JP2009261392A - リボヌクレオチド標識核酸検出 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ポリヌクレオチドは、1又は複数のリボヌクレオチドの存在下での標的核酸の配列を増幅するために使用される。リボヌクレオチドは、5’末端配列セグメントに対して相補的な、規則的間隔での増幅生成物に組込まれる。組込まれたリボヌクレオチドのすぐ3’側の結合での増幅生成物の分解は、標的核酸の存在又は不在を示す、検出的に明確なフラグメントを生成する。
【選択図】なし
Description
a)5’部分が複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは、少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’末端ヌクレオチド塩基が1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして
b)3’部分が少なくとも5個のヌクレオチドを含んで成る、5’部分及び3’部分を含んで成る。いくつかの態様においては、ポリヌクレオチドは約75、50又は25個以下の長さのヌクレオチドである。
他の好ましい態様においては、5’部分は、少なくとも3, 4, 5, 6, 7又は8個の連続配列セグメントを含んで成る。いくつかの好ましい態様においては、個々の配列セグメントは、少なくとも3, 4, 5, 6, 7又は8個のヌクレオチドを含んで成る。
また好ましい態様においては、3’末端は、ポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げるために除去できるブロッキング成分を含んで成る。特に好ましい態様においては、3’末端は2’ターミネーター成分を含んで成る。
(a)標的核酸と、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド組及びヌクレオチド組込み生触媒成分とを接触し、ここで、
(i)前記ポリヌクレオチドは5’部分及び3’部分を含んで成り、前記5’部分は1又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り;
(ii)前記ヌクレオチド組は、デオキシリボヌクレオチド(dNTP)の形での少なくとも2つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド(rNTP)の形での少なくとも1つのヌクレオチドの大部分を含んで成り、ここで前記リボヌクレオチドの塩基は、前記ポリヌクレオチドの個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり;そして
(iii)前記ヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成り;
(b)前記標的核酸を、前記ポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメント(すなわち、3’部分)を含んで成るアンプリコンを生成する増幅条件下で増幅し、ここで前記3’配列セグメントは1又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基はヌクレオチド組におけるNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸(NMP)であり;
(c)個々のNMPの3’側アンプリコンをフラグメントに分解し、前記分解が個々のフラグメントとして配列セグメントを開放し;そして
(d)前記アンプリコンフラグメントを検出し、ここで検出された配列セグメントフラグメントは標的核酸配列の増幅を示し、それにより、前記標的核酸配列を検出すること、を含んで成る。
他の好ましい態様においては、少なくとも1つのヌクレオチド塩基の少なくとも80%が、リボヌクレオチド(rNTP)の形で存在する。
さらなる好ましい態様においては、分解は、アンプリコンをアルカリ溶液にゆだねることにより実施される。
また好ましい態様においては、さらに本発明の方法は、標的核酸配列とポリヌクレオチド対とを接触する段階を含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチド等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る。
a)5’部分及び3’部分を含んで成る第1ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は1又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り;
b)デオキシリボヌクレオチド(dNTP)の形での少なくとも2つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド(rNTP)の形での少なくとも1つのヌクレオチドの大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり;及び
