JP2009207491A - 単純ヘルペスウイルスに対するアプタマー - Google Patents
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Abstract
【解決手段】HSV-1単純疱疹ヘルペスウイルス(HSV-1)のgDプロテインに結合能を有するRNA分子アプタマーをSELEX法を用いて作成するとともに、さらにこれは短縮化してアプタマーとする.このアプタマーは、HSV-1に対し特異的であり、該ウイルスの宿主細胞への侵入を阻害する。
【選択図】なし
Description
(1)配列番号1または28に示す塩基配列を含むか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有することを特徴とするアプタマーRNA。
(2)配列番号2〜6及び27のいずれかで示される塩基配列からなるか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有することを特徴とするアプタマーRNA。
(3)配列番号2〜5及び27のいずれかで示される塩基配列において、これら塩基配列中、以下の共通配列における9番目のAがUに置換されている塩基配列からなるか、あるいは該置換塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有することを特徴とするアプタマーRNA。
CACGAGAGAG GUCGUCCCCA GGGGAGAACU CGUGC
(4)アプタマーRNAが、化学修飾されたヌクレオチドを有することを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかに記載のアプタマーRNA。
(5)ヌクレオチドにおけるリボース部位の2’位がフルオロ基(2’-F)またはメトキシ基(2’-OMe)により修飾されているか あるいは水素で置換されている(2’-deoxy)ことを特徴とする、上記(4)に記載のアプタマーRNA。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載のアプタマーRNAが、その3’および/または5’末端がインバーストデオキシチミジン(idT)あるいはポリエチレングリコール(PEG)により修飾されていることを特徴とするアプタマーRNA。
(7)配列番号7に示す塩基配列を含むか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA。
(8)配列番号8〜12及び29のいずれかで示される塩基配列からなるか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA 。
(9)配列番号8〜12及び29のいずれかで示される塩基配列において、これら塩基配列中、以下の共通配列における9番目のAがTに置換されている塩基配列からなるか、あるいは該置換塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA。
CACGAGAGAG GTCGTCCCCA GGGGAGAACT CGTGC
(10)上記(7)〜(9)のいずれかに記載のDNAと相補の塩基配列を有するDNA。
(11)上記(7)〜(9)のいずれかに記載のDNAと、その相補のDNAがハイブリダイズした2本鎖DNA。
(12)上記(1)〜(3)のいずれかに記載のアプタマーRNAと相補の塩基配列を有するRNA。
(13)上記(1)〜(6)のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として含有することを特徴とするHSV−1検査薬。
(14)上記(1)〜(6)のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として含有することを特徴とするHSV−1に対する抗ウイルス剤。
以上の点から、本発明のアプタマーは、特に抗HSV-1剤としてリード化合物になりうるものであって、その医薬開発等において大いに貢献するものである。
本発明のアプタマーは、SELEX法により得られた24クローン由来のものであって、その一方は、少なくとも配列番号1または28に示される塩基配列を含むRNAを包含する。さらに具体的なアプタマーRNA分子は、例えば、配列番号2〜5あるいは27に示される塩基配列からなるRNAが挙げられる。これら配列番号2〜5に示されるRNAは、上記配列番号1の塩基配列を共通に有し、さらに、配列番号27に示される塩基配列からなるRNAをも含めて、これらRNAは配列番号28の塩基配列を有する点で共通している。また、この他のアプタマーは、配列番号6に示される塩基配列からなるRNAである。
