JP2017510295A - Ｓｔａｔ５阻害剤およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＳＴＡＴ５タンパク質の阻害を介した、癌および特に白血病の処置に関する。本発明は、より具体的には、ＳＴＡＴ５タンパク質の特異的なアプタマーおよびその治療または診断用途に関する。

Description

本発明は、ＳＴＡＴ５タンパク質の阻害を介した、癌の処置、および特に白血病の処置に関する。本発明は、より具体的にはＳＴＡＴ５タンパク質の特異的なアプタマーおよびその治療または診断用途に関する。

本発明の目的は、癌、特に白血病および骨髄増殖性新生物に対する治療プロセスの一部になり得る新規の分子を示唆することである。白血病および骨髄増殖性新生物は現在、癌のうち最も頻度の高いケースであり、４０歳未満の男性および２０歳未満の女性で死亡率が高い。これらの疾患の認識されるマーカーのうち１つは、７つのメンバーを含むタンパク質のＳＴＡＴファミリーに属する２つのタンパク質、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂを指す、転写因子（ＴＦ）シグナル伝達兼転写因子５（ＳＴＡＴ５）の機能不全である。ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂタンパク質は２つの個別の遺伝子によりコードされるが、それらのアミノ酸配列は、９０％超同一である。ＳＴＡＴ５タンパク質は、細胞質シグナル伝達経路に関与する。研究から、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂの活性の機能不全がヒト癌の誘導の一因となり得ることが示されている。

ＳＴＡＴ５Ｂタンパク質の活性化は、血液性悪性腫瘍の場合に頻繁に見られる。そのため、ＳＴＡＴ５Ｂタンパク質は、白血病誘発に寄与するものとして示されている（Ｂｅｎｅｋｌｉら、２００３ Ｂｌｏｏｄ．１０１（８），２９４０−５４）。研究からも、幅広いリガンドによってＳＴＡＴ５転写因子が活性化され、細胞増殖、細胞分化またはアポトーシスなどの主要な生物学的機能の生理学的および病態生理学的制御にそれらが介在できるようになることも示されている。したがって、ＳＴＡＴ５Ｂタンパク質は、新規の抗癌処置に対する有望な標的に相当する。応用的見地から、ＳＴＡＴ５Ｂタンパク質の活性を阻害する分子を得ることは、尚更、現在の処置があまり特異的でなく、望ましくない副作用を生じることが知られている場合に非常に重要である。

実際に、放射線照射または化学療法などの処置は、ある一定の場合において長期入院を必要とする厳しい処置である。ある一定の患者は、白血病のある一定の場合に臨床において第一選択として現在使用される薬理学的阻害剤メシル酸イマチニブ（またはグリベック（登録商標）−Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に対する耐性を発現する。したがって、これらの疾患の処置を可能にする新規の化合物を開発することが不可欠である。

ＳＴＡＴ５阻害剤は、ＡＺＤ１４８０などがすでに開発されているが、これは、ＳＴＡＴ３の阻害剤でもあり、副作用がある。ピモジドはＳＴＡＴ５を阻害するが、ドーパミン受容体アンタゴニストおよび結果的に抗精神病薬でもある（Ｎｅｌｓｏｎ ＥＡ Ｇｅｎｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２ Ｊｕｌ；３（７−８）：５０３−１１）。ＳＴＡＴ５Ａ／Ｂに対するアンチセンスは、インビトロでの基本的な働きについて試験されたが、まだ開発されていないかまたは臨床試験で試験されていない（Ｂｅｈｂｏｄ Ｆ ２００３ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１（８）：３９１９−２７；Ｆｕｔａｍｉ Ｍ Ｌｅｕｋａｅｍｉａ．２００８ Ｊｕｎ；２２（６）：１１３１−８；Ｐａｇｅ ＢＤら、２０１１ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２０１２ Ｆｅｂ ９；５５（３）：１０４７−５５）。

本発明において、ＳＴＡＴ５タンパク質の新規の特異的なアプタマーを記載する。これらのアプタマーは、ＳＴＡＴ５タンパク質の発現の阻害に付随し得る望ましくない副作用を防ぐためにシグナル伝達経路のできる限り下流でＳＴＡＴ５タンパク質を阻害する長所がある。実際に、ＳＴＡＴ５タンパク質はシグナル伝達経路の様々な過程に、様々なレベルで関与し、その包括的な阻害は細胞に対して有害であり得る。この分子はまた、標的化されるタンパク質に非常に特異的であり、免疫原性に乏しいという長所も有し、効果的な抗増殖およびアポトーシス促進特性を示す（実施例参照）。

本発明のある目的は、ＳＴＡＴ５に、好ましくはＳＴＡＴ５Ｂに特異的に結合する核酸アプタマーであり、このアプタマーは、配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号５７の配列または後者の断片または、配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号５７と少なくとも７０％の配列同一性を有する変異体を含むことを特徴とする。

ある実施形態において、このアプタマーは、さらなる安定化基および／またはベクトル化のためのさらなる基をさらに含む。

本発明の別の目的は、本明細書中の上記のものなどの少なくとも１つのアプタマーと、医薬的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物である。