c)デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る。
a)5’部分及び3’部分を含んで成る第1ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は1又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り;
b)デオキシリボヌクレオチド(dNTP)の形での少なくとも2つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド(rNTP)の形での少なくとも1つのヌクレオチドの実質的に大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり;及び
c)デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る。
a)5’部分及び3’部分を含んで成る第1鎖、ここで前記5’部分は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして前記3’部分は、少なくとも5個のヌクレオチドを含んで成り;及び
b)前記第1鎖に対して相補的であり、そして1又は複数の連続配列セグメントを含んで成る配列セグメントを含んで成る3’部分を含んで成る第2鎖(ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチドがNMPである)を含んで成る二本鎖ポリヌクレオチドを含んで成る。
a本発明のアンプリコンを含んで成る組成物;
b)容器における又は支持体上の温度を調節するために、前記容器又は支持体と熱伝達するよう形状化された少なくとも1つの熱モジュレーター;
c)前記容器又は支持体に及び/又はそれから試薬を移行する少なくとも1つの試薬移行成分;及び
d)前記容器において又は支持体上に生成される1又は複数の配列セグメントの質量を検出するよう形状化された少なくとも1つの検出器を含んで成る少なくとも1つの容器又は支持体を含んで成る。
好ましい態様においては、検出器は、気相イオン分光計を含んで成る。
−容器における又は支持体上の温度の調節をもたらすための熱モジュレーター、
−容器への及び/又はそれから、又は支持体上への試薬の移行をもたらすための試薬移行成分、及び/又は
−容器において又は支持体上で生成される配列セグメントの質量の検出をもたらすための検出器、に操作可能的に連結される少なくとも1つの制御器を含んで成る。
用語“核酸”又は“ポリヌクレオチド”とは、リボース核酸(RNA)又はデオキシリボース核酸(DNA)ポリマーに対応され得るポリマー、又はその類似体に交換可能的に適用される。これは、ヌクレオチド、例えばRNA及びDNAのポリマー及びそれらの修飾された形、ペプチド核酸(PNA)、固定された核酸(LNATM)及び同様のものを包含する。ある態様においては、核酸は、複数のモノマータイプ、例えばRNA及びDNAサブユニットを含むポリマーであり得る。
1. 序言:
本発明は、最小数の反応段階を要し、そして便利で且つ真の多重化を可能にする多重検出のための方法を提供する。前記方法は、リボヌクレオチド塩基を組み込む反応(例えば、4種のヌクレオチド(A, C, G, T)の少なくとも1つがリボ塩基(rNTP)として、完全に又は一部、含まれる増幅反応)を使用する。標的核酸に対して特異的なプライマーが使用される。1つの又は両プライマーは、約3〜10個、又はそれ以上の塩基の1、2又はそれ以上の配列セグメント、及び個々の配列セグメントの5’末端で位置するリボ塩基に対して相補的な塩基を有する5’末端を有する。前記配列セグメントは、等質量のものであり得るが、但し必ずしも必要ではない。
本発明のポリヌクレオチドは、1、2又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及びヌクレオチドの鋳型に基づく延長を可能にするために標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る。
5’部分又は5’末端は、1、2又はそれ以上のタンデム(すなわち、連続)配列セグメントを含んで成り、個々の配列セグメントは、その個々の配列セグメントの5’末端で位置するユニークヌクレオチド塩基(すなわち、セグメントにおいてわずか1度、使用される)を含む。好ましい態様においては、5’部分又は5’末端における個々の配列セグメントは、等質量のものである。
ポリヌクレオチドの3’部分は、標的核酸配列にハイブリダイズし、そして延長されるために十分に相補的な核酸配列を有するよう企画される。3’部分は少なくとも5個の長さのヌクレオチド塩基であり、そして所望には、より長く、例えば約10、15、20、25、30、35、40、45 又は50個の長さのヌクレオチド塩基である。3’末端、又は3’部分の3’末端ヌクレオチド側の(−1)又は(−2)が、当業界において知られている方法に従って、標的核酸における特異的対立遺伝子又はSNP間を区別するために使用され得る。例えばプライマー延長又は熱循環のための典型的な反応条件は、約50 mM のトリシン-KOH, pH 7.5、00 mM のKOAc、3.0 mMのMg(OAc)2及び200 μMの個々のdNTPを包含し;アニーリング又はハイブリダイゼーション温度は、約50〜70℃、例えば約60〜65℃であり得る。