また、本発明のアプタマーには、上記配列番号2〜5あるいは27のRNA分子における共通配列(配列番号28)部分の9番目のアデニン塩基(A)をウラシル塩基(U)に変更したRNAを含む。これにより、上記gDドメインに対する結合活性が増大する。
exponential enrichment)法により得られたものである。
SELEX法は、ランダム配列の核酸ライブラリの作成から出発し、標的とするタンパク質との結合性を指標に選別して、PCR増幅するサイクルを複数回繰り返すもので、これにより、標的とするタンパク質に対し高い結合能を有する核酸のみを選別することができる。上記選別及びPCR増幅はそれぞれ、自然界における「淘汰」及び「増殖」に相当し、自然界における進化を試験管内で短時間に再現させるものである。
本発明においては、配列中央の74塩基をランダム領域とするDNAライブラリー(配列番号13)を合成し、PCR増幅した後、逆転写してRNAプールとし、このRNAプールに対し、上記gDタンパク質と結合するRNAを選別、増幅し、このサイクルを複数回繰り返すことにより、該gDタンパク質に対して特異性及び結合性の高い、配列番号5および6に示されるアプタマーを得たものであり、本発明においては配列番号5に示すアプタマー(アプタマー1)をさらに短縮化して、配列番号2〜4に示されるミニアプタマーRNAを得ており、これらはいずれもgDタンパク質に対する結合能を有するが、この中でも44merのミニアプタマー3がgDタンパク質に対し特に高い結合能を有する。一方、これらはインビトロ転写法により得られているが、化学合成法により得られたより短い41merのアプタマーHV1-41(配列番号27)もgDタンパク質に対する結合能を有し、さらに該配列番号27に示される塩基配列中9番目のアデニン塩基をウラシル塩基に変換したアプタマーHV1-41-II(配列番号25)は、HSV-1のgDドメインに対する結合活性が顕著に増大するという結果が得られている。この結果から、上記配列番号27における上記アデニン塩基と対応する、配列番号2〜5のアプタマーの上記共通配列部分における9番目のアデニン塩基をウラシル塩基に置換することにより、同様にgDドメインに対する結合活性が増大すると考えられる。
インビトロ転写法:合成目的のアプタマーRNAに対応する上記DNAを化学合成し、これをPCR増幅し、増幅されたDNAからRNAポリメラーゼによる転写反応によりアプタマーRNAを合成する。例えば、T7プロモータの下流側に上記DNAを連結してPCR増幅し2本鎖DNAを得て、該2本鎖DNAを鋳型として、T7RNAポリメラーゼ、およびATP、GTP、CTP及びUTPからなる該RNAポリメラーゼ基質を含む反応溶液中で、RNA伸長反応を行うことにより、アプタマーRNAを得ることができる。
化学合成法:RNAの合成には、リボース部位の2'水酸基の保護が必要であり、保護基として種々のアミダイトが開発されてきており、最近開発された2-cyanoethoxymethyl (CEM) 基を用いるとRNA合成時の鎖長伸長反応の効率が高くなり、100 merを超える長鎖RNAの合成も可能となる。本発明のアプタマーRNAはこのような化学合成法を用いて合成することができる。
また、このほか、上記アプタマーRNAと相補のRNAからは、RNA依存RNAポリメラーゼを使用することにより本発明のアプタマーRNAを得ることも可能である。
本発明においては、さらにアプタマーRNAの3’および/または5’末端をインバーストデオキシチミジン(idT)あるいはポリエチレングリコール(PEG)により修飾することもでき、これらにより、アプタマーRNAの耐リボヌクレアーゼ耐性はさらに向上し、生体中での分解による活性の低下が抑制され、生体内で有効な抗ウイルス作用を発揮させることが可能となる。
本発明のアプタマーRNAはHSV-1ウイルスの検査薬乃至検出剤として用いられる。例えば、本発明のアプタマーRNAをフルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド等の蛍光色素で標識し、被験試料と接触、結合反応を行い、結合しなかったものを除去した後、蛍光あるいはその強度を検出、測定することにより、HSV-1ウイルスの検出、あるいはその量を測定できる。この際、例えば、標識アプタマーRNAあるいは被験試料のいずれかを固定化した基板を用いて行うことができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
(1)ウイルスタンパク
