JP2009254344A - Method for separating lfs and prencso contained in onion - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はタマネギ中に含まれるLFS（催涙成分生成酵素）及びPRENCSO（S-1-プロペニル-システインスルフォキシド）を分離し取得する方法に関する。 The present invention relates to a method for separating and obtaining LFS (tear component producing enzyme) and PRENCSO (S-1-propenyl-cysteine sulfoxide) contained in onions.
タマネギの催涙成分（LF）であるthiopropanal S-oxideは、前駆物質のPRENCSO（S-1-プロペニル-システインスルフォキシド）に酵素アリイナーゼが作用し、スルフェン酸(E-1-propensulfenic acid)となり、スルフェン酸が催涙成分生成酵素により異性化されることにより生じる(非特許文献1)。 Onion tearing component (LF), thiopropanal S-oxide, is the precursor PRENCSO (S-1-propenyl-cysteine sulfoxide), the enzyme alliinase acts as sulfenic acid (E-1-propensulfenic acid), This is caused by isomerization of sulfenic acid by a lacrimal component-generating enzyme (Non-patent Document 1).
催涙成分は、産業上、有用である事が知られている。例えば、催涙成分は、涙液分泌検査用試薬及び涙液分泌検査方法、言い換えればドライアイ検査用にも利用できる（特許文献1）。 It is known that the tear component is useful in industry. For example, the tear component can be used for a reagent for lacrimation examination and a lacrimation examination method, in other words, for dry eye examination (Patent Document 1).
従来から、PRENCSO、アリイナーゼ、LFSをそれぞれ単独で取得する方法は知られていた。 Conventionally, methods for acquiring PRENCSO, alliinase, and LFS independently have been known.
非特許文献2にはタマネギに含まれるPRENCSOを有機溶媒（メタノール:クロロホルム:水=12:5:3）を用いて抽出する方法が開示されている。しかし、アリイナーゼ及びLFSの抽出、精製方法に関しては一切言及されていない。
Non-Patent
非特許文献3にはアリイナーゼを、200℃のオーブンや沸騰水中で6分間以上加熱すること、及びマイクロ波で加熱することにより失活することが開示されている。この方法はPRENCSO単独の取得のためには有用であるが、アリイナーゼとともにLFSも活性を失ってしまう。 Non-Patent Document 3 discloses that alliinase is inactivated by heating in an oven or boiling water at 200 ° C. for 6 minutes or more and by heating with microwaves. This method is useful for obtaining PRENCSO alone, but LFS also loses activity along with alliinase.
特許文献2にはタマネギに水を加えて破砕し抽出することによりLFSを得る方法が開示されている。この方法では破砕の際にアリイナーゼの作用によりPRENCSOが分解されるという問題がある。
特許文献3ではタマネギ外皮を炭素数1〜3の低級アルコールと水との混合物で浸漬してケルセチンを抽出する方法が開示されているが、アリイナーゼ、PRENCSO、LFSについては何ら言及されていない。 Patent Document 3 discloses a method of extracting quercetin by immersing an onion skin with a mixture of a lower alcohol having 1 to 3 carbon atoms and water, but does not mention alliinase, PRENCSO, and LFS.
上記の通り、タマネギからPRENCSO、アリイナーゼ及びLFSのうち2成分以上を一緒に取得する方法は従来知られていない。アリイナーゼについては安価な製造方法が知られているが、PRENCSO及びLFSについては適当な取得方法が従来知られていなかった。 As described above, a method for obtaining two or more components of PRENCSO, alliinase and LFS together from onion is not known. An inexpensive production method is known for alliinase, but no suitable acquisition method has been known for PRENCSO and LFS.
LFSとしては、遺伝子組み換え法により調製されたもの(特許文献4)が知られているが、高価であるという問題があった。 As LFS, one prepared by a genetic recombination method (Patent Document 4) is known, but there is a problem that it is expensive.
一方、食品工業では加工に用いたタマネギの一部がタマネギ加工残査として排出される。そこでタマネギ加工残査の有効活用が求められている。 On the other hand, in the food industry, a part of the onion used for processing is discharged as an onion processing residue. Therefore, effective utilization of the onion processing residue is required.
本発明は、タマネギからPRENCSOとLFSとを共に取得する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for obtaining both PRENCSO and LFS from onion.
本発明者らは鋭意研究の結果、10(v/v)%以上70(v/v)%未満の水溶性有機溶媒を含有する水溶液にタマネギを浸漬することにより、LFSの活性を維持しつつアリイナーゼを失活することができること、並びに、陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂をこの順で作用させることによりLFS及びPRENCSOをそれぞれ分離できることを見出し、本発明を完成させるに至った。本発明は以下の発明を包含する。 As a result of diligent research, the present inventors have maintained the LFS activity by immersing the onion in an aqueous solution containing 10 (v / v)% or more and less than 70 (v / v)% of a water-soluble organic solvent. The present inventors have found that alliinase can be inactivated, and that LFS and PRENCSO can be separated by allowing anion exchange resin and cation exchange resin to act in this order, thereby completing the present invention. The present invention includes the following inventions.
(1) タマネギからLFS（催涙成分生成酵素）及びPRENCSO（S-1-プロペニル-システインスルフォキシド）を分離する方法であって、
10(v/v)%以上70(v/v)%未満の水溶性有機溶媒を含有する水溶液にタマネギを浸漬することにより、タマネギに含まれるアリイナーゼを失活させる浸漬工程、
浸漬工程後の前記水溶液とともに前記タマネギを粉砕して、LFS及びPRENCSOを前記水溶液中に抽出する抽出工程、
抽出工程後の前記水溶液を陰イオン交換樹脂に接触させることにより陰イオン交換樹脂にLFSを吸着させ、次いで吸着されたLFSを分離するLFS分離工程、並びに
LFS分離工程において陰イオン交換樹脂に吸着されない画分を陽イオン交換樹脂に接触させることにより陽イオン交換樹脂にPRENCSOを吸着させ、次いで吸着されたPRENCSOを分離するPRENCSO分離工程、
を含むことを特徴とする前記方法。
(1) A method for separating LFS (Tearing Component Generating Enzyme) and PRENCSO (S-1-propenyl-cysteine sulfoxide) from onion,
Immersion step of inactivating alliinase contained in the onion by immersing the onion in an aqueous solution containing 10 (v / v)% or more and less than 70 (v / v)% water-soluble organic solvent,
The extraction step of pulverizing the onion together with the aqueous solution after the immersion step, and extracting LFS and PRENCSO into the aqueous solution,
An LFS separation step of adsorbing LFS to the anion exchange resin by contacting the aqueous solution after the extraction step with the anion exchange resin, and then separating the adsorbed LFS; and
PRENCSO separation step of adsorbing PRENCSO on the cation exchange resin by contacting the fraction not adsorbed on the anion exchange resin in the LFS separation step with the cation exchange resin, and then separating the adsorbed PRENCSO,
The method comprising the steps of:
(2) 浸漬工程に用いる水溶液が40〜60(v/v)%の水溶性有機溶媒を含有することを特徴とする、(1)記載の方法。
(3) 水溶性有機溶媒がアルコールであることを特徴とする、(1)又は(2)記載の方法。
(4) 浸漬工程においてタマネギの浸漬を24時間以上かけて行うことを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(2) The method according to (1), wherein the aqueous solution used in the dipping step contains 40 to 60 (v / v)% of a water-soluble organic solvent.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the water-soluble organic solvent is an alcohol.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the onion is immersed for 24 hours or more in the immersion step.
(5) 浸漬工程に用いられるタマネギが予め凍結されたものであることを特徴とする、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(6) 浸漬工程において予め凍結されたタマネギの浸漬を1時間以上かけて行うことを特徴とする、(5)記載の方法。
(7) LFS分離工程で分離されたLFSをアリイナーゼと共に乾燥するLFS安定化工程を更に含む、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(5) The method according to any one of (1) to (3), wherein the onion used in the dipping step is frozen in advance.
(6) The method according to (5), wherein the onion previously frozen in the dipping step is dipped for 1 hour or more.
(7) The method according to any one of (1) to (6), further comprising an LFS stabilization step of drying the LFS separated in the LFS separation step together with alliinase.
(8) PRENCSO分離工程で分離されたPRENCSOを酸性水溶液中に保持するPRENCSO安定化工程を更に含む、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9) PRENCSOを酸性水溶液中で保持することを特徴とする、PRENCSOの保存方法。
(8) The method according to any one of (1) to (7), further comprising a PRENCSO stabilization step of maintaining PRENCSO separated in the PRENCSO separation step in an acidic aqueous solution.
(9) A method for preserving PRENCSO, comprising maintaining PRENCSO in an acidic aqueous solution.
本発明によりタマネギからLFS及びPRENCSOを効率的に取得することができる。 According to the present invention, LFS and PRENCSO can be efficiently obtained from onions.
本発明の方法においてはタマネギ加工残査を用いてもよく、タマネギ加工残査の有効活用が可能になる。 In the method of the present invention, an onion processing residue may be used, and the onion processing residue can be effectively utilized.
1. タマネギ
原材料として使用されるタマネギとしては、タマネギの鱗茎（バルブまたは、球）および鱗茎から伸びる鞘葉の部分を用いることが好ましい。食品加工業ではタマネギ加工残査として、鱗茎の底盤部（盤茎）と底盤部に隣接する鱗葉の一部（厚み0.5〜3センチ）、および鱗茎の先端部（ノーズ）に隣接する鱗葉の一部（厚み0.5〜3センチ）が多く排出される（以降これらの部分を「ヘタ」と呼ぶ）。このヘタの部分も本発明の方法において好適に使用することができる。数センチ程度の寸法に切ったタマネギの試料を浸漬工程に使用することが好ましい。タマネギを粉砕するなどして小さくし過ぎると酵素の作用によりPRENCSOが消費されてしまうため好ましくない。タマネギの試料の寸法を大きくしすぎると浸漬工程においてアリイナーゼの失活が進行しにくくなる。
1. As an onion used as an onion raw material, it is preferable to use a bulb (bulb or bulb) of an onion and a portion of a sheath leaf extending from the bulb. In the food processing industry, as the onion processing residue, the base of the bulb (basal stem) and a part of the bulb (thickness 0.5-3 cm) adjacent to the base, and the bulb adjacent to the tip of the bulb (nose) Part (thickness of 0.5 to 3 cm) is discharged in a large amount (hereinafter, these parts are referred to as “heta”). This part of the plate can also be suitably used in the method of the present invention. It is preferable to use an onion sample cut into dimensions of several centimeters for the dipping process. If the onion is ground too small, for example, PRENCSO is consumed by the action of the enzyme, which is not preferable. If the size of the onion sample is too large, the deactivation of alliinase is difficult to proceed in the dipping process.