本発明の別の目的は、本明細書中の上記のものなどの少なくとも１つのアプタマーを含む薬剤である。

本発明はまた、癌、好ましくは白血病の処置において使用するための、アプタマー、医薬組成物または薬剤、例えば本明細書中の上記のものなどの目的も有する。

ある実施形態において、本発明の、アプタマーまたは医薬組成物または薬剤は、抗癌剤、抗血管新生薬、抗転移薬、抗白血病薬、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、アルキル化剤、挿入剤、紡錘体に作用する物質、チロシンキナーゼ阻害剤、分化剤またはそれらの混合物から選択される別の活性物質と組み合わせて使用される。

別の実施形態において、本発明のアプタマーは、癌、好ましくは白血病の処置において使用するための、抗癌剤、抗血管新生薬、抗転移薬、抗白血病薬、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、アルキル化剤、挿入剤、紡錘体に作用する物質、チロシンキナーゼ阻害剤、分化剤またはそれらの混合物から選択される別の活性物質との組み合わせである。

別の実施形態において、本発明の、医薬組成物または薬剤は、癌、好ましくは白血病の処置において使用するための、抗癌剤、抗血管新生薬、抗転移薬、抗白血病薬、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、アルキル化剤、挿入剤、紡錘体に作用する物質、チロシンキナーゼ阻害剤、分化剤またはそれらの混合物から選択される別の活性物質との組み合わせである。

本発明はまた、目的として、生体試料中でＳＴＡＴ５を検出するための方法であって：
ａ．本明細書中の上記のものなどのアプタマーを対象から前もって採取した前記試料と接触させ、
ｂ．前記試料に結合した前記アプタマーの量を決定すること
を含む方法も有する。

図１は、選択され、ＰＣＲにより増幅されたアプタマーのセンスおよびアンチセンス鎖の、ＰＡＧＥ−尿素７Ｍ（ゲル１５％ＰＡＧＥ−尿素７Ｍ上の分離を示す。ＰＣＲ（１００μＬ＋２５μＬ尿素５Ｘ）の産物を単一ウェルに分注し、ＴＢＥ緩衝液中での泳動を２００Ｖで５５分間行う（Ａ）蛍光を測定することにより明らかにする。（Ｂ）メチレンブルーで明らかにする。 図２は、回収されたアプタマー量の、見かけ上非常に分散した変化を示すが、傾向曲線は、１．３３倍の濃縮があることを示す。 図３は、ｍｆｏｌｄソフトウェアによる、Ａｐｔａ１の構造を示す。 図４は、ｍｆｏｌｄソフトウェアによる、Ａｐｔａ２の構造を示す。 図５は、ｍｆｏｌｄソフトウェアによる、Ａｐｔａ３の構造を示す。 図６は、ＳＴＡＴ５とＡｐｔａ１との間の相互作用の証拠を明らかにすることを示す。ウエスタンブロットのプールダウンの結果を示す。ＭＷ：サイズマーカー（Ｄｕａｌ ｃｏｌｏｕｒ−ＢＩＯＲＡＤ）。ＴＰ：総タンパク質抽出物。ＮＲ：保持されない分画。Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３、Ｗ４：連続洗浄分画。Ｅ１、Ｅ２：連続溶出分画。 図７は、Ａｐｔａ１の非存在下（ＪｅｔＰＥＩ）または存在下（アプタマー１／ＪｅｔＰＥＩ）でのＫＵ−８１２細胞の増殖を示す。ｔ＝０（白色）、ｔ＝２４ｈ（黒色）での細胞数の測定。５回の実験にわたり得られた平均。 図８は、６μｇのＤＮＡ／５００，０００個細胞の比率での、Ａｐｔａ１の非存在下（ＪｅｔＰＥＩ）または存在下（アプタマー１／ＪｅｔＰＥＩ）でのＫＵ−８１２細胞の細胞死率を明らかにすることを示す。培養２４時間後にトリパンブルーで細胞を染色し、マラッセの細胞遺残上で数えた。 図９は、ヒトアポトーシス抗体アレイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の膜の顕色を示す。スポットの強度を測定するＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏアプリケーションを用いて分析を行う。シグナルの強度は、タンパク質抽出物中の標的タンパク質の発現に依存する。ヒストグラムは、未処理細胞とＡｐｔａ１／ＪｅｔＰｅＩを４８時間遺伝子移入した細胞（３００，０００個細胞／ｍＬ）との間の発現の差に対応する。 図１０はＫＵ−８１２細胞の増殖を示す。ＪｅｔＰＥＩ：ＪｅｔＰＥＩにより遺伝子移入した細胞、ＪｅｔＰＥＩ／Ａｐｔａ２：ＪｅｔＰＥＩ／Ａｐｔａ２により処理した細胞。Ａｐｔａ２。ｔ＝０（白色）、ｔ＝２４ｈ（黒色）での細胞数の測定。２回の実験にわたり得られた平均。 図１１は、６μｇのＡｐｔａ２で２４時間ごとに遺伝子移入したＫＵ−８１２細胞の増殖を示す。 図１２は、時間（６ｈ；１２ｈ；２４ｈ）の関数としての、異なる濃度のＡｐｔａ２：５０ｎＭ；１５０ｎＭ；３００ｎＭにより遺伝子移入したＫＵ−８１２細胞の細胞生存能を示す。 図１３は、ＫＵ−８１２細胞に遺伝子移入された１５０ｎＭのＡｐｔａ２のアポトーシス効果を示す。

