JP2009225661A - 胚性幹細胞のインスリン分泌細胞への分化誘導方法、該方法により誘導されるインスリン分泌細胞およびその用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アクチビンを用いて未分化なES細胞から分化させた胚体内胚葉を、馴化培地を用いてニューロジェニン3発現細胞へ分化させたのちに該細胞を高グルコース培地で刺激することにより、インスリン分泌細胞へ効率的に分化誘導する方法、特には(a)線維芽細胞増殖因子およびアクチビンの存在下に胚性幹細胞を培養することにより胚体内胚葉へ分化させる工程、(b)得られた胚体内胚葉を、線維芽細胞増殖因子の存在下、馴化培地を用いて培養することにより原始膵へ分化させる工程、(c)得られた原始膵を、馴化培地を用いて培養することによりニューロジェニン3発現細胞数を増加させ、ニューロジェニン3発現細胞を得る工程、および(d)得られたニューロジェニン3発現細胞を、高グルコース濃度の無血清細胞培養用培地中で刺激してインスリン分泌細胞へ分化させる工程を含む方法、該方法により誘導されたインスリン分泌細胞、該細胞を含有する糖尿病治療薬、バイオ人工膵臓、研究試薬および創薬モデル動物。
【選択図】なし
Description
ヒト神経芽細胞株SK−N−AS、ATCC番号:CRL−2137
ヒト神経芽細胞株SK−N−FI、ATCC番号:CRL−2142
ヒト脳由来;線維芽細胞種IMR−32、ATCC番号:CCL−127
ヒト神経芽細胞株CHP−212、ATCC番号:CRL−2273
ヒト神経芽細胞株SH−SY5Y、ATCC番号:CRL−2266
ヒト神経芽細胞株BE(2)−M17、ATCC番号:CRL−2267
ヒト神経芽細胞株BE(2)−C、ATCC番号:CRL−2268
ヒト神経芽細胞株SK−N−BE(2)、ATCC番号:CRL−2271
ヒト神経芽細胞株SK−N−SH、ATCC番号:HTB−11
不死化膵間葉細胞株LT2(LT2 Immortalized Pancreatic Mesenchymal Cell Line)、カタログ番号:SCR013
原始膵間葉細胞株VIT1(VIT1 Primary Pancreatic Mesenchymal Cell Line)、カタログ番号:SCR014
カタログ番号1300 HCPEC(ヒト脳脈絡叢血管内皮細胞(Human Choroid Plexus Endothelial Cells))
カタログ番号2900 HIMEC(ヒト小腸血管内皮細胞(Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells))
カタログ番号6000 HCMEC(ヒト心臓血管内皮細胞(Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells)
カタログ番号6100 HAEC(ヒト大動脈血管内皮細胞(Human Aortic Endothelial Cells))
カタログ番号6530 HREC(ヒト網膜血管内皮細胞(Human Retinal Endothelial Cells))
カタログ番号8000 HUVEC(ヒト臍帯静脈血管内皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells))
カタログ番号8010 HUAEC(ヒト臍帯動脈血管内皮細胞(Human Umbilical Artery Endothelial Cells))
を意味する。
1.形状(shape):
「扁平(flat):1点」、「ほぼ扁平:2点」、「いびつな球状:3点」、「ほぼ球状:4点」、および「球状(spherical):5点」の5段階評価する。この中では、「球状:5点」が最も好ましい。
2.辺縁の形状(border):
「不ぞろいの(irregular):1点」、「ほぼ不ぞろいの:2点」、「やや均整のとれた:3点」、「ほぼ均整のとれた:4点」、および「均整のとれた(well-rounded):5点」の5段階評価する。この中では、「均整のとれた:5点」が最も好ましい。
3.統合性(integrity):
「断片化した(fragmented):1点」、「ほぼ断片化した:2点」、「ややソリッド/コンパクト:3点」、「ほぼソリッド/コンパクト:4点」、および「ソリッド/コンパクト(solid/compact):5点」の5段階評価する。この中では、「ソリッド/コンパクト:5点」が最も好ましい。
4.直径(diameter):
「スフェロイドの個々が100μm未満(all<100μm):1点」、「スフェロイドの個々が100〜150μm:2点」、「スフェロイドの個々が125〜175μm:3点」、「スフェロイドの個々が150〜200μm:4点」、および「スフェロイドの個々中10%以上が200μmより大きい(>10%>200μm):5点」の5段階評価する。その中では、「スフェロイドの個々中10%以上が200μmより大きい:5点」が最も好ましい。
5.染色の均一性(uniformity staining):