2. 浸漬工程
浸漬工程は、10(v/v)%以上70(v/v)%未満、好ましくは40〜60(v/v)%の水溶性有機溶媒を含有する水溶液にタマネギを浸漬することにより、タマネギに含まれるアリイナーゼを失活させる工程である。ただし、水溶性有機溶媒としてプロパノール、アセトンを用いる場合は、10(v/v)%以上50(v/v)%未満であることが好ましい。
2. Immersion process In the immersion process, the onion is immersed in an aqueous solution containing 10 (v / v)% or more and less than 70 (v / v)%, preferably 40-60 (v / v)% water-soluble organic solvent. This is a step of inactivating the alliinase contained in the onion. However, when propanol or acetone is used as the water-soluble organic solvent, it is preferably 10 (v / v)% or more and less than 50 (v / v)%.
水溶性有機溶媒としてはアルコール又はアセトンが好ましく、アルコールがより好ましく、炭素数2以下のアルコールがより好ましい。 As the water-soluble organic solvent, alcohol or acetone is preferable, alcohol is more preferable, and alcohol having 2 or less carbon atoms is more preferable.
浸漬に用いる水溶液の、タマネギに対する量は、タマネギが浸るのに十分な量であれば特に限定されない。 The amount of the aqueous solution used for soaking is not particularly limited as long as it is sufficient for the onion to soak.
浸漬に用いる水溶液の温度は、LFSが失活しない温度ならば特に限定されない。好ましくは10℃以下が好ましい。 The temperature of the aqueous solution used for immersion is not particularly limited as long as LFS does not deactivate. Preferably it is 10 degrees C or less.
タマネギの前記水溶液中での浸漬時間は、凍結していないタマネギを使用する場合には24時間以上が好ましく、24〜72時間がより好ましく、36〜60時間が最も好ましい。 The onion time of the onion in the aqueous solution is preferably 24 hours or more, more preferably 24 to 72 hours, and most preferably 36 to 60 hours when using an onion that is not frozen.
本発明者らは驚くべきことに、予め凍結されたタマネギを使用することにより、浸漬時間を短縮できることを見出した。凍結方法としては、-20℃以下、好ましくは-80℃〜-20℃の温度での急速冷凍が好ましい。凍結時間は30分間以上が好ましく、2時間以上がより好ましい。例えば-80℃において30分間以上、-20℃において2時間以上の条件が挙げられる。予め凍結されたタマネギを使用する場合の浸漬時間は1時間以上が好ましく、3〜12時間がより好ましい。 The inventors have surprisingly found that the immersion time can be shortened by using a pre-frozen onion. As the freezing method, quick freezing at a temperature of −20 ° C. or lower, preferably −80 ° C. to −20 ° C. is preferable. The freezing time is preferably 30 minutes or more, more preferably 2 hours or more. For example, conditions of -80 ° C. for 30 minutes or more and -20 ° C. for 2 hours or more can be mentioned. When using a pre-frozen onion, the immersion time is preferably 1 hour or more, and more preferably 3 to 12 hours.
3. 抽出工程
抽出工程は、浸漬工程後の前記水溶液とともに浸漬されたタマネギを粉砕して、LFS及びPRENCSOを前記水溶液中に抽出する工程である。浸漬工程においてアリイナーゼの活性が失われているため、粉砕してもPRENCSOは分解されない。
3. Extraction Step The extraction step is a step of pulverizing the onion soaked with the aqueous solution after the soaking step and extracting LFS and PRENCSO into the aqueous solution. Since alliinase activity is lost in the dipping process, PRENCSO is not decomposed even when pulverized.
粉砕はホモジナイザー、ミキサー等の通常の攪拌装置により行うことができる。粉砕後に遠心分離、ろ過などの通常の固液分離手段によって、固形画分と、LFS及びPRENCSOを含有する水溶液（液体画分）とに分離し、水溶液を以下のLFS分離工程に供する。 The pulverization can be performed with a normal stirring device such as a homogenizer or a mixer. After pulverization, the solid fraction is separated into an aqueous solution (liquid fraction) containing LFS and PRENCSO by ordinary solid-liquid separation means such as centrifugation and filtration, and the aqueous solution is subjected to the following LFS separation step.
4. LFS分離工程
LFS分離工程は、抽出工程後の水溶液を陰イオン交換樹脂に接触させることにより陰イオン交換樹脂にLFSを吸着させ、次いで吸着されたLFSを分離する工程である。
4. LFS separation process
The LFS separation step is a step of adsorbing LFS on the anion exchange resin by bringing the aqueous solution after the extraction step into contact with the anion exchange resin, and then separating the adsorbed LFS.
イオン交換樹脂との接触の前に、抽出工程後の水溶液に対して、必要に応じて塩濃度の調整を行う。塩濃度は樹脂の平衡化に用いるバッファーの塩濃度と同程度またはそれ以下とする。 Before the contact with the ion exchange resin, the salt concentration is adjusted as necessary for the aqueous solution after the extraction step. The salt concentration is the same as or less than the salt concentration of the buffer used for resin equilibration.
陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂、弱塩基性陰イオン交換樹脂ともに使用可能である。好ましくは強塩基性陰イオン交換樹脂が好ましい。また担体の種類に限定されない。 As the anion exchange resin, both a strong basic anion exchange resin and a weak basic anion exchange resin can be used. A strongly basic anion exchange resin is preferred. Moreover, it is not limited to the kind of support | carrier.
樹脂の使用量は、用いる樹脂（今回検討した樹脂（DE52、DEAE、SuperQ））の交換容量にもよるが液量に対して1/5〜1/10倍volの範囲ならば確実である。また吸着時の温度に関しては、酵素が失活しない範囲内ならば特に限定されない。好ましくは10℃以下である。 Depending on the exchange capacity of the resin used (resin (DE52, DEAE, SuperQ) studied this time), the amount of resin used is sure to be in the range of 1/5 to 1/10 times vol with respect to the liquid volume. The temperature at the time of adsorption is not particularly limited as long as the enzyme is not inactivated. Preferably it is 10 degrees C or less.
LFSの吸着後、LFSを吸着してなる陰イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂に吸着されない液体画分とを分離する。次いで、LFSを吸着してなる陰イオン交換樹脂を、好ましくは洗浄した後に、溶出用液に加えてLFSを溶出させる。溶出用液として使用できるものは、塩濃度が50mM以上の無機塩水溶液（pH5.0〜7.0）、好ましくは塩濃度が100〜500mMのpH5.0〜6.5のバッファーである。樹脂と液体の量比は、樹脂量に対して2倍vol以上の溶出用液で溶出を行う。溶出用液は少量の方が経済的、且つ溶出酵素液の濃度的にも好ましい。温度は酵素が失活しない温度であれば良い。陰イオン交換樹脂に吸着されない画分を、後述するPRENCSO分離工程に供する。LFSを溶出する前に洗浄を行う場合は、洗浄液も加えて後述するPRENCSO分離工程に供する。 After the adsorption of LFS, the anion exchange resin formed by adsorbing LFS and the liquid fraction not adsorbed on the anion exchange resin are separated. Next, the anion exchange resin formed by adsorbing LFS is preferably washed and then added to the elution solution to elute LFS. What can be used as the elution solution is an aqueous inorganic salt solution (pH 5.0 to 7.0) having a salt concentration of 50 mM or more, preferably a buffer having a salt concentration of 100 to 500 mM and pH 5.0 to 6.5. Elution is performed with an elution liquid having a volume ratio of the resin to the liquid that is at least twice the volume of the resin. A small amount of the elution solution is more economical and preferable in terms of the concentration of the elution enzyme solution. The temperature may be any temperature that does not deactivate the enzyme. The fraction that is not adsorbed by the anion exchange resin is subjected to the PRENCSO separation step described later. When washing is performed before elution of LFS, a washing solution is also added to the PRENCSO separation step described later.
5. PRENCSO分離工程
PRENCSO分離工程は、LFS分離工程において陰イオン交換樹脂に吸着されない画分を陽イオン交換樹脂に接触させることにより陽イオン交換樹脂にPRENCSOを吸着させ、次いで吸着されたPRENCSOを分離する工程である。
5. PRENCSO separation process
The PRENCSO separation step is a step in which PRENCSO is adsorbed on the cation exchange resin by bringing the fraction not adsorbed on the anion exchange resin in the LFS separation step into contact with the cation exchange resin, and then the adsorbed PRENCSO is separated.
陽イオン交換樹脂としては、強酸性陽イオン交換樹脂、弱酸性陽イオン交換樹脂ともに使用可能である。好ましくは強酸性陽イオン交換樹脂が好ましい。また担体の種類には限定されない。 As the cation exchange resin, both strong acid cation exchange resins and weak acid cation exchange resins can be used. A strong acid cation exchange resin is preferred. The type of carrier is not limited.
陽イオン交換樹脂の使用量は、用いる樹脂の交換容量にもよるが液量に対して1/5〜1/10倍volの範囲ならば確実である。また吸着時の温度については特に限定されず、好ましい例として10〜25℃という条件を掲げることができる。 The amount of the cation exchange resin used is sure to be in the range of 1/5 to 1/10 times vol with respect to the liquid amount, although it depends on the exchange capacity of the resin used. Moreover, it does not specifically limit about the temperature at the time of adsorption | suction, The conditions of 10-25 degreeC can be hung up as a preferable example.
PRENCSOの吸着後、PRENCSOを吸着してなる陽イオン交換樹脂と、陽イオン交換樹脂に吸着されない液体画分とを分離する。次いで、PRENCSOを吸着してなる陽イオン交換樹脂を、好ましくは洗浄した後に、溶出用液に加えてPRENCSOを溶出させる。溶出用液としてはpH8.5の水溶液が使用可能である。その後の樹脂の再生も考えたならばpH8.5〜9.0のアンモニア水が好ましい。樹脂と液体の量比については、バッチ式の場合、樹脂の2倍vol以上の溶出用液で行う。溶出時の温度については特に限定されず、好ましい例として10〜25℃という条件を掲げることができる。溶出用液のpHは9.0以下が好ましい。 After the adsorption of PRENCSO, the cation exchange resin formed by adsorbing PRENCSO and the liquid fraction not adsorbed on the cation exchange resin are separated. Next, the cation exchange resin formed by adsorbing PRENCSO is preferably washed and then added to the elution solution to elute PRENCSO. An aqueous solution with a pH of 8.5 can be used as the elution solution. Considering the subsequent regeneration of the resin, aqueous ammonia having a pH of 8.5 to 9.0 is preferable. Regarding the volume ratio of the resin to the liquid, in the case of a batch type, it is carried out with an elution liquid that is at least twice as much as the resin. The temperature at the time of elution is not particularly limited, and a preferable example is a condition of 10 to 25 ° C. The pH of the elution solution is preferably 9.0 or less.
6. LFS安定化工程
LFS安定化工程は、LFS分離工程で分離されたLFSをアリイナーゼと共に乾燥状態とする工程である。
6. LFS stabilization process
The LFS stabilization process is a process in which the LFS separated in the LFS separation process is dried together with alliinase.
本発明者らは驚くべきことに、LFSは、アリイナーゼと共に乾燥させると室温においても安定に保存することが可能であることを見出した。 The inventors have surprisingly found that LFS can be stored stably at room temperature when dried with alliinase.