定義
本発明において、次の用語は次の意味を有する。

「アプタマー」は、単離オリゴヌクレオチドに関し、本発明において無差別に「核酸アプタマー」とも呼ばれ得る。アプタマーまたは核酸アプタマーは、タンパク質または他の分子に、このタンパク質または他の分子の機能を妨害するように結合され得る１本鎖または２本鎖オリゴヌクレオチド配列である。実施形態において、核酸は、リボヌクレオシド単位を含む。

本発明の意味において、「処置」、「処置する」または「緩和する」という用語は、治療的処置および予防的または防御的手段の両方に関し、この目的は、癌の出現または導入を防ぐかまたは遅延させることである。したがって、処置しようとする対象には、既に癌に罹患している対象および癌に罹患し易い傾向がある対象またはこのような疾患を予防しなければならない対象の両方が含まれる。対象は、治療的有効量の本発明によるアプタマーを受けた後、その対象が癌細胞数の観察可能なおよび／または測定可能な改善を示し、および／または対象のクオリティーオブライフが顕著に向上する場合、癌に対して有効に「処置」される。有効な処置を評価するためのこれらのパラメーターは、当業者にとってよく知られている通常の手順で容易に測定することができる。

本発明の意味において、「有効量」（または「治療的有効量」）という表現は、対象に対して顕著で、かつ望ましくない副作用を引き起こすことなく、（１）癌の出現を遅延させるかもしくは停止させるか、（２）改善を提供するか、（３）癌発生の重症度を軽減するか、または（４）癌を終止させるかまたは癌をケアするのに必要とされるかまたは十分である、本発明によるアプタマーの量を指す。予防的または防御的作用のために、癌の出現前に有効量を投与することができる。あるいはまたはさらに、治療的作用のために、癌の出現後に有効量を投与することができる。

「賦形剤」は、本発明において、安定性、形態（液体、固体、カプセルなど、投与方式による）、味、溶解性（例えば胃または消化管での標的化された溶解）、色などの特性を付与する、組成物中に存在する活性成分以外のあらゆる物質を指す。「医薬的に許容可能な賦形剤」は、より具体的には、アレルギー性または望ましくない反応を誘発しないか、またはそれが対象、より好ましくはヒトに投与された場合に、賦形剤を指す。この定義は、全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および活性物質の吸収を遅延させることができるようにする物質などを含む。ヒトに対する投与の場合、調製物は、ＦＤＡのｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｂｕｒｅａｕにより定義される、無菌性、発熱性、全般的な安全性および純度の基準の条件を満たさなければならない。

数値の前の「約」は、その数値の値のプラスマイナス１０％を意味する。

「特異的な」は、標的タンパク質に特異的に結合され、生物学的効果を促進するかまたは逆に標的タンパク質の生物学的効果を阻止することである。この結合は、非特異的な結合が測定可能で非飽和性である生物学的効果を何ら惹起しない一方で、飽和性である。アプタマーは、標的と何ら構造の関連性がない化合物に対して実質的に親和性を全く有さない場合、標的に特異的に結合すると言われる。好ましくは、タンパク質標的の場合、タンパク質化合物は、標的とこの化合物との間の配列同一性が６０％未満、好ましくは７０％未満、より好ましくは８０％未満である場合、本発明による標的との構造的関連性がないと言われる。

本発明は、ＳＴＡＴ５に特異的に結合する核酸アプタマーに関する。

アプタマーと標的タンパク質との間の特異的な相互作用は、本発明の実施例２に記載のものなどのＴｅｓｔＡによって決定することができる。

２００ｐｍｏｌのビオチン化アプタマーを結合／洗浄緩衝液（５Ｘ：Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ ５０ｍＭ；ＮａＣｌ ５０ｍＭ；ＥＤＴＡ ５ｍＭ；ＰＭＳＦ ２．５ｍＭ；グリセロール２５％；ＮＰ４０−テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（登録商標）０．５％）中の細胞質および核抽出物の２００μｇのタンパク質とともに氷上で２時間温置する。次いで混合物を４℃で撹拌下で３０分間、１００μＬのストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）と接触させる。洗浄緩衝液で全てを３時間洗浄する。次いで、４０μＬの溶出緩衝液（Ｔｒｉｓ ０．５Ｍ ２５０ｍＭ ｐＨ６．８；グリセロール２５％、ＳＤＳ８％、β−メルカプトエタノール２０％；Ｈ_２Ｏ ｑｓｐ １０ｍＬ）を添加することによって、および９０℃で５分間加熱することによって、タンパク質を溶出させる。

タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳動での泳動後、ウエスタンブロットによって分析する。

（供給元により指示される濃度の）２つの抗体：ウサギで産生される抗体抗ＳＴＡＴ５（Ｃ−１７ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；ウサギで産生される抗体抗ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＡＴ５（Ｙ６９４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を使用することによって、活性化ＳＴＡＴ５タンパク質を検出する。

次いで、１／５０００に希釈したペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でマークした二次抗体（抗ウサギＩｇＧ）によって、これらの抗体の特異的な認識を明らかにする。