組み換えHSV−1gDタンパク質は、CORTEX BIOCHEM (CA, USA)から購入した、319アミノ酸配列を発現するPichia pastorisから調製された。一方、HSV-2 gDは、Drs. Jerry P. Weir and Clement Meseda from DVP, OVRR/CBER/FDA, Rockville, MD, USAから提供された。これらの配列はpET20b (Novagen)にサブクローン化し、E. coli.sで発現させた。発現タンパク質は、Mono-Q カラムに続きニッケル樹脂によりさらに精製された。
中央の74塩基をランダム領域とする一本鎖DNA(ssDNA)のライブラリーをDNA自動合成機を用いて合成してテンプレートとし、同様に、DNA自動合成機を用いて以下の配列を有するDNAを合成し、5‘プライマー及び3’プライマーとし、PCR増幅した。
TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCACTGC--N74---GGCACCACGGTCGGATCCTG, (配列番号13)
なお、上記配列中の下線部分はT7プロモータ領域である。
〔5’末端プライマー〕
5’-TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCACTGC-3’(配列番号14)
〔3’ 末端プライマー〕
5’-CAGGATCCGACCGTGGTGCC-3’(配列番号15)
次いでT7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies)を用いて、インビトロでの転写を行い、増幅されたDNAライブラリーをRNAライブラリーに変換した。
選別は、上記(2)で得られたRNAライブラリー15 μg (〜1014 RNA molecules)を用い、RNAライブラリーと上記(1)で得られた各精製タンパク質とをモル比で2:1の割合で含むRNA 結合用緩衝液 (50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 7.5)中で行った。選別サイクルの間、タンパク質濃度は、高い親和性を有するRNAを選別するためのサイクルの後になるほど減少した。RNAは、選別サイクルの後、95℃に加熱後、安定な構造を形成させるため室温に冷却した。選別サイクルにおいては、非特異的に結合するRNAを除去するためコンペティターとしてtRNA ( E. coli,のトータルtRNA (Boehringer-Mannheim))を用いた。
以下においては、RNAのHSV-1gDタンパク質に対する特異性と高い親和性を有するRNAを得るために、各選別サイクルを行った。これらサイクルにおいては、RNA:タンパク質比、コンペティター濃度及び緩衝液量についての修正を含む。
非特異的に結合するRNAの濃縮を避けるために、第3、第5、7及び第8の各世代の選別には、フィルターではなくxenobindプレート(xenopore社)を使用した。Xenobind選別のために、最初にRNA結合用緩衝液1mlあたり上記gDタンパク質5 μgで各ウエルをコートし、残りの部分をBSA (3% stock solution)でブロックした。次いで、各ウエルを洗浄し、選別に使用した。選別においては、2回目のサイクルで得たRNAプールを、90℃2分間変性させ、次いで異なる構造体の平衡を促進するため室温で10分間冷却した。
個別のアプタマーを得るために、サイクル8で得られたPCR産物を、マニュファクチュアズプロトコールに従い、直接ベクターpCRII (Invitrogen)に連結した。DNAは、アルカリミニプレップ法により個別のクローンから分離され、DNA シーケンサー (Model 373A, ABI)で、ダイターミネータシーケンシングキット(Applied Biosystems Inc. (ABI))を用いてその塩基配列を調べた。アプタマーの2次構造は、BayesFold プログラム (version 1.01)により予想した。上記個別のアプタマーと同様に、異なる選別サイクルから得られたRNAプールの結合活性を評価するため、 [γ-32P]ATPを使用して放射性標識(ラベル)したRNAを調製し、以前報告した(非特許文献11、12,13)方法と同様のフィルター結合分析を用いて行った。
フィルターは1mlの上記結合用緩衝液で洗浄し、空気中で乾燥し、放射線強度は、イメージアナライザー(BAS2500, 富士フイルム)で定量した。結合が特異的であることを確認するため、非特異的コンペティターとして、結合反応においてRNAを10倍モル過剰量加えた。さらに、結合及び識別分析は、先行記述(非特許文献14)に従い、表面プラズモン共鳴装置(SPR)でも行った。
上記取得したクローンの配列解析により、アプタマーはaptamer-1とaptamer-5の2つのクラスに分けられた。
アプタマー1及びアプタマー5は以下に示される。