アリイナーゼの保護のために、糖などの保護剤を更に共存させることが好ましい。アリイナーゼの保護剤としては、糖、好適には二糖類が挙げられる。二糖類としては、例えば、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、又はセルビオース等を挙げることができる。当該保護剤は、糖に加えて、塩を含んでもよい。塩としては、任意の塩が挙げられるが、例えば、KCl、MgCl2、NaClなどが挙げられるが、1価の金属塩が好適で、具体的には、NaClが好適である。更に、当該保護剤は、ピリドキサールリン酸を含むこともできる。つまり、保護剤は、（イ）糖、あるいは（ロ）糖並びに塩及び/又はピリドキサールリン酸からなる成分である。 In order to protect alliinase, it is preferable to further coexist a protecting agent such as sugar. Alliinase protecting agents include sugars, preferably disaccharides. Examples of the disaccharide include sucrose, trehalose, maltose, lactose, and cerobiose. The protective agent may contain a salt in addition to the sugar. Examples of the salt include any salt, and examples thereof include KCl, MgCl 2 , NaCl, and the like. Monovalent metal salts are preferable, and specifically, NaCl is preferable. Furthermore, the protective agent can also contain pyridoxal phosphate. That is, the protective agent is a component composed of (i) sugar or (b) sugar and a salt and / or pyridoxal phosphate.
アリイナーゼとLFSの存在比率としては、例えば、アリイナーゼ0.02Units:LFS 0.5μl（比活性6.2×109PA/μl）からアリイナーゼ200Units:LFS 0.5μl（比活性6.2×109PA/μl）の範囲とすることができる。好ましくは、アリイナーゼ10Units:LFS 0.5μl（比活性6.2×109PA/μl）程度である。 As the ratio of alliinase to LFS, for example, alliinase 0.02Units: LFS 0.5 μl (specific activity 6.2 × 10 9 PA / μl) to alliinase 200 Units: LFS 0.5 μl (specific activity 6.2 × 10 9 PA / μl) can do. Preferably, it is about alliinase 10Units: LFS 0.5 μl (specific activity 6.2 × 10 9 PA / μl).
LFSとアリイナーゼの混合物を乾燥させて乾燥混合酵素を調製する場合には、乾燥手段としては、凍結乾燥又は熱風乾燥が挙げられ、凍結乾燥が特に望ましい。なお、LFSとアリイナーゼの混合物を溶液からそのまま乾燥させることもできるが、例えば、吸水体や高吸水性担体にLFSとアリイナーゼの混合溶液を吸わせ、その後乾燥することもできる。 In the case of preparing a dry mixed enzyme by drying a mixture of LFS and alliinase, the drying means includes freeze drying or hot air drying, and freeze drying is particularly desirable. The mixture of LFS and alliinase can be dried from the solution as it is. For example, a mixed solution of LFS and alliinase can be sucked into a water-absorbing body or a superabsorbent carrier and then dried.
また、乾燥混合酵素は、粉末で使用することが望ましいが、容易に再水和できるような形態であれば、顆粒、散剤とすることもできる。 The dry mixed enzyme is preferably used in a powder form, but can be made into granules or powders as long as it can be easily rehydrated.
製剤化には、賦形剤、結合剤、及び崩壊剤など、製剤化のために常用される補助剤を添加することができる。賦形剤としては、例えば、デンプン、乳糖、白糖、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、リン酸水素カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（PVP）、ハイドロキシプロピルスターチ（HPS）などがある。 また、結合剤としては、デンプン、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン（PVP）、アラビアゴム末、ゼラチン、ブドウ糖、白糖などの水溶液、又はそれらの水・エタノール溶液などがある。崩壊剤としては、デンプン、カルボキシルメチルセルロース、カルボキシルメチルセルロースカルシウム、微結晶セルロース、ハイドロキシプロピルスターチ、リン酸カルシウムなどがある。 For formulation, adjuvants commonly used for formulation, such as excipients, binders, and disintegrants, can be added. Examples of excipients include starch, lactose, sucrose, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium alginate, calcium hydrogen phosphate, synthetic aluminum silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone (PVP), and hydroxypropyl starch (HPS). is there. Examples of the binder include starch, microcrystalline cellulose, sodium carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone (PVP), gum arabic powder, gelatin, glucose, sucrose, and aqueous / ethanol solutions thereof. Examples of the disintegrant include starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, microcrystalline cellulose, hydroxypropyl starch, and calcium phosphate.
散剤または顆粒として用いる場合に補助剤としては、アリイナーゼの保護剤、例えばマルトースなどを用いることができる。 When used as a powder or granule, as an auxiliary, an alliinase protective agent such as maltose can be used.
7. PRENCSO安定化工程
PRENCSO安定化工程は、PRENCSO分離工程で分離されたPRENCSOを酸性水溶液中に保持する工程である。
7. PRENCSO stabilization process
The PRENCSO stabilization step is a step of holding PRENCSO separated in the PRENCSO separation step in an acidic aqueous solution.
PRENCSOを安定に保存するためには、イオン交換樹脂や逆相クロマトグラフィーによってPRENCSOを精製した後に粉末化又は水溶液に溶解した状態とすることが従来必要であると考えられてきた。しかしながら本発明者らは、驚くべきことに、PRENCSOは酸性水溶液中において室温で長期間保存可能なほど安定であり、精製の必要すらないことを見出した。 In order to stably store PRENCSO, it has been conventionally considered that it is necessary to purify PRENCSO by ion exchange resin or reverse phase chromatography and then to make it into a powdered or dissolved state in an aqueous solution. However, the inventors have surprisingly found that PRENCSO is stable enough to be stored in acidic aqueous solution at room temperature for long periods of time and does not require purification.
PRENCSO分離工程において得られるPRENCSO水溶液に酸成分を添加して酸性とすることによりPRENCSOの安定化が達成される。 PRENCSO stabilization is achieved by adding an acid component to the PRENCSO aqueous solution obtained in the PRENCSO separation step to make it acidic.
上記酸性のpHの範囲は4.0以下、好ましくはpH2.0〜3.5である。また酸成分としてはクエン酸などの有機酸、及び塩酸のような無機酸でもよい。 The acidic pH is 4.0 or less, preferably pH 2.0 to 3.5. The acid component may be an organic acid such as citric acid and an inorganic acid such as hydrochloric acid.
新たに見出されたこの知見は、従来の方法で得られるLFSの安定化にも有用である。すなわち本発明は、PRENCSOを酸性水溶液中で保持することを特徴とする、PRENCSOの保存方法を提供するものでもある。 This newly discovered finding is also useful for stabilizing LFS obtained by conventional methods. That is, the present invention also provides a method for preserving PRENCSO, characterized in that PRENCSO is retained in an acidic aqueous solution.
以下の実施例の記載において「タマネギ」とは特に断りのない限り鱗茎部を指す。
試験1
エタノール水溶液の濃度と抽出PRENCSO量、LFSの活性量の関係（図2）
230ｍｌ容の蓋付き容器5個に、包丁で4センチ角程度の大きさに切った市販のタマネギを50gずつ量り取った。次に各容器にエタノール濃度が10〜90(v/v)% であるエタノール水溶液50mlを加え、タマネギが浸った状態で10℃の低温実験庫内で48時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間） し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。各抽出溶液中のPRENCSO量、LFSの活性量の比較を行った。結果を図2に示す。10〜60(v/v)%エタノールでタマネギを浸漬した場合、PRENCSOとLFSを効率良く抽出できるが、70(v/v)%を超えるとLFSの活性量がなくなってしまうことも併せて確認された。
In the description of the following examples, “onion” refers to a bulb portion unless otherwise specified.
Relationship between concentration of ethanol aqueous solution and amount of extracted PRENCSO and LFS activity (Figure 2)
50 g of commercially available onions cut into a size of about 4 cm square with a knife were weighed into five 230 ml lidded containers. Next, 50 ml of an ethanol aqueous solution having an ethanol concentration of 10 to 90 (v / v)% was added to each container, and immersed for 48 hours in a low-temperature laboratory at 10 ° C. with the onion immersed. The soaked product was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution. The amount of PRENCSO and the amount of LFS activity in each extraction solution were compared. The result is shown in figure 2. When onion is immersed in 10-60 (v / v)% ethanol, PRENCSO and LFS can be extracted efficiently, but it is also confirmed that the amount of LFS activity is lost when it exceeds 70 (v / v)% It was done.
抽出溶液に含まれるPRENCSOの量と、LFSの活性量は、以下に示した方法と条件で定量した。
（１）PRENCSO量と、LFS活性量の測定方法
陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂でのLFS、PRENCSOの精製効率は一定であるため、PRENCSO及びLFSの最終的な収量は、これらの樹脂による処理を行う前の抽出溶液中に含まれるPRENCSO量、LFSの活性量と相関する。そこで本試験の試験1、2、3では、粉砕後遠心分離により得た抽出溶液中に含まれるPRENCSO量、LFSの活性量の比較検討を行った。
The amount of PRENCSO contained in the extraction solution and the amount of LFS activity were quantified by the following methods and conditions.
(1) Method of measuring the amount of PRENCSO and LFS activity Since the purification efficiency of LFS and PRENCSO with anion exchange resin and cation exchange resin is constant, the final yield of PRENCSO and LFS depends on these resins. It correlates with the amount of PRENCSO and LFS contained in the extracted solution before the treatment. Therefore, in
＜PTENCSO測定方法＞
PRENCSOはHPLCで定量した。分析条件は次の通り、カラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3 , 温度：35℃ , 検出波長：230nm , 流速：0.6ml/min,注入量：PRENCSO溶液 1μl。保持時間9分に検出されたピークの面積から、PRENCSOを定量した。
<PTENCSO measurement method>
PRENCSO was quantified by HPLC. Analysis conditions are as follows: Column: Pegasil ODS 4.6mmΦ × 25cm (Senshu Kagaku), Mobile phase: Acidic water pH3.3, Temperature: 35 ℃, Detection wavelength: 230nm, Flow rate: 0.6ml / min, Injection amount:
＜LFS活性測定方法＞
LFSの活性量は、酵素反応で発生した催涙成分（LF）のピーク面積に基づいて定量した。アルコール濃度が16(v/v)%となるように調整した抽出溶液10μlに対し、250 Unit/ml の精製Aliinase溶液を40μl添加し、さらに20mg/ml の精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させた。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、LF発生量を測定した。HPLC条件はカラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの , 温度：35℃ , 検出波長：254nm , 流速：0.6ml/minで行った。LFのピークは、保持時間9.6分に検出された。
<LFS activity measurement method>
The amount of LFS activity was quantified based on the peak area of the tear component (LF) generated by the enzyme reaction. Add 40 μl of 250 Unit / ml purified Aliinase solution to 10 μl of the extraction solution adjusted to an alcohol concentration of 16 (v / v)%, and then add 20 μl of 20 mg / ml purified PRENCSO solution. The substrate reaction was started. Three minutes later, 1 μl of the reaction solution was injected into the HPLC, and the amount of LF generated was measured. HPLC conditions: Column: Pegasil ODS 4.6mmΦ × 25cm (Senshu Kagaku), Mobile phase: Acid water pH3.3 and methanol mixed 7 to 3, Temperature: 35 ℃, Detection wavelength: 254nm, Flow rate: 0.6ml / I went in min. The LF peak was detected at a retention time of 9.6 minutes.