ある実施形態において、アプタマーは、本発明による化合物に対して、特にタンパク質に関するアプタマーの解離定数（Ｋ_Ｄ）が１０^−６ｍｏｌ／Ｌより大きい、好ましくは１０^−７ｍｏｌ／Ｌより大きい場合、実質的に何ら親和性を有さないと言われる。解離定数は、特に、標準的条件で、当業者にとって周知のスキャッチャードおよびラインウェーバー−バークプロットを用いて決定することができる。好ましくは、タンパク質に対する本発明のアプタマーの親和性は、約１００ｐＭから約１０ｎＭのＫ_Ｄのものである。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、ＳＴＡＴ／Ｊａｋ（ヤヌスキナーゼ）シグナル伝達経路を調整する。ＳＴＡＴ／Ｊａｋシグナル伝達経路の制御不全は、癌の発生に大きく関与する。ＳＴＡＴ／Ｊａｋシグナル伝達経路の制御不全は、当業者にとって周知であり、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ試験で測定することができ、これによりこの経路に関与するキナーゼのリン酸化レベルを決定することが可能になる。

ある実施形態によれば、本発明のアプタマーは、ヒトＳＴＡＴ５Ａタンパク質（配列番号５）およびヒトＳＴＡＴ５Ｂタンパク質（配列番号６）、好ましくはＳＴＡＴ５Ｂに特異的に結合する。別の実施形態によれば、本発明のアプタマーは、ＳＴＡＴ５Ａ（配列番号５）およびＳＴＡＴ５Ｂ（配列番号６）、好ましくはＳＴＡＴ５Ｂを阻害、好ましくは特異的に阻害する。

ＳＴＡＴ５タンパク質は様々なレベルのシグナルの形質導入経路で介入するので、いくつかの阻害の可能性が可能である。ある実施形態において、ＳＴＡＴ５は、タンパク質が単量体型である場合、細胞質において阻害される。別の実施形態において、阻害は、その標的配列上でその固定が妨げられるように、二量体化の過程中および／または核への後者の転位中に介入する。別の実施形態において、ＤＮＡ上の遺伝子プロモーター上でのその固定を防ぐためにＳＴＡＴ５の阻害が介入する。別の実施形態において、ＳＴＡＴ５の阻害は、そのリン酸化の阻害に対応し、例えばウサギで産生される抗体抗ＳＴＡＴ５（Ｃ−１７ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；ウサギで産生される抗体抗ＰｈｏｓｐｈｏＳＴＡＴ５（Ｙ６９４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を用いたウエスタンブロットなどの当業者にとって周知の技術によって測定することができる。

本発明のアプタマーは、配列Ａｐｔａ１（配列番号１）、配列Ａｐｔａ２（配列番号２）、配列Ａｐｔａ３（配列番号５７）、Ａｐｔａ１の断片、Ａｐｔａ２の断片、Ａｐｔａ３の断片、Ａｐｔａ１の変異体、Ａｐｔａ２の変異体またはＡｐｔａ３の変異体から選択される配列を含むかまたはこれらからなる。
配列番号１：５’−ＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＡＣＣＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’
配列番号２：５’−ＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＣＣ−３’
配列番号５７：５’−ＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＣＣ−３’。

ある実施形態において、本発明のアプタマーは、配列Ａｐｔａ１、Ａｐｔａ２およびＡｐｔａ３、フランキング配列により５’および３’で組み立てられる後者の断片または変異体から選択される配列を含むかまたはこれらからなる。

ある実施形態において、本発明による、配列番号１または配列番号２または配列番号５７を含む本発明のアプタマーは、フランキング配列などの核酸を構築することを目的とする、特に５’および／または３’側の配列を含み得る。優先的に、本発明によるアプタマーは、配列番号３または４または５８を含むかまたはこれらから構築され、これらは個々に配列番号１および２および５７を含む。次いで、この実施形態において、本発明は、特に、この配列から構築される存在するアプタマーがＳＴＡＴ５に特異的に結合する状態である、配列番号３または配列番号４または配列番号５８と少なくとも６０％の同一性を有する配列の少なくとも１５連続ヌクレオチドを含むかまたはこれから構築されるアプタマーにも関する。
配列番号３：５’−ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＡＣＣＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ−３’．
配列番号４：５’−ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ−３’．
配列番号５８：５’−ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ−３’。

ある実施形態において、本発明のアプタマーの断片は、配列番号１および２および５７の少なくとも１５連続ヌクレオチド、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０連続ヌクレオチドを含むかまたはこれからなる。

別の実施形態において、本発明のアプタマーの変異体は、配列番号１または２または５７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはこれからなる。

別の実施形態において、本発明のアプタマーの変異体は、配列番号１または２または５７と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％，または９９％の同一性を有する、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの配列を含むかまたはこれからなる。

ある実施形態において、本発明のアプタマーの断片は、１５から１００ヌクレオチド、好ましくは２０から６０ヌクレオチド、より好ましくは２５から４０ヌクレオチドであり、配列番号１または配列番号２または配列番号５７と７０；７５；８０；８５；９０；９５；９６；９７；９８；９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはこれからなる。

