JPWO2015178397A1 - インスリン産生細胞の分化誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]幹細胞を、以下の工程(1)〜(5)で培養することを特徴とする、インスリン産生細胞の分化誘導方法:
(1)幹細胞を、(1−1)アクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤およびGSK3阻害剤を含む培地で培養し、次いで、(1−2)アクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られた細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤およびFGFを含む培地で培養する工程、
(3)前記工程(2)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤(、好ましくはさらにTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤)を含む培地で培養する工程、
(4)前記工程(3)で得られた細胞を、TGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤(、好ましくはさらにプロテインキナーゼC活性化因子)を含む培地で培養する工程、および
(5)前記工程(4)で得られた細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤(、好ましくはさらに、GLP−1受容体アゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子のいずれか1以上、より好ましくは2以上、特に好ましくは全て)を含む培地で培養する工程。
[2]前記工程(1−2)の培地が、実質的にGSK3阻害剤を含まない培地である、上記[1]に記載の分化誘導方法。
[3]前記工程(3)および(4)におけるBMPシグナル伝達阻害剤がNOGGINであり、工程(5)のホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、上記[1]または[2]に記載の分化誘導方法。
[4]工程(3)および工程(4)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも100ng/mL以上である、上記[3]に記載の分化誘導方法。
[5]工程(3)および工程(4)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも200〜500ng/mLである、上記[4]に記載の分化誘導方法。
[6]工程(3)が、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、BMPシグナル伝達阻害剤およびTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤を含み、工程(4)が、TGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤、BMPシグナル伝達阻害剤、およびプロテインキナーゼC活性化因子を含み、工程(5)が、ホスホジエステラーゼ阻害剤、GLP−1受容体アゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子を含む、上記[1]〜[5]のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[7]工程(3)におけるレチノイン酸アゴニストがレチノイン酸であり、工程(2)および(3)におけるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤がKAAD−シクロパミンである、上記[1]〜[6]のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[8]工程(3)におけるTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤がSB431542であり、工程(5)におけるGLP−1受容体アゴニストがエキセンジン−4である、上記[6]または[7]に記載の分化誘導方法。
[9]上記工程(1)〜(5)の全てを、ゼノフリー培養系で行うことを特徴とする、上記[1]〜[8]のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
(a)内胚葉細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤およびFGFを含む培地で培養する工程、
(b)前記工程(a)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤(、好ましくはさらにTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤)を含む培地で培養する工程、
(c)前記工程(b)で得られた細胞を、TGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤(、好ましくはさらにプロテインキナーゼC活性化因子)を含む培地で培養する工程、および
(d)前記工程(c)で得られた細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤(、好ましくはさらに、GLP−1受容体のアゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子のいずれか1以上、より好ましくは2以上、特に好ましくは全て)を含む培地で培養する工程。
[11]前記工程(b)および(c)におけるBMPシグナル伝達阻害剤がNOGGINであり、工程(d)のホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、上記[10]に記載の分化誘導方法。
[12]工程(b)および工程(c)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも100ng/mL以上である、上記[11]に記載の分化誘導方法。
[13]工程(c)および工程(d)におけるNOGGINの濃度が、200〜500ng/mLである、上記[12]に記載の分化誘導方法。
[14]工程(b)が、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、BMPシグナル伝達阻害剤およびTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤を含み、工程(c)が、TGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤、BMPシグナル伝達阻害剤、およびプロテインキナーゼC活性化因子を含み、工程(d)が、ホスホジエステラーゼ阻害剤、GLP−1受容体アゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子を含む、上記[10]〜[13]のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[15]工程(b)におけるレチノイン酸アゴニストがレチノイン酸であり、工程(a)および(b)におけるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤がKAAD−シクロパミンである、上記[10]〜[14]のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[16]工程(b)におけるTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤がSB431542であり、工程(d)におけるGLP−1受容体アゴニストがエキセンジン−4である、上記[14]または[15]に記載の分化誘導方法。