移動相として用いた酸性水pH3.3としてはTFA溶液を使用した。作製方法は以下である。蒸留水2リットルを密栓できる容器に注ぎ、アスピレーターを用いて脱気した。脱気した蒸留水2リットルにTFA（アミノ酸配列分析用特製試薬 ナカライテスク 34902-11 1ｍｌアンプル×5本入り）1mlを加え、ストック溶液（TFA溶液（×10））とした。そのストック溶液を、脱気した蒸留水で10倍に希釈して、酸性水 ｐＨ3.3を作製した。 A TFA solution was used as the acidic water pH 3.3 used as the mobile phase. The manufacturing method is as follows. Distilled water (2 liters) was poured into a container that could be sealed and degassed using an aspirator. To 2 liters of degassed distilled water, 1 ml of TFA (special reagent for amino acid sequence analysis, Nacalai Tesque 34902-11 1 ml ampoule x 5) was added to obtain a stock solution (TFA solution (x10)). The stock solution was diluted 10 times with degassed distilled water to make acidic water pH 3.3.
LFSの活性量測定に用いた、精製アリイナーゼ溶液、精製PRENCSO溶液は以下の手順で調製したものを用いた。 The purified alliinase solution and purified PRENCSO solution used for the measurement of the LFS activity amount were prepared by the following procedure.
（２）精製アリイナーゼ溶液の調製
（２−１）ニンニクを粉砕・酸沈
まず、ミキサーのジョッキを冷蔵庫に入れて冷やしておく。また、低温遠心機にローターをセットし、温度を４℃にセットして冷却しておく。ニンニク片（100g）に等量のバッファー A（後述）を加えて、ミキサーで粉砕する。氷上に置いたジョッキの口に二重にしたガーゼを輪ゴムでとめる。粉砕物をそのガーゼの上に流して、濾す。ろ液がある程度得られた後で、ガーゼ上の粉砕物をガーゼで包んで絞る。得られたろ液を12000rpmで10 分間 ４℃で遠心分離する。遠心上清を回収する。回収した遠心上清を氷上に置いた状態で攪拌しつつ、pHをモニターしながら、酢酸を加えていき、pHを4.0にする。pHが4.0になったら、そのまま5min静置する。沈殿の出てきたサンプルを12000rpm×10min、４℃で遠心分離する。遠心ペレットを回収する（バッファー Aを使う）。
(2) Preparation of purified alliinase solution (2-1) Grinding and acid precipitation of garlic First, put the mug of the mixer in a refrigerator and keep it cool. In addition, a rotor is set in a low-temperature centrifuge, and the temperature is set at 4 ° C. and cooled. Add an equal amount of Buffer A (described later) to garlic pieces (100 g) and grind with a mixer. Use a rubber band to fasten the double gauze on the mouth of a mug placed on ice. Pour the ground material over the gauze and filter. After a certain amount of filtrate is obtained, the crushed material on the gauze is wrapped with gauze and squeezed. The resulting filtrate is centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Collect the centrifugation supernatant. While stirring the collected centrifugal supernatant on ice, acetic acid is added while monitoring the pH, and the pH is adjusted to 4.0. When pH reaches 4.0, leave it for 5 min. The sample from which the precipitate has come out is centrifuged at 12000 rpm × 10 min at 4 ° C. Collect the centrifugation pellet (use buffer A).
回収したペレットを50〜100mlにして（バッファー A）、そのまま、５℃で30min静置する。サンプルを12000rpmで10分間４℃で遠心分離する。1N水酸化ナトリウム水溶液を用いて、回収した遠心上清のpHを6.5に調製する。これをアリイナーゼ粗抽出液とする。 The collected pellet is made 50-100 ml (buffer A) and left at 5 ° C. for 30 min. Samples are centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Using 1N aqueous sodium hydroxide solution, adjust the pH of the collected centrifugal supernatant to 6.5. This is designated as the alliinase crude extract.
（２−２）ハイドロキシアパタイトカラム処理
上記アリイナーゼ粗抽出液（遠心上清）をバッファー Aで平衡化したハイドロキシアパタイトカラムにアプライする。ハイドロキシアパタイトカラムに黄色のバンドとなって吸着される。サンプルをアプライしたハイドロキシアパタイトカラムを300mlのバッファーAで洗浄する。洗浄の終了したハイドロキシアパタイトカラムに300mlのバッファーC（後述）を流して、溶出させる。溶出液はフラクションコレクターを使って10 mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集める。
(2-2) Hydroxyapatite column treatment The above-described alliinase crude extract (centrifugal supernatant) is applied to a hydroxyapatite column equilibrated with buffer A. Adsorbed as a yellow band on the hydroxyapatite column. Wash the hydroxyapatite column with sample applied in 300 ml of buffer A. Pour 300 ml of buffer C (described later) through the hydroxyapatite column after washing to elute. The eluate is fractionated in 10 ml portions using a fraction collector, and the fraction in which the yellow eluate is fractionated is collected.
（２−３）ConAカラムによるアリイナーゼの精製
集めたフラクション（20ml）の1/20倍volの20mM塩化カルシウム,塩化マグネシウム溶液を加えて、サンプル溶液のカルシウムイオン,マグネシウムイオン濃度を上げる。そうした上で、再生し、startingバッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）で平衡化したConAカラムにアプライする。サンプルをアプライした後のConAカラムを50mlのstartingバッファーで洗浄する。洗浄の終了したConAカラムに50mlのConA溶出バッファー（ConA Sepharose 4Bのマニュアルに記載されている推奨バッファー）を流して、溶出させる。溶出液はフラクションコレクターを使って2mlずつ分画し、黄色の溶出液が分画されているフラクションを集める。
(2-3) Purification of alliinase by
（２−４）精製したアリイナーゼの濃縮方法
ConAカラム精製によって得られた黄色い溶出液（アリイナーゼ溶液）10mlをCENTRIPLUS CONCENTRATORS(up to 15ml,No.4421)（ミリポア社製）に入れる。CENTRIPLUS CONCENTRATORSを、４℃に冷却した遠心機にセットし、3000rpmで30分遠心する。中身を一度確認した後、もう一度、3000rpmで30分間遠心する。濃縮が完了したアリイナーゼ溶液の活性を下に示す方法に従って測定し、必要な濃度になっていることを確認する。
(2-4) Method for concentrating purified alliinase
10 ml of the yellow eluate (aliinase solution) obtained by the ConA column purification is placed in CENTRIPLUS CONCENTRATORS (up to 15 ml, No. 4421) (Millipore). Set CENTRIPLUS CONCENTRATORS in a centrifuge cooled to 4 ° C and centrifuge at 3000 rpm for 30 minutes. After confirming the contents once, centrifuge again at 3000 rpm for 30 minutes. The activity of the alliinase solution after completion of concentration is measured according to the method shown below to confirm that the required concentration is obtained.
なお、上記バッファーA(pH7.0)（アリイナーゼ精製用50mMバッファーA）は次のように調製した。50mMリン酸水素２カリウム溶液（5.22gを600mlに溶解）と50mMリン酸二水素カリウム溶液（3.4gを500mlに溶解）を調製する。pHをモニターしながら、両者を混合して、pHを7.0に調整する。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合する。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3 mgのピリドキサールリン酸を添加して混合する。出来上がったバッファーにラベルして、低温実験庫（10℃）で保存する。 The buffer A (pH 7.0) (50 mM buffer A for purifying alliinase) was prepared as follows. Prepare 50 mM dipotassium hydrogen phosphate solution (5.22 g dissolved in 600 ml) and 50 mM potassium dihydrogen phosphate solution (3.4 g dissolved in 500 ml). While monitoring the pH, mix both to adjust the pH to 7.0. Add 1-fold volume of glycerol to 9-fold volume of buffer and mix well. Add 5.3 mg of pyridoxal phosphate to 1 L of the glycerol-containing buffer and mix. Label the finished buffer and store in a low-temperature laboratory (10 ° C).
また、バッファーC(pH7.0)（アリイナーゼ精製用500mMバッファーC）は、次のように調製した。500mMリン酸水素２カリウム溶液（43.6gを500mlに溶解）と500mMリン酸二水素カリウム溶液（34.0gを500mlに溶解）を調製する。pHをモニターしながら、両者を混合して、ｐHを7.0に調整する。出来上がったバッファー9倍volに対して、グリセロールを1倍vol加えてよく混合する。出来上がったグリセロール入りバッファー 1Lに対して、5.3mgのピリドキサールリン酸を添加して混合する。出来上がったバッファーにラベルして、低温実験庫（10℃）で保存する。 Buffer C (pH 7.0) (500 mM buffer C for purifying alliinase) was prepared as follows. Prepare 500 mM dipotassium hydrogen phosphate solution (43.6 g dissolved in 500 ml) and 500 mM potassium dihydrogen phosphate solution (34.0 g dissolved in 500 ml). While monitoring the pH, both are mixed to adjust the pH to 7.0. Add 1-fold volume of glycerol to 9-fold volume of buffer and mix well. Add 5.3 mg of pyridoxal phosphate to 1 L of the glycerol-containing buffer and mix. Label the finished buffer and store in a low-temperature laboratory (10 ° C).
（３）精製PRENCSO溶液の調製
（３−１）加熱タマネギからPRENCSOの抽出
生タマネギ３玉（1000ｇ）の外皮をはがし、ラップをして電子レンジで12分間加熱する。加熱したタマネギをミキサーに入れ、等量の蒸留水を加えてから粗砕し、粗砕液を8000rpmで10分間遠心分離する。上清を回収し、陽イオン交換樹脂IR120Bを加えて攪拌したのち、吸引濾過により、樹脂を回収する。回収した樹脂に蒸留水1Lを加え、これに濃アンモニア水を加えてpH8.5に調製する。吸引濾過により、上清を回収し、残った樹脂に再度pH8.5のアンモニア水を加える。再度、吸引濾過により、上清を回収する。得られた溶液に1N塩酸を加えてpH7.0に中和する。エバポレーターを用いて溶液を濃縮乾固する。
(3) Preparation of purified PRENCSO solution (3-1) Extraction of PRENCSO from heated onion Peel 3 eggs (1000 g) of raw onion, wrap and heat for 12 minutes in a microwave oven. Put the heated onion into a mixer, add an equal volume of distilled water, crush it, and centrifuge the crushed liquid at 8000 rpm for 10 minutes. The supernatant is collected, cation exchange resin IR120B is added and stirred, and then the resin is collected by suction filtration. Distilled water (1 L) is added to the recovered resin, and concentrated aqueous ammonia is added thereto to adjust the pH to 8.5. The supernatant is recovered by suction filtration, and ammonia water having a pH of 8.5 is added to the remaining resin again. Again, collect the supernatant by suction filtration. The resulting solution is neutralized to pH 7.0 by adding 1N hydrochloric acid. The solution is concentrated to dryness using an evaporator.