例えば、配列番号１のアプタマーの断片は次のとおりである：
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１１）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号１２）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＴ−３’（配列番号１３）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１４）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＧ−３’（配列番号１５）；
５’−ＡＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１６）；
５’−ＴＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１７）；
５’−ＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１８）；
５’−ＧＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号１９）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴ−３’（配列番号２０）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号２１）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧ−３’（配列番号２２）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＡ−３’（配列番号２３）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡ−３’（配列番号２４）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴ−３’（配列番号２５）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣＧ−３’（配列番号２６）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣＣ−３’（配列番号２７）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＴＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号２８）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＣ−３’（配列番号２９）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号３０）；
５’−ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＧＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号３１）。

例えば、配列番号２のアプタマーの断片は次のとおりである：
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号３２）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡ−３’（配列番号３３）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴ−３’（配列番号３４）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＣ−３’（配列番号３５）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号３６）；
５’−ＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号３７）；
５’−ＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号３８）；
５’−ＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号３９）；
５’−ＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号４０）；
５’−ＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号４１）；
５’−ＴＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号４２）；
５’−ＣＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号４３）；
５’−ＧＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号４４）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＡ−３’（配列番号４５）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＴ−３’（配列番号４６）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＣ−３’（配列番号４７）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＧ−３’（配列番号４８）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＡ−３’（配列番号４９）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＴ−３’（配列番号５０）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号５１）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＧ−３’（配列番号５２）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号５３）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号５４）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号５５）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＧＡＴＡＣＡＣＡＧ−３’（配列番号５６）。

例えば、配列番号５７のアプタマーの断片は次のとおりである：
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号５９）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＡ−３’（配列番号６０）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＴ−３’（配列番号６１）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＣ−３’（配列番号６２）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＧ−３’（配列番号６３）；
５’−ＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号６４）；
５’−ＣＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号６５）；
５’−ＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号６６）；
５’−ＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号６７）；
５’−ＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号６８）；
５’−ＴＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号６９）；
５’−ＣＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号７０）；
５’−ＧＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号７１）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＡＡ−３’（配列番号７２）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＡＴ−３’（配列番号７３）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＡＣ−３’（配列番号７４）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＡＧ−３’（配列番号７５）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＴＡ−３’（配列番号７６）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＴＴ−３’（配列番号７７）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＴＣ−３’（配列番号７８）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＴＧ−３’（配列番号７９）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＡＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号８０）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号８１）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号８２）；
５’−ＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＧＡＴＡＣＡＣＡＡ−３’（配列番号８３）。

別の実施形態によれば、本発明による配列番号１または配列番号２または配列番号５７とヌクレオチドにおいて少なくとも６０％の同一性を有する配列は、特に配列番号１または２または５７とは、少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、抑制または置換によって異なる。ここで理解されるように、２つの配列との間の同一性の％は、配列が最適に並べられる場合に塩基が同一である位置の数を２つの配列のうち長い方の総塩基数で除したものとして定義される。２つの配列は、同一性の％が最大である場合に最適に並べられていると言われる。さらに、当業者にとって明らかになるように、２つの配列間で最適なアライメントを得るために、ギャップを入れることを利用する必要があり得る。

本発明は、修飾されたアプタマー、すなわち、核酸に加えて少なくとも１つのさらなる基を含む本発明によるアプタマーに関する。このように、本発明による核酸は少なくとも１つのさらなる基に結合され得る。優先的に、本発明によるアプタマーは、本発明による核酸および少なくとも１つの本発明によるさらなる基から構成される。

ある実施形態において、本発明のさらなる基は、放射性同位元素、最大限でも１００個の炭素原子を含む有機分子、ナノ粒子、タンパク質、特に糖タンパク質、炭水化物、脂質またはポリヌクレオチドなどであり得る。ある実施形態において、本発明のさらなる基は、非限定的に、検出可能マーカー、薬理学的化合物および結合する核酸の薬物動態学的特徴を変化させることができる化合物、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アプタマーの３’−および／または５’における構造３’−ＣＡＰ−および／または５’−ＣＡＰ−構造および／または修飾ヌクレオチドグアノシン（７−メチル−グアノシンなど）など、から選択される。

ある実施形態において、本発明のさらなる基は、その半減期を延長させることによって本発明のアプタマーを安定化する。

ある実施形態において、アプタマーはＰＥＧ化される。

ある実施形態において、本発明のさらなる基は、本発明のアプタマーのＬおよび／またはＤ鏡像異性体である。

本発明の検出可能マーカーは、フルオロフォア、例えばフルオレセインまたはルシフェラーゼ；放射性同位元素、特にシンチグラフィーに適合化されたもの、例えば９９ｍＴｃ；抗体によって認識することができる標識、例えばタンパク質ｃ−Ｍｙｃ；親和性標識、例えばビオチン；酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼを含むが限定されない。

別の実施形態によれば、特に本発明によるアプタマーを、特にヌクレアーゼの作用による加水分解性の分解に耐性にするために、本発明によるアプタマーを全体的にまたは部分的に修飾することができる。このような修飾は、当業者にとって周知であり、特にメチル化１個あたりのリボースの位置２’の炭素におけるＯＨ官能基の修飾、またはアミノ基でまたはハロゲンで、特にフッ素でのこのＯＨ官能基の置換、ならびにホスホロチオエート骨格またはロックド核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）型の構造へのリコース（ｒｅｃｏｕｒｓｅ）を包含する。このように、好ましくは、本発明によるアプタマーは、プリンヌクレオチドのリボースが不変である可能性がある、ピリミジンヌクレオチドのリボースが２’位の炭素で１個のフッ素原子を保有するＲＮＡである。