[17]上記工程(a)〜(d)の全てを、ゼノフリー培養系で行うことを特徴とする、上記[10]〜[16]のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[18]幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)またはヒトの体性幹細胞である上記[1]〜[17]のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[19]上記[1]〜[18]のいずれか一つに記載の方法で得られたインスリン産生細胞。
[20]上記[19]の細胞を含む医薬組成物。
[21]上記[1]〜[18]のいずれか一つに記載の方法で得られたインスリン産生細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
[22]インスリン産生細胞を被験物質とともに培養する工程を含む、上記[21]に記載のスクリーニング方法。
[23]さらに細胞によるインスリン分泌を検出する工程を含む、上記[22]に記載のスクリーニング方法。
本明細書において用いられる用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。また、本明細書中で、「A〜B」を言った場合は、下限としてAを含み、上限としてBを含む意味で用いられる。
本明細書において、「インスリン産生細胞」とは、インスリン分泌促進物質および高血糖に反応してインスリンを分泌する細胞であって、他の膵ホルモンに比べてインスリン発現能力が有意に優れている細胞を意味する。ここで他の膵ホルモンとしては、例えば、グルカゴンやソマトスタチンを上げることができる。
本明細書においてインスリン産生細胞の製造を意図して「製造」または「作製」という用語を用いる場合は、「分化(誘導)」と置き換えることもでき、また、特に断りがない限り、それらの用語は交換可能に用いられる。
ES細胞は、一般的には、胚盤胞期の受精卵をフィーダー細胞と一緒に培養し、増殖した内部細胞塊由来の細胞をばらばらにして、さらに、植え継ぐ操作を繰り返し、最終的に細胞株として樹立することができる。このように、ES細胞は、受精卵から取得することが多いが、受精卵以外、例えば、脂肪組織、胎盤、精巣細胞から取得することもでき、いずれのES細胞も本発明の対象である。
本発明の分化誘導方法は、幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する方法である。本発明の分化誘導方法はまた、内胚葉細胞あるいは原腸管細胞や膵臓前駆細胞をインスリン産生細胞へと分化誘導する方法である。
(1)幹細胞を、(1−1)アクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤およびGSK3阻害剤を含む培地で培養し、次いで、(1−2)アクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤含む培地で培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られた細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤およびFGFを含む培地で培養する工程、
(3)前記工程(2)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤(、好ましくはさらにTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤)を含む培地で培養する工程、
(4)前記工程(3)で得られた細胞を、TGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤(、好ましくはさらにプロテインキナーゼC活性化因子)を含む培地で培養する工程、
(5)前記工程(4)で得られた細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤(、好ましくはさらに、GLP−1受容体アゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子のいずれか1以上、より好ましくは2以上、特に好ましくは全て)を含む培地で培養する工程、
である。
哺乳動物由来のES細胞の培養方法は常法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてマウス胎児線維芽細胞(MEF細胞)を用い、白血病阻害因子、KSR(ノックアウト血清代替物)、ウシ胎仔血清(FBS)、非必須アミノ酸、L−グルタミン、ピルビン酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノールを加えた培地、例えばDMEM培地を用いて維持することができる。
iPS細胞の培養も定法により行うことができる。例えば、フィーダー細胞としてMEF細胞を用いて、bFGF、KSR(ノックアウト血清代替物)、非必須アミノ酸、L−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノールを加えた培地、例えばDMEM/F12培地を用いて維持することができる。
これらの幹細胞を原料として用いて、本発明の分化誘導方法により、インスリン産生細胞を製造することができる。さらには、ゼノフリー培養系で本発明の分化誘導方法を用いることにより、異種抗原汚染のないインスリン産生細胞を得ることができる。
好ましくは、本発明の工程(1)における(1−2)の培地は、実質的にGSK3阻害剤を含まない培地である。
この工程により、幹細胞を内胚葉細胞へと分化誘導できる。
本工程では、いずれのアクチビンを用いることができ、例えば、アクチビンは、アクチビンA、B、C、DおよびABが知られているが、本工程においてはそのいずれのアクチビンも用いることができる。本工程に用いるアクチビンとしては、特に好ましくはアクチビンAである。また、用いるアクチビンとしては、ヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができるが、分化に用いる幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビン、特にはヒト由来のアクチビンAを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
本工程における培地中のアクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤の濃度は、用いる種類によって適宜設定されるが、ヒトアクチビンAを使用する場合の濃度は、通常0.1〜200ng/ml、好ましくは5〜150ng/ml、特に好ましくは10〜100ng/mlである。
