を含んでなるベクター。
- 分泌型のTMEM27タンパク質を含んでなる単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが約25kDaであり、配列番号16に一致するか、又は相同性を有する配列のN末端断片を含んでなるポリペプチド。
- 膵臓β細胞量を増加させる方法であって、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、TMEM27ポリペプチドと接触させることと、β細胞の増殖に適する条件を設定することを含んでなる方法。
- 前記細胞がin vitro又はex vivoでの接触に供される、請求項8記載の方法。
- 前記細胞がin vivoでの接触に供される、請求項8記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項8記載の方法。
- 前記細胞が糖尿病に罹患する患者又は糖尿病体質の患者から単離される、請求項8記載の方法。
- 前記患者に前記細胞を投与する処理を更に含んでなる、請求項12記載の方法。
- 前記細胞が前記患者に関して自己由来であるか又は同種由来である、請求項13記載の方法。
- 前記TMEM27ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項8記載の方法。
- 前記細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させる処理を更に含んでなる、請求項8記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項16記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がBB94である、請求項17記載の方法。
- 前記細胞をTcf1タンパク質又は前記Tcf1タンパク質をコードする核酸と接触させる処理を更に含んでなる、請求項8記載の方法。
- 膵臓β細胞量を増加させる方法であって、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、TMEM27ポリペプチドをコードする核酸と接触させることと、前記核酸の発現に好適な条件を設定することを含んでなる方法。
- 前記細胞がin vitro又はex vivoでの接触に供される、請求項20記載の方法。
- 前記細胞がin vivoでの接触に供される、請求項20記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項20記載の方法。
- 前記細胞が糖尿病に罹患する患者又は糖尿病体質の患者から単離される、請求項20記載の方法。
- 前記患者に前記細胞を投与する処理を更に含んでなる、請求項24記載の方法。
- 前記細胞が前記患者に関して自己由来であるか又は同種由来である、請求項25記載の方法。
- 前記TMEM27ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項20記載の方法。
- 前記細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させる処理を更に含んでなる、請求項20記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項28記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がBB94である、請求項29記載の方法。
- 前記細胞をTcf1タンパク質又は前記Tcf1タンパク質をコードする核酸と接触させる処理を更に含んでなる、請求項20記載の方法。
- 膵臓β細胞量を増加させる方法であって、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、TMEM27ポリペプチド又はそのTMEM27ポリペプチドをコードする核酸と接触させることと、β細胞の増殖に適する条件を設定することを含んでなる方法。
- 前記細胞がin vitro又はex vivoでの接触に供される、請求項32記載の方法。
- 前記細胞がin vivoでの接触に供される、請求項32記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項32記載の方法。
- 前記細胞が前記患者におけるインスリン分泌を促進する、請求項32記載の方法。
- 前記細胞が、糖尿病に罹患する患者又は糖尿病の体質を有する患者から単離されるか、当該患者に投与されるか、又はそれらの組み合わせである、請求項32記載の方法。
- 前記細胞が前記患者に関して自己由来であるか又は同種由来である、請求項37記載の方法。
- 前記TMEM27ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項32記載の方法。
- 前記TMEM27ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項32記載の方法。
- 前記細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させる処理を更に含んでなる、請求項32記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項41記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がBB94である、請求項42記載の方法。