本発明のある実施形態において、本発明のアプタマーは、ベクトル化を介して本発明のアプタマーを細胞および／または組織および／または臓器および／または標的細胞区画に侵入させるように修飾することができる。この修飾は、ベクトル化のためにさらなる基を付加することによってなすことができる。

ベクトル化の目的は、本発明のアプタマーを保つこと、過剰な疎水性の場合その溶解度を向上させること、その毒性を低下させることである。ベクトル化は、生物中での本発明のアプタマーの分布を空間的に、時間的におよび量的に調節するための目的も有し得る。例えば、本ベクターは、標的化分子を保有し得、これは、ある実施形態において、受容体のリガンドまたは関与する組織における過剰発現タンパク質に対する抗体であり得る。ベクトル化はまた、キメラタンパク質によって発現が標的化される導入遺伝子にも関し得る。ある実施形態において、本発明のアプタマーは、造影剤で包まれ得る。ｐＨまたは温度などの刺激に感受性であるベクターの使用によってもまた、所望の位置で放出を加速するかまたはそれを誘発することが可能になり得る。

ある実施形態において、本発明のアプタマーのＳＴＡＴ５へのベクトル化または標的化を確実にするために、ペプチドまたは核配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはアドレス（ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ）分子を添加することができる。別の実施形態において、配列ＴＡＴなどのペプチド配列を、例えば、リンパ球への本発明のアプタマーの侵入を助けるために付加することができる。本発明の別の実施形態において、細胞に浸透するペプチドを含むキメラ構築を本発明によるアプタマーに付加することができる。本発明の別の実施形態において、本発明のアプタマーを含むミセル、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、リポソーム、ウイルスなどのカプセル化方法を使用し得る。これらのベクトル化およびそれらの実行の方法は当業者にとって周知である。

本発明はまた、本発明による少なくとも１つのアプタマーを含む組成物にも関する。

ある実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも配列番号１または配列番号１の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなどを含む。

別の実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも配列番号２または配列番号２の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなどを含む。

別の実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも配列番号５７または配列番号５７の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなどを含む。

別の実施形態において、本発明の組成物は、配列番号１または配列番号１の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなど、および配列番号２または配列番号２の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなどを含む。

別の実施形態において、本発明の組成物は、配列番号１または配列番号１の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなど、および配列番号５７または配列番号５７の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなどを含む。

別の実施形態において、本発明の組成物は、配列番号５７または配列番号５７の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなど、および配列番号２または配列番号２の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなどを含む。

別の実施形態において、本発明の組成物は、（ｉ）配列番号１または配列番号１の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなど、および（ｉｉ）配列番号２または配列番号２の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなど、および（ｉｉｉ）配列番号５７または配列番号５７の断片もしくは変異体、例えば本明細書中の上記のものなど、を含む。

本発明はまた、医薬的に許容可能な賦形剤と組み合わせて少なくとも本発明の組成物を含む医薬組成物にも関する。

本発明はまた、少なくとも本発明の組成物を含む薬剤にも関する。

本発明はまた、必要とする対象における、ＳＴＡＴ５に関連する疾患を処置するための、または処置において使用するための、本発明のアプタマーまたは本発明の組成物、医薬組成物もしくは薬剤にも関する。

ある実施形態において、ＳＴＡＴ５に関連する疾患は、ＳＴＡＴ５の遺伝子および／またはタンパク質発現の過剰発現に対応する。

別の実施形態において、ＳＴＡＴ５に関連する疾患は、ＳＴＡＴ５の生物学的活性の過剰活性化に対応する。

別の実施形態において、ＳＴＡＴ５に関連する疾患は、ＳＴＡＴ５の生物学的活性の制御解除に対応する。

第一の実施形態によれば、ＳＴＡＴ５に関連する疾患は癌である。癌の例としては白血病、急性白血病、慢性白血病、リンパ芽球性またはリンパ性白血病、骨髄芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、ガルトン（Ｇａｌｔｏｎ’ｓ）Ｔ細胞前リンパ球性白血病、サプレッサーＴリンパ球がある菌状息肉症、ヘアリー細胞白血病（ｔｒｉｃｈｏｌｅｕｋａｅｍｉａ）および大リンパ球白血病、前立腺癌、乳癌、転移性乳癌、肺癌、膵臓癌、腸癌、子宮癌、結直腸癌が挙げられるが限定されず、好ましい癌は白血病である。

第二の実施形態によれば、ＳＴＡＴ５に関連する疾患は、ＳＴＡＴ５の過剰発現および／または過剰活性化、および／またはＳＴＡＴ５の生物学的活性の制御解除に関連する癌である。これらの疾患の例としては、白血病、急性白血病、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、リンパ芽球性またはリンパ性白血病、骨髄芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、バーキット白血病、若年性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、ガルトン（Ｇａｌｔｏｎ’ｓ）Ｔ細胞前リンパ球性白血病、菌状息肉症、ヘアリー細胞白血病（ｔｒｉｃｈｏｌｅｕｋａｅｍｉａ）および大リンパ球白血病、前立腺癌、乳癌、転移性乳癌が挙げられるが限定されず；より好ましくはＳＴＡＴ５に関連する疾患は白血病である。

