JP2009240269A - Method for discriminating kind of cynodon dactylon with microsatellite marker - Google Patents

Method for discriminating kind of cynodon dactylon with microsatellite marker Download PDF

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良 明石
Yu Kuno
裕 久野
Tetsuyuki Tabata
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for discriminating the kind of Cynodon dactylon by the use of a genotype which is a genotype at a specific microsatellite site in the genome DNA of control Cynodon dactylon and the genotype specific to the kind of the control Cynodon dactylon, as an indicator, and the like. <P>SOLUTION: Microsatellites are extracted from ESTs originated from the aboveground portion of Cynodon dactylon, and a primer is designed so that 90 to 300 bp PCR fragments containing the microsatellites can be obtained. Various kinds of Cynodon dactylon have been subjected to PCRs using a genome DNA as a template and using the designed primer pair. The PCR products have been subjected to fluorescent label reactions and then separated by an electrophoresis method using a 10% polyacrylamide gel. Consequently, it has found that a kind-specific PCR fragment length can be detected and used as an indicator to determine the kind of a Cynodon dactylon to be tested. <P>COPYRIGHT: (C)2010,JPO&INPIT

Description

本発明は、マイクロサテライトマーカーを用いるバーミューダグラス品種判別法に関する。   The present invention relates to a method for discriminating varieties of Bermuda glass using a microsatellite marker.

バーミューダグラス/ギョウギシバ(Cynodon dactylon)は、熱帯から亜熱帯にかけて広く分布するイネ科の多年生草本である。バーミューダグラスは、飼料用の他、ゴルフ場や緑地などの園芸・芝生用に広く利用されている。 Bermuda grass / Cynodon dactylon is a perennial herb that is widely distributed from the tropics to the subtropics. Bermuda glass is widely used for horticulture and lawns such as golf courses and green spaces in addition to feed.

バーミューダグラスの品種・系統識別や分類には、主に形態の違いが指標とされてきた。形態観察以外の識別法として、DNAマーカーの利用が挙げられる。バーミューダグラスにおいては、AFLPマーカーやRAPDマーカーなどが開発されている。
Ludovic et al. (2005) Dinitroaniline-Induced Genetic Changes in Bermudagrass. Crop Sci., 45: 1504-1510 Yerramsetty et al. (2005) DNA Fingerprinting of Seeded Bermudagrass Cultivars. Crop Sci., 45: 772-777 Karaca et al. (2002) Genetic Diversity among Forage Bermudagrass (Cynodon spp.): Evidence from Chloroplast and Nuclear DNA Fingerprinting. Crop Sci., 42: 2118-2127 Differences in form and lineage of Bermuda Douglas have mainly been attributed to differences in form. As an identification method other than morphological observation, use of a DNA marker can be mentioned. In Bermuda glass, AFLP markers and RAPD markers have been developed.
Ludovic et al. (2005) Dinitroaniline-Induced Genetic Changes in Bermudagrass. Crop Sci., 45: 1504-1510 Yerramsetty et al. (2005) DNA Fingerprinting of Seeded Bermudagrass Cultivars. Crop Sci., 45: 772-777 Karaca et al. (2002) Genetic Diversity among Forage Bermudagrass (Cynodon spp.): Evidence from Chloroplast and Nuclear DNA Fingerprinting. Crop Sci., 42: 2118-2127

バーミューダグラス利用の多様化に伴い、今後も新たな登録品種の増加が予想される。そのため、従来の形態的特徴による品種識別に加えて、DNAマーカーによる品種識別もまた併用することが望ましい。DNAマーカーによる品種識別としてはAFLPマーカーやRAPDマーカーによる品種識別がある。しかし、AFLPマーカーによる品種識別は、作業が煩雑であり、さらに特定のマーカー座位のアリルを特定するにはその座位領域を増幅するプライマーを再設計（STS化）することが必要である。また、RAPDマーカーは再現性が低いため、品種判別マーカーとして利用しにくい。どちらのマーカーも、ある特定のマーカー座位のアリルを特定することができない点で、汎用性に乏しい。また、DNAマーカーによる品種識別としてはマイクロサテライトマーカーによる品種識別がある。ゲノムDNA内のmRNAに転写されない領域に存在するマイクロサテライトは、そのマイクロサテライトが単離された生物と遠縁の生物には存在しない可能性があるので、そのようなマイクロサテライトをマーカーとした品種識別は汎用性に乏しい。   With the diversification of usage of Bermuda glass, new registered varieties are expected to increase in the future. For this reason, it is desirable to use cultivar identification using DNA markers in addition to conventional cultivar identification. Variety identification by DNA marker includes breed identification by AFLP marker or RAPD marker. However, identification of varieties using AFLP markers is complicated, and it is necessary to redesign (STS) a primer that amplifies the locus region in order to identify an allele at a particular marker locus. In addition, since the RAPD marker has low reproducibility, it is difficult to use it as a kind discrimination marker. Neither marker is versatile in that it cannot identify an allele at a particular marker locus. In addition, cultivar identification using a DNA marker includes cultivar identification using a microsatellite marker. Microsatellite that exists in a region that is not transcribed into mRNA in genomic DNA may not be present in organisms that are distant from the organism in which the microsatellite is isolated, so cultivar identification using such microsatellite as a marker Is not very versatile.

