JP2005130853A - リン脂質の特異的検出方法および検出のための分子プローブ並びにタンパク質、それをコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

【課題】 各種ホスホイノシチド、特にホスファチジルイノシトール−４−リン酸を特異的に検出する方法を提供する。
【解決手段】 リン脂質を特異的に検出する方法であって、リン脂質に特異的に結合するタンパク質ドメイン構造を持つ分子プローブを用いて検出することを特徴とするリン脂質を特異的に検出する方法。
リン脂質を特異的に検出するための分子プローブであって、リン脂質に特異的に結合するタンパク質ドメイン構造を持つことを特徴とする分子プローブ

Description

本発明は、リン脂質に特異的に結合する性質をもつ分子プローブを用いてリン脂質を検出する方法に関する。また本発明は、リン脂質に特異的に結合する性質をもつ分子プローブおよびタンパク質、遺伝子に関する。

生命体の最小単位である細胞は、生体膜とよばれる構造体で細胞内部と外界との境界、あるいは細胞内の構造体の境界が形成されている。このうち特に、細胞の外周を取り巻く生体膜は、形質膜、あるいは細胞膜と呼ばれ、この他に各種の細胞内構造体を取り巻く生体膜も存在する。いずれも基本的な構造は同じであるが、特に真核細胞では、各種の細胞内構造体の機能を行うため、生体膜は各組織ごとに構造的、構成成分的に分化している。生体膜の主成分は極性脂質および膜タンパク質であり、両親媒性の極性脂質は、疎水部分を内側に配位した脂質二重層を形成し、その中に膜タンパク質の疎水部分が陥入するという構造をとっている。生体膜を構成している極性脂質の大部分はリン脂質である。リン脂質は、その疎水部分がグリセロールからなるグリセロリン脂質と、スフィンゴシンからなるスフィンゴリン脂質に大別され、前者にはホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールなどがあり、また後者にはスフィンゴミエリンなどがある。

このように、生体膜はさまざまなリン脂質から構成されているが、膜の構成成分という機能の他に、それぞれのリン脂質がどのような役割を果たしているかといったことには、関心を持たれることはあまり多くはなかった。しかしながら近年、脂質がシグナル伝達系や膜輸送系において重要な役割を果たしていることが次第に明らかになり、急速にその重要性が見なおされてきた。前述のリン脂質のうち、特に重要な役割に深く関わっているとされるのが、ホスファチジルイノシトールである。

ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）は、イノシトール環をもつグリセロリン脂質であり、生体膜における存在比率は、生物種により開きがあるが、おおよそ２％〜３０％程度を占めているとされる。ＰＩは、それ自身が持つイノシトール環の３，４，５位の水酸基が可逆的にリン酸化されることで、ホスホイノシチドと総称されるリン酸化代謝物が派生する。ホスホイノシチドには、リン酸化された位置と数により、以下のような種類があり、即ちホスファチジルイノシトール−３−リン酸（ＰＩ３Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸（ＰＩ４Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸（ＰＩ５Ｐ）、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸（ＰＩ（３，４）Ｐ２）、ホスファチジル−３，５−ビスリン酸（ＰＩ（３，５）Ｐ２）、ホスファチジル−４，５−ビスリン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）、ホスファチジル−３，４，５−トリスリン酸（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）がある。ＰＩ自体はリン脂質全体に占める割合は比較的多いが、その他のホスホイノシチドの含有量は、ＰＩ４Ｐ、ＰＩ４，５Ｐ２が０．１％〜１％と少なく、さらにその他については非常にわずかな量しか存在しない。

ホスホイノシチドは、現在までの知見において、大別して以下の２つの役割を果たしていると考えられている。一つ目は、ホスホリパーゼの分解基質としての役割で、その分解産物であるイノシトールリン酸とジアシルグリセロールは、いずれもシグナル伝達系における二次メッセンジャーとなる。二つ目は、リン脂質それ自身が生理活性を持つ役割であり、具体的には細胞内のタンパク質との相互作用相手としてや、細胞骨格系の調節、酵素活性の制御、膜輸送系への関与などが知られている。