（３−２）PRENCSOの精製
残留物に蒸留水50mlを加えて溶解させる。得られた粗PRENCSO溶液を中圧逆相クロマトグラフィーによって精製する。必要に応じて、さらにHPLC（カラム：ODS，移動相：酸性水pH3.3，温度：35℃，UV：230nm）によって精製する。カラムから得られた溶出液をエバポレーターおよび凍結乾燥機を用いて乾固し、精製PRENCSO粉末（約100mg）を得る。
(3-2) Purification of
試験2
エタノール水溶液での浸漬時間と抽出PRENCSO量、LFSの活性量の関係（図3）
230ｍｌ容の蓋付き容器5個に、包丁で4センチ角程度の大きさに切った市販のタマネギを50gずつ量り取った。次に各容器に50mlの50(v/v)%のエタノール水溶液を加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内でそれぞれ3, 6, 24, 48, 72時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間） し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。各抽出溶液中のPRENCSO量、LFSの活性量の比較を行い、浸漬時間と抽出PRENCSO量、LFSの活性量の関係を検討した。PRENCSO量と、LFSの活性量は試験１記載の手順で測定した。
Relationship between immersion time in ethanol aqueous solution and amount of extracted PRENCSO and LFS activity (Fig. 3)
50 g of commercially available onions cut into a size of about 4 cm square with a knife were weighed into five 230 ml lidded containers. Next, add 50 ml of 50 (v / v)% ethanol aqueous solution to each container, and immerse for 3, 6, 24, 48, 72 hours in a low-temperature laboratory at 10 ° C with the onion sample immersed. went. The soaked product was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution. The amount of PRENCSO and LFS activity in each extraction solution was compared, and the relationship between the immersion time and the amount of extracted PRENCSO and LFS was examined. The amount of PRENCSO and the amount of LFS activity were measured according to the procedure described in
また本試験に用いたアルコール浸漬を行わないタマネギに含まれるPRENCSO量を、PRENCSO量のコントロールとして図中に「加熱タマネギ」として示した。その測定手順は次の通りである。生タマネギの外皮をはずし、包丁で50g分切った。次に切ったタマネギにラップをして電子レンジで3分間加熱した。加熱したタマネギをミキサーに入れ、等量の蒸留水を加えて粉砕した。その後、遠心（12000rpm、10分間）し、上澄みを加熱タマネギ抽出溶液として回収した。抽出溶液に含まれるPRENCSO量の測定も試験１記載の方法で行った。
結果を図3に示す。
その結果、エタノール水溶液での浸漬時間は48時間程度が好ましいことが確認された。
In addition, the amount of PRENCSO contained in the onion not subjected to alcohol immersion used in this test is shown as “heated onion” in the figure as a control of the amount of PRENCSO. The measurement procedure is as follows. The skin of the raw onion was removed and cut with a knife for 50 g. The chopped onion was then wrapped and heated in a microwave for 3 minutes. The heated onion was placed in a mixer and pulverized by adding an equal amount of distilled water. Thereafter, the mixture was centrifuged (12000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was recovered as a heated onion extract solution. The amount of PRENCSO contained in the extraction solution was also measured by the method described in
The results are shown in Figure 3.
As a result, it was confirmed that the immersion time in the aqueous ethanol solution was preferably about 48 hours.
試験3
凍結処理による浸漬時間の短縮効果（図4）
市販のタマネギのヘタ部分を用いて実験を行った。本実験は、剥ぎタマネギの工業的な作製工程で生じるタマネギ加工残査からPRENCSO、LFSを抽出することを想定したモデル実験である。
Exam 3
Effect of shortening immersion time by freezing treatment (Fig. 4)
Experiments were performed using a commercially available onion head portion. This experiment is a model experiment assuming that PRENCSO and LFS are extracted from the onion processing residue generated in the industrial production process of peeled onion.
まず市販のタマネギ6個を厚みが0.5〜0.8センチになるように包丁で切った。よって得たヘタ部分12個から無作為に4個づつ選び、3グループに分け、ビニール袋にいれた。 First, 6 commercially available onions were cut with a knife so that the thickness was 0.5 to 0.8 cm. Therefore, 4 pieces were selected at random from the 12 pieces of stickers obtained, divided into 3 groups, and placed in plastic bags.
1つ目のグループは、-80℃で30分間凍結処理を行い、凍結後、金づちで4センチ角程度の大きさになるように粉砕し、230ｍｌ容の蓋付き容器に30g量り取った。次に容器に30mlの50% (v/v) のエタノール水溶液を加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で5時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間） し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。 The first group was frozen at −80 ° C. for 30 minutes, and after freezing, it was crushed to a size of about 4 cm square with a hammer and weighed 30 g in a 230 ml lidded container. Next, 30 ml of 50% (v / v) ethanol aqueous solution was added to the container, and the onion sample was immersed in a low-temperature experimental chamber at 10 ° C. for 5 hours. The soaked product was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution.
2つ目のグループは、-20℃で22時間凍結処理を行い、凍結後、金づちで4センチ角程度の大きさになるように粉砕し、230ｍｌ容の蓋付き容器5個に30gずつ量り取った。次に各容器に30mlの50(v/v)% のエタノール水溶液を加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で1、2、3、4、5時間の浸漬を行った。所定の時間になったら各浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離（4℃、12000rpm、10分間）を行い、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。 The second group was frozen at -20 ° C for 22 hours, and after freezing, it was crushed to a size of about 4 cm square with a hammer, and weighed 30 g into five 230 ml containers with lids. It was. Next, add 30 ml of 50 (v / v)% aqueous ethanol solution to each container and immerse for 1, 2, 3, 4, 5 hours in a low-temperature laboratory at 10 ° C with the onion sample immersed. It was. After reaching a predetermined time, each immersion material was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution.
3つ目のグループは、凍結処理は行わず、生のまま包丁で4センチ角程度の大きさに切った後、230ｍｌ容の蓋付き容器に30g量り取った。次に容器に30mlの50(v/v)% のエタノール水溶液を加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で52時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離（4℃、12000rpm、10分間）し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。 The third group was not subjected to freezing treatment, and was cut into a size of about 4 cm square with a kitchen knife and weighed 30 g into a 230 ml container with a lid. Next, 30 ml of 50 (v / v)% ethanol aqueous solution was added to the container, and the onion sample was immersed in a low-temperature experimental chamber at 10 ° C. for 52 hours. The soaked material was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution.
このようにして得られた各抽出溶液中のPRENCSO量、LFSの活性量を比較した。PRENCSO量およびLFSの活性量の測定は試験1記載の方法で行なった。
The amount of PRENCSO and the amount of LFS activity in each extraction solution thus obtained were compared. The amount of PRENCSO and the amount of LFS activity were measured by the method described in
結果を図4に示す。その結果、浸漬前にタマネギに凍結処理を行うことで、エタノール水溶液での浸漬時間を40時間程度短縮できることが確認された。 The results are shown in FIG. As a result, it was confirmed that the immersion time in the aqueous ethanol solution can be shortened by about 40 hours by freezing the onion before immersion.
試験4
浸漬する水溶性有機溶媒の種類と抽出PRENCSO量、LFSの活性量の関係
エタノール以外の水溶性有機溶媒によるPRENCSOとLFSの回収の可能性について確認した。
Relationship between the type of water-soluble organic solvent to be immersed and the amount of extracted PRENCSO and LFS activity The possibility of recovery of PRENCSO and LFS with water-soluble organic solvents other than ethanol was confirmed.
まず、-20℃で凍結していたタマネギのヘタ部分を、金づちで4センチ角程度の大きさになるように粉砕し、230ｍｌ容の蓋付き容器4個に30gずつ量り取った。 First, onion that had been frozen at −20 ° C. was ground to a size of about 4 cm square with a hammer and weighed 30 g into four 230 ml containers with lids.
次に各容器に30mlの10(v/v)% のエタノール水溶液、メタノール水溶液、プロパノール水溶液、アセトン水溶液をそれぞれ加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で5時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間） し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。各抽出溶液中のPRENCSO量、及びLFSの活性量の比較を行い、浸漬溶媒の種類と抽出PRENCSO量、LFSの活性量の関係を検討した。PRENCSO量については試験1記載の方法で行った。LFSの活性量については以下の方法で行った。
Next, add 30 ml of 10 (v / v)% ethanol aqueous solution, methanol aqueous solution, propanol aqueous solution, and acetone aqueous solution to each container, and immerse for 5 hours in a low-temperature laboratory at 10 ° C with the onion sample immersed. Went. The soaked product was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution. The amount of PRENCSO in each extraction solution and the amount of LFS activity were compared, and the relationship between the type of immersion solvent and the amount of extracted PRENCSO and LFS was examined. The amount of PRENCSO was determined by the method described in
＜LFS活性測定方法＞
LFSの活性量の測定は、抽出溶液10μlに、250Unit/ml 精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/ml 精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させた。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、催涙成分のピーク面積を測定した。HPLC条件はカラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの , 温度：35℃ , 検出波長：254nm , 流速：0.6ml/minで行った。保持時間は9.6分に検出された。
<LFS activity measurement method>
To measure the amount of LFS activity, 40 μl of 250 Unit / ml purified alliinase solution was added to 10 μl of the extraction solution, and 20 μl of 20 mg / ml purified PRENCSO solution was added to start the enzyme substrate reaction. Three minutes later, 1 μl of the reaction solution was injected into the HPLC, and the peak area of the tear component was measured. HPLC conditions: Column: Pegasil ODS 4.6mmΦ × 25cm (Senshu Kagaku), Mobile phase: Acid water pH3.3 and methanol mixed 7 to 3, Temperature: 35 ℃, Detection wavelength: 254nm, Flow rate: 0.6ml / I went in min. Retention time was detected at 9.6 minutes.
結果を表１に示す。表１から明らかなように各水溶性有機溶媒でPRENCSO及びLFSを同時に回収できることが確認された。 The results are shown in Table 1. As is clear from Table 1, it was confirmed that PRENCSO and LFS can be recovered simultaneously with each water-soluble organic solvent.
試験5
浸漬する水溶性有機溶媒の濃度と抽出PRENCSO量、LFSの活性量の関係(図5)
試験4の結果を受けて、50(v/v)％に各水溶性有機溶媒の濃度を上げた場合のPRENCSO及びLFSの回収率を確認した。
Relationship between the concentration of water-soluble organic solvent to be immersed, the amount of extracted PRENCSO, and the amount of LFS activity (Figure 5)
Based on the results of
まず、-20℃で凍結していたタマネギのヘタ部分を、金づちで4センチ角程度の大きさになるように粉砕し、230ｍｌ容の蓋付き容器4個に30gずつ量り取った。 First, onion that had been frozen at −20 ° C. was ground to a size of about 4 cm square with a hammer and weighed 30 g into four 230 ml containers with lids.
