JP2009294201A - 多角的皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルと、タイトジャンクション機能トレーサー及び蛍光標識されたセラミドとを用い、トレーサーの分布の変化より、タイトジャンクションにおいてどの様にその機能の回復をせしめるかを視覚的に鑑別する。
【選択図】なし
Description
しかしながら、検体が及ぼす、セラミドの分布状況と、タイトジャンクションの傷害からの回復改善効果とを比較可能な条件下で同時に検討した例は存しない。この為、皮膚バリア機能の低下とその改善に関しては、その要因が多面的であることを認めつつも、一因子のみで語られることが少なくなかった。
(1)皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルにおける標識されたセラミドの存在状況を観察することを特徴とする、セラミドの組織内輸送の鑑別法。
(2)(1)に記載のセラミドの組織内輸送の鑑別法において、検体が標識されたセラミドの組織内輸送に与える影響を鑑別し、セラミドの組織内輸送が、検体が存在しない条件に比して促進された場合には前記検体は、セラミドの欠乏による皮膚バリア機能を改善する作用を有すると鑑別することを特徴とする、皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法。
(3)更に、前記検体が、皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルに対して、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有するか否かを鑑別し、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有する場合には、より好ましい皮膚バリア機能改善素材であると鑑別することを特徴とする、(2)に記載の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法。
(4)(3)に記載の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法において、スクリーニング評価の結果を、1)タイトジャンクションの傷害からの回復促進も、セラミドの産生促進作用も有さない素材、2)タイトジャンクションの傷害からの回復促進作用は有するが、セラミドの産生促進作用は有さない素材、3)タイトジャンクションの傷害からの回復促進は有さないが、セラミドの産生促進作用は有する素材、4)タイトジャンクションの傷害からの回復促進も、セラミドの産生促進作用も有する素材の4つに分類し、それぞれの分類ごとに序列を決めることを特徴とする、(3)に記載のスクリーニング方法。
本発明の セラミドの組織内輸送の鑑別法は、 皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルにおける標識の存在状況を観察することを特徴とする。前記の皮膚としては、所望により体毛を除去し、生体より採取した皮膚断片であって、角層などを除いた、表皮顆粒層、表皮基底層及び真皮部分からなるものが好ましく、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウサギの皮膚断片が好ましい。又、前記培養皮膚三次元モデルとしては、ヒト乃至はヒトを除く動物の皮膚より採取した、正常な(癌化していない)ケラチノサイト、フィブロブラストなどの皮膚細胞を培養し、三次元構造を構築し、皮膚の皮膚の構造に疑似させたものが好ましく、この様な形態の市販品を購入して使用することも出来る。好ましい市販品としては、例えば、倉敷紡績株式会社から販売されている「EFT-400」(正常培養ヒト三次元皮膚モデル)などが好適に例示できる。特に表皮成分のみで構成される「EPI-200」や、USA MaTek社から販売されている「EpiDerm」などがさらに好適に例示できる。かかる皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルは、標識されたセラミドを含む培地中で1〜10時間、好ましくは3〜5時間培養し、標識されたセラミドを細胞内に取り込ませる。PBS(リン酸緩衝生理食塩水)や液体培地で洗浄した後、新鮮な培地に交換して培養を続ける。6〜24時間後、好ましくは12〜18時間後に培地を回収し、その蛍光強度を計測したり、組織を切片に加工して、蛍光顕微鏡下観察して取り込まれたセラミドの量を蛍光として捉え、定量するとともにその存在位置を鑑別する。回収した培地中のセラミド量が多かったり、培養皮膚三次元モデルにおける、表皮細胞間の角層側を上部分とした場合にセラミドが上部分に多く輸送されたほうが角層形成が促進され、皮膚バリア機能改善作用を有する。切片においてはさらにその鑑別には、蛍光顕微鏡の観察像をコンピューターなどに取込み、アドビ社製の「フォトショップ」などの画像処理ソフトを用いて、二値化などの画像処理を行い、蛍光部位と非蛍光部位とを分けて、存在位置を二次元分布として把握することが出来る。又、白点と黒点の面積比より、蛍光強度を鑑別することも出来る。かかるセラミドの組織内輸送状況は、後記の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法の指標として使用することが出来る。