本発明は、上記状況に鑑みてなされたものであり、対照バーミューダグラスのゲノムDNAにおける特定のマイクロサテライト座位の遺伝子型であって、対照バーミューダグラス品種に特異的な遺伝子型を指標とする被検バーミューダグラスの品種判別法、該方法に用いるための試薬やキット、該方法に使用できるオリゴヌクレオチド、該方法に使用できるオリゴヌクレオチドのセットなどを提供することを課題とする。   The present invention has been made in view of the above circumstances, and is a genotype of a specific microsatellite locus in genomic DNA of a control burgundy glass, and a test using a genotype specific to the control burgundy cultivar as an index It is an object to provide a method for discriminating varieties of Bermuda glass, reagents and kits for use in the method, oligonucleotides usable in the method, a set of oligonucleotides usable in the method, and the like.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、バーミューダグラスの地上部由来のEST(Expressed Sequence Tag)からマイクロサテライトを抽出し、それらを含む90〜300bpのPCR断片が得られるようにプライマーを設計した。多品種のバーミューダグラスそれぞれについて、ゲノムDNAを鋳型として、設計したプライマーペアを用いてPCRを行ない、それらのPCR産物を10%ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分離した。その結果、品種特異的なPCR断片長を検出することができ、品種特異的なPCR断片長を指標に被検バーミューダグラスの品種判定を行えることが判明した。本発明は、この知見に基づくものであり、より詳細には、以下の〔１〕から〔１０〕に記載の発明に関する。
〔１〕下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）対照バーミューダグラスのゲノムDNAにおける下記（１）から（１０）からなる群より選択される少なくとも1つのマイクロサテライト座位の遺伝子型であって、対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型、
（１）配列番号：1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（２）配列番号：3に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（３）配列番号：5に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：6に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（４）配列番号：7に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（５）配列番号：9に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：10に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（６）配列番号：11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（７）配列番号：13に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（８）配列番号：15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：16に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（９）配列番号：17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、並びに、
（１０）配列番号：19に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：20に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位。
〔２〕対照バーミューダグラスが、ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンのゲノムDNAにおける下記（１）から（８）からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロサテライト座位の遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型、
（１）配列番号：1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（２）配列番号：3に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（３）配列番号：5に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：6に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（４）配列番号：7に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（５）配列番号：9に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：10に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（６）配列番号：11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（７）配列番号：13に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、並びに、
（８）配列番号：15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：16に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位。
〔４〕〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法に用いるためのバーミューダグラスの品種判別用試薬。
〔５〕〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法に用いるためのバーミューダグラスの品種判別用キット。
〔６〕配列番号：1から20のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
〔７〕下記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択される少なくとも1組のセット；
（Ａ）配列番号：1に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｂ）配列番号：3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｃ）配列番号：5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｄ）配列番号：7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｅ）配列番号：9に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：10に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｆ）配列番号：11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：12に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｇ）配列番号：13に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：14に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｈ）配列番号：15に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：16に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｉ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：18に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、並びに、
（Ｊ）配列番号：19に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：20に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。
〔８〕〔７〕に記載のセットを含有するバーミューダグラスの品種判別用試薬。
〔９〕〔７〕に記載のセットを含有するバーミューダグラスの品種判別用キット。
〔１０〕ティフウェイ、フェニックスターフ、ティフドワーフ、及び、ティフグリーンからなる群より選択されるいずれかのバーミューダグラスのゲノムDNAを鋳型とし、下記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択されるいずれかのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物；
（Ａ）配列番号：1に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｂ）配列番号：3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｃ）配列番号：5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｄ）配列番号：7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｅ）配列番号：9に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：10に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｆ）配列番号：11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：12に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｇ）配列番号：13に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：14に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｈ）配列番号：15に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：16に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｉ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：18に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、並びに、
（Ｊ）配列番号：19に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：20に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。 The inventors of the present invention have intensively studied to solve the above problems. The present inventors extracted microsatellite from EST (Expressed Sequence Tag) derived from the above-ground part of Bermuda Douglas, and designed primers so as to obtain a 90-300 bp PCR fragment containing them. For each of various types of Bermuda glass, PCR was performed using the designed primer pair using genomic DNA as a template, and the PCR products were separated by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel. As a result, it was found that the variety-specific PCR fragment length can be detected, and the variety of the tested Bermuda glass can be determined using the variety-specific PCR fragment length as an index. The present invention is based on this finding, and more specifically, relates to the inventions described in [1] to [10] below.
[1] A method for discriminating varieties of test Bermuda glass, comprising the step of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotype compared in the step is A method in which, when matched, the test varieties glass variety is determined to be of the same varieties as the control varieties glass;
(A) a genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of the following (1) to (10) in the genomic DNA of a control bar glass grass, the genotype specific to the control bar glass grass:
(B) the genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass,
(1) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2;
(2) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 4;
(3) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 6;
(4) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 8;
(5) a microsatellite locus sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 9 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 10;
(6) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 11 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 12;
(7) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 13 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 14;
(8) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 15 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 16;
(9) a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 17, and a microsatellite locus sandwiched between base sequences complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 18; and
(10) A microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 19 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 20.
[2] The method according to [1], wherein the control Bermuda glass is Tiffway, Phoenix Starf, Tiff Dwarf or Tiff Green.
[3] A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the step of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotype compared in the step is A method in which, when matched, the test varieties glass variety is determined to be of the same varieties as the control varieties glass;
(A) genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of the following (1) to (8) in Tifway, Phoenix Starf, or Tif Dwarf or Tiff Green genomic DNA;
(B) the genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass,
(1) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2;
(2) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 4;
(3) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 6;
(4) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 8;
(5) a microsatellite locus sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 9 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 10;
(6) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 11 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 12;
(7) a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 13, and a microsatellite locus sandwiched between base sequences complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 14; and
(8) A microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 15 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 16.
[4] A reagent for discriminating varieties of Bermuda glass for use in the method according to any one of [1] to [3].
[5] A kit for discriminating varieties of Bermuda glass for use in the method according to any one of [1] to [3].
[6] An oligonucleotide comprising the base sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 20.
[7] At least one set selected from the group consisting of (A) to (J) below:
(A) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2,
(B) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
(C) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
(D) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8;
(E) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
(F) a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(G) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 14;
(H) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 16;
(I) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and
(J) A set of an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
[8] A reagent for discriminating varieties of Bermuda glass containing the set according to [7].
[9] A kit for discriminating varieties of Bermuda glass containing the set according to [7].
[10] Any one selected from the group consisting of (A) to (J) below, using as a template a genomic DNA of any Bermuda glass selected from the group consisting of Tiffway, Phoenix Starf, Tif Dwarf, and Tiff Green PCR products amplified by PCR using these sets as primer sets;
(A) an oligonucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 2,
(B) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
(C) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
(D) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8;
(E) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
(F) a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(G) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 14;
(H) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 16;
(I) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and
(J) A set of an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20.

本発明によって、形態が類似するバーミューダグラス種内において、DNAレベルでの品種の識別、品種の雑種性や遺伝的背景の同定などが可能となる。また、本発明のマイクロサテライトは、EST由来のマイクロサテライト、すなわちゲノムDNA内のmRNAに転写される領域に存在するマイクロサテライトであるので、そのマイクロサテライトが単離されたバーミューダグラスと遠縁のバーミューダグラスにも存在する可能性が高い。よって、本発明は、マイクロサテライトが単離されたバーミューダグラスだけでなく、該バーミューダグラスと類縁のバーミューダグラスや遠縁のバーミューダグラスにも応用可能である。さらに、本発明において、複数のマイクロサテライト座位の遺伝子型を品種識別の指標とする場合は、品種判別法によって得られる結果の信頼性が高くなる。   According to the present invention, it is possible to identify varieties at the DNA level, to identify the hybridity and genetic background of varieties, etc. in a Bermuda glass species with similar morphology. The microsatellite of the present invention is an EST-derived microsatellite, that is, a microsatellite existing in a region transcribed into mRNA in genomic DNA. There is a high possibility that it exists. Therefore, the present invention can be applied not only to Bermuda glass from which microsatellite has been isolated, but also to Bermuda glass that is similar to the Bermuda glass or far-field Bermuda glass. Furthermore, in the present invention, when the genotypes of a plurality of microsatellite loci are used as an index for breed identification, the reliability of the result obtained by the breed identification method is increased.

〔発明の実施の形態〕
本発明者らは、バーミューダグラスのゲノムDNAにおいて、下記（１）から（１０）に記載のマイクロサテライト座位を解析したところ、該マイクロサテライト座位が多型性を示すことを見出した。また、本発明者らは、該マイクロサテライト座位の遺伝子型を解析したところ、特定のバーミューダグラス品種に特異的な遺伝子型が存在すること、及び、該遺伝子型を指標とすることにより、被検バーミューダグラスの品種判別を行えることを見出した。本発明は、このような知見に基づき、以下の発明を提供する。 [Embodiment of the Invention]
The present inventors analyzed the microsatellite loci described in (1) to (10) below in genomic DNA of Bermuda glass, and found that the microsatellite loci showed polymorphism. In addition, the present inventors analyzed the genotype of the microsatellite locus, and found that a specific genotype exists in a specific Bermuda grass variety, and that the genotype was used as an index, We found that it was possible to identify the variety of Bermuda glass. The present invention provides the following inventions based on such findings.

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）対照バーミューダグラスのゲノムDNAにおける下記（１）から（１０）からなる群より選択される少なくとも1つのマイクロサテライト座位の遺伝子型であって、対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型、
（１）配列番号：1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（２）配列番号：3に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（３）配列番号：5に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：6に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（４）配列番号：7に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（５）配列番号：9に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：10に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（６）配列番号：11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（７）配列番号：13に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（８）配列番号：15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：16に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（９）配列番号：17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、並びに、
（１０）配列番号：19に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：20に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match And the method of discriminating that the test varieties of varieties are the same varieties as the control varieties.
(A) a genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of the following (1) to (10) in the genomic DNA of a control bar glass grass, the genotype specific to the control bar glass grass:
(B) the genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass,
(1) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2;
(2) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 4;
(3) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 6;
(4) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 8;
(5) a microsatellite locus sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 9 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 10;
(6) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 11 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 12;
(7) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 13 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 14;
(8) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 15 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 16;
(9) a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 17, and a microsatellite locus sandwiched between base sequences complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 18; and
(10) A microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 19 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 20.

なお、この方法では、遺伝子型が一致しなかったときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種ではないと判定される。   In this method, when the genotype does not match, it is determined that the varieties of the tested bar glass grass are not the same as the control bar glass grass.

本発明において、「マイクロサテライト」とは、1つまたは複数の塩基を1反復単位とする反復配列を意味する。1つまたは複数の塩基としては、1から5の塩基が例示できるが、これに制限されるものではない。本発明の「マイクロサテライト」は、「SSR（Simple Sequence Repeat）」と表現することもできる。   In the present invention, “microsatellite” means a repeating sequence having one or more bases as one repeating unit. Examples of one or more bases include, but are not limited to, 1 to 5 bases. The “microsatellite” of the present invention can also be expressed as “SSR (Simple Sequence Repeat)”.