本発明の工程(1)の工程(1−1)および工程(1−2)において使用するアクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤の種類および濃度は、同一であっても異なってもよいが、同じ種類が好ましく、また同じ濃度が好ましい。
本工程で用いられるGSK3阻害剤は、GSK3α阻害活性を有する物質、GSK3β阻害活性を有する物質、およびGSK3α阻害活性とGSK3β阻害活性とを併せ持つ物質からなる群より選択される。本工程で用いるGSK3阻害剤としては、GSK3β阻害活性を有する物質またはGSK3α阻害活性とGSK3β阻害活性とを併せ持つ物質が好ましい。
上記GSK3阻害剤として、具体的にはCHIR98014、CHIR99021、ケンパウロン(Kenpaullone)、AR−AO144−18、TDZD−8、SB216763、BIO、TWS−119およびSB415286等が例示される。これらは市販品として購入可能である。また、市販品として入手できない場合であっても、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
また、GSK3のmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA等もGSK3阻害剤として使用することができる。これらはいずれも商業的に入手可能であるか既知文献に従って合成することができる。
本工程で用いられるGSK3阻害剤は、好ましくはCHIR99021(6−[[2−[[4−(2,4−ジクロロフェニル)−5−(4−メチル−1H−イミダゾール−2−イル)−2−ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]ニコチノニトリル)、SB216763(3−(2,3−ジクロロフェニル)−4−(1−メチル−1H−インドール−3−イル)−1H−ピロール−2,5−ジオン)、およびSB415286(3−[(3−クロロ−4−ヒドロキシフェニル)アミノ]−4−(2−ニトロフェニル)−1H−ピロール−2,5−ジオン)からなる群から選択され、特に好ましくはCHIR99021である。
GSK3阻害剤の培地中の濃度は、用いるGSK3阻害剤の種類によって適宜設定されるが、GSK3阻害剤としてCHIR99021を使用する場合の濃度は、通常0.1〜20μM、好ましくは1〜5μMである。GSK3阻害剤としてSB415286を使用する場合の濃度は、通常0.1〜20μM、好ましくは1〜10μMである。GSK3阻害剤としてSB216763を使用する場合の濃度は、通常0.1〜30μM、好ましくは0.5〜20μMである。
上記「実質的にGSK3阻害剤を含まない培地」とは、培地中にGSK3阻害剤を積極的に添加しないことを意味し、幹細胞を培養する培地中にGSK3阻害剤が微量に含まれることを排除する意味ではない。例えば、幹細胞をアクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤およびGSK3阻害剤を含む培地で培養した後、アクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤を添加しているがGSK3を添加していない培地に交換することにより、幹細胞をアクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤は含むが「実質的にGSK3阻害剤を含まない培地」で培養することができる。
上記基礎培地としては、例えば、BME培地、BGjB培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagles MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s、およびこれらの混合培地等をあげることができるが、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの培地は市販されており入手可能である。
本発明で用いられる培地は、血清含有培地であっても無血清培地であってもよい。無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分(例えば、増殖因子)が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。本工程で用いられる培地が血清含有培地である場合はウシ胎児血清などの哺乳動物の血清が使用できる。培地は、好ましくは無血清培地、さらに好ましくは化学的に定義されていない成分を含まない無血清培地である。
本工程で用いられる培地はまた、他の添加物、例えば、脂質、アミノ酸(例えば、非必須アミノ酸)、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質(例えばペニシリンやストレプトマイシン)または抗菌剤(例えばアンホテリシンB)等を含有してもよい。
本工程で用いられる培地は、特に好ましくは、無血清培地であり、かつ、化学的に定義された原材料のみを含む培地である。それにより、異種抗原汚染が軽減されたあるいは汚染がない分化した細胞を得ることができる。
本工程においては、B−27サプリメントを添加したDMEM培地が好適に用いられる。
本工程における培地中のヘッジホッグシグナル伝達阻害剤の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、0.01〜5μMが好ましく、0.02〜2μMがより好ましく、0.1〜0.5μMがさらに好ましい。
本工程に用いることができるFGFとしては、FGF−1、FGF−2(bFGF)、FGF−3、FGF−4、FGF−5、FGF−6、FGF−7、FGF−8、FGF−9、FGF−10、FGF−11、FGF−12、FGF−13、FGF−14、FGF−15、FGF−16、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、FGF−22、FGF−23等をあげることができ、好ましくは、FGF−2(bFGF)、FGF−5、FGF−7、FGF−10であり、さらに好ましくはFGF−10である。これらは、天然型であってもよいしまた組換タンパクであってもよい。
本工程における培地中のFGFの濃度は、5〜150ng/mLが好ましく、10〜100ng/mLがより好ましく、20〜80ng/mLがさらに好ましい。
本工程において特に好ましい組合せは、KAAD−シクロパミンとFGF−10である。
BMPシグナル伝達阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜選択されるが、NOGGINを用いる場合の濃度は、通常10ng/ml〜1000ng/ml、好ましくは50ng/ml〜500ng/ml、さらに好ましくは100ng/ml〜500ng/ml、最も好ましくは200ng/ml〜300ng/mlである。
また、ALK−4,5,7のmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA等もALK−4,5,7の阻害剤として使用することができる。
また、ALK−4,5,7のmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA等もALK−4,5,7の阻害剤として使用することができる。