第三の実施形態によれば、ＳＴＡＴ５に関連する疾患は白血病である。白血病の例としては、急性白血病、慢性白血病、リンパ芽球性またはリンパ性白血病、骨髄芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、若年性骨髄単球性白血病、ガルトン（Ｇａｌｔｏｎ’ｓ）Ｔ細胞前リンパ球性白血病、菌状息肉症、ヘアリー細胞白血病（ｔｒｉｃｈｏｌｅｕｋａｅｍｉａ）および大リンパ球白血病が挙げられるが限定されない。

急性骨髄性白血病（またはＡＭＬ）は、様々なステージ：ＡＭＬ０：未分化；ＡＭＬ１：分化のない骨髄芽球性；ＡＭＬ２：分化がある骨髄芽球性；ＡＭＬ３：前骨髄球性；ＡＭＬ４：骨髄単球性；ＡＭＬ４Ｅｏ：好酸球増加症がある骨髄単球性；ＡＭＬ５：単芽球（分化なし：Ｍ５ａ、分化あり：Ｍ５ｂ）；ＡＭＬ６：赤芽球性または赤白血病；ＡＭＬ７：巨核芽球性を含む。同様に、急性リンパ性白血病（またはＡＬＬ）は次のステージ：ＡＬＬ１；ＡＬＬ２；ＡＬＬ３またはバーキット白血病；必ずＢ増殖に対応するＬ３型を含む。Ｌ１およびＬ２型は、分化度が可変的であるプレＢまたはプロプレＢ増殖またはＴ増殖に対応し得る。

この分類が変化すべき場合、当業者は、どのタイプの疾患に対して新しい分類が対応するかが分かる。

ある実施形態において、ＳＴＡＴ５に関連する疾患は、慢性リンパ球性白血病；ヘアリー細胞白血病（ｔｒｉｃｈｏｌｅｕｋａｅｍｉａ）；大リンパ球白血病；または前リンパ球性白血病を含まない。

本発明のある実施形態によれば、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は経口投与に適している。本発明の観点から、「経口投与」という用語は、続いて本発明によるアプタマーの消化が起こる口腔での投与を意味し、その腸での吸収後に全身循環に合流する。

本発明のある実施形態によれば、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は固形である。経口投与に適している固形処方物の例としては、顆粒剤、粉剤、カプセル、錠剤、軟膏、ジェル、溶解すべき粉剤、ペースト、咀嚼用ガム、柔軟性のあるカプセルまたは軟カプセルが挙げられるが限定されない。

固形ビヒクル、希釈剤または賦形剤の例としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、黄色デキストリン、白色デキストリン、マルトデキストリン、微結晶セルロース、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ソルビトール、グルコースシロップ剤、ラクトース、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、アルファ−トコフェロール、グリセロール、プロピレングリコール、スクロエステル、グリセリル脂肪酸ポリエステル、スクログリセリド（ｓｕｃｒｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、ベヘネートモノ−、ジ−およびトリグリセリド、カラギーナン、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ニコチンアミド、アミノ酸、カルシウム塩、顔料が挙げられるが限定されない。

本発明の別の実施形態によれば、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は液体形態である。経口投与に適した液体処方物の例としては、溶液、懸濁液、エマルション（水中油、油中水、無水、固形またはマイクロエマルションのエマルション）、スプレー、吸入器、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤を含むバイアル、溶解すべき粉剤、飲料またはシロップ剤が挙げられるが限定されない。

液体ビヒクルの例としては、蒸留水、食塩水、水性グルコース溶液、アルコール、例えばエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール；および油性ビヒクル、例えば植物および動物油など、パラフィンまたはワックスが挙げられるが限定されない。

抗酸化剤の例としては、トコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、天然抗酸化剤、例えばビタミンＥ、ローズマリー抽出物、プロピル没食子酸５などが挙げられるが限定されない。

抗菌保存剤の例としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸が挙げられるが限定されない。

固化阻止剤の例としては、二酸化ケイ素が挙げられるが限定されない。

界面活性剤の例としては、陰イオン性、陽イオン性または非イオン性界面活性剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ポリソルベート、ポリエチレングリコールなどが挙げられるが限定されない。

ｐＨまたは緩衝液安定化剤の例としては、クエン酸ナトリウム−クエン酸、リン酸ナトリウムリン酸、酢酸ナトリウム−酢酸が挙げられるが限定されない。

本発明の別の実施形態において、本発明による、組成物、医薬組成物または薬剤は、当業者にとって周知の技術、例えばマイクロカプセル化またはコロイドビヒクル系などにより制御放出されるようにする、ポリマーベースでのコーティングを用いて、制御放出錠剤の形態で処方される。カプセル化剤の例としては、デンプン、動物性タンパク質、例えばゼラチンなど、植物性タンパク質、カゼイン、ペクチン、アルギネート、寒天、マルトデキストリン、リグニンスルホネート、セルロース誘導体（エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース）、糖、ソルビトール、ガムなどが挙げられるが限定されない。

本発明のある実施形態によれば、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は、注射を介した、例えば静脈内、くも膜下腔内、皮内、筋肉内または硬膜外注射などによる投与に適している。