ホスホリパーゼの分解基質としての役割の例としては、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸（ＰＩ（４，５）Ｐ２）のホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）による分解系が挙げられる。ＰＬＣは、Ｇプロテイン共役系またはチロシンキナーゼ共役系という二つの経路により活性化され、ＰＩ（４，５）Ｐ２を分解する働きを持つ。分解されたＰＩ（４，５）Ｐ２からは、分解産物としてイノシトール−３，４，５−トリスリン酸（ＩＰ３）およびジアシルグリセロール（ＤＧ）が生成すし、これらはいずれも二次メッセンジャーとして機能する。具体的には、ＩＰ３は小胞体上のＩＰ３受容体と結合して小胞体中のカルシウムイオンを細胞質内に放出、さまざまな細胞内のカルシウム依存性経路を活性化する働きを持ち、またＤＧはプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する因子として働く。

一方で、ホスホイノシチド自身が生理活性を持つ役割は、前述の二次メッセンジャー産生基質としての役割よりもさらに後年になって見出されたものである。その中で特に関心を持たれているのが、ホスホイノシチドの膜輸送への関与である。その一例として、ＰＩ（４，５）Ｐ２は細胞外への小胞輸送（エクソサイトーシス）に必須であることが知られている。しかしながら、その作用機構は未だ正確には明らかになっていない。

このような細胞内での様々な機能の局在を知る上で、さらにはそれぞれの反応系の詳細を解析する上で、種々のリン脂質の細胞内での局在を知ることは非常に重要であるといえる。

一方、細胞内において、細胞内小器官（オルガネラ）を選択的にリソソームまたは液胞へ融合させて分解する反応（オートファジー）においても、ホスホイノシチドが重要な役割を果たしているのではないかといったことが示唆されている。中でも、ペルオキシソームに対して選択的に起こるオートファジーは、特にペキソファジーと呼ばれ、現在最も精力的に研究が進められている分野のひとつである。ペキソファジーには、Ｐａｚタンパク質と呼ばれる一連のタンパク質群が反応の各ステップにおいて重要な役割を果たしていることがわかっている。そのうちのひとつであるＰａｚ４タンパク質は、ペキソファジーの一形態であるミクロペキソファジーにおいて、その反応のステージ１後期からステージ２への進行に関与しているタンパク質であり、ｐａｚ４遺伝子を欠失した細胞株は、ミクロペキソファジーがステージ１後期で停止することが知られている。Ｐａｚ４タンパク質には、前述した脂質結合ドメインであるＰＨドメインとともに、ＧＲＡＭドメインと呼ばれる構造が含まれている。ＧＲＡＭドメインは当初、様々なタンパク質の構造中に存在が確認されていたが、その機能はこれまでよくわかっていなかった。

このようにホスホイノシチドは生体にとって重要な役割を果たしていると予想されているが、それぞれのホスホイノシチドが、生体内のどの部位に局在するかの情報を検出する技術が、その解析に必要不可欠であると考えられる。
また、種々のタンパク質においてさまざまな脂質結合ドメインが見出されている。具体的には、ＰＨ（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｒｏｇｙ）ドメイン、ＰＸ（ｐｈｏｘ）ドメイン、Ｃ２−ＣａＬＢ（Ｃａ２＋ ｌｉｐｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメイン、ＦＹＶＥドメイン、ＦＥＲＭドメイン、ＥＮＴＨ（ｅｐｓｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメイン、ＴＢＣドメイン、ＳＴＡＲＴ（ｓｔｅｒｏｉｄｇｅｎｉｃ ａｃｕｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）ドメインなどが挙げられる。これらはいずれも、一種または複数種のリン脂質に特異的に結合する性質を持っている。言い換えれば、各リン脂質の構造の違いが、上記のようなドメイン構造を持つそれぞれのタンパク質が関与する一連の反応に影響を与えうるということであり、いくつかのホスホイノシチドに関しては、前述の脂質結合ドメインがそれぞれ特異的に結合することが知られているが、ＰＩ４Ｐのみに特異的に結合する脂質結合ドメインはこれまで知られていなかった。

上記のような理由から、各種ホスホイノシチド、特にホスファチジルイノシトール−４−リン酸を特異的に検出する方法が求められていた。すなわち本発明の目的は、各種ホスホイノシチド、特にホスファチジルイノシトール−４−リン酸を特異的に検出する方法を提供することにある。また本発明の目的は、各種ホスホイノシチド、特にホスファチジルイノシトール−４−リン酸を特異的に検出する分子プローブを提供することにある。