(a)内胚葉細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびFGFを含む培地で培養する工程、
(b)前記工程(a)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤(、好ましくはさらにTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤)を含む培地で培養する工程、
(c)前記工程(b)で得られた細胞を、TGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤(、好ましくはさらにプロテインキナーゼC活性化因子)を含む培地で培養する工程、および
(d)前記工程(c)で得られた細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤(、好ましくはさらに、GLP−1受容体のアゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子のいずれか1以上、より好ましくは2以上、特に好ましくは全て)を含む培地で培養する工程、
でもある。
上記のそれぞれの工程で培地に添加される物質の例は、既に上記した通りである。
本発明の方法の一つの好ましい態様における特徴は、高濃度のNOGGINが、未分化幹細胞を、PDX1陽性膵臓前駆細胞へ、次いでNGN3発現膵内分泌前駆細胞への分化を特異的に増強する一方、肝臓や腸の細胞への誘導を抑制するのに重要な役割を果たすことである。また、本発明の方法の他の好ましい態様における特徴は、機能的に成熟したβ細胞の様々なマーカーを発現するインスリンシングルポジティブ細胞(INSULIN-single positive cell)への分化のために、エキセンジン−4とニコチンアミドとともにIBMXが重要な役割を果たすことである。そして、このような好ましい態様を用いて分化誘導された細胞は、様々なインスリン分泌促進物質および高グルコースに応答して放出される内因性のC−ペプチドのプールを含んでいる。
本発明の方法の一つの好ましい態様において、ステージ3で膵臓前駆細胞を誘導するために、RA、KAAD−シクロパミン、SB431542およびNOGGINを組み合わせた処理が用いられる。ヘッジホッグシグナル伝達は、ゼブラフィッシュとマウスの胚発生期間中、膵臓内分泌細胞のRAが媒介する仕様(RA-mediated specification)に拮抗することが報告されている。それ故、このステージでのKAAD−シクロパミンとRAの使用は、それらの既知の重要性と一致している。本発明の分化誘導系においては、AFP陽性細胞は、高濃度のNOGGIN(200〜300ng/mL)で減少するが、このことは、BMPが、膵臓分化に要求されるが、肝分化には阻害的であるということと一致している。BMPシグナル伝達はまた、SMAD4を介してCDX2の発現を増加させるが、このことは、NOGGINによるCDX2のダウンレギュレーションを説明できるかもしれない。
さらに、NGN3転写物は、このステージで高発現し、そして、1または2日以上の日数以内に徐々に消失したが、このことは、インビボでのこの遺伝子の一過性発現と一致する。膵臓内分泌細胞、特にβ細胞の分化の重要な調節因子であるNKX6.1は、ステージ3とステージ4の細胞の両方で発現されており、このことは、本発明の培養系で誘導した前駆細胞が、膵β細胞へと分化する能力を有していることを示している。
また、IBMXとFRKLの組合せのすべての条件で、優勢なC−ペプチド/PDX1ダブルポジティブ細胞を観察される。C−ペプチドを発現しなかったPDX1陽性細胞もまた存在していたが、これらの細胞は、高度にPDX1陽性であり、上皮前駆細胞またはその前駆体かもしれない。エキセンジン−4およびニコチンアミドに加えて、IBMXおよびFRKLは、C−ペプチドポジティブ細胞への分化を同様に促進するが、エキセンジン−4、ニコチンアミドおよびIBMXの組合せは、以下の考察に基づくと、INS−発現細胞への内分泌前駆細胞の誘導のためのより良い条件であると考えることができる。まず、SST−シングルおよびCP/SSTダブルポジティブ細胞の数は、IBMXベースの条件よりも、FPKLベースの条件の方が比較的高かったが、このことは、IBMXとFRKLの両方が細胞内cAMPを増加したものの、FRKLが他の経路に作用することによりSSTポジティブ細胞を促進した可能性があることを示唆している。第二に、PDX1シングルポジティブ細胞の数もまた、IBMXベースの条件よりもFRKLベースの条件で高かったことは、FRKLはまた、他の細胞型を作製するために作用したことを反映している。第三に、β細胞特異的な遺伝子の発現が、FRKLに誘導される細胞よりもIBMX誘導細胞では比較的高かった。
本発明は、上記した本発明の分化誘導方法により製造されたインスリン産生細胞を含む医薬を提供する。ここで、インスリン産生細胞とは、インスリン分泌促進物質または高血糖に反応してC−ペプチドを分泌する細胞であって、他の膵ホルモンに比べてインスリン発現能力が有意に優れている細胞である。
本発明の分化誘導方法は、ゼノフリーの培養系においても、効率よくインスリン産生細胞を分化誘導(製造)することができる。従って、本発明の医薬は、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ブタ、サル)に投与した際に、異種抗原汚染がなく安全である。
本発明の医薬のヒトへの投与形態(移植方法)としては、例えば、ヒト患者の右下腹部に小切開を置き、腸間膜の細い血管を露出して直視下にカテーテルを挿入して細胞を移植する方法;エコーにて肝臓の門脈を同定して、カテーテルを穿刺して細胞を移植する方法;または腹部エコーガイド下に脾臓を直接穿刺することにより脾臓に移植する方法(Nagata H,Ito M,Shirota C,Edge A,McCowan TC,Fox IJ:Route of hepatocyte delivery affects hepatocyte engraftment in the spleen.Transplantation,76(4):732−4,2003.参照)があげられる。なかでも、エコーを用いて細胞移植を行う方法の方が、侵襲が少ないため好ましく、このような方法の具体例として、腹部エコーガイド下に直接穿刺することにより脾臓や肝臓に移植する方法が挙げられる。本発明の医薬の投与量(移植量)は、例えば、1×108〜1×1010細胞/個体、好ましくは、5×108〜1×1010細胞/個体、さらに好ましくは、1×109〜1×1010細胞/個体である。本発明の医薬において、患者本人の細胞あるいは組織適合型が許容範囲のドナーの細胞を用いて作成されたインスリン産生細胞、特にはゼノフリー培養系で分化誘導(製造)したインスリン産生細胞を用いることが好ましい。また、本発明の医薬の投与量(移植量)は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜変更することができる。
本発明はまた、上記した本発明のインスリン産生細胞の分化誘導方法により作製されたインスリン産生細胞を用いた糖尿病治療薬のスクリーニング方法である。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下のようにして実施される。