「均一ではない(not uniform):1点」、「ほぼ均一でない:2点」、「やや均一:3点」、「ほぼ均一:4点」および「完全に均一(perfectly uniform):5点」の5段階評価する。その中では、「完全に均一:5点」が最も好ましい。
ES細胞の調製
129vマウス由来のES細胞(大日本住友製薬株式会社より購入)を、ネオマイシン耐性遺伝子が導入されているフィーダー細胞(マウス由来の胚性線維芽細胞、大日本住友製薬株式会社より購入)を用いて、0.1%ゼラチン水(カタログ番号:R−ES−006B、大日本住友製薬株式会社より購入)でコートした培養フラスコT−75(ファルコン社製、ベクトン デッキンソン アンド カンパニー(Becton, Dickinson and Company)販売)を使用して培養した。細胞培養用培地には、ES培養液(R−ES−101:大日本住友製薬株式会社より購入):ダルベッコ改変イーグル(DMEM)培養液の混合液(1:1容量比)に15%ウシ胎仔血清(FBS)、1%非必須アミノ酸、1%ヌクレオシド、110μmol/L 2−メルカプトエタノール(大日本住友製薬株式会社より購入)、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン、1%グルタミン酸、ならびに500U/mLマウス由来白血病抑制因子(LIF)(大日本住友製薬株式会社より購入)を添加したものを使用した。培養液は毎日交換し、ES細胞は、3日毎に継代した。培養プレート中にES細胞が占める割合が80〜90%の状態になったところで、2段階式処置にて、すなわち、まず、0.25%濃度のトリプシン−EDTA(インビトロジェン社製)を添加し、45秒間経過後、トリプシン−EDTA液を取り除くことでフィーダー細胞を一緒に除去し(ES細胞はまだこの段階では培養プレートに残っている)、ついでその2分後にES培養液を加え剥離することによって、培養プレートに残っているES細胞を回収した。
工程(a):未分化ES細胞の胚体内胚葉への分化
製造例1で得られた未分化ES細胞は、細胞培養濃度を少なくし(細胞培養濃度:175,000細胞/mL)、コラーゲンタイプIV、マトリゲル、ラミニンタイプ1、ジェラチンのいずれかで加工した培養皿を用いてアクチビンA(Activin A、カタログ番号:338−AC、R&D社製)(0ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、または200ng/mL)、線維芽細胞成長因子(FGF−2、カタログ番号:233−FB/CF、R&D社製)(20ng/mL)、ウシ胎仔血清(FBS)、およびウシ血清アルブミン(BSA)を加えたエス・クロンSF−03培地(製品番号SS−1303、三光純薬株式会社製)で計2日間培養(培養温度:37℃、pH:7.4)を行った。2日間の培養におけるウシ胎仔血清およびウシ血清アルブミン(BSA)の濃度は次のように変化させた。すなわち0.2%FBSおよび2.5%BSAで12時間培養、1%FBSおよび2.5%BSAで12時間培養後3%FBSおよび2.5%BSAで24時間ES細胞を培養した。当該胚体内胚葉への分化判定には、Foxa2とSox17の遺伝子発現をRT−PCR法にて判定した。
誘導された胚体内胚葉における遺伝子発現
実施例1に記載の分化誘導された胚体内胚葉において、RT−PCR法により、胚体内胚葉特異的な遺伝子であるFoxa2およびSox17遺伝子の発現を調べた。内因性コントロールとしてGAPDH遺伝子の発現も調べた。RT−PCR法では、細胞を0.25%トリプシン−EDTA(インビトロジェン社製)で処理したのちに回収し、RNAトリゾール(インビトロジェン社製)を用いて製品の取扱説明書にしたがってRNAを抽出した。抽出したRNA2μgを用いてRNA逆転写酵素による逆転写反応(22℃で10分、さらに42℃20分、99℃5分、その後4℃で5分以上静置)を行った。
5′プライマー:5′−TGGTCACTGGGGACAAGGGAA(配列番号1)
3′プライマー:5′−GCAACAACAGCAATAGAGAAC (配列番号2)
Sox17遺伝子(210bp、60℃、35サイクル)
5′プライマー:5′−GCCAAAGACGAACGCAAGCGGT(配列番号3)
3′プライマー:5′−TCATGCGCTTCACCTGCTTG(配列番号4)
工程(b):原始膵の形成
実施例1に記載の分化誘導を2日間行った後に、工程(a)で得た胚体胚様体を用いて原始膵の形成を行った。ヒト神経膠芽細胞腫由来細胞株T98G(ATCC番号:CRL−1690、ATCC(米国)から入手可能)をSF−03培地で1日間培養(細胞培養濃度:8×105細胞/mL、培養温度:37℃、pH:7.4)して得られた馴化培地を使用して、工程(a)で得られた胚体内胚葉を5日間培養(培養温度:37℃、pH:7.4)した。上記馴化培地には、レチノイン酸(1μmol/L、10μmol/L、100μmol/Lまたは1000μmol/L)およびFGF−2(20ng/mL)を添加し、コラーゲンタイプIV加工培養皿T−25フラスコ(細胞培養濃度175,000細胞/mL、計700,000細胞)を使用した。工程(b)で得た細胞には、Foxa2(+)、Sox17(+)、Pdx−1(+)、Shh(−)の遺伝子発現を示しており、ES細胞が原始膵への形成を開始していることが確認された。