前述の目的を達成するために、本発明者らは鋭意検討重ね、上記のリン脂質に特異的に結合するドメインを持つタンパク質に蛍光を発するドメインを結合させることにより、リン脂質の存在位置を検出することができることを見出し、さらにはＧＲＡＭドメインがホスファチジルイノシトール−４−リン酸に特異的に結合する性質を持つことを見出し、さらに蛍光標識したタンパク質ドメイン、特にＧＲＡＭドメインを含む分子プローブによりリン脂質、特にホスファチジルイノシトール−４−リン酸を特異的に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は以下の項目からなる。

（１） リン脂質を特異的に検出する方法であって、リン脂質に特異的に結合するタンパク質ドメイン構造を持つ分子プローブを用いて検出することを特徴とするリン脂質を特異的に検出する方法。

（２） タンパク質ドメイン構造が、野生型タンパク質由来のタンパク質ドメインもしくはそれに類似する配列を含むことを特徴とする（１）に記載の方法。

（３） 野生型タンパク質が、酵母由来であることを特徴とする（１）〜（２）に記載の方法。

（４） 酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであることを特徴とする、（１）〜（３）に記載の方法。

（５） タンパク質ドメイン構造が、ＧＲＡＭドメインであることを特徴とする（１）〜（４）に記載の方法。

（６） リン脂質が、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルイノシトール−３−リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸から選択されるいずれかのホスホイノシチドであることを特徴とする（１）〜（５）に記載の方法。

（７） リン脂質が、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸であることを特徴とする（１）〜（６）に記載の方法。

（８） 分子プローブが、蛍光物質が付加されていることを特徴とする（１）〜（７）に記載の方法。

（９） 蛍光物質が、蛍光色素または蛍光タンパク質であることを特徴とする（１）〜（８）に記載の方法。

（１０） 蛍光物質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択されるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする（１）〜（９）に記載の方法。

（１１） リン脂質を特異的に検出するための分子プローブであって、リン脂質に特異的に結合するタンパク質ドメイン構造を持つことを特徴とする分子プローブ

（１２） タンパク質ドメイン構造が、野生型タンパク質由来のタンパク質ドメインもしくはそれに類似する配列を含むことを特徴とする（１１）に記載の分子プローブ。

（１３） 野生型タンパク質が、酵母由来であることを特徴とする（１１）〜（１２）に記載の分子プローブ。

（１４） 酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであることを特徴とする、（１１）〜（１３）に記載の分子プローブ。

（１５） タンパク質ドメイン構造が、ＧＲＡＭドメインであることを特徴とする（１１）〜（１４）に記載の分子プローブ。

（１６） リン脂質が、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルイノシトール−３−リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸から選択されるいずれかのホスホイノシチドであることを特徴とする（１１）〜（１５）に記載の分子プローブ。

（１７） リン脂質が、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸であることを特徴とする（１）〜（１６）に記載の分子プローブ。

（１８） 分子プローブが、蛍光物質が付加されていることを特徴とする（１１）〜（１７）に記載の分子プローブ。

（１９） 蛍光物質が、蛍光色素または蛍光タンパク質であることを特徴とする（１１）〜（１８）に記載の分子プローブ。

（２０） 蛍光物質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択されるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする（１１）〜（１９）に記載の分子プローブ。

（２１）リン脂質と特異的に結合する部位および蛍光を発する部位とを含有することを特徴とするタンパク質。

（２２）リン脂質と特異的に結合する部位が、酵母由来もしくはそれに類似する構造であることを特徴とする（２１）に記載のタンパク質。

（２３） 酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであることを特徴とする、（２２）に記載のタンパク質。

（２４）リン脂質と特異的に結合する部位が、ＧＲＡＭドメインであることを特徴とする（２１）〜（２３）のいずれかに記載のタンパク質。

（２５）リン脂質が、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルイノシトール−３−リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸から選択されるいずれかのホスホイノシチドであることを特徴とする（２１）〜（２４）のいずれかに記載のタンパク質。

（２６）蛍光を発する部位が、蛍光色素または蛍光タンパク質であることを特徴とする（２１）〜（２５）のいずれかに記載のタンパク質。

（２７）蛍光を発する部位が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択されるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする（２１）〜（２６）のいずれかに記載のタンパク質。