Zは、O、S又はSeである]を含んで成る。さらに例証すると、BGは任意には、下記式(III):
a.標的核酸と本発明のポリヌクレオチドとの接触
検出方法を実施する最初の段階は、標的核酸と、本発明のポリヌクレオチド、ヌクレオチド組、ヌクレオチド組込み生触媒成分との接触を包含する。
本発明の方法に使用されるヌクレオチド組は、リボヌクレオチド塩基(例えば、A, U, G又はC、又はもう1つのリボヌクレオチド、rNTP)の形で少なくとも1つの塩基を含む。いくつかの態様においては、ヌクレオチド組は、リボヌクレオチド塩基の形で少なくとも2個の塩基を含む。リボヌクレオチド塩基として含まれる1又は複数の塩基は、ヌクレオチド組においてリボヌクレオチド塩基として、完全に(例えば、100%リボヌクレオチド)、又は一部(例えば、100%以下のリボヌクレオチド)、又は一部(例えば、100%以下のポリヌクレオチド、ここで塩基の残りはデオキシヌクレオチド又はdNTP)、含まれ得る。
本発明に使用されるヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性の両者を含んで成る。好ましい態様においては、同じ触媒ドメインが、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性の両者を触媒することができる。他の好ましい態様においては、生触媒成分は少なくとも2種の触媒ドメインを含んでなり、その1つはデオキシリボヌクレオチド組込み活性を有し、他の1つはリボヌクレオチド組込み活性を有する。
前記方法に使用される5’−末端化されたポリヌクレオチドは、上記及び以下に記載されている。好ましい態様においては、標的核酸においては、多くの(例えば、複数の)5’−末端化されたポリヌクレオチドと接触される。他の好ましい態様においては、多数中の個々のポリヌクレオチドは、ユニーク質量の1、2又はそれ以上の配列セグメントを含んで成る5’部分を有することにより別々に同定できる。この場合、個々の5’−末端化されたポリヌクレオチドのアンプリコン又は補体のフラグメント化が、異なった質量のシグナル又は特徴的質量プロフィールを生成する。さらなる好ましい態様においては、ポリヌクレオチドは、1又は複数のプライマー対として標的核酸に接触される。
標的核酸は、いずれかの源、例えば動物又は植物からの組織サンプル、細菌又はウィルスからであり得るか、又は例えば反応混合物から合成され得る。標的核酸は例えば、ゲノムDNA、染色体又は染色セグメント、mRNA、cDNA、ベクター(例えば、発現ベクター)、発現カセット、裸DNA又はRNAポリマー、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)の生成物、オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマー、等であり得る。標的核酸は例えば一本鎖、二本鎖、等であり得、そしていずれかの特定の長さに制限されない。本発明の方法に使用される標的核酸は、1又は複数の単一ヌクレオチド多形現象(SNP)、挿入、欠失、置換又は他の区別する特徴を含むであろう。標的核酸は一般的に、サンプルで供給される。
i.増幅方法:
標的核酸は、当業界において知られているいずれかのポリヌクレオチド延長又は増幅方法を用いて、本発明の1又は複数のポリヌクレオチドにより増幅され得る。ポリメラーゼ鎖反応(PCR)、例えばRT-PCR、定量的PCR、多重化された及び同時PCRのいずれかの既知変法を用いての増幅が本発明の方法に使用され得る。
標的核酸配列の増幅は、二本鎖アンプリコンを生成し、ここでポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的なアンプリコンの鎖は、1又は複数の配列セグメントを含む3’部分を含んで成り、ここで前記配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基は組込まれたリボヌクレオチド一リン酸(rNMP)を含む。
アンプリコンの配列セグメントは、当業界において知られているいずれかの方法を用いて、分解され得る。本発明の好ましい態様においては、アンプリコンは、アルカリ(すなわち、塩基性溶液)にアンプリコンをゆだねることにより、組込まれたNMPの3’側結合で分解される。アンプリコンは好ましくは、組込まれたNMPの3’側結合の分解をもたらすのに十分な時間及び温度で、分解のためのアルカリ溶液に暴露される。一般的に、温度が高いほど、アルカリ処理のために必要な時間は短い。
アンプリコンフラグメント、又は分離され、そして開放される配列セグメントは、当業界において知られているいずれかの方法を用いて検出され得る。好ましい態様においては、分解されたフラグメントは、質量の同定により検出される。配列セグメントはまた、分解の前又は後、例えば蛍光発光団又は放射性同位体により、検出可能的にラベルされ得る。フラグメントは、5’又は3’末端で、又はいずれかのヌクレオチド塩基上で十分にラベルされ得る。例示される検出方法は、質量分光学、電気泳動分離、時間決定された蛍光検出、回転共鳴検出、及び固相(例えば、アレイ)へのハイブリダイゼーション、及び続く検出を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