本発明において、「マイクロサテライト座位」とは、染色体又は遺伝地図上におけるマイクロサテライトの位置を意味する。本発明の「マイクロサテライト座位」は、「マイクロサテライト座」と表現することもできる。   In the present invention, the “microsatellite locus” means the position of the microsatellite on the chromosome or genetic map. The “microsatellite locus” of the present invention can also be expressed as “microsatellite locus”.

本発明において、「遺伝子型」とは、アリルの種類（パターン）を意味する。よって、本発明の「遺伝子型」は「アリルパターン」と表現することもできる。また、本発明の「アリル」は「アレル」や「対立遺伝子」と表現することもできる。また、本発明において、「マイクロサテライト座位の遺伝子型」とは、マイクロサテライト座位におけるアリルの種類を意味する。マイクロサテライト座位におけるアリルは、当該するマイクロサテライトの反復単位の繰り返し回数の違いによって種類わけされ、PCR産物中のマイクロサテライトの長さ、すなわち分子量サイズが異なるためにその違いを検出することができる。   In the present invention, the “genotype” means the kind (pattern) of allele. Therefore, the “genotype” of the present invention can also be expressed as an “allyl pattern”. Moreover, the “allyl” of the present invention can also be expressed as “allele” or “allele”. In the present invention, the “genotype of the microsatellite locus” means the type of allyl in the microsatellite locus. Alleles at the microsatellite locus are classified according to the difference in the number of repetitions of the repetitive unit of the microsatellite, and the difference can be detected because the length of the microsatellite in the PCR product, that is, the molecular weight size is different.

本発明において、「少なくとも1つのマイクロサテライト座位の遺伝子型」には、1つのマイクロサテライト座位の遺伝子型、及び、複数のマイクロサテライト座位それぞれの遺伝子型の組み合わせが含まれる。   In the present invention, “genotype of at least one microsatellite locus” includes a genotype of one microsatellite locus and a combination of genotypes of a plurality of microsatellite loci.

本発明における「対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型」は「対照バーミューダグラス品種に特異的な遺伝子型」と表現することもできる。   The “genotype specific to control Bermuda glass” in the present invention can also be expressed as “genotype specific to control Bermuda glass variety”.

本発明における対照バーミューダグラスは、そのバーミューダグラスのゲノムDNAにおける上記（１）から（１０）からなる群より選択される少なくとも1つのマイクロサテライト座位の遺伝子型であって、そのバーミューダグラスに特異的な遺伝子型が検出されるバーミューダグラスである。対照バーミューダグラスとしては、例えば、以下の1から4からなる群より選択される少なくとも1つのバーミューダグラスが挙げられるが、バーミューダグラスである限り、これらに制限されるものではない。以下の1から4のバーミューダグラスと類縁のバーミューダグラスや遠縁のバーミューダグラスもまた本発明の対照バーミューダグラスに含まれる。
1.ティフドワーフ（Tifdwarf）（販売元：雪印種苗）
2.ティフグリーン（Tifgreen）(別名：ティフトン328（Tifton328）)（販売元：雪印種苗）
3.ティフウェイ（Tifway）(別名：ティフトン419（Tifton419）)（販売元：雪印種苗）
4.フェニックスターフ（Phoenix Turf）（市販されており、容易に入手できる） The control Bermudagrass in the present invention is at least one microsatellite locus genotype selected from the group consisting of (1) to (10) in the genomic DNA of the Bermudagrass, and is specific to the Bermudagrass It is a Bermuda glass whose genotype is detected. Examples of the control bar glass include at least one bar glass which is selected from the group consisting of the following 1 to 4. However, the control bar glass is not limited to these as long as it is a bar glass. The following 1 to 4 Bermuda glasses and related Bermuda glasses and remote glasses are also included in the control Bermuda glass of the present invention.
1. Tifdwarf (Distributor: Snow Brand Seedling)
2. Tifgreen (aka Tifton 328) (Seller: Snow Brand Seedling)
3. Tifway (aka Tifton 419) (Seller: Snow Brand Seedling)
4. Phoenix Turf (commercially available and easily available)

本発明において、被検バーミューダグラスとしては、バーミューダグラスの特徴を有する植物、バーミューダグラスの可能性がある植物、遺伝的にバーミューダグラスに近縁な植物種等が例示できるが、これらに制限されない。   In the present invention, examples of the tested glass can include, but are not limited to, plants having the characteristics of Bermuda glass, plants having the potential of Bermuda glass, and plant species genetically related to Bermuda glass.

またバーミューダグラスの特徴としては、茎は細く地下茎を有するとともに、匍匐茎があり各節から発根し、直立する稈を出して広がることが例示できるが、これらに限定されない。   Further, the characteristic of Bermuda glass is that the stem is thin and has an underground stem, and there are stems, rooted from each node, and erecting an upright fold and spreading, but is not limited thereto.

また、本発明における「品種」は、品種登録制度がある国においては「品種又は育成系統」と表現することもできる。「品種又は育成系統」における「品種」は品種登録制度における登録品種を意味し、「品種又は育成系統」における「育成系統」は品種登録制度における未登録品種（例えば、品種として確立される前の育成段階のもの、広く流通している系統などが例示できる）を意味する。   Further, the “variety” in the present invention can also be expressed as “variety or breeding line” in a country having a variety registration system. “Cultivar” in “Cultivar or breeding line” means a registered variety in the breed registration system, and “Growth line” in “Cultivar or breeding line” means an unregistered variety (for example, before being established as a breed in the breed registration system) Examples include those in the breeding stage and widely distributed systems).

本発明における「判別」は、「識別」、「同定」、「特定」、「鑑定」、又は「判定」と表現することもできる。   The “discrimination” in the present invention can also be expressed as “identification”, “identification”, “specific”, “appraisal”, or “determination”.

本発明の具体的な態様としては、以下の発明が例示できるが、これらに限定されるものではなく、本発明には実施例の結果に基づき特定可能な全ての発明が含まれる。   Specific embodiments of the present invention can be exemplified by the following inventions, but are not limited thereto, and the present invention includes all inventions that can be specified based on the results of the examples.

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンのゲノムDNAにおける下記（１）から（８）からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロサテライト座位の遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型、
（１）配列番号：1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（２）配列番号：3に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（３）配列番号：5に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：6に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（４）配列番号：7に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（５）配列番号：9に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：10に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（６）配列番号：11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（７）配列番号：13に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、並びに、
（８）配列番号：15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：16に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match And the method of discriminating that the test varieties of varieties are the same varieties as the control varieties.
(A) genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of the following (1) to (8) in Tifway, Phoenix Starf, or Tif Dwarf or Tiff Green genomic DNA;
(B) the genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass,
(1) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2;
(2) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 4;
(3) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 6;
(4) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 8;
(5) a microsatellite locus sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 9 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 10;
(6) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 11 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 12;
(7) a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 13, and a microsatellite locus sandwiched between base sequences complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 14; and
(8) A microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 15 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 16.

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、ティフドワーフ又はティフグリーンと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）ティフドワーフ又はティフグリーンのゲノムDNAにおける上記（１）から（８）からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロサテライト座位の遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match And a method for discriminating that the varieties of the tested Bermuda glass are the same varieties as Tif Dwarf or Tiff Green;
(A) the genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (8) above in the Tif Dwarf or Tiff Green genomic DNA;
(B) The genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass.

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、ティフウェイと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）ティフウェイのゲノムDNAにおける上記（１）から（８）からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロサテライト座位の遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match In addition, the method for determining that the test varieties of varieties are the same varieties as Tiffway;
(A) a genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (8) above in Tifway genomic DNA;
(B) The genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass.

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、フェニックスターフと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）フェニックスターフのゲノムDNAにおける上記（１）から（１０）からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロサテライト座位の遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match In addition, the method for discriminating that the varieties of the tested glass douglas are the same varieties as Phoenix Starf;
(A) genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (10) above in the genomic DNA of Phoenix Starf;
(B) The genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass.