誘導された原始膵における遺伝子発現
実施例2に記載の誘導された原始膵において、RT−PCR法により、原始膵特異的な遺伝子であるPdx−1遺伝子とShh遺伝子の発現を調べた。内因性コントロールとしてGAPDH遺伝子の発現も調べた。また、胚発生の時期に特異的に発現する遺伝子であるShh遺伝子の発現も調べた。RT−PCR法では、細胞を0.25%トリプシン−EDTA(インビトロジェン社製)で処理したのちに回収し、RNAトリゾール(インビトロジェン社製)を用いて製品の取扱説明書にしたがってRNAを抽出した。抽出したRNA2μgを用いてRNA逆転写酵素による逆転写反応(22℃で10分、さらに42℃20分、99℃5分、その後4℃で5分以上静置)を行った。
5′プライマー:5′−ACCATGAACAGTGAGGAGCA(配列番号5)
3′プライマー:5′−TCCTCTTGTTTTCCTCGGGT(配列番号6)
Shh遺伝子(248bp、60℃、35サイクル)
5′プライマー:5′−CCTCTCCTGCTATGCTCCTG(配列番号7)
3′プライマー:5′−GTGGCGGTTACAAAGCAAAT(配列番号8)
GAPDH遺伝子(171bp、60℃、35サイクル)
5′プライマー:5′−ACCCAGAAGACTGTGGATGG(配列番号9)
3′プライマー:5′−CACATTGGGGGTAGGAACAC(配列番号10)
工程(c)ニューロジェニン3発現細胞の選別
工程(b)で得られた原始膵を馴化培地を用いて培養することによりニューロジェニン3発現細胞を増加させた。ヒト肝内皮細胞株TMNT−1細胞(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成14年4月16日、受託番号:FERM BP−8017、万人が使用できる)を低グルコースDMEM培地(グルコース濃度:1000mg/L、カタログ番号31600−083、インビトロジェン社製)で1日間培養(細胞培養濃度:8×105細胞/mL、培養温度:37℃、pH:7.4)して得られた馴化培地にγ−セクレターゼインヒビターXVIII(Calbiochem社(カタログ番号565779)、またはAlexis Biochemicals社(カタログ番号:ALX−270−415−C250、またはALX−270−415−M001)から購入可能)、FGF−2(20ng/mL)、EGF(20ng/mL)を添加したものを使用して、ラミニン−1(濃度は5μg/cm2)(BD Biosciences社、カタログ番号:354232)で加工した培養皿T−25フラスコ(細胞培養濃度50,000細胞/mL、計200,000細胞)でニューロジェニン3発現細胞を4日間培養(培養温度:37℃、pH:7.4)して誘導した。ニューロジェニン3発現細胞の選別には、ニューロジェニン3遺伝子のプロモーターの下流に増強黄色蛍光タンパク質(eYFP)をコードしている遺伝子を導入しeYFP発現細胞を指標としてセルソーター(MoFlo)を用いて選別した。eYFP遺伝子の導入には、Ngn3プロモーター下にeYFP(enhanced yellow fluorescence;増強黄色蛍光タンパク質)を発現するプラスミドベクター:ngn3−Spel−eYFP(以下の論文から当該プラスミドベクターは入手可能である。Mellitzer G, Martin M, Sidhoum−Jenny M, Orvain C, Barths J, Seymour PA, Sander M, Gradwohl G. Pancreatic islet progenitor cells in neurogenin 3−yellow fluorescent protein knock−add−on mice.Mol Endocrinol.18(11):2765−76.2004)を用いた。その後、一過性にngn3−Spel−eYFPをNucelofector(Amaxa社、取り扱い規約に則れば万人が使用可能である)を使用して導入した。ベクター:ngn3−Spel−eYFP(Mellitzer Gら、Mol.Endocrinol.(2004)Nov;18(11):2765−76参照。Mellitzerからベクターを万人が提供を受けることができる。)をヌクレオフェクター(Amaxa社製、操作方法は以下のホームページを参照 http://www.wako−chem.co.jp/siyaku/info/gene/article/amaxa/pdf/Manual.pdf)を用いて遺伝子導入(細胞培養濃度:5×105細胞/mL、培養温度:37℃、pH:7.4)した。48時間後に、当該細胞を、セルソーターMoFloを使用してeYFPの発現を検討したところ、原始膵の3分の1がeYFPを発現していた。eYFP発現細胞(ニューロジェニン発現細胞)をMoFloを使用して回収した。そして、Ngn3発現細胞をMoFlo(Dako−Cytomation社、取り扱い規約に則れば万人が使用可能である)を使用して回収した。
RCNK−1細胞株の樹立