HSV-1gDとHSV-2-gD ectodomainのアミノ酸配列は84%の相同性があるが、フィルター結合分析によれば、HSV-2-gDとの結合は見られなかった。また、BIACOREを用いたSurface Plasmon Resonance(SPR)においても、やはり結合は見られなかった。したがって、アプタマー1及び5の結合能は、HSV-1gD に特異的である。
(1)安定なアプタマーの製造
選別のために使用された最初のプールは、2’-OH 基を含有するRNAを持つように調製された。すなわち、安定なRNAを製造するため、選別されたクローンは、転写工程において2’-フルオロ基で修飾されるよう調製した。2’-フルオロ基によるピリミジン位置の化学修飾は、それらの寿命を延ばすために、シチジン及びウリジンの修飾によりなされた。選別されたアプタマーは、選別プロセスにおいて使用したプライマーと同じプライマーにより増幅された。プライマーの塩基配列は以下に示される。
3’末端プライマー;5’-CAGGATCCGACCGTGGTGCC-3’(配列番号17)
得られたdsDNAは、T7 Durascribe kit (Epicentre Technologies)を使用して、37℃で1晩のインキュベーションを行って、インビトロ転写により安定なRNAに変換された。そして転写されたRNAは上記[0029]と同じ方法により精製された。
従って、この後の実験では、aptamer-1を用いた。また、比較対象のため、aptamer-1と相補的な配列をもつaptamer-1Cも利用した。
(1)リン酸基修飾と干渉解析
選択したアプタマーのどのサイトがgD結合部位であるかどうかを同定するためにリン酸基修飾解析を行った。実施例1でIn vitro転写で得られたRNA(aptamer-1)を子ウシのフォスファターゼで一時間37℃で処理した後に、フェノールで抽出し、エタノールで沈殿した。RNAは[γ-32P]ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼでラベルし、8% polyacrylamide/7 M urea gelで電気泳動を行った。ラベルしたRNAは95℃で2分間熱して構造をほぐし、室温までゆっくり冷却して正しく折りたたまれた構造に戻した。5’末端をラベルした RNA (1100 Kcpmのカウントをもつ) を緩衝液(20 mM HEPES, pH 8.0, 1 mM EDTA, 2.5 μg tRNA)で溶かし、N-nitroso-N-ethyl-ureaで飽和した5 μlのエタノールで混合した。90°Cで2分間修飾反応し、15 μg のcarrier tRNAを加えて反応を止めた。
なお、N-nitroso-N-ethyl-ureaはリン酸基と反応し、Phosphotriesterをつくり、これはアルカリ処理により容易に加水分解できる。
テンプレート
5’- GGGCACGAGAGAGGTCGTCCCCAGGGGAGAACTCGTGCC -3’ (配列番号18)
プライマー
5’- AGTAATACGACTCACTATAGGGCACGAGAGAGGTCGTCCCCA -3’(配列番号19)
5’- GGCACGAGTTCTCCCCTGGGGT -3’(配列番号20)
Mini-2 aptamer
実施例1により得られたクローン1(アプタマー1)
プライマー
5’- AGTAATACGACTCAC TATAGGGCCTTCACTGCACGAGAGAGG -3’(配列番号21)
5’- GCCTCCAGGAGCACGA GTTCT -3’(配列番号22)
Mini-2 aptamerのHSV-1-gD結合部位を調べるためにIn-line probing法を試みた。
上記(1)で得られたmini-2 aptamerの3’末端を、32pラベルしたpCpとRNA ligase (Krol and Carbon, 1989)によりラベルした。ラベルしたmini-2 aptamer は5 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8.3、25°C) 、100 mM KClを含む溶液で25°Cで40時間反応させた。
この際、タンパク質を加える場合と加えない場合に分け、ある場合はタンパク質濃度を100-300nMに変化させた。それぞれの反応後、分解産物は12% denaturing (7 M urea) PAGEで分解し、autoradiographyを行った。
これによれば、G29,G30,∪34,C38,A39,G40,A44残基の3’末端側リン酸基に開裂が見られる。特にC38の場所で強い開裂が見られ、この場所でのHSV-1-gDとの結合が示唆された。
分解物フラグメントとHSV-1-gDとの結合を調べ、5’末端あるいは3’末端からどの程度の長さがあれば結合するかを以下のようにして調べた。