（２８）上記（２１）〜（２７）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。

本発明により、今まで困難であった生体内のホスファチジルイノシトール−４−リン酸の局在部位が容易にかつ短時間で検出可能となった。

まず本発明は、分子プローブを用いてリン脂質を特異的に検出する方法である。また本発明はその分子プローブである。さらにはリン脂質を特異的に検出できるプローブとして好適に用いられるタンパク質であり、このタンパク質をコードする遺伝子である。

ここでいう分子プローブとは、一分子または数個の分子の集合体で、何らかの対象を検出する機能を持つ分子を指し、その構造は特に限定されないが、タンパク質や核酸などの高分子が好ましく、特に一分子のタンパク質であることが好ましい。さらに具体的には、リン脂質を特異的に結合する性質を持つタンパク質ドメイン構造および蛍光物質を構造中に含有する分子プローブであることが好ましい。

タンパク質ドメイン構造は、野生型タンパク質由来のタンパク質ドメインもしくはそれに類似する配列を含むことが好ましい。なお本発明で述べる類似する構造及び類似体とは、ドメイン構造等の機能を失わない程度で改変されていても良いという意味であり、具体的には、ドメイン構造等の好ましくは１０％以内、より好ましくは７％以内、さらに好ましくは５％以内、特に好ましくは３％以内、最も好ましくは２％以内のタンパク質が置換、欠失、付加されていても良い。

また、ここでいうリン脂質とは、どのようなものであっても良いが、機能的に特徴の多いとされるホスファチジルイノシトールやそのリン酸化代謝物であるホスホイノシチド、具体的にはホスファチジルイノシトール−３−リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸であることが好ましく、さらに具体的にはホスファチジルイノシトール−４−リン酸であることが好ましい。

また、ここでいうリン脂質を特異的に結合する性質を持つタンパク質ドメイン構造とは、どのようなものであっても良いが、天然タンパク質中に存在するＰＨ（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｈｏｍｏｒｏｇｙ）ドメイン、ＰＸ（ｐｈｏｘ）ドメイン、Ｃ２−ＣａＬＢ（Ｃａ２＋ ｌｉｐｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ）ドメイン、ＦＹＶＥドメイン、ＦＥＲＭドメイン、ＥＮＴＨ（ｅｐｓｉｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメイン、ＴＢＣドメイン、ＳＴＡＲＴ（ｓｔｅｒｏｉｄｇｅｎｉｃ ａｃｕｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ）ドメイン、ＧＲＡＭドメインなどもしくはそれに類似する構造をもつ構造が好適に使用され、特にＧＲＡＭドメインが好適に用いられる。またここでいう天然タンパク質とは、その由来は特に限定されないが、酵母などが好適に用いられる。

また、ここでいう蛍光物質とは、各種蛍光色素や、各種蛍光タンパク質を指すが、細胞内で発現させるという目的においては、蛍光タンパク質を用いることが好ましい。具体的には、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体等の各種蛍光タンパク質を用いることが好ましい。

上記のように、プローブとして好適に用いることができる、リン脂質と特異的に結合する部位と蛍光を発する部位とを合わせ持つタンパク質は、それぞれの部位を別に作製した後に結合させる手も良いが、好ましくはタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡ、またはＲＮＡとして細胞内に組み込み、細胞内で合成することが好ましい。

細胞への遺伝子ＤＮＡあるいはＲＮＡの導入法は、いかなる方法を用いてもよいが、一般的に多用されるエレクトロポレーション法や、陽イオンリポソーム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、ウィルス感染法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、活性型デンドリマー法、非リポソーム系脂質法などが好適に使用される。また本発明における遺伝子ＤＮＡあるいはＲＮＡを導入した細胞については、一過性にＤＮＡあるいはＲＮＡが導入された細胞（トランジエントトランスフォーマント）であってもよいし、安定的にＤＮＡが導入された細胞（ステーブルトランスフォーマント）であってもよい。

また、本発明のタンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡをプラスミドに組み込み、これを酵母や大腸菌等の菌類等に形質転換して発現させることが好ましい。