カナダのアルバータ大学から提供された健常分離ヒト膵島(カナダ、アルバータ大学、ヒト膵島移植プログラム、ジョナサン レイキー(Jonathan RT. Lakey)博士より、万人が入手可能である)から、球形のきれいな形態を呈しているものを実体顕微鏡(STEMI、Carl Zeiss社、ドイツ)下にhand pickup法にて10個選別し、これをT25培養フラスコに播いた。培養液は、CMRL1066、インビトロジェン社製)に10%ウシ胎仔血清(FCS、シグマ社)、10-7mol/lインスリン(シグマ社)、10-6mol/lデキサメタゾン(シグマ社)、25μg/ml上皮成長因子(EGF、シグマ社)、10mMニコチンアミド(シグマ社)、抗生物質のペニシリンG/ストレプトマイシン(シグマ社)の組成のものを基本培養液として用いた。当該膵島を、ヌクレオフェクターシステム用緩衝液(NucleofectorTM Solution、和光純薬工業株式会社製)1mlで希釈し、そこにpYK−1のプラスミドDNA(国際公開第2005/100546号パンフレットを参照)のTE緩衝液(TE buffer、シグマ社製)の懸濁液(1μg/μl)2μlを添加して、ヌクレオフェクターシステム(NucleofectorTM system、和光純薬工業株式会社製)により、該システムのプロトコールにしたがって遺伝子導入した。得られた細胞をT−25フラスコに播種し、CS−C無血清培地(CS−SF−4Z0−500、大日本製薬株式会社販売)にて培養を継続した。遺伝導入して48時間後に、100μg/mlのハイグロマイシン含有CS−C無血清培地にて、耐性クローンの選択を行なった。選択開始から2週間後に耐性クローンの出現を認め、4週間後にクローニングリングを使用し、RCNK−1細胞株を樹立した。
工程(d)インスリン分泌細胞への分化
(DMEM培地を用いる方法)
工程(c)で得られたニューロジェニン3発現細胞を、3%または5%のウシ胎仔血清(3%ウシ胎仔血清にて3日間、ついで5%ウシ胎仔血清にて4日間培養)、肝細胞増殖因子10ng/mL、ニコチンアミド10mmol/L、エクスディン−4 100nmol/L、トログリタゾン10μmol/L、硫酸亜鉛16.7μmol/Lを加えた低グルコースDMEM培地を用いて7日間培養(培養温度:37℃、pH:7.4)した。培養皿としては、マトリゲルで加工した6−well−plateを使用した。工程(d)においては、毎日、血清非添加の高グルコースDMEM培地(グルコース濃度:4500mg/L、カタログ番号:12800−082、インビトロジェン社製)にて2時間培養(培養温度:37℃、pH:7.4)した後、前記低グルコースDMEM培地で22時間の培養を7日間継続した。なお、高グルコース培地にも肝細胞増殖因子10ng/mL、ニコチンアミド10mmol/L、エクスディン−4 100nmol/L、トログリタゾン10μmol/L、硫酸亜鉛16.7μmol/Lを加えた。
工程(c)で得られたニューロジェニン3発現細胞を、低グルコースRCNK−1馴化培地を用いてインスリン分泌細胞へ分化誘導を行った。RCNK−1細胞を低グルコースDMEM+10%FBSで培養し、フラスコに一杯になった時点で核内限局信号(NLS)標識されたCre組換え酵素を産生する複製不可能な組換えアデノベクターAxCANCre(3×108pfu/ml)(理研ジーンバンクより入手可能、RDB No.1748)をMOI(感染多重度)=10〜50(15が好ましい)で2〜4時間(3時間が好ましい)感染させ、RCNK−1細胞をCre/loxPシステムで不死化遺伝子のSV40Tを取り除いた(培養温度:35〜37度)。感染後は、RCNK−1細胞を低グルコースDMEM+5%FBSで2日間(48時間)培養して、その後、低グルコースDMEMのみで培養した。24時間培養した後に、当該低グルコースRCNK−1馴化培地を回収した。なお当該操作は、無血清であるため細胞が弱るまで4回から5回可能である。当該低グルコースRCNK−1馴化培地に3%または5%のウシ胎仔血清(3%ウシ胎仔血清にて3日間、ついで5%ウシ胎仔血清にて4日間培養)、肝細胞増殖因子10ng/mL、ニコチンアミド10mmol/L、エクスディン−4 100nmol/L、トログリタゾン10μmol/L、硫酸亜鉛16.7μmol/Lを加えた培地を用いて7日間培養(培養温度:37℃、pH:7.4)した。低グルコースRCNK−1馴化培地は、培養皿としては、マトリゲルで加工した6−well−plateを使用した。工程(d)においては、毎日、血清非添加の高グルコース濃度に調製したKRBB培地(Krebs Ringer Balanced Buffered(KRBB)(143mM Na, 5.8mM K, 2.5mM Ca, 1.2mM Mg2, 124.1mM Cl, 1.2mM PO−4, 1.2mM SO−4, 25mM HCO−3, 10mM HEPES, 0.2% BSAを含む、以下の論文に詳細に書いてある。Srivastava S, Goren HJ.Insulin constitutively secreted by beta−cells is necessary for glucose−stimulated insulin secretion.Diabetes. 2003 ;52(8):2049−56.参照))に肝細胞増殖因子10ng/mL、ニコチンアミド10mmol/L、エクスディン−4 100nmol/L、トログリタゾン10μmol/L、硫酸亜鉛16.7μmol/Lを加えた培地で2時間培養(培養温度:37℃、pH:7.4)した後、前記RCNK−1馴化培地で22時間の培養を7日間継続した。