本発明はまた、本発明の方法に包含される反応混合物も供給する。上記のいずれかの反応混合物が生成され得る。典型的な反応混合物は例えば、1,2又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及び標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る1又は複数の本発明のポリヌクレオチド;dNTPを含んで成るヌクレオチド組、ここで少なくとも1つの塩基の大部分はポリヌクレオチドであり;及びリボヌクレオチド組込み活性を有する生触媒成分を含んで成る。いくつかの態様においては、反応混合物は1又は複数の標的核酸配列を含んで成る。
本発明はまた、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。典型的には、キットは、容易な使用のために区画に分けられ、そして本発明を実施するための成分、例えば1,2又はそれ以上のタンデム配列セグメントから構成される5’部分又は5’末端、及び標的核酸にアニーリングするために十分に相補的であるよう企画された3’部分を含んで成る本発明の1又は複数のポリヌクレオチド;dNTPを含んで成るヌクレオチド組、ここで少なくとも1つの塩基の大部分はリボヌクレオチドであり;及びリボヌクレオチド組込み活性を有する生触媒成分を供給する容器を含む。
本発明はまた、本発明の方法により生成されるアンプリコンを供給する。PCRアンプリコンは通常、二本鎖であり、そして本発明のポリヌクレオチドに対して相補的である鎖を含んで成る。アンプリコンは、本発明のポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメントを含んで成り、ここでアンプリコンの3’配列セグメントは少なくとも1、2又はそれ以上の配列セグメントを含んで成り、ここで配列セグメントの3’末端ヌクレオチドは、アンプリコンを生成するために使用されるヌクレオチド組においてNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸(NMP)である。
本発明はさらに、本発明の方法を自動化するためのシステムを供給する。システムは、ポリヌクレオチド又はアンプリコン又は本発明の反応混合物を含んで成る少なくとも1つの容器又は支持体;ポリヌクレオチド又はアンプリコンを含んで成る組成物と、1つの又はいくつかの温度で熱的に通じるよう形状化された熱モジュレーター(例えば、核酸熱循環機械;インキュベーター);試薬を容器又は支持体に又はそれらから移行する少なくとも1つの試薬移行機会;及びフラグメント化された配列セグメントの質量を検出するために形状化された少なくとも1つの検出器(例えば、質量分光計、蛍光計)を含んで成る。好ましい態様においては、システムは、熱モジュレーター、試薬移行機械及び質量を検出するための形状化された検出器の少なくとも1つの操作可能的に通じる少なくとも制御器を含んで成る。
例1.高処理量SNP遺伝子型決定のためのフラッグ−標識:
ヒトH19遺伝子におけるSNPを含むアンプリコンを、分析のために調製した。標的配列は、gtgaggagtgtggagtaggyGCCCAGGCATCGTGCagacagggcgacatcagc(配列番号11)(小文字はプライマーにアニーリングする配列を示し、“y”はSNP位置C又はTを示す)であった。PCRを、20μlの合計体積で実施し、そして2μlは10ng/mlに希釈されたゲノムDNAサンプルからであった。
6種の異なったゲノムDNAサンプルを、すべての3種のプライマー対に対して、2重反復して試験した。さらに、4個の“鋳型なし”対象が個々のプライマー対のために試験された。
感染剤スクリーニングへのフラッグ−標識技法の適用を、HIV由来の配列をコードするRNA転写体を用いて試験した。それらの実験についての転写体を、HIV株HXB2からのgag領域の発現ベクター中へのクローニングにより生成した。線状化の後、転写体を、T7 RNAポリメラーゼを用いて製造した。次に、転写体を、ポリ−dTカラム上で精製した。標的配列は、catgcagggcctattgcaccaGGCCAGATGAGAGAACCAAGGGGaagtgacatagcaggaactactagtacccttcagga(配列番号17)(プライマー配列は小文字下にある)であった。
対立遺伝子−特異的PCR:
1ng/μlのヒトゲノムDNA20μl、0.4 μMの個々のプライマー(表1)、0.15 mMのピロリン酸ナトリウム、100 mM のトリシン/KOH pH 7.3、100 mMの KCOO pH 7.5、3 mMの Mg(COO)2、0.2 mMの個々の ( rATP、dCTP、dGTP及びdTTP) 及び0.25 U/μl FP-1 DNAポリメラーゼ (すなわち、GLTDSE DNA ポリメラーゼ)におけるリボ−PCR増幅。PCRについての熱循環プロフィールは、92℃で4分、続いて92℃で15秒、63℃で4分(60サイクル)であった。これは常に4℃で行われた。5μlのPCRを、2%のアガロースゲノム中に配置し、PCRを調節した。