なお、生体細胞内での合成にとどまらず、無細胞タンパク合成系で合成しても良い。

本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。

実施例１
ＧＲＡＭプローブの精製
酵母ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ） のＰａｚ４タンパク質をコードする遺伝子ＵＧＴ５１Ｂ１ のＧＲＡＭドメインに相当する部位を、合成ヌクレオチドＧＲＡＭ−Ｎ１（配列番号１）とＧＲＡＭ−Ｃ１（配列番号２）をプライマーとして宝バイオ社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（R）ＤＮＡ ポリメラーゼを用いたＰＣＲ法により増幅した。増幅された遺伝子断片を黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする遺伝子と共にアマシャムバイオサイエンス社製プラスミドＤＮＡ ｐＧＥＸ６Ｐ−１にクローニングし、ＧＲＡＭドメインをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＹＦＰとの融合タンパク質として発現させるための発現プラスミドを構築した。またセミインタクト細胞系に使用するプローブ作成のため、先述ＧＲＡＭドメインの相当部位を合成ヌクレオチドＧＲＡＭ−Ｎ２（配列番号３）とＧＲＡＭ−Ｃ２ （配列番号４）をプライマーとして宝バイオ社製Ｐｙｒｏｂｅｓｔ(R) ＤＮＡ ポリメラーゼを用いたＰＣＲ法により増幅し、クロンテック社製プラスミドｐＥＣＦＰ−Ｎ１にクローニングした。得られたプラスミドｐＣＧ１からＧＲＡＭドメイン−ＣＦＰをコードする遺伝子部分をアマシャムバイオサイエンス社製プラスミドＤＮＡ ｐＧＥＸ６Ｐ−１にクローニングし、ＧＲＡＭドメインをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＣＦＰとの融合タンパク質として発現させるための発現プラスミドを構築した。以上の方法により作成されたプラスミドｐＧＹＧ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ＹＦＰ−ＧＲＡＭドメインをコードするプラスミド）、およびプラスミドｐＧＧＣ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ＧＲＡＭドメイン−ＣＦＰをコードするプラスミド）を、それぞれノバジェン社製大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（R） ＤＥ３コンピテントセルおよびＲｏｓｅｔｔａ（R） ＤＥ３ｐＬｙｓコンピテントセルに導入し、それぞれ大腸菌株ＧＹＧ１、ＧＧＣ１を得た。本株を０．２ｍＭ のイソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）添加後２０℃で１６時間浸とうし回収した。回収菌体を超音波破砕した後遠心により上澄みだけを回収し、アマシャムバイオサイエンス社製グルタチオンセファロース（R） ４Ｂ樹脂と混合した。樹脂に吸着したプローブを１０ｍＭの還元型グルタチオンを含む溶液で溶出させ、セルロース膜を介した透析で還元型グルタチオンを除去したものを精製品として使用した。

実施例２
ＧＲＡＭプローブによるリポソームとの結合実験
シグマ社製のフォスファチジルイノシトールとフォスファチジルセリンとを等量混合し、そこにシグマ社製各種リン酸化フォスファチジルイノシトール（ＰＩＰ）をモル比で１％分加えた。この脂質を２５ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩水に懸濁し、氷冷しながら超音波をかけリポソームを作成した。リポソームは脂質量にして１ｍｇ／ｍｌとなるよう生理食塩水で希釈し、以下の実験に用いた。
１ｍｌの生理食塩水に対し、２．５μｇの精製プローブと、脂質量にして０．２５ｍｇ相当のリポソームを加えて懸濁し、１０分間室温に置いた。この懸濁液を１０，０００ｇで１５分間遠心し、リポソームに結合したプローブを共沈させた。その後島津製作所製蛍光光度計ＲＦ−５３００ＰＣでリポソームに結合せず上清画分に残留したＹＦＰの蛍光強度を測定した。
その結果を図１に示す。各種ＰＩＰを含むリポソームと混合したサンプルから得た蛍光強度と、ＰＩＰを含まないリポソームと混合したサンプルから得た蛍光強度の差から、各種ＰＩＰに特異的に結合したプローブの量を算出した。精製ＧＲＡＭプローブが各種ＰＩＰの中でもフォスファチジルイノシトール４リン酸に対し特異的な結合活性をもつことが明らかとなった。