aptamer−1の3’末端と5’末端の両方から行った。3’末端をラベルしたaptamer−1と5’末端のラベルしたルaptamer−1は10% polyacrylamide/7 M ureaゲルを用いて電気泳動した。ラベルしたこれらRNAはアルカリ加水分解緩衝液(Ambion) と3 μg のyeast RNA で95℃、15分間反応させ、部分加水分解した。反応は3M酢酸ナトリウム(pH5.2)で中和し、エタノール沈殿した。100kcpmのカウントをもつラベルしたRNAは500 nMのHSV1-gDと室温で10分間、結合用緩衝液中で反応させた。複合体はnitrocelluloseフィルターで分離し、結合した分子は7M尿素を含む緩衝液を加えて95℃、2分間反応して回収し、エタノール沈殿後10% polyacrylamide/7 M ureaゲル上にロードした。確認のため、アプタマーのアルカリ加水分解とRNase T1分解物は同時に電気泳動した。ゲルを乾燥しX線照射しautoradiographyを行った。
実施例1により得られたクローン1(アプタマー1)
プライマー
5’- AGTAAT ACGACTCACTATAGGGCACGAGAGAGGTCGT -3’(配列番号23) 及び
5’- CCAGGAGCACG AGTTCTC -3’(配列番号24)
一方、アプタマー1の2次構造の最初のモデルはBayesFoldで作成したが、これを確かめるために、リボヌクレアーゼT1による加水分解場所を解析した。この結果は、最初の2次構造モデルをサポートするものではなかった。顕著な加水分解場所は、G27,G29,G30であった。一方、single strandと予想されたG40,G42は加水分解がない、あるいはわずかな加水分解しか見られなかった(図14)。以上から、mini-3アプタマーはpseudoknot様構造(図13)をとると予想された。
結合阻害解析
(1)アプタマー1と、比較としてアプタマー1C(アプタマー1と相補の配列)について、以下に示すようにCC50、IC50を求め、SIを算出した。
培養細胞(Vero cells)はアプタマー1とアプタマー1C(アプタマー1と相補の配列)の濃度を変えながら、5%FBSを含むMEM培地及び無血清MEM培地で、それぞれ37°Cで72時間培養した。生存細胞数はトリパンブルー染色法により決定した。阻害データは、CC50(50%細胞毒性濃度)を基に濃度−応答カーブでプロットした。
培養したベロ細胞には、HSV-1の細胞当たり0.1 プラーク生成ユニットで (PFU)で感染する。PBSで3回洗浄後HSV-1あるいは HSV-2を含む保持剤(MEM + 2 % FBS)中で20-24時間培養した。ウイルス生成はベロ細胞の単層上のプラークを基に決定した。抗ウイルス活性はIC50で表した。
上記試験により得られたCC50及びIC50から、SI( CC50/IC50)算出した。なお、一般的には化合物やアプタマーのSI値が10以上のとき、効き目がある抗ウイルスと評価できる。
結果を表2、図16に示す。これによれば、アプタマー1は、IC50は充分低く、抗ウイルス活性を有していることは明らかであり、他方、細胞毒性は認められず、選択指数は10を超えていた。他方、アプタマー1と相補の配列を有するアプタマー1CはIC50及びCC50とも10以上であり、選択指数は極めて低いものであった。
(1)アプタマーの抗ウイルス作用の解析
ウイルスと宿主細胞との間の相互作用を阻害するアプタマー能について、Aptamer-1の受容体への結合阻害、ウイルスの宿主細胞への侵入阻害について以下の方法で調べた。
ベロ細胞懸濁液(1 × 10-4 細胞/25 μl), HSV-1 (1 × 10-4 PFU/25 μl) とaptamer-1あるいは aptamer-1C (0.2, 2 μM)をそれぞれ氷上で3時間冷やした後に、それぞれ25 μl、但しaptamer-1及び aptamer-1Cは50 μlをそれぞれ混合し、4°Cで1時間反応させた。細胞は氷冷したリン酸塩緩衝液(PBS)で3回洗浄後、フリーのウイルスとアプタマーを除いた。細胞ペレットは氷冷PBSで10-100倍に薄めた直後に、ベロ細胞の単層に加えた。その上に、プラーク解析のために、0.5% メチルセルロースを含む試薬を加えた。結果を表4に示す。これによれば、検出されたプラーク数はアプタマーを加えなかった場合と、アプタマーを使用した場合とでほとんど差違がなく、アプタマー1は、細胞表面のウイルス受容体にはほとんど結合しないことが明らかである。