インスリン分泌細胞のMafA遺伝子発現
本発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞(工程(d)の培養7日目)を位相差顕微鏡下にて観察した(図4(a)参照)。核1はドット状に赤く染まっており、直径が約200μmの球状を呈しているインスリン分泌細胞群全体2は緑に染まっていることからMafA遺伝子の発現が確認できた。MafA遺伝子の発現は、MafA抗体を用いて行った(MafA抗体(BL1069、カタログ番号:A300−611A、BETHYL LABORATORIES,INC.社製。使用方法に関しては、製品に添付の取扱説明書を参照)。なお、添付の写真は白黒2階調に変換したものであるので、染色された色は表現されていない。本発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞は、MafA遺伝子を発現する能力を有するのに対し、従来技術であるダムール法で分化誘導されたインスリン分泌細胞はMafA遺伝子を発現していないことが報告されている(非特許文献12参照)。この結果からも、本願発明の分化誘導方法は従来技術と比較して優れていることが明らかとなった。本願発明が優れている要因としては、ダムール法ではFGF−10を使用しているのに対し、本願発明では工程(c)においてEGFおよびFGF−2を使用した点が考えられる。FGF−10は、膵臓の発生過程でβ細胞への分化を抑制(非特許文献13参照)し、膵外分泌細胞を誘導する(非特許文献14参照)ことが報告されている。一方、EGFとFGF−2が膵臓の発生過程でβ細胞への分化を促進する(Cras−Meneur C, Elghazi L, Czernichow P, Scharfmann R. Epidermal growth factor increases undifferentiated pancreatic embryonic cells in vitro: a balance between proliferation and differentiation. Diabetes. 2001 Jul;50(7):1571−9)ことが報告されている。
インスリン分泌細胞のインスリン分泌能の確認および形態学的検討
本願発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞の形態を位相差顕微鏡下にて観察した(図4(b)参照)。なお、核1は赤く染まっており、分化誘導4、7日目においては直径が約200μmの球状を呈しているインスリン分泌細胞群全体2はインスリン分泌を示す緑に染まっている。インスリンの検出は抗インスリン抗体を用いて行った(Sta. Cruz sc−9168,使用方法は製品に添付させている取り扱い説明書を参照)。インスリン分泌細胞は培養日数の増加に伴い緑色を呈していることが確認された。なお、添付の写真は白黒2階調に変換したものであるので、染色された色は表現されていない。図4の写真右下のスケールバーは共に200μmを示す。インスリン分泌細胞は培養日数と共に球状の形態を形成してきている。
1.形状が「いびつな球状:3点」、2.辺縁の形状が「やや均整のとれた:3点」、3.統合性が「断片化した(fragmented):1点」、4.直径が「培養膵島の個々が125〜175μm:3点」、5.染色の均一性が「やや均一:3点」評価値の合計が13点であった(図4参照)。
1.形状が「球状:5点」、2.辺縁の形状が「やや均整のとれた:3点」、3.統合性が「ややソリッド/コンパクト:3点」、4.直径が「培養膵島の個々中10%以上が200μmより大きい:5点」、5.染色の均一性が「やや均一:3点」評価値の合計が19点であった(図4参照)。
1.形状が「球状:5点」、2.辺縁の形状が「均整のとれた:5点」、3.統合性が「ソリッド/コンパクト:5点」、4.直径が「培養膵島の個々中10%以上が200μmより大きい:5点」、5.染色の均一性が「完全に均一:5点」評価値の合計が25点であった(図4参照)。一方、ダムール法により得られたインスリン分泌細胞は球状にはなっていなかった。
1.形状が「扁平:1点」、2.辺縁の形状が「不ぞろいの:1点」、3.統合性が「断片化した:1点」、4.直径が「培養膵島の全体が100μm未満:1点」、5.染色の均一性が「やや均一:3点」評価値の合計が7点であった(非特許文献12参照)。
形態学的検討結果より、本発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞は従来技術(ダムール法)より優れていることが明らかとなった。
本発明の手法により得られたインスリン分泌細胞の機能評価
1)インスリン分泌