本発明の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法は、前記のセラミドの組織内輸送の鑑別法において、検体が標識されたセラミドの組織内輸送に与える影響を鑑別し、セラミドの組織内輸送が、検体が存在しない条件に比して促進された場合には前記検体は、セラミドの欠乏による皮膚バリア機能の低下を改善する作用を有すると鑑別することを特徴とする。セラミドの組織内輸送は、前記の如くに、蛍光部分の面積の増大と、蛍光部分の広がりによって鑑別することが出来る。
(工程1)皮膚又は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害手段により傷害し、タイトジャンクション傷害皮膚モデルを作成する工程
(工程2)タイトジャンクション傷害皮膚モデルを検体で処理する工程
(工程3)工程2の検体で処理したタイトジャンクション傷害皮膚モデルと、検体で処理しないタイトジャンクション傷害皮膚モデルをタイトジャンクション機能トレーサーキットの片方、好ましくは標識されたビオチンで処理する工程
(工程4)工程3のトレーサー処理した皮膚モデルより顕微鏡用の標本を作製する工程
(工程5)工程4の標本をトレーサーキットのもう一方、好ましくは、蛍光標識アビジンで処理する工程
(工程6)工程4の標本を顕微鏡下、好ましくは蛍光顕微鏡下観察する工程
(好ましくは工程7)工程6の顕微鏡像をイメージ画像としてコンピューターに取込み、画像処理し、蛍光部と非蛍光部とに分け、蛍光部の量比を求める工程
(好ましくは工程8)工程7の蛍光部の量比と、検体処理の相関関係の程度を求め、タイトジャンクション機能の回復促進作用の有無を鑑別する工程
(工程2、3)処理検体として500μg/mlε,γ−グルタミルリジンと0.1%パルマリア抽出物の混合物を含む、1mMカプリン酸ナトリウムを含まない培地に交換して培養を続け、一定時間ごとに「EPI-200」を回収する1時間前にトレーサーとして「EZ-LinkTM-スルフォ-NHS-LC-ビオチン」(ピアス社製)を最終濃度0.1mg/mlになるように加えた。一方、未処理検体として500μg/mlε,γ−グルタミルリジンと0.1%パルマリア抽出物を含まない70%エタノール水溶液を添加し、同様に培養を続けた。
(工程4)工程1〜3で処理した「EPI-200」を回収し、「OCTコンパウンド」(サクラファインテック社製)に浸漬し、液体窒素中で凍結した。続いて凍結切片作製装置にて凍結切片標本を作製した。
(工程5)該標本をウサギ抗オクルディン抗体(インビトロジェン社製)と反応させ、その後FITC標識ロバ抗ウサギ抗体(ICN-ファーマシューティカル社製)及びストレプトアビジン-テキサスレッド(オンコジーン社製)と反応させた。
(工程6)工程5で得た標本を488、543nmの2波長で、蛍光顕微鏡下で観察した。
<工程2>500μlの新鮮な維持培地に置換し、37℃、5% CO2で20時間培養した。
<工程3>300μlの5%脱脂牛血清アルブミンを含む維持培地に置換し、4℃で30分間静置した。
<工程4>工程3を2回繰り返した。
<工程5>新鮮な維持培地及び1mMカプリン酸ナトリウムを含む維持培地にそれぞれ置換し、37℃、5%二酸化炭素で培養した。
<工程6>培養12時間後、1mM カプリン酸ナトリウムを含まない新鮮な維持培地に置換した。
<工程7>一定時間培養後「EPI-200」を支持体から切り離し、「OCTコンパウンド」(サクラファインテック社製)に包埋して液体窒素で凍結した。
<工程8>凍結切片を作製し、蛍光顕微鏡下、励起波長470nm/蛍光波長525nmで観察した。
Claims (4)
- 皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルを標識されたセラミドとともに培養し、しかる後に、皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルにおける標識されたセラミドの存在状況を観察することを特徴とする、セラミドの組織内輸送の鑑別法。
- 請求項1に記載のセラミドの組織内輸送の鑑別法において、検体が標識されたセラミドの組織内輸送に与える影響を鑑別し、セラミドの組織内輸送が、検体が存在しない条件に比して促進された場合には前記検体は、セラミドの欠乏による皮膚バリア機能を改善する作用を有すると鑑別することを特徴とする、皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法。
- 更に 前記検体が、皮膚乃至は培養皮膚三次元モデルのタイトジャンクションを傷害処理してなる、タイトジャンクション傷害皮膚モデルに対して、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有するか否かを鑑別し、タイトジャンクションの傷害からの回復効果を有する場合には、より好ましい皮膚バリア機能改善素材であると鑑別することを特徴とする、請求項2に記載の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法。
- 請求項3に記載の皮膚バリア機能改善素材のスクリーニング法において、スクリーニング評価の結果を、1)タイトジャンクションの傷害からの回復促進も、セラミドの産生促進作用も有さない素材、2)タイトジャンクションの傷害からの回復促進作用は有するが、セラミドの産生促進作用は有さない素材、3)タイトジャンクションの傷害からの回復促進は有さないが、セラミドの産生促進作用は有する素材、4)タイトジャンクションの傷害からの回復促進も、セラミドの産生促進作用も有する素材の4つに分類し、それぞれの分類ごとに序列を決めることを特徴とする、請求項3に記載のスクリーニング方法。
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