次に各容器に30mlの50(v/v)% のエタノール水溶液、メタノール水溶液、プロパノール水溶液、アセトン水溶液をそれぞれ加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で5時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間） し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。各抽出溶液中のPRENCSO量の比較を行い、浸漬溶媒と抽出PRENCSO量の関係を検討した。 Next, add 30 ml of 50 (v / v)% ethanol aqueous solution, methanol aqueous solution, propanol aqueous solution, and acetone aqueous solution to each container, and immerse for 5 hours in a low-temperature laboratory at 10 ° C with the onion sample immersed. Went. The soaked product was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution. The amount of PRENCSO in each extraction solution was compared, and the relationship between the immersion solvent and the amount of extracted PRENCSO was examined.
＜PTENCSO測定方法＞
PRENCSO量の測定は試験１記載の方法で行った。
その後、本試験では浸漬溶媒が異なり試験１の方法ではLFSの活性量の測定ができないため、溶媒の影響を受けないレベルまで精製することにした。具体的には、各抽出溶液に陰イオン交換樹脂(DEAE-650M)を前記抽出溶液の液量の1/5倍vol加え、LFSの吸着を行った。吸着操作後に陰イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂に吸着されない溶液画分とを分離し、分離後の樹脂を5倍volの水で洗浄した後、樹脂の5倍volの500mMリン酸バッファー(pH5.0)を加えバッチ式で溶出させ、その上澄みを回収した。このようにして得た上澄みをLFS溶液とした。
LFS溶液中のLFSの活性量の比較を行い、浸漬溶媒と抽出LFSの活性量の関係を検討した。
<PTENCSO measurement method>
The amount of PRENCSO was measured by the method described in
After that, since the immersion solvent was different in this test and the amount of LFS activity could not be measured by the method of
The activity of LFS in LFS solution was compared, and the relationship between the immersion solvent and the activity of extracted LFS was examined.
＜LFS活性測定方法＞
LFSの活性量の測定は、LFS溶液を10〜100倍希釈したもの10μlに、250Unit/ml 精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/ml 精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させた。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、催涙成分のピーク面積を測定した。HPLC条件はカラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの , 温度：35℃ , 検出波長：254nm , 流速：0.6ml/minで行った。保持時間は9.6分に検出された。
<LFS activity measurement method>
The LFS activity was measured by adding 40 μl of 250 Unit / ml purified alliinase solution to 10 μl of 10 to 100-fold diluted LFS solution, and then adding 20 μl of 20 mg / ml purified PRENCSO solution to start the enzyme substrate reaction. I let you. Three minutes later, 1 μl of the reaction solution was injected into the HPLC, and the peak area of the tear component was measured. HPLC conditions: Column: Pegasil ODS 4.6mmΦ × 25cm (Senshu Kagaku), Mobile phase: Acid water pH3.3 and methanol mixed 7 to 3, Temperature: 35 ℃, Detection wavelength: 254nm, Flow rate: 0.6ml / I went in min. Retention time was detected at 9.6 minutes.
結果を図５に示す。濃度を10(v/v)％から50(v/v)％に上げて浸漬溶媒の種類と抽出PRENCSO量、LFSの活性量の関係を検討した結果、プロパノールとアセトンは50(v/v)％では回収出来るLFSの活性量が著しく低下することが確認された。 The results are shown in FIG. As a result of increasing the concentration from 10 (v / v)% to 50 (v / v)% and examining the relationship between the type of immersion solvent and the amount of extracted PRENCSO and LFS activity, propanol and acetone were 50 (v / v) %, It was confirmed that the amount of LFS activity that can be recovered decreases significantly.
試験6
プロパノール、アセトンを浸漬溶媒として用いる場合の濃度と抽出効率の関係(図6)
50％濃度のプロパノールとアセトンの場合はLFSの回収率が著しく低下することが確認された。そこで、プロパノールとアセトンの濃度とPRENCSO及びLFSの回収率の関係について検討した。
Exam 6
Relationship between concentration and extraction efficiency when propanol and acetone are used as immersion solvents (Figure 6)
In the case of 50% propanol and acetone, it was confirmed that the recovery rate of LFS was significantly reduced. Therefore, the relationship between the concentration of propanol and acetone and the recovery rate of PRENCSO and LFS was examined.
まず、-20℃で凍結していたタマネギのヘタ部分を、金づちで4センチ角程度の大きさになるように粉砕し、230ｍｌ容の蓋付き容器10個に30gずつ量り取った。 First, onion that had been frozen at −20 ° C. was ground to a size of about 4 cm square with a hammer, and 30 g was weighed into 10 230 ml lidded containers.
次に各容器に30mlの10〜50(v/v)% のプロパノール水溶液、アセトン水溶液をそれぞれ加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で5時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間） し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。各抽出溶液中のPRENCSO量の比較を行い、浸漬溶媒の濃度と抽出PRENCSO量の関係を検討した。 Next, 30 ml of 10-50 (v / v)% propanol aqueous solution and acetone aqueous solution were added to each container, respectively, and immersed for 5 hours in a low-temperature laboratory at 10 ° C. with the onion sample immersed. The soaked product was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution. The amount of PRENCSO in each extraction solution was compared, and the relationship between the concentration of the immersion solvent and the amount of extracted PRENCSO was examined.
＜PTENCSO測定方法＞
PRENCSO量の測定は試験１記載の方法で行った。
その後、試験５と同様の理由で、溶媒の影響を受けないレベルまで精製することにした。具体的には、各抽出溶液に陰イオン交換樹脂(DEAE-650M)を前記抽出溶液の液量の1/5倍vol加え、LFSの吸着を行った。吸着操作後に陰イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂に吸着されない溶液画分とを分離し、分離後の樹脂を5倍volの水で洗浄した後、樹脂の5倍volの500mMリン酸バッファー(pH5.0)を加えバッチ式で溶出させ、その上澄みを回収した。このようにして得た上澄みをLFS溶液とした。
LFS溶液中のLFSの活性量の比較を行い、浸漬溶媒の濃度と抽出LFSの活性量の関係を検討した。
<PTENCSO measurement method>
The amount of PRENCSO was measured by the method described in
Thereafter, for the same reason as in
The amount of LFS activity in the LFS solution was compared, and the relationship between the concentration of the immersion solvent and the amount of extracted LFS activity was examined.
＜LFS活性測定方法＞
LFSの活性量の測定は、LFS溶液を10〜100倍希釈したもの10μlに、250Unit/ml 精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/ml 精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させた。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、催涙成分のピーク面積を測定した。HPLC条件はカラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの , 温度：35℃ , 検出波長：254nm , 流速：0.6ml/minで行った。保持時間は9.6分に検出された。
結果を図６に示す。図６の結果、浸漬溶媒としてプロパノール、アセトンを用いる場合、好ましい溶媒濃度は10(v/v)%以上50(v/v)%未満であることが確認された。
<LFS activity measurement method>
The LFS activity was measured by adding 40 μl of 250 Unit / ml purified alliinase solution to 10 μl of 10 to 100-fold diluted LFS solution, and then adding 20 μl of 20 mg / ml purified PRENCSO solution to start the enzyme substrate reaction. I let you. Three minutes later, 1 μl of the reaction solution was injected into the HPLC, and the peak area of the tear component was measured. HPLC conditions: Column: Pegasil ODS 4.6mmΦ × 25cm (Senshu Kagaku), Mobile phase: Acid water pH3.3 and methanol mixed 7 to 3, Temperature: 35 ℃, Detection wavelength: 254nm, Flow rate: 0.6ml / I went in min. Retention time was detected at 9.6 minutes.
The results are shown in FIG. As a result of FIG. 6, when propanol or acetone was used as the immersion solvent, it was confirmed that the preferable solvent concentration was 10 (v / v)% or more and less than 50 (v / v)%.
試験7
浸漬に好ましい濃度の各浸漬溶媒と抽出PRENCSO量、LFSの活性量の関係(図７)
試験6までに、各浸漬溶媒のPRENCSO、LFSを抽出するのに好ましい濃度範囲が確認された。そこで、各溶媒の好ましい濃度で浸漬した場合に抽出されるPRENCSO量、及びLFSの活性量を比較し、浸漬に好ましい溶媒を決定することとした。
まず、-20℃で凍結していたタマネギのヘタ部分を、金づちで4センチ角程度の大きさになるように粉砕し、230ｍｌ容の蓋付き容器4個に30gずつ量り取った。
Test 7
Relationship between each immersion solvent at the preferred concentration for immersion and the amount of extracted PRENCSO and LFS activity (Fig. 7)
By Test 6, preferred concentration ranges for extracting PRENCSO and LFS of each immersion solvent were confirmed. Therefore, the amount of PRENCSO extracted when immersed in a preferable concentration of each solvent and the amount of LFS activity were compared to determine a preferable solvent for immersion.
First, onion that had been frozen at −20 ° C. was ground to a size of about 4 cm square with a hammer and weighed 30 g into four 230 ml containers with lids.
次に各容器に30mlの50(v/v)% のエタノール水溶液、メタノール水溶液、20(v/v)%のプロパノール水溶液、30(v/v)%のアセトン水溶液をそれぞれ加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で5時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間）し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。各抽出溶液中のPRENCSO量の比較を行い、浸漬溶媒と抽出PRENCSO量の関係を検討した。 Next, 30 ml of 50 (v / v)% ethanol aqueous solution, methanol aqueous solution, 20 (v / v)% propanol aqueous solution, and 30 (v / v)% acetone aqueous solution were added to each container, and the onion sample was soaked. In this state, immersion was performed for 5 hours in a low temperature test chamber at 10 ° C. The soaked material was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution. The amount of PRENCSO in each extraction solution was compared, and the relationship between the immersion solvent and the amount of extracted PRENCSO was examined.
＜PTENCSO測定方法＞
PRENCSO量の測定は試験１記載の方法で行った。
その後、各抽出溶液に陰イオン交換樹脂(DEAE-650M)を前記抽出溶液の液量の1/5倍vol加え、LFSの吸着を行った。吸着操作後に陰イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂に吸着されない溶液画分とを分離し、分離後の樹脂を5倍volの水で洗浄した後、樹脂の5倍volの500mMリン酸バッファー(pH5.0)を加えバッチ式で溶出させ、その上澄みを回収した。このようにして得た上澄みをLFS溶液とした。
LFS溶液中のLFSの活性量の比較を行い、浸漬溶媒と抽出LFSの活性量の関係を検討した。
<PTENCSO measurement method>
The amount of PRENCSO was measured by the method described in
Thereafter, an anion exchange resin (DEAE-650M) was added to each extraction solution at 1/5 times the volume of the extraction solution, and LFS was adsorbed. After the adsorption operation, the anion exchange resin and the solution fraction not adsorbed on the anion exchange resin are separated, and the separated resin is washed with 5 times the volume of water, and then 5 times the volume of the 500 mM phosphate buffer ( pH 5.0) was added and eluted in a batch system, and the supernatant was recovered. The supernatant thus obtained was used as an LFS solution.
The activity of LFS in LFS solution was compared, and the relationship between the immersion solvent and the activity of extracted LFS was examined.