実施例３
脂質吸着膜に対するＧＲＡＭプローブの結合実験
各種脂質をスポット上に吸着させたニトロセルロース膜であるＰＩＰ−Ｓｔｒｉｐｓ（R）は、エケロン社より購入した。本膜を重量比３％の脂肪酸無含ウシ血清アルブミンと体積比０．０５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートを含む溶液中で１μｇ／ｍｌの精製プローブと混合し４℃で１４時間攪拌した。その後モレキュラープローブス社製抗緑色蛍光タンパク質抗体およびアマシャムバイオサイエンス社製の西洋わさびパーオキシダーゼ標識抗ウサギイミュノグロブリン抗体と順次室温で１時間ずつ混合し、パーキンエルマーライフサイエンス社製Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ（R）キットにより膜に結合したプローブを可視化した。
その結果を図２に示す。図２ＡはＰＩＰ−Ｓｔｒｉｐｓ^（R)に結合したプローブを可視化したものである。黒い円状のパターンを図２Ｂに図示した吸着脂質のパターンと比較しても分かるように、本精製プローブはアッセイした脂質の中でも特にフォスファチジルイノシトール４リン酸にのみ強い結合を示すことが明らかとなった。

実施例４
ＧＲＡＭプローブの酵母細胞内での発現とその細胞内局在の可視化
ＧＲＡＭプローブ精製のために作成したプラスミドｐＧＹＧ１より、ＹＦＰ−ＧＲＡＭに相当する遺伝子をタカラバイオ社製制限酵素Ｂａｍ ＨＩとＸｈｏ Ｉにより切り出し、酵母発現用ベクターｐＩＢ４（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ０２７９６１）にライゲーションさせた。得られたプラスミドｐＹＰＧ１をタカラバイオ社製制限酵素Ｓｔｕ Ｉで切断後、酵母ピキアパストリス野生株ＰＰＹ１２に導入し、ＹＰＧ１株を得た。ＹＰＧ１株はグルコース含有培地で増殖させた後、プローブの大量発現のためにメタノールを炭素源とする培地に移され、２８℃で１５時間振とう培養された。この培地変換と同時に細胞内小器官である液胞を標識するためにモレキュラープローブス社製蛍光色素ＦＭ（R） ４―６４を７．５μＭ添加した。その後ＹＰＧ１株を再びグルコース含有培地に移して１時間培養したものを観察標本とした。観察はオリンパス光学工業社製蛍光顕微鏡ＩＸ ７０を用いて行われた。
その結果を図３に示す。プラスミドｐＹＰＧ１内部のアルコールオキシダーゼプロモーターにより、メタノール存在条件で多量に転写・翻訳されたプローブは、図３で示すような細胞内の粒状のパターンを示した。これら粒状パターンのうちのいくつかは、蛍光色素ＦＭ（R） ４―６４で標識された液胞膜の局在と重なって存在した。

実施例５
ＧＲＡＭプローブの哺乳類培養細胞内での発現とその細胞内局在の可視化
ＧＲＡＭプローブ精製のために作成したプラスミドｐＧＹＧ１より、ＹＦＰ−ＧＲＡＭに相当する遺伝子をタカラバイオ社製制限酵素Ｂａｍ ＨＩとＸｈｏ Ｉにより切り出し、クロンテック社製哺乳類発現用ベクターｐＴＲＥ２ｈｙｇにライゲーションした。得られたプラスミドｐＴＹＧ１をクロンテック社製ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ（R）を用いてクロンテック社製ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）培養細胞株であるＢＤ（R） Ｔｅｔ−ｏｎ細胞株に導入した。 抗生物質ハイグロマイシンへの耐性を指標にして選抜された細胞を、０．１％ポリ−_Ｌ−リジンでコートされたガラスボトム培養皿上で培養した。細胞が先述培養皿に接着した後、培養液にドキシコリンを１μｇ／ｍｌ添加してＹＦＰ−ＧＲＡＭプローブの発現を誘導した。誘導４８時間後、培養液をハンクス平衡塩溶液と交換し、モレキュラープローブス社製ＢＯＤＩＰＹ（R） ＴＲ−セラミド を１００倍希釈となるよう加えた。３７℃で１時間静置した後、カールツァイス社製の共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡにより観察した。
その結果を図４に示す。ドキシコリン添加によりＢＤ（R） Ｔｅｔ−ｏｎ細胞株中で多量に転写・翻訳されたプローブは、図４に示すように細胞内の多数の点状パターンとして可視化された。特に集中的にプローブが局在する細胞内の部位には、ゴルジ体標識試薬であるＢＯＤＩＰＹ（R） ＴＲ−セラミドによるシグナルも局在していた。