本発明で分化誘導したインスリン産生細胞を用い、(a)試験化合物存在下でインスリン産生細胞を培養した場合と、(b)試験化合物非存在下でインスリン産生細胞を培養した場合における、該細胞内のインスリン発現量または該細胞外へのインスリン分泌量をそれぞれ測定し、比較する方法が挙げられる。
インスリンのmRNA量の測定は、公知の方法、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、S1マッピング法、PCR法、定量RT−PCR法、DNAチップあるいはアレイ法またはそれに準じる方法に従って行うことができる。
試験化合物としては、特に制限がなく、例えば、合成化合物、天然化合物、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、ならびに、動植物または生体由来の抽出物をあげることができる。
本発明のスクリーニング方法を用いて、インスリン産生を抑制(阻害)する物質および促進する物質のいずれも検出することができる。このようにしてスクリーニングされたインスリン産生を促進する物質は、糖尿病治療薬として有用である。
(1)セルライン
ヒトiPS(hiPS)セルラインを用いた。hiPSセルラインは、国立成育医療研究センター(東京、日本)の豊田らによって確立された(Yamazoeら、J Cell Sci 26, 5391-5399, 2013)Toeを、NIBIO(日本)のセルバンクから得た。 Toeは、当初は、非特許文献11に記載の異種混入条件下で増殖させ、未分化の状態で維持した。
凍結保存されたhiPS細胞を溶解し、ゼノフリー条件下で、ゼノフリー合成足場(Synthemax II −SC基板、Corning)でコーティングされたCellBIND細胞培養皿(Corning)上で、hiPS細胞維持培地で培養した。異種含有培養での維持培地は、ペニシリン−ストレプトマイシン(50単位/mL ペニシリン、50μg/mL ストレプトマイシン、ナカライテスク)、2mM L−グルタミン(L−Gln、ナカライテスク)、1%非必須アミノ酸(NEAA、Life Technologies)、0.1mM 2−メルカプトエタノール(2−ME、Sigma-Aldrich)、20%(v/v)ノックアウト血清代替物(Kockout SR、Life Technologies)、および5ng/mLの組換えヒトFGF2(rhFGF2、Pepro Tech)を補充したKockout DMEM/F12(Life Technologies)からなる。これに対し、Knockout SRおよびrhFGF2 をそれぞれ、Kockout SR xeno−free Cell Therapy System(CTS)(Life Technologies)およびxeno−free rhFGF2(Pepro Tech)に置き換え、1% Knockout SR growth factor cocktail CTS(Life Technologies)を添加し、ゼノフリー培養のための、維持培地を調製した。未分化hiPS細胞は、手動で、細胞解離緩衝液(Life Technologies)を用いて細胞コロニーを解離させて、細胞スクレーパー(Asahi)を使用して小さなクラスタを回収することにより、3〜4日ごとに1:3の割合で継代した。細胞は、当初異種含有条件の下で拡張させ、次いで、分化に使用する前に、ゼノフリー条件下で連続して継代した。
膵臓分化は、3代継代後、未分化hiPS細胞を、TrypLE Select CTS(Life Technologies)を用いて分離した後、セルスクレーパーを用いて回収し、Synthemax II−SC Substrateでコーティングした96ウェルのCellBIND細胞培養プレート上に1×105細胞/ウェルの密度で播種した。その後、細胞を、10μM Rock 阻害剤(Y−27632、和光)を加えたゼノフリー維持培地を用いて1日間培養し、次いで、Rock阻害剤無しで、80〜90%コンフルエントになるまでさらに1〜2日間培養した。その後、細胞を、以下に示す膵臓分化のための主要なステージへと向けた:胚体内内胚葉細胞(DE、ステージ1)、原腸管細胞(PG、ステージ2)、膵臓前駆細胞(PP、ステージ3)、内分泌前駆細胞(EP、ステージ4)、およびホルモン発現内分泌細胞(EC、ステージ5)(図2参照)。
フローサイトメトリーは、Martinら(非特許文献12)に記載の方法に若干の修正を加え、異種抗原性因子N−グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)に対して行った。簡単に述べると、細胞を15分間37℃で、細胞解離緩衝液で処理して解離し、マイクロピペットを用いて単一細胞懸濁液として回収した。次いで、細胞をPBSで2回洗浄した後、0.5%(v/v)のブロッキング剤(BA、Sialix)を加えたPBS(0.5%BA/PBS)を用いて1回洗浄した。染色は、全量50μl中の1.0×106細胞を、0.5%BA/PBS中、ニワトリ抗Neu5Gc IgY抗体(Ab)(1:200希釈、Sialix)、ニワトリIgYネガティブコントロール(1:200希釈、Sialix)とともに、あるいは一次抗体なしで、60分間、4℃でインキュベートした。0.5%BA/PBSで3回洗浄した後、細胞を、0.5%BA/PBS中で、1:500希釈のAlexa Fluor 488ロバ抗ニワトリ抗体(Molecular Probes)とともに60分間、4℃でインキュベートした。フローサイトメトリーは、BD FACSCanto フローサイトメーター(BD Biosciences)で実施し、FlowJoソフトソフトウェアバージョン7.6.5(Tree Star, Inc.)を用いて分析した。
総RNAを、TRI試薬(Sigma-Aldrich)を用いて各ステージの細胞から抽出し、ゲノムDNAの混入は、デオキシリボヌクレアーゼI(Sigma-Aldrich)で消化することにより除去した。成人ヒト膵臓の総RNAは、市販品(Clontech)を購入した。cDNAは、オリゴdTおよびReverTraAce RT−試薬キット(東洋紡)を用いて、2.0μgのRNAから調製した。リアルタイムPCRに用いたプライマー配列を、その長さとともに下記の表1に示す(フォワードプライマーの配列を上から配列番号1〜30、リバースプライマーの配列を上から配列番号31〜60とする)。リアルタイムPCRは、7500FASTリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で行った。PCR増幅は、10μLの2хThunderbird SybrqPCR Mix(東洋紡)、8.5μLのミリQ水、0.5μLの0.25μMフォワードおよびリバースプライマー、および1.0μLの鋳型cDNA、を含む全量20μlの反応混合物中で行い、40サイクル(サイクル条件:50℃で2分間、95℃で10分間、および、95℃で15秒間と60℃で1分の40サイクル)で停止した。各標的遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の発現レベルに対して標準化した。