＜LFS活性測定方法＞
LFSの活性量の測定は、LFS溶液を10〜100倍希釈したもの10μlに、250Unit/ml 精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/ml 精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させた。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、催涙成分のピーク面積を測定した。HPLC条件はカラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの , 温度：35℃ , 検出波長：254nm , 流速：0.6ml/minで行った。保持時間は9.6分に検出された。
<LFS activity measurement method>
The LFS activity was measured by adding 40 μl of 250 Unit / ml purified alliinase solution to 10 μl of 10 to 100-fold diluted LFS solution, and then adding 20 μl of 20 mg / ml purified PRENCSO solution to start the enzyme substrate reaction. I let you. Three minutes later, 1 μl of the reaction solution was injected into the HPLC, and the peak area of the tear component was measured. HPLC conditions: Column: Pegasil ODS 4.6mmΦ × 25cm (Senshu Kagaku), Mobile phase: Acid water pH3.3 and methanol mixed 7 to 3, Temperature: 35 ℃, Detection wavelength: 254nm, Flow rate: 0.6ml / I went in min. Retention time was detected at 9.6 minutes.
結果を図７に示す。図７の結果、浸漬溶媒としては、炭素数2以下のアルコールがアセトンよりも好ましいことが確認された。 The results are shown in FIG. As a result of FIG. 7, it was confirmed that an alcohol having 2 or less carbon atoms is preferable to acetone as the immersion solvent.
試験8
室温でもPRENCSO溶液が安定な条件（図8）
市販のタマネギ3個のヘタ部分を厚みが0.5〜0.8センチになるように包丁で切った。切ったヘタ部分を適当なビニール袋に入れ、-80℃で30分間凍結処理を行った。凍結後、金づちで4センチ角程度の大きさになるように粉砕し、230ｍｌ容の蓋付き容器に30g量り取った。次に容器に30mlの50(v/v)%のエタノール水溶液を加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で5時間の浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離 （4℃、12000rpm、10分間） し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。
Conditions under which the PRENCSO solution is stable even at room temperature (Figure 8)
Three pieces of commercially available onion were cut with a knife so that the thickness was 0.5 to 0.8 cm. The cut piece was placed in a suitable plastic bag and frozen at -80 ° C for 30 minutes. After freezing, it was pulverized to a size of about 4 cm square with a hammer and weighed 30 g in a 230 ml container with a lid. Next, 30 ml of 50 (v / v)% aqueous ethanol solution was added to the container, and the onion sample was immersed in a low-temperature laboratory at 10 ° C. for 5 hours. The soaked product was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution.
回収した抽出溶液に液量の1/4倍volの100mMリン酸バッファー（pH6.5）を加え、塩濃度の調整を行った。その後、塩濃度の調整を行った抽出溶液に、20mMのリン酸バッファー（pH6.5）で平衡化した陰イオン交換樹脂(DE52:Cl-)を前記抽出溶液の液量の1/2倍vol加え、LFSの吸着を行った。吸着操作後に陰イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂に吸着されない溶液画分とを分離し、分離後の樹脂に2倍volの水を加えバッチ式で洗浄した後、樹脂の2倍volの500mMリン酸バッファー(pH6.5)を加えバッチ式で樹脂からLFSを溶出させ、その上澄みを回収した。溶出操作は2度行った。このようにして得た上澄みはLFS溶液として回収し、下記試験9に用いる。 The salt concentration was adjusted by adding 1/4 volume vol of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) to the recovered extracted solution. Then, the anion exchange resin (DE52: Cl − ) equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.5) was added to the extracted solution whose salt concentration was adjusted to 1/2 times the volume of the extracted solution. In addition, LFS adsorption was performed. After the adsorption operation, the anion exchange resin is separated from the solution fraction that is not adsorbed on the anion exchange resin. After the separation resin is added with 2 volumes of water and washed in a batch system, the volume of the resin is 2 volumes vol. Phosphate buffer (pH 6.5) was added to elute LFS from the resin in a batch system, and the supernatant was recovered. The elution operation was performed twice. The supernatant thus obtained is recovered as an LFS solution and used in Test 9 below.
その後、陰イオン交換樹脂に吸着されない前記画分とLFSの溶出前に陰イオン交換樹脂を洗浄した水を適当な容器に集め、液量の1/4倍volの陽イオン交換樹脂(IR-120BH+)を加えてバッチ式でPRENCSOの吸着を行った。吸着操作後に陽イオン交換樹脂と、陽イオン交換樹脂に吸着されない溶液画分とを分離し、分離後の樹脂を2倍volで洗浄した後、樹脂に2倍volの水を加え、さらに濃アンモニア水を加えてpH8.5になるように調整することにより樹脂からPRENCSOを溶出させ、その上澄みを回収した。また回収後は直ちに1N塩酸でpH6.5へ中和した。溶出操作は2回行った。このようにして得られた溶液をPRENCSO溶液とした。 Thereafter, the fraction that is not adsorbed by the anion exchange resin and the water from which the anion exchange resin has been washed before elution of LFS are collected in a suitable container, and the cation exchange resin (IR-120BH of 1/4 volume of the liquid volume) is collected. + ) Was added to adsorb PRENCSO in batch mode. After the adsorption operation, the cation exchange resin is separated from the solution fraction that is not adsorbed on the cation exchange resin. After the separated resin is washed with 2 vol, 2 vol water is added to the resin, and concentrated ammonia is added. PRENCSO was eluted from the resin by adding water to adjust the pH to 8.5, and the supernatant was recovered. Immediately after the recovery, the mixture was neutralized with 1N hydrochloric acid to pH 6.5. The elution operation was performed twice. The solution thus obtained was designated as PRENCSO solution.
次にPRENCSO溶液が室温でも安定に保存できる条件の検討を行うため、以下の処理をPRENCSO溶液に行った。
(i) PRENCSO溶液に何の処理も行わない。
(ii) PRENCSO溶液をクリーンベンチ内で0.2μmの無菌フィルターで無菌濾過し、その後、PRENCSO溶液150μlに対して0.1N塩酸を10μlの割合で加えて溶液を酸性状態（pH3.0）にした。
(iii) PRENCSO溶液をクリーンベンチ内で0.2μmの無菌フィルターで無菌濾過した。
(iv) PRENCSO溶液150μlに対して0.1N塩酸を10μlの割合で加えて溶液を酸性状態（pH3.0）にした。
Next, in order to investigate the conditions under which the PRENCSO solution can be stored stably even at room temperature, the following treatment was performed on the PRENCSO solution.
(i) Do not perform any treatment on the PRENCSO solution.
(ii) The PRENCSO solution was aseptically filtered through a 0.2 μm sterile filter in a clean bench, and then 0.1 N hydrochloric acid was added at a ratio of 10 μl to 150 μl of the PRENCSO solution to make the solution acidic (pH 3.0).
(iii) The PRENCSO solution was sterile filtered with a 0.2 μm sterile filter in a clean bench.
(iv) 0.1N hydrochloric acid was added at a ratio of 10 μl to 150 μl of PRENCSO solution to bring the solution into an acidic state (pH 3.0).
上記(i)〜(iv)の処理を行った各PRENCSO溶液を室温で2ヶ月間保存した後のPRENCSO量を測定することで、保存安定性を評価した。PRENCSO量の測定は試験1記載の方法で行った。結果を図8に示す。
その結果、PRENCSO溶液は酸性状態で保存することで室温でも安定に保存できることが確認された。
The storage stability was evaluated by measuring the amount of PRENCSO after storing each PRENCSO solution treated with the above (i) to (iv) at room temperature for 2 months. The amount of PRENCSO was measured by the method described in
As a result, it was confirmed that the PRENCSO solution can be stored stably at room temperature by storing it in an acidic state.
試験9
LFS溶液の室温での保存安定性（図9）
試験8で得られたLFS溶液を用いて、LFS溶液の室温での保存安定性の検討を行った。これまでに本発明者らは、LFSをアリイナーゼと混合して凍結乾燥することで、室温でも安定に保存できることを確認している。そこで、本実験でもLFSとアリイナーゼを混合して凍結乾燥する方法を試みた。
Test 9
Storage stability of LFS solution at room temperature (Figure 9)
Using the LFS solution obtained in
8×108 Peak area/μlのLFS溶液 4.5μlに別途ニンニクから抽出した150Unit/mlのアリイナーゼ粗抽出液（5mMリン酸バッファー in 10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）25μlを加えてエッペンチューブ内で混合した。この混合液を、6ミリ四方に切った吸水紙（ニップンテクノクラスタ社；イムノクロマト部材＃470）に吸収させた後、大気圧下、-80℃で予備凍結した。凍結後、減圧下-10℃で凍結乾燥した。凍結乾燥後の吸水紙は500μlのエッペンチューブ内に入れて保存した。凍結乾燥後のLFSの活性量を100%として、室温で1, 2, 又は4週間保存した時の残存しているLFSの活性量（%）の確認を行った。 8 × 10 8 Peak area / μl LFS solution 4.5 μl and 150 μm of alliinase crude extract (5 mM phosphate buffer in 10% sucrose, 0.5% BSA, 25 μM pyridoxal phosphate) separately extracted from garlic and added to Eppen Mixed in a tube. This mixed solution was absorbed on water-absorbing paper (Nippon Technocluster Co., Ltd .; Immunochromatographic member # 470) cut into 6 mm squares, and then pre-frozen at −80 ° C. under atmospheric pressure. After freezing, it was lyophilized at −10 ° C. under reduced pressure. The water-absorbent paper after lyophilization was stored in a 500 μl Eppendorf tube. The LFS activity level after freeze-drying was defined as 100%, and the remaining LFS activity level (%) when stored at room temperature for 1, 2, or 4 weeks was confirmed.
凍結乾燥後のLFSの活性量の測定は、はじめに凍結乾燥した吸水紙に50mMリン酸バッファー(pH6.5、25μMピリドキサルリン酸、10%グリセロール) 200μl加え、吸水紙からバッファー中へLFSを再溶解させた。その後、再溶解させたLFS溶液を20〜40倍希釈したもの10μlに、250Unit/ml 精製アリイナーゼ溶液を40μl添加し、さらに20mg/ml 精製PRENCSO溶液20μlを添加して、酵素基質反応を開始させた。3分後に反応液1μlをHPLCへ注入し、催涙成分のピーク面積を測定した。HPLC条件はカラム：Pegasil ODS 4.6mmΦ×25cm （センシュウ科学） , 移動相：酸性水pH3.3とメタノールを7対3で混合したもの , 温度：35℃ , 検出波長：254nm , 流速：0.6ml/minで行った。保持時間9.6分に検出された。結果を図9に示す。その結果LFSはアリイナーゼと混合して乾燥することで、室温で長期間活性を保持できることが示された。 To measure the amount of LFS activity after lyophilization, first add 200 μl of 50 mM phosphate buffer (pH 6.5, 25 μM pyridoxal phosphate, 10% glycerol) to the lyophilized water-absorbing paper, and re-dissolve LFS from the water-absorbing paper into the buffer. It was. Thereafter, 40 μl of 250 Unit / ml purified alliinase solution was added to 10 μl of 20-40 times diluted reconstituted LFS solution, and 20 μl of 20 mg / ml purified PRENCSO solution was added to start the enzyme substrate reaction. . Three minutes later, 1 μl of the reaction solution was injected into the HPLC, and the peak area of the tear component was measured. HPLC conditions: Column: Pegasil ODS 4.6mmΦ × 25cm (Senshu Kagaku), Mobile phase: Acid water pH3.3 and methanol mixed 7 to 3, Temperature: 35 ℃, Detection wavelength: 254nm, Flow rate: 0.6ml / I went in min. Retention time was detected at 9.6 minutes. The results are shown in FIG. As a result, it was shown that LFS can maintain activity at room temperature for a long time by mixing with alliinase and drying.
＜LFS溶液と混合して凍結乾燥したアリイナーゼ粗抽出液の調整方法＞
まず、ミキサーのジョッキを冷蔵庫に入れて冷やしておく。また、低温遠心機にローターをセットし、温度を４℃にセットして冷却しておく。ニンニク片（100g）に等量のバッファー Aを加えて、ミキサーで粉砕する。氷上に置いたジョッキの口に二重にしたガーゼを輪ゴムでとめる。粉砕物をそのガーゼの上に流して、濾す。ろ液がある程度得られた後で、ガーゼ上の粉砕物をガーゼで包んで絞る。得られたろ液を12000rpmで10 分間 ４℃で遠心分離する。遠心上清を回収する。回収した遠心上清を氷上に置いた状態で攪拌しつつ、pHをモニターしながら、酢酸を加えていき、pHを4.0にする。pHが4.0になったら、そのまま5min静置する。沈殿の出てきたサンプルを12000rpm×10min、４℃で遠心分離する。遠心ペレットを回収する（バッファー Aを使う）。
<Preparation method of crude extract of alliinase mixed with LFS solution and freeze-dried>
First, put the mixer mug in the refrigerator and let it cool. In addition, a rotor is set in a low-temperature centrifuge, and the temperature is set at 4 ° C. and cooled. Add an equal amount of Buffer A to garlic pieces (100 g) and grind with a mixer. Use a rubber band to fasten the double gauze on the mouth of a mug placed on ice. Pour the ground material over the gauze and filter. After a certain amount of filtrate is obtained, the crushed material on the gauze is wrapped with gauze and squeezed. The resulting filtrate is centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Collect the centrifugation supernatant. While stirring the collected centrifugal supernatant on ice, acetic acid is added while monitoring the pH, and the pH is adjusted to 4.0. When pH reaches 4.0, leave it for 5 min. The sample from which the precipitate has come out is centrifuged at 12000 rpm × 10 min at 4 ° C. Collect the centrifugation pellet (use buffer A).
回収したペレットを50ml〜100mlにして（バッファー A）、そのまま、５℃で30min静置する。サンプルを12000rpmで10分間４℃で遠心分離する。1N水酸化ナトリウム水溶液を用いて、回収した遠心上清のpHを6.5に調製する。これをアリイナーゼ粗抽出液とする。 The collected pellet is made 50 ml to 100 ml (buffer A) and left as it is at 5 ° C. for 30 min. Samples are centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. Using 1N aqueous sodium hydroxide solution, adjust the pH of the collected centrifugal supernatant to 6.5. This is designated as the alliinase crude extract.
今回はこのアリイナーゼ粗抽出液のバッファーを5mMリン酸バッファー（pH6.5、10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）に置換し用いた。バッファーの置換はEcono-Pac 10DG Column 30×10ml（BIO-RAD）を用い、マニュアルの推奨方法で行った。概要は元々カラムに入っている溶液をデカンテーションで捨てた後、カラムを5mMリン酸バッファー（pH6.5、10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸） 20mlで平衡化した。その後、アリイナーゼ粗抽出液3mlをカラムにアプライした。その後、5mMリン酸バッファー（pH6.5、10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）でカラムからアリイナーゼを溶出し、アリイナーゼ粗抽出液（10%スクロース、0.5%BSA、25μMピリドキサルリン酸）として回収した。
This time, the buffer of this alliinase crude extract was replaced with 5 mM phosphate buffer (pH 6.5, 10% sucrose, 0.5% BSA, 25 μM pyridoxal phosphate). Buffer replacement was performed using the recommended method of the manual using Econo-
試験10
実施例（図10）
880ｍｌ容の蓋付き容器に、包丁で4センチ角程度の大きさに切った市販のタマネギを200g量り取った。次に容器に200mlの50(v/v)%のエタノール水溶液を加え、タマネギ試料が浸った状態で、10℃の低温実験庫内で60時間浸漬を行った。浸漬物をミキサーで粉砕した後、遠心分離（4℃、12000rpm、10分間）し、得られた上澄みを抽出溶液として回収した。回収した抽出溶液に液量の1/4倍volの100mMリン酸バッファー（pH6.5）を加え、塩濃度の調整を行った。
Example (Figure 10)
In an 880 ml container with a lid, 200 g of a commercially available onion cut into a size of about 4 cm square with a knife was weighed. Next, 200 ml of 50 (v / v)% ethanol aqueous solution was added to the container, and the onion sample was immersed in a low-temperature experimental chamber at 10 ° C. for 60 hours. The soaked material was pulverized with a mixer and then centrifuged (4 ° C., 12000 rpm, 10 minutes), and the resulting supernatant was recovered as an extraction solution. The salt concentration was adjusted by adding 1/4 volume vol of 100 mM phosphate buffer (pH 6.5) to the recovered extracted solution.
その後、塩濃度の調整を行った抽出溶液に20mMのリン酸バッファー（pH6.5）で平衡化した陰イオン交換樹脂(DE52:Cl-)を前記抽出溶液の液量の1/2倍vol加え、LFSの吸着を行った。吸着操作後に陰イオン交換樹脂と、陰イオン交換樹脂に吸着されない溶液画分とを分離し、分離後の樹脂を2倍volの水で洗浄した後、樹脂の2倍volの500mMリン酸バッファー(pH6.5)を加えバッチ式で溶出させ、その上澄みを回収した。溶出操作は2度行った。このようにして得た上澄みをLFS溶液とした。 After that, an anion exchange resin (DE52: Cl − ) equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.5) was added to the extraction solution whose salt concentration had been adjusted by 1/2 times the volume of the extraction solution. And LFS adsorption. After the adsorption operation, the anion exchange resin and the solution fraction that is not adsorbed on the anion exchange resin are separated, and the separated resin is washed with 2 volumes of water, and then 2 volumes of the 500 mM phosphate buffer ( pH6.5) was added and eluted in a batch system, and the supernatant was recovered. The elution operation was performed twice. The supernatant thus obtained was used as an LFS solution.
その後、陰イオン交換樹脂に吸着されない前記画分とLFSの溶出前に陰イオン交換樹脂を洗浄した水を適当な容器に集め、液量の1/4倍volの陽イオン交換樹脂(IR-120BH+)を加えてバッチ式でPRENCSOの吸着を行った。吸着操作後に陽イオン交換樹脂と、陽イオン交換樹脂に吸着されない溶液画分とを分離し、分離後の樹脂を2倍volで洗浄した後、樹脂に2倍volの水を加え、さらに濃アンモニア水を加えてpH8.5になるように調整することにより樹脂からPRENCSOを溶出させ、その上澄みを回収した。また回収後は直ちに1N塩酸でpH6.5へ中和した。溶出操作は2回行った。このようにして得られた溶液をPRENCSO溶液とした。 Thereafter, the fraction that is not adsorbed by the anion exchange resin and the water from which the anion exchange resin has been washed before elution of LFS are collected in a suitable container, and the cation exchange resin (IR-120BH of 1/4 volume of the liquid volume) is collected. + ) Was added to adsorb PRENCSO in batch mode. After the adsorption operation, the cation exchange resin is separated from the solution fraction that is not adsorbed on the cation exchange resin. After the separated resin is washed with 2 vol, 2 vol water is added to the resin, and concentrated ammonia is added. PRENCSO was eluted from the resin by adding water to adjust the pH to 8.5, and the supernatant was recovered. Immediately after the recovery, the mixture was neutralized with 1N hydrochloric acid to pH 6.5. The elution operation was performed twice. The solution thus obtained was designated as PRENCSO solution.
エタノール水溶液浸漬処理後の抽出溶液（イオン交換前上澄み）、LFS溶液（陰イオン交換吸着画分）、およびPRENCSO溶液（陽イオン交換吸着画分）のそれぞれについて、PRENCSOの量と、LFSの活性量を測定した。測定は試験1記載の手順により行った。
The amount of PRENCSO and the amount of LFS activity for each of the extraction solution (supernatant before ion exchange), LFS solution (anion exchange adsorption fraction), and PRENCSO solution (cation exchange adsorption fraction) after immersion in ethanol aqueous solution Was measured. The measurement was performed according to the procedure described in
結果を図10に示す。その結果、LFS、PRENCSOを抽出、精製することが出来た。またそれぞれの回収率はイオン交換前の上澄みに対して、LFSは回収率80%、PRENCSOは回収率50%であった。 The results are shown in FIG. As a result, LFS and PRENCSO could be extracted and purified. The recovery rates were 80% for LFS and 50% for PRENCSO relative to the supernatant before ion exchange.
Claims (9)
10(v/v)%以上70(v/v)%未満の水溶性有機溶媒を含有する水溶液にタマネギを浸漬することにより、タマネギに含まれるアリイナーゼを失活させる浸漬工程、
浸漬工程後の前記水溶液とともに前記タマネギを粉砕して、LFS及びPRENCSOを前記水溶液中に抽出する抽出工程、
抽出工程後の前記水溶液を陰イオン交換樹脂に接触させることにより陰イオン交換樹脂にLFSを吸着させ、次いで吸着されたLFSを分離するLFS分離工程、並びに
LFS分離工程において陰イオン交換樹脂に吸着されない画分を陽イオン交換樹脂に接触させることにより陽イオン交換樹脂にPRENCSOを吸着させ、次いで吸着されたPRENCSOを分離するPRENCSO分離工程、を含むことを特徴とする前記方法。 A method for separating LFS (Tearing Component Generating Enzyme) and PRENCSO (S-1-propenyl-cysteine sulfoxide) from onion,
Immersion step of inactivating alliinase contained in the onion by immersing the onion in an aqueous solution containing 10 (v / v)% or more and less than 70 (v / v)% water-soluble organic solvent,
The extraction step of pulverizing the onion together with the aqueous solution after the immersion step, and extracting LFS and PRENCSO into the aqueous solution,
An LFS separation step of adsorbing LFS to the anion exchange resin by contacting the aqueous solution after the extraction step with the anion exchange resin, and then separating the adsorbed LFS; and
It includes a PRENCSO separation step in which PRENCSO is adsorbed on the cation exchange resin by contacting the fraction not adsorbed on the anion exchange resin in the LFS separation step with the cation exchange resin, and then the adsorbed PRENCSO is separated. Said method.
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