氷上で前もって3時間冷やした、24穴プレート中のベロ細胞単層は、HSV-1 (約100 PFU/穴) を用い、aptamer-1あるいは aptamer-1C の存在下または非存在下において4℃で1時間感染させた。氷冷PBSで3回洗浄後、ベロ細胞単層はアプタマーを含む溶液により37℃で反応させた。その0, 0.5, 1, 2, 3, 6時間後、細胞単層は40 mM クエン酸緩衝液(pH 3.0)で1分、非侵入ウイルスを不活性化する処理を行った。その上にプラーク解析のために、0.5% メチルセルロースを含む試薬を加え、2日後に侵入ウイルスをプラークとして検出した。結果を表5に示す。これによれば、アプタマー1は、特に1.0μM濃度で、出現するプラーク数が抑制されており、ウイルスの宿主細胞への侵入を阻害していることが明らかである。また、このことから、アプタマー1はgDタンパク質のC-末端に結合すると考えられる。
aptamer-1あるいは aptamer-1Cによる、ウイルス粒子を直接不活性化する効果を決めるために、HSV-1 (2 × 104 PFU/25 μl) を当容積のaptamer-1 あるいはaptamer-1C (10, 20 μM)で37°C、1時間処理した。混合液はアプタマー効果を無視するため100倍に薄め、ベロ細胞単層に加え、1時間室温で放置した。プラーク解析のために、0.5% メチルセルロースを含む試薬を加えた。結果を表6に示す。この結果から明らかなように、アプタマー1は、ウイルス粒子に対する直接効果はほとんどない。
アプタマーが宿主細胞に非特異的に結合しているかどうかを決めるために、ベロ細胞単層を35mmシャーレに置き、aptamer-1 あるいは aptamer-1C (0.1, 1, 10 μM)で 37°C、1時間処理した。アプタマーを除くため、PBSで3回洗浄後、細胞単層はHSV-1 (100 PFU/皿)で1時間、室温で感染させ、出現するプラークを数えた。結果を表7に示す、これによれば、アプタマー1を使用した場合と使用しない場合とで、プラークの出現数はほとんど差がなく、アプタマー1は、Vero細胞に直接作用して、該細胞自体に耐ウイルス作用を付与するものではない。
(1)In vivoにおける抗ウイルス実験
25 μl HSV-1 (2 × 105 PFU)は、1 μl RNase阻害剤の存在下で、25 μl の試料(PBS, 10 μM aptamer-1, 10 μM aptamer-1C)とそれぞれ混合した。BALB/c マウス (♀, 5-週齢, n = 3)を用い、各混合試料で膣内注射した。感染(p.i.)の3日と5日後、膣内を洗浄(100 μl/マウス)し、個々のマウスのプラーク解析を行った。ヘルペス性病変と死の記録を2週間行った。
結果を表8に示す。これによれば、PBSのみあるいはaptamer-1Cの使用によって死んだマウスはなく、この点では区別がつかなかったが、アプタマー1含有混合試料においては、マウスのプラーク数は、他と比べて減少しており、マウスを使った実験でも、Aptamer-1は抗HSV-1活性をもつことが判明した。
(1)アプタマーの置換体の作製
アプタマーの結合能、安定性、アプタマー作製のコストダウンに関して最適化アプタマーを得るため、アプタマー残基の置換および修飾を行った。まず置換体の作製は、図13のpseudoknot様構造をもつアプタマーを出発材料にし、化学合成法により行った。5’末端の3個のGはインビトロ転写法による合成の際に必要であったが、化学合成法では不要なため除き、残基番号を改めて割り振りふった(図17のHV1-41(配列番号27))。実施例3において、gDタンパク質との結合が予想されたループ領域のうち、A7からG11に至る残基をそれぞれ置換したところ、A9をUに置換したHV1-41-II(図17)は結合活性が増大した。HV1-41-IIの配列を以下に示し、その2次構造モデルを図17に示す。
アプタマーHV1-41-II(配列番号25)
5’- CACGAGAGUGGUCGUCCCCAGGGGAGAACUCGUGCUCCUGG-3’
RNAはリボース部位2’位に水酸基(2’-OH)をもち、特にピリミジンヌクレオチドはribonucleaseにより分解されやすいので、これを安定化するために、アプタマー(HV1-41-II)の配列(配列番号25) を基に、メトキシ基(2’-OMe)をもつシチジン、ウリジンの各アミダイトを用いて、化学合成法により、メトキシ基で修飾したアプタマーRNAを得た。また、上記アミダイトに加え、メトキシ基修飾したアデノシン、同グアノシンを用いて、アプタマーRNA(HV1-41-II-Va)のステム領域内側の塩基対ヌクレオチドのリボース部位の2位が全てメトキシ基(2’-OMe)で修飾されたアプタマーRNA(HV1-41-II-Va1)を合成し、次いで、さらに、アプタマーRNA末端のidTあるいはPEG修飾によるexonucleaseによる分解抑制効果をみるため、idT及び (CH2)12NH2修飾シチジン(シチジンのリボース5’位に修飾)を使用して、アプタマーRNA(HV1-41-II-Va1の3’-末端、5’-末端がそれぞれidT、(CH2)12NH2で修飾されたアプタマーRNA(HV1-41-II-Va1-idT)を作成した。