アルカリ分解(表2)に関しては、5.0μlの1.2M水酸化ナトリウムを、残存する15μlの増反応に添加し、0.3Mの最終濃度にし、そして70℃で1.5時間インキュベートした。
表2は、NOS1_361のATPリボ-PCRの分解のフラグメントの予測される質量を示す。下線の配列は、プライマーのフラッグ部分を表わし、そして単一のヘプタマーは、プライマー配列において太字で示される。
サンプルを、H+により荷電されカチオン交換樹脂の添加により脱塩した。6mgの樹脂を、MassArray(商標) Clean Resin Tool Kitと共に反応添加し、そして室温で20分間、撹拌下でインキュベートした。その後、サンプルを、134xgで2分間、遠心分離し、樹脂を沈殿した。
トリヒドロキシアセトフェノン(THAP)をマトリックスとして使用した。調製のために、水中、50%アセトニトリル及び0.3Mのクエン酸アンモニウム溶液(6/3/2(v/v))中、0.2Mの2,4,6−及び2,3,4−THAP 0.5μlを、MALDI標的物プレート(400 μmのスポットサイズを有するAnchorChipTM Target、Bruker Daltonik GmbH、Bremen、Germany)の固定位置上に沈着した。その後、0.5μlの上清液を添加し、そして室温で乾燥した。
Claims (15)
- 標的核酸の検出方法であって、
(a)標的核酸と、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド組及びヌクレオチド組込み生触媒成分とを接触し、ここで、
(i)前記ポリヌクレオチドは5’部分及び3’部分を含んで成り、前記5’部分は1又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り;
(ii)前記ヌクレオチド組は、デオキシリボヌクレオチド(dNTP)の形での少なくとも2つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド(rNTP)の形での少なくとも1つのヌクレオチドの大部分を含んで成り、ここで前記リボヌクレオチドの塩基は、前記ポリヌクレオチドの個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり;そして
(iii)前記ヌクレオチド組込み生触媒成分は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成り;
(b)前記標的核酸を、前記ポリヌクレオチドの5’部分に対して相補的な3’配列セグメントを含んで成るアンプリコンを生成する増幅条件下で増幅し、ここで前記3’配列セグメントは1又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチド塩基はヌクレオチド組におけるNTPと同じ塩基を有するヌクレオシド一リン酸(NMP)であり;
(c)個々のNMPの3’側アンプリコンをフラグメントに分解し、前記分解が個々のフラグメントとして配列セグメントを開放し;そして
(d)前記アンプリコンフラグメントを検出し、ここで検出された配列セグメントフラグメントは標的核酸配列の増幅を示し、それにより、前記標的核酸配列を検出することを含んで成る方法。 - 前記標的核酸配列とポリヌクレオチド対とを接触し、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチド等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項1記載の方法。
- 前記標的核酸と、少なくとも1つのポリヌクレオチドとを接触し、ここで前記ポリヌクレオチドの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が前記標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す請求項1記載の方法。
- 前記標的核酸と、少なくとも2種の異なったポリヌクレオチドとを接触し、ここで前記ポリヌクレオチドの3’部分が3’末端ヌクレオチド塩基でのみ異なり、ここで個々のポリヌクレオチドの3’末端ヌクレオチド塩基がユニーク質量の配列セグメントに対応し、そして前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つの補対からの配列セグメントフラグメントの検出が標的核酸配列における多形現象ヌクレオチドの対立遺伝子の存在を示す請求項1記載の方法。
- 多くの異なった標的核酸配列が多くの異なったポリヌクレオチドと接触され、前記異なったポリヌクレオチドの個々はユニーク質量の配列セグメントを含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチドの配列セグメントは前記多くの異なった標的核酸配列の1つの識別体であり、それにより、前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つの補体からの配列セグメントフラグメントの検出が多くの異なった標的核酸配列の少なくとも1つの存在し示す請求項1記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドの延長を実質的に妨げるブロッキング成分を含んで成り、そして前記方法がさらに、増幅の前、ポリヌクレオチドからのブロッキング成分を除去する段階を含んで成る請求項1記載の方法。