培養細胞は、4%(w/v)パラホルムアルデヒド(ナカライテスク)で固定し、PBSで洗浄し、次いでアルカリホスファターゼ緩衝液(100mMトリス−HCl[pH9.5]、100mMNaCl、50mMMgCl2、および0.1%Tween−20)とともに、室温で30分間インキュベートした。次に、発色反応を、35μg/mLの4−ニトロブルーテトラゾリウムクロライドおよび17.5μg/mLの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸(Roche Diagnostics)を用いて、暗所にて、室温で30分間行った。その後、細胞を、1mMEDTA/PBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定し、最後に画像を取得した。
細胞を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、15分間PBSで洗浄し、次いで、1%トリトンX−100(ナカライテスク)で10分間処理して透過性処理した。PBST(PBS中、0.1%Tween−20[ナカライテスク])で洗浄した後、細胞を、20%(v/v)ブロッキングワン(Blocking one)(BO:ナカライテスク)を添加したPBST(20%BO/PBST)で1時間ブロッキングし、次いで、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した:マウス抗OCT3/4(1:100、Santa Cruz Biotechnology、sc−5279);ウサギ抗NANOG(1:100、リプロセル、RCAB003P);マウス抗SSEA4(1:100、R&D Systems、BAM1435);マウス抗TRA 1−81(1:100、ミリポア、MAB4381);ウサギ抗SOX2(1:100、ミリポア、AB5603);マウス抗SSEA1(1:100、BioLegend、125603);ヤギ抗SOX17(1:100、R&D Systems、AF1924);ウサギ抗HNF3β/FOXA2(1:300、ミリポア、#07−633);ヤギ抗HNF4α(1:100、Santa Cruz Biotechnology、SC− 6556);ヤギ抗PDX1(1:100、R&D Systems、AF2419);ウサギ抗HNF6(1:100、Santa Cruz Biotechnology、sc−13050);ウサギ抗SOX9(1:200、ミリポア、AB5535);マウス抗CDX2(1:500、BioGenex、MU392−UC);マウス抗AFP(1:200、MONOSAN、MON4035);ヒツジ抗NGN3(1:200、R&D Systems、AF3444);ウサギ抗PAX4(1:200、Abcam、ab42450);ヤギ抗NEUROPED1(1:100、R&D Systems、AF2746);モルモット抗インスリン(1:500、DAKO、A0564);ウサギ抗C−ペプチド(1:200、Cell Signaling Technology、#4593);マウス抗グルカゴン(1:300、Sigma-Aldrich、G2654);ヤギ抗ソマトスタチン(1:500、Santa Cruz Biotechnology、sc−7819);ウサギ抗ソマトスタチン(1:500、DAKO、A0566);ウサギ抗膵臓POLYPEPTIDE(1:300、DAKO、A0619);マウス抗アミラーゼ(1:100、Santa Cruz Biotechnology、sc−46657);ウサギ抗UCN3(1:500、Phoenix Pharmaceuiticals、G−019−28)、ヤギ抗−ISL1(1:100、R&D Systems、AF1837);およびウサギ抗IAPP(1:200、Abacam、ab15125)。翌日、細胞を、PBSTで洗浄後、1:1000に希釈した二次抗体(Alexa Fluor 488−,568−,または633−を接合したロバまたはヤギの、抗マウス、抗ヤギ、抗ウサギ、抗ヒツジまたは抗モルモットIgG)(Molecular Probes)とともに、暗所で、室温で、2時間インキュベートした。一次および二次抗体は全て、20%BO/PBSTで希釈した。核は、4’、6−ジアミジノ−2−フェニルインドール二塩酸(DAPI、Roche Applied Science)で対比染色した。PBSTで3回洗浄した後、最終的に画像を、ImageXpress Microスキャニングシステム(Molecular Devices、日本)で取得し、MetaXpress細胞画像解析ソフトウェア(Molecular Devices、日本)を用いて定量分析を行った。
ステージ5の終わりの分化した細胞を、最初に、最小必須培地、2.5mMグルコースおよび1%B27 Supplement XenoFree CTSを含有するDMEM(Life Technologies)で30分間、37℃でインキュベートした。この最初のインキュベーションは洗浄として扱った。その後培地を捨て、次いで、ウェル当たり100μlの2.5mMのグルコースを含有するDMEMで、37℃で1時間インキュベートした。上清を回収し、同一の細胞をさらに、20mMグルコースを含有するDMEMまたは2.5mMのグルコースを含有するDMEMに、さらに種々の刺激因子、例えば、2μMの(−)−Bay K8644(Sigma-Aldrich)、100μMのトルブタミド(和光)、250μMのカルバコール(Sigma-Aldrich)、0.5mMのIBMX、または30mMの塩化カリウム(KCl)(和光)を添加した培地にて、1時間培養した。上清を再度回収し、分析まで−20℃で保存した。最後に、1%プロテアーゼインヒビターカクテル(ナカライテスク)を含有するPBS中の0.01%トリトンX−100を用いて細胞を溶解し、細胞内のC−ペプチドおよびタンパク質レベルを定量した。C−ペプチドレベルは、ヒトC−ペプチドELISAキット(ALPCO Diagnostics)を用いて、製造者の指示に従って測定した。細胞溶解物中の全タンパク質は、BIO−RAD試薬キット(Bio-Rad Laboratories)を用いて定量した。C−ペプチドの量は、全タンパク質の対応する量に対して標準化した。
実施例1:ゼノフリー条件での未分化hiPS細胞の自己複製および維持
(A)(2)に従って、ゼノフリー条件下で、未分化hiPS細胞を継代した。その結果、ヒト多能性幹細胞培養物の異種汚染の指標であるN−グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)のレベルが、2継代(P2)後は、ゼノフリー条件で増殖したhiPS細胞において検出できないレベルまで低下したことを見出した。ゼノフリー条件で増殖したhiPS細胞(P3)は、アルカリホスファターゼ染色およびOct4、NANOG、SOX2、TRA1−81およびSSEA−4の発現によって確認したところ、それらの指標は、異種含有条件(P0)で増殖したhiPS細胞のそれと同様であり、自己複製および多能性を維持していることが確認された。hiPS細胞分化に関連したマーカーであるSSEA1の発現は検出できず、このことは、hiPS細胞がゼノフリー条件で未分化状態に維持されていることを示唆している。図1に示すように、ゼノフリー条件で約30継代まで増殖したhiPS細胞は、シャープなエッジ、フラットそして密に詰まったコロニーの構造という多能性幹細胞の特徴である、独特の形態を示した。従って、本発明者らが見出したゼノフリー系は、hiPS細胞の多能性を維持しつつ、細胞を、非ヒト由来因子からの汚染なしの状態にするのに有効であることが判った。