また、本発明は、下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、下記（ａ）で選択されるバーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法に関する。この方法には、被検バーミューダグラスの品種が、ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンのいずれかであるのか、又は、それ以外であるのかを判別する方法も含まれる。
（ａ）ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンのゲノムDNAにおける上記（１）から（８）からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロサテライト座位の遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型。 Further, the present invention is a method for discriminating varieties of test Bermuda glass, comprising a step of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, and compared in the step The present invention relates to a method for discriminating that the variety of the tested glass grass is the same as the glass grass selected in the following (a) when the genotypes match. This method also includes a method of determining whether the test varieties glass variety is Tiffway, Phoenix Starf, Tiff Dwarf or Tiff Green, or any other type.
(A) the genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (8) above in Tifway, Phoenix Starf, or Tif Dwarf or Tiff Green genomic DNA;
(B) The genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass.

また、本発明は、下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、下記（ａ）で選択されるバーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法に関する。この方法には、被検バーミューダグラスの品種が、ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンのいずれかであるのか、又は、それ以外であるのかを判別する方法も含まれる。
（ａ）ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンのゲノムDNAにおける上記（１）から（１０）からなる群より選択される全てのマイクロサテライト座位の遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型。 Further, the present invention is a method for discriminating varieties of test Bermuda glass, comprising a step of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, and compared in the step The present invention relates to a method for discriminating that the variety of the tested glass grass is the same as the glass grass selected in the following (a) when the genotypes match. This method also includes a method of determining whether the test varieties glass variety is Tiffway, Phoenix Starf, Tiff Dwarf or Tiff Green, or any other type.
(A) genotypes of all microsatellite loci selected from the group consisting of (1) to (10) above in Tifway, Phoenix Starf, or Tif Dwarf or Tiff Green genomic DNA;
(B) The genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass.

本発明は、以下のように別の形式で表現することができる。また、本発明の具体的な態様として例示した上記発明も以下の形式で表現することができる。   The present invention can be expressed in another form as follows. Further, the above-described invention exemplified as a specific aspect of the present invention can also be expressed in the following format.

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む、下記（ｂ）に記載の遺伝子型が下記（ａ）に記載の遺伝子型と一致するか否かを判定する方法；
（ａ）対照バーミューダグラスのゲノムDNAにおける下記（１）から（１０）からなる群より選択される少なくとも1つのマイクロサテライト座位の遺伝子型であって、対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型。遺伝子型同士が一致すると判定された場合、対照バーミューダグラスの品種が被検バーミューダグラスの品種の候補であると判断される。 The genotype described in the following (b) includes the step of comparing the genotype described in the following (a) and the genotype described in the following (b), and the genotype described in the following (a) How to determine whether or not;
(A) a genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of the following (1) to (10) in the genomic DNA of a control bar glass grass, the genotype specific to the control bar glass grass:
(B) The genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass. If it is determined that the genotypes match, it is determined that the control Bermuda glass variety is a candidate for the test Bermuda glass variety.

本発明は、以下のように別の形式で表現することができる。また、本発明の具体的な態様として例示した上記発明も以下の形式で表現することができる。   The present invention can be expressed in another form as follows. Further, the above-described invention exemplified as a specific aspect of the present invention can also be expressed in the following format.

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）対照バーミューダグラスのゲノムDNAにおける下記（１１）から（２０）からなる群より選択される少なくとも1つの領域の遺伝子型であって、対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ領域の遺伝子型、
（１１）配列番号：1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、
（１２）配列番号：3に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、
（１３）配列番号：5に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：6に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、
（１４）配列番号：7に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、
（１５）配列番号：9に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：10に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、
（１６）配列番号：11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、
（１７）配列番号：13に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、
（１８）配列番号：15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：16に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、
（１９）配列番号：17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域、並びに、
（２０）配列番号：19に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：20に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれる領域であって、マイクロサテライトを含む領域。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match And the method of discriminating that the test varieties of varieties are the same varieties as the control varieties.
(A) a genotype of at least one region selected from the group consisting of the following (11) to (20) in the genomic DNA of the control burgundy glass, the genotype specific to the control burgundy glass:
(B) the genotype of the same region as (a) in the genomic DNA of the subject Bermuda glass,
(11) A region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2, wherein the region includes microsatellite;
(12) A region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 4, wherein the region includes microsatellite;
(13) A region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 6, wherein the region includes microsatellite;
(14) A region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 8 and including a microsatellite;
(15) A region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 9 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 10 and comprising a microsatellite;
(16) a region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 11 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 12 and comprising a microsatellite;
(17) a region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 13 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 14 and comprising a microsatellite;
(18) A region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 15 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 16 and comprising a microsatellite;
(19) A region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17 and a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18 and comprising a microsatellite; And
(20) A region sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 19 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 20 and containing microsatellite.

本発明は、以下のように別の形式で表現することができる。また、本発明の具体的な態様として例示した上記発明も以下の形式で表現することができる。   The present invention can be expressed in another form as follows. Further, the above-described invention exemplified as a specific aspect of the present invention can also be expressed in the following format.

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）下記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRの増幅対象となる対照バーミューダグラスのゲノムDNAにおける領域の遺伝子型であって、対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ領域の遺伝子型、
（Ａ）配列番号：1に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｂ）配列番号：3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｃ）配列番号：5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｄ）配列番号：7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｅ）配列番号：9に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：10に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｆ）配列番号：11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：12に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｇ）配列番号：13に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：14に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｈ）配列番号：15に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：16に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｉ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：18に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、並びに、
（Ｊ）配列番号：19に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：20に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match And the method of discriminating that the test varieties of varieties are the same varieties as the control varieties.
(A) A genotype of a region in the genomic DNA of a control worm glass to be amplified by PCR using at least one set selected from the group consisting of (A) to (J) below as a primer set, Genotype specific to glass,
(B) the genotype of the same region as (a) in the genomic DNA of the subject Bermuda glass,
(A) an oligonucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 2,
(B) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
(C) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
(D) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8;
(E) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
(F) a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(G) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 14;
(H) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 16;
(I) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and
(J) A set of an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20.

本発明において「含む」という文言の代わりに、「からなる」という文言を使用できる。   In the present invention, the word “consisting of” can be used instead of the word “including”.

本発明は、以下のように別の形式で表現することができる。また、本発明の具体的な態様として例示した上記発明も以下の形式で表現することができる。   The present invention can be expressed in another form as follows. Further, the above-described invention exemplified as a specific aspect of the present invention can also be expressed in the following format.

下記（ａ）に記載のPCR産物の種類、及び、下記（ｂ）に記載のPCR産物の種類を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較したPCR産物の種類が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）対照バーミューダグラスのゲノムDNAを鋳型とし、上記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物の種類であって、対照バーミューダグラスに特異的なPCR産物の種類、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAを鋳型とし、（ａ）と同じセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物の種類。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the types of PCR products described in (a) below and the types of PCR products described in (b) below, and the PCR products compared in the above steps A method for discriminating that the varieties of the tested Bermudagrass are the same varieties as the control Bermudagrass when the types match;
(A) a kind of PCR product amplified by PCR using the genomic DNA of control Bermuda glass as a template and at least one set selected from the group consisting of (A) to (J) above as a primer set, The type of PCR product specific to the control Bermuda glass,
(B) The kind of PCR product amplified by PCR using the genomic DNA of the test Bermuda glass as a template and the same set as (a) as a primer set.

本発明において、「PCR産物の種類」とは、分子サイズによって分類されたPCR産物の種類（パターン）を意味し、「PCR産物の種類」は「PCRパターン」と表現することができる。「PCR産物の種類（PCRパターン）」は「遺伝子型（アリルパターン）」に相当する。   In the present invention, “type of PCR product” means the type (pattern) of PCR products classified by molecular size, and “type of PCR product” can be expressed as “PCR pattern”. “Type of PCR product (PCR pattern)” corresponds to “genotype (allyl pattern)”.

本発明は、以下のように別の形式で表現することができる。また、本発明の具体的な態様として例示した上記発明も以下の形式で表現することができる。   The present invention can be expressed in another form as follows. Further, the above-described invention exemplified as a specific aspect of the present invention can also be expressed in the following format.