- a)5’部分及び3’部分を含んで成る第1ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は1又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り;
b)デオキシリボヌクレオチド(dNTP)の形での少なくとも2つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド(rNTP)の形での少なくとも1つのヌクレオチドの大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり;及び
c)デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成る反応混合物。 - ポリヌクレオチド対を形成するために5’部分及び3’部分を含んで成る第2ポリヌクレオチドをさらに含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチドが等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項7記載の反応混合物。
- a)5’部分及び3’部分を含んで成る第1ポリヌクレオチド、ここで前記5’部分は1又は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして前記3’部分は、標的核酸にハイブリダイズし、そして増幅条件下で延長されるのに、実質的に十分、相補的である配列セグメントを含んで成り;
b)デオキシリボヌクレオチド(dNTP)の形での少なくとも2つのヌクレオチド塩基、及びリボヌクレオチド(rNTP)の形での少なくとも1つのヌクレオチドの実質的に大部分を含んで成るヌクレオチド組、ここでリボヌクレオチドとして供給されるヌクレオチド塩基が個々の配列セグメントのユニーク5’ヌクレオチド塩基に対して相補的であり;及び
c)デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド組込み活性を含んで成るヌクレオチド組込み生触媒成分、を含んで成るキット。 - 陽性対照標的核酸配列をさらに含んで成る請求項9記載のキット。
- ポリヌクレオチド対を形成するために5’部分及び3’部分を含んで成る第2ポリヌクレオチドをさらに含んで成り、ここで前記ポリヌクレオチド対における個々のポリヌクレオチドが等質量の5’部分配列セグメントを含んで成る請求項9記載のキット。
- a)5’部分及び3’部分を含んで成る第1鎖、ここで前記5’部分は複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’−末端ヌクレオチド塩基は1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして前記3’部分は、少なくとも5個のヌクレオチドを含んで成り;及び
b)前記第1鎖に対して相補的であり、そして1又は複数の連続配列セグメントを含んで成る配列セグメントを含んで成る3’部分を含んで成る第2鎖(ここで個々の配列セグメントの3’末端ヌクレオチドがNMPである)を含んで成る二本鎖ポリヌクレオチドを含んで成るアンプリコン。 - a)請求項12記載のアンプリコンを含んで成る組成物;
b)容器における又は支持体上の温度を調節するために、前記容器又は支持体と熱伝達するよう形状化された少なくとも1つの熱モジュレーター;
c)前記容器又は支持体に及び/又はそれから試薬を移行する少なくとも1つの試薬移行成分;及び
d)前記容器において又は支持体上に生成される1又は複数の配列セグメントの質量を検出するよう形状化された少なくとも1つの検出器を含んで成る少なくとも1つの容器又は支持体を含んで成るシステム。 - −容器における又は支持体上の温度の調節をもたらすための熱モジュレーター、
−容器への及び/又はそれから、又は支持体上への試薬の移行をもたらすための試薬移行成分、及び/又は
−容器において又は支持体上で生成される配列セグメントの質量の検出をもたらすための検出器、に操作可能的に連結される少なくとも1つの制御器をさらに含んで成る請求項13記載のシステム。 - a)5’部分が複数の連続配列セグメントを含んで成り、ここで個々の配列セグメントは、少なくとも3個のヌクレオチド塩基を含んで成り、等質量のものであり、そして個々の配列セグメントの5’末端ヌクレオチド塩基が1つの配列セグメント内でユニークであり、そして個々の配列セグメントにおいて同じであり;そして
b)3’部分が少なくとも5個のヌクレオチドを含んで成る、5’部分及び3’部分を含んで成る、100個以下の長さの塩基であるポリヌクレオチド。
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