実施例4のDMEM培地を用いた培養により得られたインスリン分泌細胞または実施例4のRCNK−1馴化培地を用いた培養により得られたインスリン分泌細胞を、それぞれDMEM(図5(a)および表1(a)参照)またはKRBB(図5(b)および表1(b)参照)に、3.3mM濃度(低グルコース)ないしは25mM濃度(高グルコース)のグルコースを添加して、各2時間培養(培養温度:37℃、pH:7.4)して、培地中のインスリン分泌量を測定し(Ultrasensitive insulin kit、Mercodia Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA、製品番号:10−1150−01、Mercodia社製)従来技術(ダムール法、およびシュローダー法(シュローダーら、nature protocols vol.1, no.2, p.495−507, 2006))との比較を行った(図5、表1(a)および表1(b)参照)。すなわち、低グルコースにて2時間刺激後高グルコースにて2時間刺激(「グルコース刺激:低→高」と略す)した後の培地中のインスリン分泌量を測定、または低グルコースにて2時間刺激後高グルコースにて2時間刺激後再度低グルコースにて2時間刺激(「グルコース刺激:低→高→低」と略す)した後の培地中のインスリン分泌量を測定した。その結果、本願発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞は、低グルコースDMEMで2日、4日、7日、と培養日数が増加するごとに、「グルコース刺激:低→高」した際のインスリン分泌量が増加しており(それぞれ、図5の横軸の1、3、5を参照。)、一方で「グルコース刺激:低→高→低」した際のインスリン分泌量は減少しており(それぞれ、図5の横軸の2、4、6を参照)、インスリン分泌細胞がグルコース応答性を有することが明らかとなった。なお比較として、従来技術であるシュローダー法によるインスリン分泌細胞を「グルコース刺激:低→高」した後の培地中のインスリン分泌量(図5の横軸の7を参照)、ダムール法によるインスリン分泌細胞を「グルコース刺激:低→高→低」した後の培地中のインスリン分泌量(図5の横軸の8を参照)、ダムール法によるインスリン分泌細胞を「グルコース刺激:低→高」した後の培地中のインスリン分泌量(図5の横軸の9を参照)、ダムール法によるインスリン分泌細胞を「グルコース刺激:低→高→低」した後の培地中のインスリン分泌量(図5の横軸の10を参照)を測定した。その結果、本発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞は、従来技術によるインスリン分泌細胞と比較して優れたインスリン分泌能を有し、グルコース応答性も優れていることが明らかとなった。
本発明の手法により得られたインスリン分泌細胞の機能評価
2)トルブタミドによる刺激
実施例4により得られたインスリン分泌細胞を、低グルコース濃度のKRBBを培地として用いてインスリン分泌量を測定(図6(a)および表2参照)後、培地を低グルコース濃度のKRBBに10micromol/Lトルブタミド(シグマ社製)で1時間刺激した際の培地中のインスリン分泌量を測定(図6(b)および表2参照)した。その結果、本願発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞は従来技術と比較して高いインスリン分泌能を示した。
本発明の手法により得られたインスリン分泌細胞の機能評価
3)糖尿病マウスへの移植実験
重症免疫不全(SCID(severe combined immunodeficiency))マウス(体重20g、日本クレア株式会社)にストレプトゾトシン(220mg/kg)を腹腔内に投与し、一週後に血糖値が360mg/dL以上に2日続けてなった際に、糖尿病と判断した。当該糖尿病マウスを移植実験に使用した。本願発明の分化誘導方法にて得られたインスリン分泌細胞(5×106細胞)、未分化なマウスES細胞(5×106細胞)、および正常マウス膵島450個を移植細胞として用いた。それぞれ5匹の糖尿病マウスに細胞移植を行った。なお、正常な健常マウス(3匹)および移植しない糖尿病マウスをコントロールとして使用した。マウスの左腎皮膜下に移植した後の血糖値の平均を図7および表3に示す。移植後の最初の5日間は中間型ヒトインスリンNPH(Novo Nordisk社製)を2単位皮下注射し、その後の5日間は中間型ヒトインスリンNPH(Novo Nordisk社製)を1単位皮下注射した場合の移植後の血糖値の平均を図7に示す。その後、3日おきに血糖値を測定し、移植後3週目以降は一週間に一回の割合で血糖値をPortable glucose meter FreeStlyle TM(TheraSence社製)を使用して測定した。マウスES細胞を移植したマウスでは、NPH投与を終えた後に血糖値が再度360mg/dL以上になり、治療効果がないことが明らかとなった。これとは対照的に、本願発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞を移植したマウスは、健常マウス膵島を移植したマウスと同様にグルコース濃度が100mg/dL程度を維持することができた。これは、当該インスリン分泌細胞の機能が健常マウス膵島と同程度であり、治療効果があることを示す。なお、治療を行わない糖尿病マウス全て(非治療群)およびES細胞を移植したマウス全ては10週間以内に高血糖により死亡した。