下記（ａ）に記載のPCR産物、及び、下記（ｂ）に記載のPCR産物の同一性を決定する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程においてPCR産物が同一であったときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）対照バーミューダグラスのゲノムDNAを鋳型とし、上記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択される少なくとも1つのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物であって、対照バーミューダグラスに特異的なPCR産物、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAを鋳型とし、（ａ）と同じセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of determining the identity of the PCR product described in (a) below and the PCR product described in (b) below. A method in which, when present, the varieties of the tested burgundy glasses are determined to be the same varieties as the control burgundy glasses;
(A) a PCR product amplified by PCR using the genomic DNA of a control burgundy glass as a template and at least one set selected from the group consisting of (A) to (J) above as a primer set, Glass-specific PCR products,
(B) A PCR product amplified by PCR using the genomic DNA of the test Bermuda glass as a template and the same set as (a) as a primer set.

以下に本発明の方法を例示するが、これに限定されるものではない。
本発明においては、まず、多品種のバーミューダグラスそれぞれについて、ゲノムDNAにおける上記（１）から（１０）からなる群より選択される少なくとも1つのマイクロサテライト座位の遺伝子型を検出する。次いで、多品種のバーミューダグラスうち特定又は1つの品種のバーミューダグラスに特異的な遺伝子型（以下、遺伝子型Xと称する）、及び、該遺伝子型Xを示すマイクロサテライト座位（以下、マイクロサテライト座位Yと称する）を同定する。また、該特定又は1つの品種のバーミューダグラスを対照バーミューダグラスとする。次いで、被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおいて、マイクロサテライト座位Yと同じ座位の遺伝子型（以下、遺伝子型Zと称する）を同定する。次いで、遺伝子型X、及び、遺伝子型Zを比較する。比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される。 Although the method of this invention is illustrated below, it is not limited to this.
In the present invention, first, the genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (10) in the genomic DNA is detected for each of various types of Bermuda grass. Next, a genotype (hereinafter referred to as genotype X) specific to one or more varieties of Bermudagrass among various types of Bermudagrass, and a microsatellite locus indicating the genotype X (hereinafter referred to as microsatellite locus Y) Identified). In addition, the specific or one variety of Bermuda glass is used as a control Bermuda glass. Next, the genotype (hereinafter referred to as genotype Z) of the same locus as the microsatellite locus Y is identified in the genomic DNA of the test Bermuda glass. Next, genotype X and genotype Z are compared. When the compared genotypes match, it is determined that the test varieties glass variety is the same as the control varieties glass.

具体的には、まず、上記（１）から（１０）からなる群より選択されるいずれかのマイクロサテライト座位におけるDNA領域をPCRにより増幅するためのプライマーを設計する。プライマーを設計する際には、プライマーの長さが20bp前後、Tm値が55〜60℃程度になることが好ましいが、これに制限されるものではない。プライマーはPrimer3 (Rozen and Skaletsky, 2000, In: Krawets and Misener (eds.) Bioinfomatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, USA: Humana Press, 365-386)によって設計できる。上記（１）から（１０）からなる群より選択されるいずれかのマイクロサテライト座位におけるDNA領域としては、上記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択されるいずれかのセットをプライマーセットとするPCRの増幅対象となるバーミューダグラスのゲノムDNAにおける領域である。   Specifically, first, a primer for amplifying a DNA region at any microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (10) by PCR is designed. When designing a primer, it is preferable that the length of the primer is about 20 bp and the Tm value is about 55 to 60 ° C. However, the present invention is not limited to this. Primers can be designed by Primer 3 (Rozen and Skaletsky, 2000, In: Krawets and Misener (eds.) Bioinfomatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, USA: Humana Press, 365-386). As a DNA region at any microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (10) above, any set selected from the group consisting of (A) to (J) above is a primer set. This is a region in the genomic DNA of Bermuda glass to be amplified by PCR.

次いで、設計したプライマーを合成する。プライマーは、その塩基配列情報に従って化学的に合成することができる。任意の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する方法が公知である。たとえば、オリゴヌクレオチドは、DNA合成装置(DNA synthesizer)によって合成することができる。具体的には、現在、ホスホロアミダイト法やホスホン酸エステル法などの原理に基づく、DNA合成装置が実用化されている。これらのDNA合成装置は、与えられた塩基配列にしたがって、固相上に、ヌクレオチドモノマーをひとつずつ化学的に連結する。全ての反応工程は自動化されていて、目的とする塩基配列情報を入力することで合成が開始される。したがって、このようなDNA合成装置に対して、設計したプライマーの塩基配列を与えることによって、目的とするDNAを合成することができる。   The designed primer is then synthesized. Primers can be chemically synthesized according to the nucleotide sequence information. Methods for synthesizing oligonucleotides having an arbitrary base sequence are known. For example, the oligonucleotide can be synthesized by a DNA synthesizer. Specifically, DNA synthesizers based on principles such as the phosphoramidite method and the phosphonate method are now in practical use. These DNA synthesizers chemically link nucleotide monomers one by one on a solid phase according to a given base sequence. All reaction steps are automated, and synthesis is started by inputting target base sequence information. Therefore, the target DNA can be synthesized by giving the designed primer base sequence to such a DNA synthesizer.

次いで、多品種からなる対照バーミューダグラスそれぞれについて、ゲノムDNAを鋳型とし、合成したプライマーセットを用いてPCRを行う。本発明においては、好ましくは、まず対照バーミューダグラスのゲノムDNAの調製（ゲノムDNAの抽出）を行う。ゲノムDNAの調製は、例えば、対照バーミューダグラスの葉、根、種子、カルス、葉鞘、培養細胞等を用いて行うことができるが、これらに特に限定されない。これらの植物体もしくは植物細胞からのゲノムDNAの抽出は、当業者においては一般的に公知の方法、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）法（Murray and Thompson, Nucleic Acids Research 8, p.4321−4325, 1980）等によって行うことができる。また、DNeasy（登録商標） Plant Mini Kit(QIAGEN)等を利用してゲノムDNAを抽出することができる。また、ゲノムDNAの抽出処理を行わず、例えば、直接細胞破砕液等を用いてPCRを実施することも可能である。   Next, PCR is performed on the control Bermuda glass consisting of various varieties, using the genomic DNA as a template and the synthesized primer set. In the present invention, preferably, genomic DNA of control Bermuda glass is first prepared (extraction of genomic DNA). Genomic DNA can be prepared using, for example, control Bermuda glass leaves, roots, seeds, callus, leaf sheath, cultured cells, and the like, but is not particularly limited thereto. Extraction of genomic DNA from these plants or plant cells is generally performed by those skilled in the art, for example, the cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method (Murray and Thompson, Nucleic Acids Research 8, p.4321- 4325, 1980). In addition, genomic DNA can be extracted using DNeasy (registered trademark) Plant Mini Kit (QIAGEN) or the like. Moreover, it is also possible to carry out PCR without using a genomic DNA extraction process, for example, directly using a cell disruption solution or the like.

PCR法としては、例えば、タッチダウンPCR法（Sato et al. 2005, DNA Res. 12, 301-364）が挙げられるが、これに限定されるものではなく、当業者においては、その反応条件等について実験または経験によって最適な条件を適宜選択して実施することが可能である。   Examples of the PCR method include a touchdown PCR method (Sato et al. 2005, DNA Res. 12, 301-364), but are not limited thereto. It is possible to appropriately select and carry out optimal conditions according to experiments or experience.

通常、PCRは、反応液および耐熱性ポリメラーゼを含む市販の試薬キット(rTaq, ExTaq, Takara; BIOTAQ, BIOLINEなど) 、および市販のPCR装置(GeneAmp（登録商標） PCR System 9700, ABIなど)等を利用して、簡便に実施することができる。   Usually, PCR is performed using a commercially available reagent kit (rTaq, ExTaq, Takara; BIOTAQ, BIOLINE, etc.) containing a reaction solution and a thermostable polymerase, a commercially available PCR device (GeneAmp (registered trademark) PCR System 9700, ABI, etc.), etc. It can be carried out simply by using.

次いで、PCRによって増幅されたPCR産物の分子サイズを測定する。PCRによって増幅されたPCR産物の分子サイズの測定方法としては、当業者に周知の方法が挙げられる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いる方法、アガロースゲル電気泳動を用いる方法、フラグメントアナライザーを用いる方法、マイクロチップ電気泳動装置（Multina, 島津）が例示できるが、これらに限定されるものではない。   The molecular size of the PCR product amplified by PCR is then measured. Methods for measuring the molecular size of a PCR product amplified by PCR include methods well known to those skilled in the art. Examples include, but are not limited to, a method using polyacrylamide gel electrophoresis, a method using agarose gel electrophoresis, a method using a fragment analyzer, and a microchip electrophoresis apparatus (Multina, Shimadzu).