- 前記細胞をTcf1タンパク質又は前記Tcf1タンパク質をコードする核酸と接触させる処理を更に含んでなる、請求項32記載の方法。
- 前記患者がインスリン抵抗性又はインスリン分泌低下に罹患する、請求項32記載の方法。
- 前記患者が糖尿病患者又は糖尿病の体質の患者である、請求項32記載の方法。
- 前記患者にスルホニル尿素、レプチン、メグリチナイド、ビグアナイド、チアジアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤又はそれらの組み合わせを投与する処理を更に含んでなる、請求項32記載の方法。
- 患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法であって、膵臓β細胞又は膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞を、TMEM27ポリペプチド又はTMEM27ポリペプチドをコードする核酸と接触させることを含んでなる方法。
- 前記細胞がin vitro又はex vivoでの接触に供される、請求項48記載の方法。
- 前記細胞がin vivoでの接触に供される、請求項48記載の方法。
- 前記細胞が幹細胞又は前駆細胞である、請求項48記載の方法。
- 前記細胞が、糖尿病に罹患する患者又は糖尿病の体質を有する患者から単離されるか、当該患者に投与されるか、又はそれらの組み合わせである、請求項48記載の方法。
- 前記細胞が前記患者に関して自己由来であるか又は同種由来である、請求項52記載の方法。
- 前記細胞が前記患者のβ細胞増殖、インスリン分泌又はそれらの組み合わせを活性化する、請求項48記載の方法。
- 前記TMEM27ポリペプチドが全長タンパク質又はその断片を含んでなる、請求項48記載の方法。
- 前記核酸が全長TMEM27タンパク質又はその断片をコードする、請求項48記載の方法。
- 前記細胞をプロテアーゼ阻害剤と接触させる処理を更に含んでなる、請求項48記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がセリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤である、請求項57記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がBB94である、請求項58記載の方法。
- 前記細胞をTcf1タンパク質又は前記Tcf1タンパク質をコードする核酸と接触させる処理を更に含んでなる、請求項48記載の方法。
- 前記患者がインスリン抵抗性又はインスリン分泌低下に罹患する、請求項48記載の方法。
- 前記患者が糖尿病の体質の患者である、請求項48記載の方法。
- 前記患者が若年性糖尿病(MODY)に罹患する、請求項48記載の方法。
- 前記患者にスルホニル尿素、レプチン、メグリチナイド、ビグアナイド、チアジアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤又はそれらの組み合わせを投与する処理を更に含んでなる、請求項48記載の方法。
- 患者の膵島量を評価する方法であって、前記患者の血清中のTMEM27濃度を測定することと、前記濃度とコントロールのそれとを比較することを含んでなる方法。
- TMEM27タンパク質と相互作用するタンパク質又はその分泌型タンパク質を同定する方法であって、TMEM27ポリペプチドと標的分子とを、所定時間、前記ポリペプチドと前記分子との間の特異的な相互作用が十分可能となる条件下で接触させ、前記標的分子を同定することを含んでなる方法。
- 膵臓β細胞量を増加させる方法であって、膵臓β細胞若しくは膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞であってTMEM27を発現するか若しくは発現を誘導されうる細胞を、セリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることと、β細胞増殖に適する条件を設定することを含んでなる方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤が、BB94(HONH−COCH2CH2CO−FA−NH2)(OA−Hy、シス−P−オクタデセノイル−N−ヒドロキシルアミド、オレオイル−N−ヒドロキシルアミド)、{N−[[(4,5−ジヒドロ−5−チオキソ−1,3,4−チアジアゾル−2−イル)アミノ]カルボニル]−L−フェニルアラニンメチルエステル}、{a−[[[4,5−ジヒドロ−5−チオキソ−1,3,4−チアジアゾル−2−イル)アミノ]カルボニル]アミノ]−(2−ピリジル)ピペラジニル)−(S)−ベンゼンプロパンアミド}、{(2R)−2−[(4−ビフェニルイルスルホニル)アミノ]−3−フェニルプロピオン酸}、{(2R)−[アミノ(4−ビフェニルイルスルホニル)]−N−ヒドロキシ−3−フェニルプロピオンアミド}、H−Cys1−Thr−Thr−His−Trp−Gly−Phe−Thr−Leu−Cys10−OH(SB−3CT)、(Ac−RCGVPD−NH2、ストロメリシン−1阻害剤)、[N−イソブチル−N−(4−メトキシフェニルスルホニル)−グリシルヒドロキサミン酸、NNGH]、{N−[[4,5−ジヒドロ−5−チオキソ−1,3,4−チアジアゾル−2−イル)アミノ]カルボニル]−L−フェニルアラニン}、{a−[[[4,5−ジヒドロ−5−チオキソ−1,3,4−チアジアゾル−2−イル)アミノ]カルボニル]アミノ]−N−(シクロヘキシルメチル)−(S)−ベンゼンプロパンアミド}、4−ジベンゾフラン−2¢−イル−4−ヒドロキシイミノ酪酸)、[4−(4¢−ビフェニル)−4−ヒドロキシイミノ酪酸]、{(3R)−(+)−[2−(4−メトキシベンゼンスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−ヒドロキシサメート]}、{(3S)−(+)−[2−(4−メトキシベンゼンスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−ヒドロキサメート]}、[N−ヒドロキシ−1−(4−メトキシフェニル)スルホニル−4−(4−ビフェニルカルボニル)ピペラジン−2−カルボキサミド]、[N−ヒドロキシ−1−(4−メトキシフェニル)スルホニル−4−ベンジルオキシカルボニルピペラジン−2−カルボキサミド]、(1,10−フェナントロリン一水和物)、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、ネオバスタット、ゾレドロン酸又はそれらの組み合わせである、請求項67記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がBB94である、請求項68記載の方法。
- 患者の代謝を変化させる方法であって、膵臓β細胞若しくは膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞であってTMEM27を発現するか若しくは発現を誘導されうる細胞を、セリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることを含んでなる方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤が、BB94(HONH−COCH2CH2CO−FA−NH2)、(OA−Hy、シス−9−オクタデセノイル−N−ヒドロキシルアミド、オレオイル−N−ヒドロキシルアミド)、{N−[[(4,5−ジヒドロ−5−チオキソ−1,3,4−チアジアゾル−2−イル)アミノ]カルボニル]−L−フェニルアラニンメチルエステル}、{a−[[[4,5−ジヒドロ−5−チオキソ−1,3,4−チアジアゾル−2−イル)アミノ]カルボニル]アミノ]−(2−ピリジル)ピペラジニル)−(S)−ベンゼンプロパンアミド}、{(2R)−2−[(4−ビフェニルイルスルホニル)アミノ]−3−フェニルプロピオン酸}、{(2R)−[アミノ(4−ビフェニルイルスルホニル)]−N−ヒドロキシ−3−フェニルプロピオンアミド}、H−Cys1−Thr−Thr−His−Trp−Gly−Phe−Thr−Leu−Cys10−OH(SB−3CT)、(Ac−RCGVPD−NH2、ストロメリシン−1阻害剤)、[N−イソブチル−N−(4−メトキシフェニルスルホニル)−グリシルヒドロキサミン酸、NNGH]{N−[[4,5−ジヒドロ−5−チオキソ−1,3,4−チアジアゾル−2−イル)アミノ]カルボニル]−L−フェニルアラニン}、{a−[[[4,5−ジヒドロ−5−チオキソ−1,3,4−チアジアゾル−2−イル)アミノ]カルボニル]アミノ]−N−(シクロヘキシルメチル)−(S)−ベンゼンプロパンアミド}、4−ジベンゾフラン−2¢−イル−4−ヒドロキシイミノ酪酸)、[4−(4¢−ビフェニル)−4−ヒドロキシイミノ酪酸]、{(3R)−(+)−[2−(4−メトキシベンゼンスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−ヒドロキシサメート]}、{(3S)−(+)−[2−(4−メトキシベンゼンスルホニル)−1,2,3,4−テトラヒドロイソキノリン−3−ヒドロキサメート]}、[N−ヒドロキシ−1−(4−メトキシフェニル)スルホニル−4−(4−ビフェニルカルボニル)ピペラジン−2−カルボキサミド]、[N−ヒドロキシ−1−(4−メトキシフェニル)スルホニル−4−ベンジルオキシカルボニルピペラジン−2−カルボキサミド]、(1,10−フェナントロリン一水和物)、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、ネオバスタット、ゾレドロン酸又はそれらの組み合わせである、請求項70記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がBB94である、請求項71記載の方法。
- 患者の糖尿病を阻害、抑制又は治療する方法であって、膵臓β細胞若しくは膵臓β細胞への分化を誘導されうる細胞であってTMEM27を発現するか若しくは発現を誘導されうる細胞を、セリンプロテアーゼ阻害剤又はメタロプロテアーゼ阻害剤と接触させることを含んでなる方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がBB94又はそれらの組み合わせである、請求項73記載の方法。
- 前記プロテアーゼ阻害剤がBB94である、請求項74記載の方法。
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