本発明の手法により得られたインスリン分泌細胞の機能評価
4)バイオ人工膵臓を用いた糖尿病マウスの治療実験
バイオ人工膵臓を移植する糖尿病マウス(実施例9記載の方法で作製)を切開し、マウス皮下にバッグ型のバイオリアクター(図8参照。SG文献に作製方法が記載されている)を埋め込み3日間かけてバイオリアクター周囲への血管伸長を行った。バイオリアクターを埋め込んでから3日後および10日後に本願発明の分化誘導方法にて得られたインスリン分泌細胞(5×106細胞)、未分化なマウスES細胞(5×106細胞)、および正常マウス膵島450個をそれぞれ5匹の糖尿病マウスに埋め込んだバイオリアクターに細胞充填を行った。なお、正常な健常マウス(3匹)および移植しない糖尿病マウスをコントロールとして使用した。細胞を充填した後のマウス血糖値の平均を図9および表4に示す。充填後の最初の10日間(細胞を充填してから、細胞のインスリン分泌能が回復するまでの間に相当する)は、中間型ヒトインスリンNPH(Novo Nordisk社製)を2単位皮下注射した。NPH注射終了後、3日おきに血糖値を測定し、移植後3週目以降は1週間に1回の割合で血糖値をPortable glucose meter FreeStlyle TM(TheraSence社製)を使用して測定した。マウスES細胞を充填したバイオ人工膵臓を埋め込んだマウスでは、NPH投与を終えた後に血糖値が再度360mg/dL以上になり、治療効果がないことが明らかとなった。これとは対照的に、本願発明の分化誘導方法により得られたインスリン分泌細胞を埋め込んだバイオ人工膵臓を装着したマウスは、健常マウス膵島を充填したバイオ人工膵臓を装着したマウスと同様にグルコース濃度が100mg/dL程度を維持することができた。これは、当該インスリン分泌細胞の機能が健常マウス膵島と同程度であり、治療効果があることを示す。なお、治療を行わない糖尿病マウス全て(非治療群)およびES細胞を充填したバイオ人工膵臓を埋め込んだマウス全ては10週間以内に高血糖により死亡した。
2 インスリン分泌細胞群全体
3 細胞注入口
4 蓋
5 ポリエチレン−ビニルアルコール膜
6 PTFE不織布
7 インスリン分泌細胞
配列番号2:Foxa2遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′プライマー
配列番号3:Sox17遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′プライマー
配列番号4:Sox17遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′プライマー
配列番号5:Pdx−1遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′プライマー
配列番号6:Pdx−1遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′プライマー
配列番号7:Shh遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′プライマー
配列番号8:Shh遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′プライマー
配列番号9:GAPDH遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用5′プライマー
配列番号10:GAPDH遺伝子を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応用3′プライマー
Claims (29)
- 胚性幹細胞のインスリン分泌細胞への分化誘導方法であって、
(a)線維芽細胞増殖因子およびアクチビンの存在下に胚性幹細胞を培養することにより胚体内胚葉へ分化させる工程、
(b)得られた胚体内胚葉を、線維芽細胞増殖因子の存在下、馴化培地を用いて培養することにより原始膵へ分化させる工程、
(c)得られた原始膵を、馴化培地を用いて培養することによりニューロジェニン3発現細胞数を増加させ、ニューロジェニン3発現細胞を得る工程、および
(d)得られたニューロジェニン3発現細胞を、高グルコース濃度の細胞培養用培地中で刺激してインスリン分泌細胞へ分化させる工程
を含む方法。 - 線維芽細胞増殖因子が線維芽細胞増殖因子−10以外の線維芽細胞増殖因子である請求項1記載の方法。
- アクチビンがアクチビンAである請求項1または2記載の方法。