なお、この化学修飾RNAの作成は、受託合成会社(Chem Genes Corporation)に依頼した。
化学合成にかかるコストは、メトキシ基(2’-OMe)<水酸基(2’-OH)<フルオロ基(2’-F)の順に高価になるので、メトキシ基(2’-OMe)の利用は安定化とコストの両面で有利である。しかし、この化学修飾は、修飾部位によっては結合活性を消失する可能性ももつ。Cを修飾したものは活性が低下したが、Uを修飾したもの(HV1-41-II-Va)は活性が維持された。このアプタマー(HV1-41-Va)の2次構造モデルを図17に示す。さらにコストを下げるためステム領域の内側の塩基対ヌクレオチドをすべてメトキシ基(2’-OMe)に修飾したHV1-41-Va1の2次構造モデルを図17に示す。
すなわち、[γ-32P]ATPを10nMのアプタマーと混合し、結合緩衝液(50mM Tris-HCl, 50mM KCl, pH7.5)中で反応させ、アプタマーの5’末端をラベルした。ラベルしたアプタマーは90℃、2分間で変性させた後に25℃、10分間でアニーリングし、種々の濃度のgDタンパク質と混合して結合実験を行った。
図18にBAS2000装置で読み取った測定結果と、HV1-41-IIとHV1-41-Va1とのHSV−1のエクトドメインgDタンパク質に対する結合能の比較を示す。上段はHV1-41-IIについてのgDに対する結合能をgD濃度に従って示す。各スポットに割り当てられた番号の1は2nMアプタマーのみ、2〜10はgDタンパク質をフィルターに結合させ、2nMアプタマーを加えた後に非結合アプタマーを洗い流したものであるが、このうち2はgD添加なし、3はgD25nMを添加したもの、4はgD50nMを添加したもの、5はgD100nMを添加したもの、6はgD150nMを添加したもの、7はgD200nMを添加したもの、8はgD300nMを添加したもの、9はgD400nMを添加したもの、10はgD800nMを添加したもの。下段はHV1-41-Va1についてのgDに対する結合能で、1は2nMアプタマーのみ、2はgD添加なし、3はgD25nMを添加したもの、4はgD50nMを添加したもの、5はgD100nMを添加したもの、6はgD150nMを添加したもの、7はgD200nMを添加したもの、8はgD300nMを添加したもの、9はgD400nMを添加したもの、10はgD800nMを添加したもの。図18の右側の表は、アプタマーRNAの結合量をRIカウント数で示したもので、1列目はgD濃度、2列目は総カウント数、3列目はgD添加なしのカウント数を差し引いた正味のカウント数、4列目は結合比率(%)を数値で示したものである。図18より、HV1-41-Va1の結合能はHV1-41-IIとほぼ同じであるのは明白である。
相補的プライマー(配列番号26)
5’- CCAGGAGCACG AGTTCTCCCCTGGGGA -3’(配列番号26)
アプタマー1μgを2%ウシ血清中でcleavage 緩衝液(1.5 M NaCl; 200 mM Tris-HCl pH 7.4; 20 mM MgCl2; 20 mM CaCl2)とともに37℃で培養(30分、60分、120分)した後に、フェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈澱により得られた各産物RNAに相補的プライマーを加えた。次にアニーリング緩衝液中90℃、2分間で変性させた後に25℃、10分間でアニーリングした。図19の15%ネーティブポリアクリルアミド電気泳動図の左端から、Oligo only(プライマーのみ)、Duplex control(アプタマーとプライマーとの複合体)、HV1-41-II添加後0, 30, 60, 120 分, HV1-41- Va1添加後0, 30, 60, 120 分の順に示してあり、下段はプライマー、中断はアプタマーとプライマーとの複合体の泳動位置を示す。また、図中のカッコはアプタマーの分解物を示す。図19より、HV1-41- Va1はHV1-41-IIよりも複合体が多く存在し、分解物が少ないのは明白で、安定であることを示唆する。また、HV1-41- Va1の分解の半減期は2時間以上あることも明白である。
ヌクレオチドのリボース部位の2’位の水酸基(2’-OH)の修飾はendonucleaseによる分解を防ぐのに役立つが、RNAの末端より分解を行うexonucleaseを防ぐには不十分で、図19のカッコに示すように分解物が生じるのは、このためと考えられる。exonucleaseによる分解を防ぐため、アプタマーRNA (HV1-41- Va1)の末端の修飾実験を行った。