具体的には、PCR産物を蛍光ラベルした後にキャピラリー電気泳動で分離し、分離された各々のPCR産物の分子サイズを測定する。あるいは、PCR産物をポリアクリルアミドゲル/アガロースゲル電気泳動で分離し、分離された各々のPCR産物の分子サイズを測定する。通常、予めサイズが既知のDNA断片（例えば、サイズマーカー）を対照として、分離された各々のPCR産物の分子サイズ（例えば、分子量や長さ）を測定する。次いで、分子サイズによってPCR産物を分類し、PCR産物の種類を特定する。特定されたPCR産物の種類は、マイクロサテライト座位の遺伝子型に相当する。   Specifically, PCR products are fluorescently labeled and then separated by capillary electrophoresis, and the molecular size of each separated PCR product is measured. Alternatively, PCR products are separated by polyacrylamide gel / agarose gel electrophoresis, and the molecular size of each separated PCR product is measured. Usually, the molecular size (for example, molecular weight or length) of each separated PCR product is measured using a DNA fragment (for example, a size marker) of a known size as a control. Next, the PCR products are classified by molecular size, and the kind of the PCR product is specified. The type of PCR product identified corresponds to the genotype of the microsatellite locus.

次いで、多品種からなる対照バーミューダグラスのうち特定又は1つの対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型を示すマイクロサテライト座位を同定する。   Next, a microsatellite locus showing a genotype specific to a specific or one control bar glass grass among various control bar glass grasses is identified.

次いで、被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおいて、多品種からなる対照バーミューダグラスのうち特定又は1つの対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型を示すマイクロサテライト座位と同じ座位の遺伝子型（以下、「被検バーミューダグラスにおける遺伝子型」と称する）を同定する。被検バーミューダグラスにおける遺伝子型の同定は、対照バーミューダグラスと同一の実験方法及び実験条件で行われることが好ましい。次いで、例えばBioNumerics (販売元：インフォコム、作製者：Applied Maths社)によって、対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型と被検バーミューダグラスにおける遺伝子型を比較する。   Next, in the genomic DNA of the test worm glass, the genotype of the same locus as the microsatellite locus showing the genotype specific to the specific or one of the control varieties glass (hereinafter referred to as “test genus”). Identified as "genotype in Bermuda glass"). The identification of the genotype in the test burgundy glass is preferably performed by the same experimental method and experimental conditions as in the control burgundy glass. Subsequently, the genotype specific to the control bar glass grass and the genotype in the test bar glass grass are compared, for example, by BioNumerics (distributor: Infocom, creator: Applied Maths).

本発明において、ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンに特異的な遺伝子型としては、本実施例に記載された遺伝子型が例示できるが、これに限定されない。例えば、これら対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型としては、本実施例と異なるPCR条件によって増幅されたPCR産物を本実施例と同じ分離方法及び分離条件で分離したときに検出されるPCR産物の種類に相当する遺伝子型でもよいし、本実施例と同じPCR条件又は異なるPCR条件によって増幅されたPCR産物を本実施例と異なる分離方法及び分離条件で分離したときに検出されるPCR産物の種類に相当する遺伝子型でもよい。   In the present invention, genotypes specific to Tiffway, Phoenix Starf, Tiff Dwarf or Tiff Green can be exemplified by the genotypes described in the present example, but are not limited thereto. For example, genotypes specific to these control Bermuda glass include PCR products detected when PCR products amplified under PCR conditions different from those in this example are separated by the same separation method and conditions as in this example. The genotype corresponding to the type may be used, and the type of PCR product detected when a PCR product amplified under the same PCR conditions or different PCR conditions as in this example is separated by a different separation method and separation conditions from this example. The genotype corresponding to may be used.

また、本発明は、本発明の方法に用いるためのバーミューダグラスの品種判別用試薬やバーミューダグラスの品種判別用キットを提供する。このような試薬やキットには、少なくとも次の構成要素i）が含まれる。
i）上記（１）から（１０）からなる群より選択されるいずれかのマイクロサテライト座位におけるDNA領域をPCRにより増幅するためのオリゴヌクレオチドのセット In addition, the present invention provides a reagent for discriminating varieties of Bermuda glass and a kit for discriminating varieties of Bermuda glass for use in the method of the present invention. Such reagents and kits include at least the following component i).
i) A set of oligonucleotides for amplifying by PCR the DNA region at any microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (10) above

上記キットには、前記構成要素i）に加え、次のような付加的な要素を含むことができる。
ii）DNAポリメラーゼ：本発明のキットは、鋳型依存性の相補鎖合成反応を触媒するDNAポリメラーゼを含むことができる。PCRなどの公知の核酸合成反応に利用されている種々のDNAポリメラーゼは、本発明に利用することができる。
iii)ヌクレオチド基質：本発明のキットは、核酸の相補鎖合成反応の基質として利用されるヌクレオチド類を含むことができる。具体的には、dCTP、dGTP、dTPT、およびdATPの少なくとも一つ、通常はこれらの全て(dNTP)をキットに含むことができる。これらのヌクレオチド類は、天然の構造のみならず、誘導体を利用することもできる。蛍光物資や結合性リガンドで修飾したヌクレオチド類が公知である。上記キットには、PCRにより増幅されたPCR産物のサイズが記載された書類を添付することができる。また、PCRにより増幅されたPCR産物のサイズ情報を機械読み取り可能なデータとし、それを格納した記録媒体としてキットに加えることもできる。 The kit may contain the following additional elements in addition to the component i).
ii) DNA polymerase: The kit of the present invention may comprise a DNA polymerase that catalyzes a template-dependent complementary strand synthesis reaction. Various DNA polymerases used in known nucleic acid synthesis reactions such as PCR can be used in the present invention.
iii) Nucleotide substrate: The kit of the present invention may contain nucleotides used as a substrate for a complementary strand synthesis reaction of a nucleic acid. Specifically, at least one of dCTP, dGTP, dTPT, and dATP, usually all of these (dNTP) can be included in the kit. These nucleotides can utilize not only natural structures but also derivatives. Nucleotides modified with fluorescent materials or binding ligands are known. A document describing the size of the PCR product amplified by PCR can be attached to the kit. Moreover, the size information of the PCR product amplified by PCR can be converted into machine-readable data and added to the kit as a recording medium storing the data.

本発明は、配列番号：1から20のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、上記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択される少なくとも1組のセットを提供する。このようなセットは、上記（１）から（１０）からなる群より選択されるいずれかのマイクロサテライト座位におけるDNA領域をPCRにより増幅するためのオリゴヌクレオチドのセットの一例である。   The present invention provides an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 20. The present invention further provides at least one set selected from the group consisting of (A) to (J) above. Such a set is an example of an oligonucleotide set for amplifying by PCR the DNA region at any microsatellite locus selected from the group consisting of (1) to (10).

例えば、被検バーミューダグラスの品種が、ティフドワーフ又はティフグリーンと同一の品種であるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記（Ａ）から（Ｈ）からなる群より選択される少なくとも１つのセットが例示できる。   For example, the primer set used to determine whether the test varieties glass variety is the same as Tiff Dwarf or Tiff Green is selected from the group consisting of (A) to (H) above. At least one set can be exemplified.

被検バーミューダグラスの品種が、ティフウェイと同一の品種であるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記（Ａ）から（Ｈ）からなる群より選択される少なくとも１つのセットが例示できる。   As a primer set used to determine whether or not the varieties of the tested Bermuda glass are the same varieties as Tiffway, at least one set selected from the group consisting of (A) to (H) above is used. It can be illustrated.

被検バーミューダグラスの品種が、フェニックスターフと同一の品種であるか否かを判別するために用いられるプライマーセットとしては、上記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択される少なくとも１つのセットが例示できる。   As a primer set used for determining whether or not the varieties of the tested Bermuda glass are the same varieties as Phoenix Starf, at least one set selected from the group consisting of (A) to (J) above. Can be illustrated.