- アクチビンの濃度が2〜200ng/mLである請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 工程(b)において用いられる馴化培地が、ヒト神経膠芽細胞腫由来細胞株T98Gを細胞培養培地中で培養したものである請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 工程(c)において用いられる馴化培地が、ヒト肝内皮細胞株TMNK−1(寄託機関:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305−8566)、寄託日:平成14年4月16日、受託番号:FERM BP−8017)または血管内皮細胞を低グルコース細胞培養培地中で培養したものである請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 各工程における培養がそれぞれ、コラーゲンタイプIV、マトリゲル、フィブロネクチン、ジェラチン、ポリオルニチンおよびラミニンよりなる群から選ばれる生体適合性材料を用いる三次元培養である請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)において用いられる生体適合性材料がコラーゲンタイプIVである請求項7記載の方法。
- 工程(c)において用いられる生体適合性材料がラミニンである請求項7または8記載の方法。
- 工程(a)における細胞培養濃度が1×105〜4×105細胞/mLである請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 工程(b)における細胞培養濃度が1×105〜8×105細胞/mLである請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)および/または(b)における線維芽細胞増殖因子の濃度が2〜20ng/mLである請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 工程(a)において用いられる培地が、細胞培養用培地中に、ウシ胎仔血清を0.2〜3%含有し、ウシ血清アルブミンを2〜3%含有する請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 工程(b)において用いられる培地が、馴化培地中にレチノイン酸を1〜50μmol/L含有する請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 工程(c)において用いられる培地が、馴化培地中にγ−セクレターゼ阻害剤XVIIIを0.25〜2μmol/L含有し、線維芽細胞増殖因子を5〜50ng/mL含有し、上皮増殖因子を5〜50ng/mL含有する請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 工程(c)において、ニューロジェニン3発現細胞がセルソーターを用いて選別される請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 工程(d)において用いられる培地が、肝細胞増殖因子を2〜50ng/mL含有し、ニコチンアミドを1〜10mmol/L含有し、エクセディン−4を5〜100nmol/L含有し、トログリタゾン1〜10μmol/Lおよび硫酸亜鉛を1〜20μmol/L含有する請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- 工程(d)が、ニューロジェニン3発現細胞を高グルコース濃度の細胞培養用培地、次いで低グルコース濃度の細胞培養用培地中で繰り返し刺激培養する工程からなり、高グルコース濃度の細胞培養用培地中で1回あたり2時間の刺激培養を、1日あたり1〜3回行うことを1〜10日間繰り返す請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 工程(d)において用いられる培地が、高グルコース濃度の細胞培養培地中に脂質、アミノ酸、ビタミンおよび/またはミネラルを含有する請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 工程(d)が、さらにニューロジェニン3発現細胞にMafA遺伝子を導入し発現させることにより、インスリン分泌細胞のMafA遺伝子発現を増強させることを含む請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- 胚性幹細胞が哺乳類由来のものである請求項1〜20のいずれかに記載の方法。
- 哺乳類がマウス、ヒト、サルよりなる群から選ばれる請求項21記載の方法。
- 哺乳類がマウスである請求項22記載の方法。
- 請求項1〜23のいずれかに記載の方法により誘導されるインスリン分泌細胞。
- インスリン分泌細胞が、スフェロイドを形成しているインスリン分泌細胞を含有する請求項24記載のインスリン分泌細胞。
- 請求項24または25記載のインスリン分泌細胞を含有する糖尿病治療剤。
- 請求項24または25記載のインスリン分泌細胞を含有するバイオ人工膵臓。
- 請求項24または25記載のインスリン分泌細胞を含有する研究試薬。
- 請求項24または25記載のインスリン分泌細胞を含有する創薬モデル動物。
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