実施例６
ＧＲＡＭプローブの酵母セミインタクト細胞内局在の可視化
酵母セミインタクト細胞は、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの野生株をグルコース培地で培養後、０．７５％のメタノールを含む培地で１５時間培養したものより作成した。培養した酵母細胞を１％のメルカプトエタノールで処理後、０．１Ｍのグルコースと１ｍｇ／ｍｌの生化学工業社製Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ １００Ｔを含む溶液に移して４５分間しんとうさせ細胞壁の消化を行った。 次に０．６Ｍのソルビトールを含む塩溶液に細胞を移し、液体窒素の入った容器中に吊り下げて凍結させた。 常温の０．５Ｍおよび０．２５Ｍソルビトールを含む塩溶液に凍結細胞を順に移して急速融解させることにより、細胞表面に小孔を作りセミインタクト細胞系を構築した。ここに前述のＧＲＡＭプローブ発現株ＧＧＣ１株より精製したＧＲＡＭプローブを最終濃度１．３ｍｇ／ｍｌとなるよう加え、３０分間常温で静置した。その後、セミインタクト細胞を塩溶液に置換し、オリンパス光学工業社製蛍光顕微鏡ＩＸ ７０を用いて観察した。
その結果を図５に示す。観察視野中のいくつかの細胞において、図５に示すとおりＧＲＡＭプローブによるＣＦＰシグナルの局在が観察された。 特にＧＲＡＭプローブが帯状の局在を示す細胞においては、細胞内膜移行タンパク質ＰｐＡｔｇ８の融合タンパク質の示す蛍光シグナルと一致したことから、ＧＲＡＭプローブがセミインタクト細胞における特定膜の標識に用いることが可能であることが判明した。

本発明により、今まで困難であった生体内のリン脂質の存在場所が容易にかつ短時間で検出可能となり、生体内の伝達系や輸送系、反応系の解明に大きな貢献ができるため、産業界に寄与すること大である。

各種ＰＩＰを含むリポソームと混合したサンプルから得た蛍光強度と、ＰＩＰを含まないリポソームと混合したサンプルから得た蛍光強度の差から、各種ＰＩＰに特異的に結合したプローブの量を算出した図。ＰＩ（３）Ｐ：フォスファチジルイノシトール ３―モノリン酸ＰＩ（４）Ｐ：フォスファチジルイノシトール ４―モノリン酸ＰＩ（５）Ｐ：フォスファチジルイノシトール ５―モノリン酸ＰＩ（３，４）Ｐ２：フォスファチジルイノシトール ３、４―ビスリン酸ＰＩ（３，５）Ｐ２：フォスファチジルイノシトール ３、５―ビスリン酸ＰＩ（４，５）Ｐ２：フォスファチジルイノシトール ４、５―ビスリン酸ＰＩ（３，４、５）Ｐ３：フォスファチジルイノシトール ３、４、５―トリリン酸 ＰＩＰ−Ｓｔｒｉｐｓ（R） に結合したプローブを可視化した図。ＬＰＡ： リゾフォスファチジン酸；ＬＰＣ： リゾフォスファチジルコリン； ＰＩ： フォスファチジルイノシトール；ＰＩ（３）Ｐ： フォスファチジルイノシトール ３−モノリン酸；ＰＩ（４）Ｐ： フォスファチジルイノシトール ４−モノリン酸；ＰＩ（５）Ｐ： フォスファチジルイノシトール ５−モノリン酸；ＰＣ： フォスファチジルコリン； ＰＥＡ： フォスファチジルエタノールアミン；Ｓ１Ｐ： スフィンゴシン １―リン酸ＰＩ（３，４）Ｐ_２： フォスファチジルイノシトール ３、４−ビスリン酸ＰＩ（３，５）Ｐ_２： フォスファチジルイノシトール ３、５−ビスリン酸ＰＩ（４，５）Ｐ_２： フォスファチジルイノシトール ４、５−ビスリン酸ＰＩ（３，４、５）Ｐ_３： フォスファチジルイノシトール ３、４、５−トリリン酸ＰＡ： フォスファチジン酸；ＰＳ： フォスファチジルセリンＢｌａｎｋ： 空白 酵母細胞内で発現させたＧＲＡＭプローブの局在観察像を示した図。Ａ： ＦＭ（R） ４―６４ の局在観察像Ｂ： ＧＲＡＭプローブの局在観察像Ｃ： ノマルスキ微分干渉顕微鏡による観察像Ｄ： Ａ〜Ｃの像を重ね合わせたもの 哺乳類培養細胞内で発現させたＧＲＡＭプローブの局在観察像を示した図。Ａ： ＢＯＤＹＰＹ（R） ＴＲ−セラミドの観察像Ｂ： ＧＲＡＭプローブの局在観察像Ｃ： ＡとＢを重ね合わせたもの 酵母セミインタクト細胞内でのＧＲＡＭプローブの局在観察像を示した図。Ａ： 細胞内発現させたＰｐＡｔｇ８の観察像Ｂ： セミインタクト細胞作成後付加したＧＲＡＭプローブの観察像Ｃ： ＡとＢを重ね合わせたもの