図21は、この実験に用いた、HV1-41- Va1の3’-末端にはidT、但し5’-末端にはPEG化する前のステップであるアミノカップリング((CH2)12NH2)したHV1-41-Va1-idTの2次構造モデルを示す図である。なお、5’末端の-(CH2)12NH2基を有するアプタマーRNAは、NHS PEGと反応緩衝液(10%重炭酸ナトリウムを含むDMF)中で反応させることにより((CH2)12NHCO)を介して、ポリエチレンが結合したアプタマーRNAにたやすく変換することができる。
HV1-41-Va1とHV1-41-Va1-idTとの安定性の比較を、図19と同様の実験方法で行った結果を図20に示す。図の上段の左端から、Oligo only(プライマーのみ)、Duplex control(アプタマーとプライマーとの複合体)、HV1-41- Va1添加後0, 30, 60, 120 分, HV1-41-Va1-idT添加後0, 30, 60, 120 分の順に示してあり、下段はプライマー、中断はアプタマーとプライマーとの複合体の泳動位置を示す。また、図中のカッコはアプタマーの分解物を示す。HV1-41-Va1-idTはHV1-41- Va1に比べ、上記カッコで示した分解物が劇的に減少しており、idTによる安定化の効果は明白である。
Claims (14)
- 配列番号1または28に示す塩基配列を含むか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有することを特徴とするアプタマーRNA。
- 配列番号2〜6及び27のいずれかで示される塩基配列からなるか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有することを特徴とするアプタマーRNA。
- 配列番号2〜5及び27のいずれかで示される塩基配列において、これら塩基配列中、以下の共通配列における9番目のAがUに置換されている塩基配列からなるか、あるいは該置換塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有することを特徴とするアプタマーRNA。
CACGAGAGAG GUCGUCCCCA GGGGAGAACU CGUGC
- アプタマーRNAが、化学修飾したヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載のアプタマーRNA。
- ピリミジンヌクレオチドにおけるリボース部位の2’位がフルオロ基(2’-F)またはメトキシ基(2’-OMe)により修飾されているか、あるいは水素で置換されていることを特徴とする、請求項4に記載のアプタマーRNA。
- 請求項1〜5のいずれかに記載のアプタマーRNAが、その3’および/または5’末端がインバーストデオキシチミジン(idT)あるいはポリエチレングリコール(PEG)により修飾されていることを特徴とするアプタマーRNA。
- 配列番号7に示す塩基配列を含むか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA。
- 配列番号8〜12及び29のいずれかで示される塩基配列からなるか、あるいは該塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA 。
- 配列番号8〜12及び29のいずれかで示される塩基配列において、これら塩基配列中、以下の共通配列における9番目のAがTに置換されている塩基配列からなるか、あるいは該置換塩基配列において、1又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含み、かつHSV−1のgDドメインに対し結合能を有するアプタマーに変換可能なDNA。
CACGAGAGAG GTCGTCCCCA GGGGAGAACT CGTGC
- 請求項7〜9のいずれかに記載のDNAと相補の塩基配列を有するDNA。
- 請求項7〜9のいずれかに記載のDNAと、その相補のDNAがハイブリダイズした2本鎖DNA。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のアプタマーRNAと相補の塩基配列を有するRNA。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として含有することを特徴とするHSV−1検査薬。
- 請求項1〜6のいずれかに記載のアプタマーRNAを有効成分として含有することを特徴とするHSV−1に対する抗ウイルス剤。
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