さらに、本発明は、ティフウェイ、フェニックスターフ、ティフドワーフ、及び、ティフグリーンからなる群より選択されるいずれかのバーミューダグラスのゲノムDNAを鋳型とし、上記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択されるいずれかのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物を提供する。該PCR産物の製造方法や利用方法は上述の通りである。
なお、本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。 Further, the present invention provides a template of genomic DNA of any Bermuda glass selected from the group consisting of Tiffway, Phoenix Starf, Tif Dwarf, and Tiff Green, and selected from the group consisting of (A) to (J) above. A PCR product amplified by PCR using any of the above set as a primer set is provided. The production method and utilization method of the PCR product are as described above.
It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.

以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
本発明者らは、バーミューダグラスの地上部由来のESTからマイクロサテライトを抽出し、それらを含む90〜300bpのPCR断片が得られるようにプライマーを設計した。DNeasy（登録商標） Plant Mini Kit (QIAGEN)を用いて抽出したバーミューダグラスのゲノムDNAを鋳型として、設計したプライマーペアを用いてPCRを行なった。それらのPCR産物を10%ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分離し、品種特異的なPCR断片長を検出することにより品種判定を行なった。以下に主な実施例を記述する。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
The present inventors extracted microsatellite from ESTs derived from the above-ground part of Bermuda glass and designed primers so that a 90-300 bp PCR fragment containing them was obtained. PCR was carried out using the designed primer pairs using the genomic DNA of Bermuda glass extracted using DNeasy (registered trademark) Plant Mini Kit (QIAGEN) as a template. The PCR products were separated by electrophoresis using 10% polyacrylamide gel, and the variety was determined by detecting the variety-specific PCR fragment length. The main examples are described below.

1-1)反応液組成
1-1-1)384穴プレートでPCRを行なう場合の1検体あたりの反応液組成
鋳型DNA (~0.25 ng/μｌ) 2 μｌ
10xPCR緩衝液 [160 mM (NH4) 2SO4、67 mM Tris-HCl (pH8.8)、0.1% Tween20] 0.5 μｌ
2.5 mM each dNTP 0.4 μｌ
50 mM MgCl2 0.6 μｌ
25 μM each プライマー混合液 0.08 μｌ
耐熱性DNAポリメラーゼ (5 unit/μｌ、BIOTAQTM、BIOLINE社) 0.008 μｌ
水 1.412 μｌ
全量 5 μｌ 1-1) Composition of reaction solution
1-1-1) Composition of reaction solution per sample when PCR is performed in a 384-well plate Template DNA (~ 0.25 ng / μl) 2 μl
10xPCR buffer [160 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 67 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% Tween20] 0.5 μl
2.5 mM each dNTP 0.4 μl
50 mM MgCl 2 0.6 μl
25 μM each primer mixture 0.08 μl
Thermostable DNA polymerase (5 unit / μl, BIOTAQ ™ , BIOLINE) 0.008 μl
1.412 μl of water
Total volume 5 μl

1-1-2)96穴プレートでPCRを行なう場合の1検体あたりの反応液組成
鋳型DNA (~0.25 ng/μｌ) 4 μｌ
10xPCR緩衝液 [160 mM (NH4) 2SO4、67 mM Tris-HCl (pH8.8)、0.1% Tween20] 1 μｌ
2.5 mM each dNTP 0.8 μｌ
50 mM MgCl2 1.2 μｌ
25 μM each プライマー混合液 0.16 μｌ
耐熱性DNAポリメラーゼ (5 unit/μｌ、BIOTAQTM、BIOLINE社) 0.016 μｌ
水 2.824 μｌ
全量 10 μｌ 1-1-2) Composition of reaction solution per sample when PCR is performed in a 96-well plate Template DNA (~ 0.25 ng / μl) 4 μl
10xPCR buffer [160 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 67 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% Tween20] 1 μl
2.5 mM each dNTP 0.8 μl
50 mM MgCl 2 1.2 μl
25 μM each primer mixture 0.16 μl
Thermostable DNA polymerase (5 unit / μl, BIOTAQ ™ , BIOLINE) 0.016 μl
2.824 μl of water
10 μl total volume

1-2)反応条件
Biometra社製あるいはABI社製のサーマルサイクラーを用いて、以下のプログラムでPCRを行なった。
94℃ 3分
[94℃ 30秒、 68℃ 30秒] 3サイクル
[94℃ 30秒、 66℃ 30秒] 3サイクル
[94℃ 30秒、 64℃ 30秒] 3サイクル
[94℃ 30秒、 62℃ 30秒、72℃ 30秒] 3サイクル
[94℃ 30秒、 60℃ 30秒、72℃ 30秒] 3サイクル
[94℃ 30秒、 58℃ 30秒、72℃ 30秒] 3サイクル
[94℃ 30秒、 55℃ 30秒、72℃ 30秒] 30サイクル
72℃ 10分 1-2) Reaction conditions
PCR was performed with the following program using a thermal cycler manufactured by Biometra or ABI.
94 ° C 3 minutes
[94 ℃ 30 seconds, 68 ℃ 30 seconds] 3 cycles
[94 ℃ 30 seconds, 66 ℃ 30 seconds] 3 cycles
[94 ℃ 30 seconds, 64 ℃ 30 seconds] 3 cycles
[94 ℃ 30 seconds, 62 ℃ 30 seconds, 72 ℃ 30 seconds] 3 cycles
[94 ℃ 30 seconds, 60 ℃ 30 seconds, 72 ℃ 30 seconds] 3 cycles
[94 ℃ 30 seconds, 58 ℃ 30 seconds, 72 ℃ 30 seconds] 3 cycles
[94 ℃ 30 seconds, 55 ℃ 30 seconds, 72 ℃ 30 seconds] 30 cycles
72 ° C 10 minutes

1-3)電気泳動
タッチダウンPCR 法によるPCR後、各サンプル5 μlの反応液に対して、10 μl BPB Dye [1 mM Tris-HCl (pH7.5)、0.1 mM EDTA、0.025% BPB、 5% グリセロール]を添加した。
10%ポリアクリルアミドゲルならびに1xTBE緩衝液を用いて電気泳動することにより、PCR産物を分離した。各サンプルについて4 μlずつアプライした。DNA分子量マーカーには20 bpラダーマーカーを用いた。電気泳動の電圧と時間は、200Vで4時間または55Vで16時間に設定した。電気泳動後は、ポリアクリルアミドゲルをエチジウムブロマイド(EtBr)添加した1xTBE緩衝液に5〜10分浸し（振盪させ）、UVトランスイルミネーターで分離の様子を観察した。 1-3) After PCR by electrophoresis touchdown PCR method, 10 μl BPB Dye [1 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.1 mM EDTA, 0.025% BPB, 5 % Glycerol] was added.
PCR products were separated by electrophoresis using 10% polyacrylamide gel and 1 × TBE buffer. 4 μl was applied to each sample. A 20 bp ladder marker was used as the DNA molecular weight marker. Electrophoresis voltage and time were set at 200V for 4 hours or 55V for 16 hours. After electrophoresis, the polyacrylamide gel was immersed in 1 × TBE buffer added with ethidium bromide (EtBr) for 5 to 10 minutes (shaken), and the state of separation was observed with a UV transilluminator.

1-4)結果
表1に示したプライマーペアを用いて、表2に示したバーミューダグラス4品種の判別を行なった。表3及び表4に示すとおり、これらのプライマーペアにおける供試4品種間での推定対立遺伝子数は2〜5であった。図1にアクリルアミドゲル電気泳動像の結果を示す。表3、表4及び図1が示すように、供試4品種間で多型が認められた。これらの結果、1あるいは複数のプライマーペアを組み合わせることにより、供試した4品種・系統の識別が可能であった。 1-4) Results Using the primer pairs shown in Table 1, four types of Bermuda glass as shown in Table 2 were identified. As shown in Table 3 and Table 4, the estimated number of alleles among the four test varieties in these primer pairs was 2-5. Fig. 1 shows the results of an acrylamide gel electrophoresis image. As shown in Table 3, Table 4 and FIG. 1, polymorphism was observed among the four varieties of the test. As a result, by combining one or more primer pairs, it was possible to distinguish the four varieties / lines tested.