Claims (28)

1. リン脂質を特異的に検出する方法であって、リン脂質に特異的に結合するタンパク質ドメイン構造を持つ分子プローブを用いて検出することを特徴とするリン脂質を特異的に検出する方法。
2. タンパク質ドメイン構造が、野生型タンパク質由来のタンパク質ドメインもしくはそれに類似する配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 野生型タンパク質が、酵母由来であることを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
4. 酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. タンパク質ドメイン構造が、ＧＲＡＭドメインであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. リン脂質が、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルイノシトール−３−リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸から選択されるいずれかのホスホイノシチドであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. リン脂質が、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 分子プローブが、蛍光物質が付加されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 蛍光物質が、蛍光色素または蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 蛍光物質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択されるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. リン脂質を特異的に検出するための分子プローブであって、リン脂質に特異的に結合するタンパク質ドメイン構造を持つことを特徴とする分子プローブ。
12. タンパク質ドメイン構造が、野生型タンパク質由来のタンパク質ドメインもしくはそれに類似する配列を含むことを特徴とする請求項１１に記載の分子プローブ。
13. 野生型タンパク質が、酵母由来であることを特徴とする請求項１１〜１２のいずれかに記載の分子プローブ。
14. 酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれかに記載の分子プローブ。
15. タンパク質ドメイン構造が、ＧＲＡＭドメインであることを特徴とする請求項１１〜１４のいずれかに記載の分子プローブ。
16. リン脂質が、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルイノシトール−３−リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸から選択されるいずれかのホスホイノシチドであることを特徴とする請求項１１〜１５のいずれかに記載の分子プローブ。
17. リン脂質が、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸であることを特徴とする請求項１１〜１６のいずれかに記載の分子プローブ。
18. 分子プローブが、蛍光物質が付加されていることを特徴とする請求項１１〜１７のいずれかに記載の分子プローブ。
19. 蛍光物質が、蛍光色素または蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれかに記載の分子プローブ。
20. 蛍光物質が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択されるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれかに記載の分子プローブ。
21. リン脂質と特異的に結合する部位および蛍光を発する部位とを含有することを特徴とするタンパク質。
22. リン脂質と特異的に結合する部位が、酵母由来もしくはそれに類似する構造であることを特徴とする請求項２１に記載のタンパク質。
23. 酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓであることを特徴とする、請求項２２に記載のタンパク質。
24. リン脂質と特異的に結合する部位が、ＧＲＡＭドメインであることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれかに記載のタンパク質。
25. リン脂質が、ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルイノシトール−３−リン酸、ホスファチジルイノシトール−４−リン酸、ホスファチジルイノシトール−５−リン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリスリン酸から選択されるいずれかのホスホイノシチドであることを特徴とする請求項２１〜２４のいずれかに記載のタンパク質。
26. 蛍光を発する部位が、蛍光色素または蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項２１〜２５のいずれかに記載のタンパク質。
27. 蛍光を発する部位が、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、Ｖｅｎｕｓなどのオワンクラゲ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体、ウミシイタケ由来蛍光タンパク質およびその類似体、ＤｓＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＡｍＣｙａｎ、ＡｃＧＦＰ、Ｋａｅｄｅなどのサンゴ由来蛍光タンパク質およびそれらの類似体から選択されるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項２１〜２６のいずれかに記載のタンパク質。
28. 請求項２１〜２７のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。