段階的にプロトコルを最適化することで、ゼノフリー条件下で、hiPS細胞を膵臓ホルモン発現細胞へと分化させる5段階のプロトコルの開発を試みた。上記(A)(3)に記載の条件にて、未分化hiPS細胞から内分泌細胞への分化を行った。分化の5段階のプロトコルの概略を図2に示す。
最初に、ゼノフリー条件で、膵臓を生じる胚細胞層である胚体内内胚葉細胞を作製することにした。ステージ1では、hiPS細胞を、アクチビンA、およびGSK3β特異的阻害剤であるCHIR99021とともに2日間培養し、次いで、アクチビンAのみで3日間培養して、胚体内内胚葉細胞(DE)への分化を誘導した。図3に示すように、ステージ1の終わりで、殆どの細胞はSOX17/FOXA2二重陽性細胞(全細胞の71.7±2.8%)に分化し、DEマーカー遺伝子であるSOX17の転写物を発現していたが、一方、未分化hiPA細胞マーカー遺伝子であるOCT4は著しく減少していた。
ステージ3の培地で200ng/mLのNOGGINを添加した場合は、PDX1陽性細胞の約62%がHNF6と共発現しており、約59%がSOX9と共発現していた一方、全DAPI陽性細胞の、たった8%の細胞がCDX−2陽性であり、4%の細胞がAFP陽性であった(図5上パネル、図6)。これらの結果より、高濃度のNOGGINは、膵臓への分化を誘導する一方、他の分家系等への分化を抑制した。このことは、高濃度のNOGGINは、効率的に膵臓前駆細胞への分化を導いたことを示唆している。
Alk5i(TGF−βI型アクチビン受容体キナーゼ−4,5,7阻害剤)、NOGGIN、およびプロテインキナーゼC活性化因子の処理が、膵前駆細胞から内分泌前駆細胞(EP)への分化を促進することが報告されている(非特許文献5)。ゼノフリー系において、これらの因子を用いて膵前駆細胞からNGN3陽性内分泌前駆細胞への分化を試験した。各遺伝子の発現を定量RT−PCRおよび免疫細胞化学分析により確認した。定量RT−PCRの結果を図7に、免疫細胞化学分析の結果を図8および9に示す。ステージ4の培地に、Alk5i、200ng/mLのNOGGIN、およびILV(プロテインキナーゼC活性化因子)を添加したときに、NGN3転写産物が顕著にアップレギュレートされた一方、AFPおよびCDX2転写物がステージ3細胞と同レベルに維持されていた(図7)。しかしながら、ステージ4の培地において、NOGGIN無しまたは低濃度のNOGGINを添加したときは、AFPおよびCDX2転写物はステージ3と比べて増加し、そしてAFPおよびCDX2陽性細胞が表れた(図7、図8)。200ng/mLのNOGGINは、膵臓前駆細胞の内分泌前駆細胞への分化を案内しながらAFPおよびCDX2陽性細胞の再出現を抑制するために必要であることが判った。
次に、内分泌前駆細胞からインスリン(INS)発現細胞への分化を行った。ステージ5において、培地に、エキセンジン−4(GLP−1受容体のペプチドアゴニスト)、ニコチンアミド、IBMX(ホスホジエステラーゼ阻害剤)、およびフォルスコリン(FRKL、アデニル酸シクラーゼ活性化因子)を添加した。各遺伝子の発現を定量RT−PCRおよび免疫細胞化学分析により確認した。定量RT−PCRの結果を図10に、免疫細胞化学分析の結果を図11および図12に示す。定量RT−PCRの結果は、分化した細胞が、INS、グルカゴン(GCG)およびソマトスタチン(SST)転写物を発現したことを示したが、GCGの発現レベルは、INSおよびSSTと比較して、すべての条件において非常に低かった(図10)。
また、定量RT−PCRを用いて、4つの全ての条件における細胞の、β細胞特異的マーカー、例えば、PDX1、NKX6.1、MAF−A、ISL−1、UROCORTIN−3(UCN3)、GLUKOKINASE(GCK)、膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)およびSLC30A8のmRNA発現を評価した。結果を図13に示す。DMSO−誘導細胞よりもIBMX誘導分化細胞において、これらの全て条件でβ−細胞成熟遺伝子の発現レベルが有意に高かった。
誘導されたINS発現細胞の成熟β細胞特性を確認するために、様々なインスリン分泌促進物質に対して応答させた分化した細胞内のC−ペプチド分泌を試験した。結果を図15に示す。塩化カリウム(KCl)の添加による細胞の直接の脱分極は、1時間のインキュベーション中の分泌C−ペプチドを〜8.3倍に増加させた。細胞内の機能的KATPチャンネルの存在は、KATPチャネル遮断薬であるトルブタミドを添加した基準レベルに対してC−ペプチドの放出が〜3.0倍に増加したことから裏付けられる。L型VDCCアゴニストである(−)BAY K8644の処理は、C−ペプチド放出を〜4.9倍び刺激し、このことは、VDCC(s)の機能的な活性化を示唆している。さらに、インスリン分泌に影響を及ぼすcAMPに対する細胞応答性を評価した。IBMX(ホスホジエステラーゼ阻害剤)を用いたcAMPレベルの増加は、約4.9倍の増加を示し、そしてカルバコール(ムスカリン作動薬)処理は、分泌されたC−ペプチドレベルを約7.0倍に増加した。結果を図15に示す。免疫細胞化学分析はまた、多くのINSポジティブまたはCPポジティブ細胞がβ細胞成熟マーカーである、UROCORTIN−3(UCN3)、IAPPおよびISL1を共発現していることを示した。結果を図16に示す。これらの結果は、培養中に誘導されたINS発現細胞は、機能的に成熟していたことを示唆している。
hiPS細胞由来の細胞を適切に導き、INSシングルポジティブ細胞へと分化させるキーとなる因子を検討したところ、NOGGINとIBMXが協同して、hiPS由来細胞からINS発現細胞への分化を高めることが判った。ステージ3と4で200ng/mLのNOGGIN(Nog 200)を添加し、そしてステージ5でIBMXを添加した場合のみ、INSの転写物発現が有意にアップレギュレートされたが、NOGGIN不存在では、hiPS由来細胞は、非常に低いレベルのINSしか発現しなかった(図17)。
免疫細胞化学分析の結果は、INSポジティブ細胞は、NOGGIN不存在では殆ど検出されなかったが、NOGGINを200ng/mL添加すると、NOGGINを100ng/mL添加した場合に比べて高割合のEC細胞をもたらすことを示した(図18、図19)。IBMXと200ng/mLのNOGGINの添加は、さらに、INS−シングルポジティブ細胞の割合を増加させた。分化誘導工程においてIBMXと高濃度のNOGGIN(200 ng/mL)を用いた場合に、C−ペプチド含量およびGSIS活性もまた有意に増加した(図21)。上記の結果は、NOGGINとIBMXが協同して、hiPS由来細胞のINS産生細胞への分化を促進し制御していることを支持している。
分化した細胞における非ヒト由来の汚染の程度を、Neu5Gcの発現を検出することによって評価した。フローサイトメトリーの結果、ゼノフリー培養条件を用いた場合に、ステージ4およびステージ5の終わりにて、Neu5Gcの発現は検出できなかった。このことは、本発明で用いた分化誘導系がゼノフリーであることを示している。また、他の市販のゼノフリー足場上で、膵臓分化を検討したところ、CELLstart(フィブロネクチンから成る)およびrhVTN基質から剥がした細胞は、大きな塊を形成することを見出した(図21)。したがって、CELLstartおよびrhVTNは、長期の分化培養において、Synthemaxほど適していなかった。さらに、膵臓系譜への分化効率も、CELLstartまたはrhVTNよりもSynthemaxが優れていた。このことは、PDX1、HNF6、NKX6.1、HLXB9およびINSの有意に高い発現、およびAFPおよびCDX2遺伝子の有意に低い発現によって示された(図22)。