バーミューダグラス品種判別マーカーのプライマー配列 Primer sequence of a marker for distinguishing Bermuda variety

バーミューダグラスの判別対象品種 Varieties for identification of Bermuda glass

PCR産物のサイズ PCR product size

アリルパターン
(サイズの小さいものからA, B…と表示した) Allyl pattern
(A, B ... are displayed from the smallest size)

1-5)考察
表3、表4に示す結果より、表2に示した品種群の中で、1品種を識別可能な最小マーカー数は１であることが言える。また、BGS0008、BGS0025、BGS0095、BGS0117、BGS0140、BGS0247、BGS0248、BGS0283、BGS0300、又は、BGS0387によって「フェニックスターフ」を、BGS0008、BGS0025、BGS0095、BGS0117、BGS0140、BGS0247、BGS0248、又は、BGS0283によって「ティフウェイ」をそれぞれ識別する事が出来る。
また、表3、表4に示す結果より、最もアリル数の多いマーカーはBGS0140であり（6アリル）、最もアリルが少ないマーカーはBGS0387である（2アリル）。 1-5) Consideration From the results shown in Tables 3 and 4, it can be said that the minimum number of markers that can identify one variety in the variety group shown in Table 2 is 1. Also, BGS0008, BGS0025, BGS0095, BGS0117, BGS0140, BGS0247, BGS0248, BGS0283, BGS0300, or BGS0387, "Phoenix Starf", BGS0008, BGS0025, BGS0095, BGS0117, BGS0140, BGS0247, BGS0248, or BGS0283, Can be identified.
From the results shown in Tables 3 and 4, the marker with the largest number of alleles is BGS0140 (6 alleles), and the marker with the least alleles is BGS0387 (2 alleles).

表1(1〜6)に示すマーカーに対応するプライマーセットを用いて増幅したPCR産物の10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離を示す写真である。It is a photograph which shows the isolation | separation by 10% polyacrylamide gel electrophoresis of the PCR product amplified using the primer set corresponding to the marker shown in Table 1 (1-6). 表1(7〜10)に示すマーカーに対応するプライマーセットを用いて増幅したPCR産物の10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離を示す写真である。It is a photograph which shows the isolation | separation by 10% polyacrylamide gel electrophoresis of the PCR product amplified using the primer set corresponding to the marker shown in Table 1 (7-10).

Claims (10)

下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）対照バーミューダグラスのゲノムDNAにおける下記（１）から（１０）からなる群より選択される少なくとも1つのマイクロサテライト座位の遺伝子型であって、対照バーミューダグラスに特異的な遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型、
（１）配列番号：1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（２）配列番号：3に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（３）配列番号：5に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：6に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（４）配列番号：7に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（５）配列番号：9に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：10に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（６）配列番号：11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（７）配列番号：13に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（８）配列番号：15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：16に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（９）配列番号：17に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：18に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、並びに、
（１０）配列番号：19に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：20に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match And the method of discriminating that the test varieties of varieties are the same varieties as the control varieties.
(A) a genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of the following (1) to (10) in the genomic DNA of a control bar glass grass, the genotype specific to the control bar glass grass:
(B) the genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass,
(1) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2;
(2) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 4;
(3) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 6;
(4) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 8;
(5) a microsatellite locus sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 9 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 10;
(6) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 11 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 12;
(7) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 13 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 14;
(8) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 15 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 16;
(9) a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 17, and a microsatellite locus sandwiched between base sequences complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 18; and
(10) A microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 19 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 20. 対照バーミューダグラスが、ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンである、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein the control Bermuda glass is Tiffway, Phoenix Starf, or Tiff Dwarf or Tiff Green. 下記（ａ）に記載の遺伝子型、及び、下記（ｂ）に記載の遺伝子型を比較する工程を含む被検バーミューダグラスの品種判別法であって、前記工程において比較した遺伝子型が一致したときに、被検バーミューダグラスの品種が、対照バーミューダグラスと同一の品種であると判別される方法；
（ａ）ティフウェイ、フェニックスターフ、又は、ティフドワーフ若しくはティフグリーンのゲノムDNAにおける下記（１）から（８）からなる群より選択される少なくとも１つのマイクロサテライト座位の遺伝子型、
（ｂ）被検バーミューダグラスのゲノムDNAにおける（ａ）と同じ座位の遺伝子型、
（１）配列番号：1に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：2に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（２）配列番号：3に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：4に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（３）配列番号：5に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：6に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（４）配列番号：7に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：8に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（５）配列番号：9に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：10に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（６）配列番号：11に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：12に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、
（７）配列番号：13に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：14に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位、並びに、
（８）配列番号：15に記載の塩基配列と相補的な塩基配列、及び、配列番号：16に記載の塩基配列と相補的な塩基配列によって挟まれるマイクロサテライト座位。 A method for discriminating varieties of test Bermuda glass comprising the steps of comparing the genotype described in (a) below and the genotype described in (b) below, wherein the genotypes compared in the above steps match And the method of discriminating that the test varieties of varieties are the same varieties as the control varieties.
(A) genotype of at least one microsatellite locus selected from the group consisting of the following (1) to (8) in Tifway, Phoenix Starf, or Tif Dwarf or Tiff Green genomic DNA;
(B) the genotype of the same locus as (a) in the genomic DNA of the test Bermuda glass,
(1) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 2;
(2) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 3 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 4;
(3) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 5 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 6;
(4) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 7 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 8;
(5) a microsatellite locus sandwiched by a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 9 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 10;
(6) a microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 11 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 12;
(7) a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 13, and a microsatellite locus sandwiched between base sequences complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 14; and
(8) A microsatellite locus sandwiched between a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 15 and a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 16. 請求項１から３のいずれかに記載の方法に用いるためのバーミューダグラスの品種判別用試薬。 A reagent for discriminating varieties of Bermuda glass for use in the method according to claim 1. 請求項１から３のいずれかに記載の方法に用いるためのバーミューダグラスの品種判別用キット。 A kit for discriminating varieties of Bermuda glass for use in the method according to claim 1. 配列番号：1から20のいずれかに記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。 An oligonucleotide comprising the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 20. 下記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択される少なくとも1組のセット；
（Ａ）配列番号：1に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｂ）配列番号：3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｃ）配列番号：5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｄ）配列番号：7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｅ）配列番号：9に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：10に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｆ）配列番号：11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：12に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｇ）配列番号：13に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：14に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｈ）配列番号：15に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：16に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｉ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：18に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、並びに、
（Ｊ）配列番号：19に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：20に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。 At least one set selected from the group consisting of (A) to (J) below;
(A) an oligonucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 2,
(B) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
(C) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
(D) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8;
(E) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
(F) a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(G) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 14;
(H) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 16;
(I) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and
(J) A set of an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20. 請求項７に記載のセットを含有するバーミューダグラスの品種判別用試薬。 A reagent for discriminating varieties of Bermuda glass containing the set according to claim 7. 請求項７に記載のセットを含有するバーミューダグラスの品種判別用キット。 A kit for discriminating varieties of Bermuda glass containing the set according to claim 7. ティフウェイ、フェニックスターフ、ティフドワーフ、及び、ティフグリーンからなる群より選択されるいずれかのバーミューダグラスのゲノムDNAを鋳型とし、下記（Ａ）から（Ｊ）からなる群より選択されるいずれかのセットをプライマーセットとするPCRによって増幅されるPCR産物；
（Ａ）配列番号：1に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：2に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｂ）配列番号：3に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：4に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｃ）配列番号：5に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：6に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｄ）配列番号：7に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：8に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｅ）配列番号：9に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：10に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｆ）配列番号：11に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：12に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｇ）配列番号：13に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：14に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｈ）配列番号：15に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：16に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、
（Ｉ）配列番号：17に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：18に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット、並びに、
（Ｊ）配列番号：19に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び、配列番号：20に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドのセット。 Any set selected from the group consisting of (A) to (J) below, using as a template genomic DNA of any Bermuda glass selected from the group consisting of Tiffway, Phoenix Starf, Tif Dwarf and Tiff Green PCR products amplified by PCR using as a primer set;
(A) an oligonucleotide comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 2,
(B) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
(C) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 6;
(D) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 7 and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 8;
(E) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 10;
(F) a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 12;
(G) an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 13 and a set of oligonucleotides containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 14;
(H) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide set comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 16;
(I) an oligonucleotide comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 17, and a set of oligonucleotides comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and
(J) A set of an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and an oligonucleotide containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
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