Claims (23)
- 幹細胞を、以下の工程(1)〜(5)で培養することを特徴とする、インスリン産生細胞の分化誘導方法:
(1)幹細胞を、(1−1)アクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤およびGSK3阻害剤を含む培地で培養し、次いで、(1−2)アクチビン受容体様キナーゼ−4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られた細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤およびFGFを含む培地で培養する工程、
(3)前記工程(2)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、
(4)前記工程(3)で得られた細胞を、TGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、
(5)前記工程(4)で得られた細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程。 - 前記工程(1−2)の培地が、実質的にGSK3阻害剤を含まない培地である、請求項1に記載の分化誘導方法。
- 前記工程(3)および(4)におけるBMPシグナル伝達阻害剤がNOGGINであり、工程(5)のホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、請求項1または2に記載の分化誘導方法。
- 工程(3)および工程(4)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも100ng/mL以上である、請求項3に記載の分化誘導方法。
- 工程(3)および工程(4)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも200〜500ng/mLである、請求項4に記載の分化誘導方法。
- 工程(3)が、さらにTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤を含み、工程(4)が、さらにプロテインキナーゼC活性化因子を含み、工程(5)が、さらにGLP−1受容体アゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子を含む、請求項1〜5のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 工程(3)におけるレチノイン酸アゴニストがレチノイン酸であり、工程(2)および(3)におけるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤がKAAD−シクロパミンである、請求項1〜6のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 工程(3)におけるTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤がSB431542であり、工程(5)におけるGLP−1受容体アゴニストがエキセンジン−4である、請求項6または7に記載の分化誘導方法。
- 上記工程(1)〜(5)の全てを、ゼノフリー培養系で行うことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 幹細胞由来の内胚葉細胞を、以下の工程(a)〜(d)で培養することを特徴とする、インスリン産生細胞の分化誘導方法:
(a)内胚葉細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤およびFGFを含む培地で培養する工程、
(b)前記工程(a)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、
(c)前記工程(b)で得られた細胞を、TGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、
(d)前記工程(c)で得られた細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程。 - 前記工程(b)および(c)におけるBMPシグナル伝達阻害剤がNOGGINであり、工程(d)のホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、請求項10に記載の分化誘導方法。
- 工程(b)および工程(c)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも100ng/mL以上である、請求項11に記載の分化誘導方法。
- 工程(c)および工程(d)におけるNOGGINの濃度が、200〜500ng/mLである、請求項12に記載の分化誘導方法。
- 工程(b)が、さらにTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤を含み、工程(c)が、さらにプロテインキナーゼC活性化因子を含み、工程(d)が、さらにGLP−1受容体アゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子を含む、請求項10〜13のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 工程(b)におけるレチノイン酸アゴニストがレチノイン酸であり、工程(a)および(b)におけるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤がKAAD−シクロパミンである、請求項10〜14のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 工程(b)におけるTGF−βI型アクチビン受容体様キナーゼ−4,5,7阻害剤がSB431542であり、工程(d)におけるGLP−1受容体アゴニストがエキセンジン−4である、請求項14または15に記載の分化誘導方法。
- 上記工程(a)〜(d)の全てを、ゼノフリー培養系で行うことを特徴とする、請求項10〜16のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)またはヒトの体性幹細胞である請求項1〜17のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
- 請求項1〜18のいずれか一つに記載の方法で得られたインスリン産生細胞。
- 請求項19の細胞を含む医薬組成物。
- 請求項1〜18のいずれか一つに記載の方法で得られたインスリン産生細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
- インスリン産生細胞を被験物質とともに培養する工程を含む、請求項21に記載のスクリーニング方法。
- さらに細胞によるインスリン分泌を検出する工程を含む、請求項22に記載のスクリーニング方法。
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