注射を介した投与に適している処方物の例としては、本発明によるアゴニストを含む、注射液および注射用エマルション（例えば水中油エマルション、油中水エマルション、無水エマルション、固形エマルションまたはマイクロエマルションなど）が挙げられるが限定されない。

本発明のある実施形態によれば、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は、局所投与、より好ましくは経皮投与に適している。「経皮投与」という用語は、続いて隣接皮膚組織を通じた全身血液循環へのその吸収が起こる、皮膚での化合物の投与を意味する。

局所投与、より好ましくは経皮に適した処方物の例としては、軟膏、ペースト、サルブ、ジェル、クリームまたは経皮パッチが挙げられるが限定されない。

本発明のある実施形態によれば、本発明によるアプタマーまたは本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は単位剤型で処方される。単位剤型の例としては、錠剤、カプセル、バイアルまたは注射液が挙げられるが限定されない。

本発明はまた、本発明によるアプタマーを含む単位用量にも関する。

本発明のある実施形態によれば、対象に投与される本発明によるアプタマーの量は、約１μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約５０μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇで変動する。

別の実施形態によれば、当業者は、癌のタイプ、疾患重症度、対象の年齢または性別に従い、本発明のアプタマーの投与を変更し得る。

本発明において、「対象」という用語は、動物、より好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。本発明の実施形態によれば、対象は男性である。本発明の別の実施形態によれば、対象は女性である。本発明の実施形態によれば、対象は成人である。本発明の別の実施形態によれば、対象は小児である。本発明の別の実施形態によれば、対象は青年期である。本発明において、小児対象は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３歳である。本発明において、青年期対象の年齢は、１４、１５、１６、１７、１８、１９歳である。本発明において、成人対象は少なくとも２０歳である。

第１の実施形態において、この対象は、ＳＴＡＴ５に関連する疾患、好ましくは癌に罹患しており、より好ましくはＳＴＡＴ５に関連する疾患、好ましくは癌に罹患しているものとして診断される。

第２の実施形態において、この対象は、ＳＴＡＴ５に関連する疾患、好ましくは癌を発症するリスクがある。

第３の実施形態によれば、本対象は、ＳＴＡＴ５に関連する疾患、好ましくは癌に対する非遺伝的な素因を有する。

癌を誘導するリスク因子としては、別の癌に対する放射線療法および化学療法歴；放射線への曝露；Ｘ線への子宮内曝露；ある種の化学物質（ベンゼン、芳香族炭化水素）またはある種の肥料への曝露；ある種の農薬への（低用量での子宮内曝露を含む）曝露が挙げられるが限定されず；１９５０年から２００９年の間に遂行された３１件の疫学研究で行われたメタ研究によれば、労働中の妊婦の曝露によって小児の白血病リスクが２倍になる（最も曝露が多かったと思われる農業従事者で４０％上昇）。この小児期白血病のリスクは、最も重大なこととして殺虫剤および除草剤への曝露後（それぞれ＋２．７および＋３．６）；ある種の遺伝学的疾患、例えば２１トリソミーなど；ある種の疾患、例えばくる病、ある種の感染および骨髄癌など；骨髄増殖性血液疾患：真性多血症またはバケー病、骨髄線維症（線維芽細胞の増殖）、再生不良性貧血（多くは実際には単に白血病）、一方で慢性白血病が急性白血病に転換することが多い；ある種の装飾物の煙霧（例：全揮発性有機化合物およびメタノール）への曝露；または現在まだ知られていない何らかの原因（１０例中９例）で上昇する。

第４の実施形態によれば、本対象は、ＳＴＡＴ５に関連する疾患、好ましくは癌、より好ましくは白血病に対する遺伝学的素因を有する。

対象において診断される疾患の例は、ＳＴＡＴ５に関連する疾患を発症するリスクを上昇させる。これらには、骨髄異形成症候群、ファンコニー病、２１トリソミー、家族性血小板減少症、Ｔ細胞白血病ウイルス−１が含まれるが非限定的である。

白血病に対する遺伝学的素因の例としては、遺伝子ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１（ＢＲＣＡ２としても知られ、この遺伝子は家族性乳癌に関与）、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＪ、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭおよびＦＡＮＣＮにおける突然変異、ｐ５３欠損、遺伝子ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１での突然変異または親の生殖細胞における遺伝子ＰＲＤＭ９が１個だけ存在することが挙げられるが限定されない。

本発明はまた、他の抗癌剤、（特に抗白血病薬）、抗転移薬、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、例えば抗プリン剤、抗ピリミジン剤など、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、オルガノプラチン、エチレンイミン、イミダゾールアミドなど、挿入剤、例えばカンプトテシン誘導体、アントラサイクリン、紡錘体に作用する物質、例えば：ビンカアルカロイド剤、タキソイド、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ、スニチニブなど、抗血管新生薬、分化剤、例えば全トランスレチノイン酸およびヒ素塩またはこれらの混合物と組み合わせて投与しようとする、組成物、医薬組成物または薬剤にも関する。

ある実施形態において、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は、化学療法処置の前、その最中、および／またはその後に投与するものとする。

別の実施形態において、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は、放射線照射処置の前、その最中、および／またはその後に投与するものとする。

別の実施形態において、本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤は、同種移植の前および／または後に投与するものとする。

本発明はまた、必要とする対象において、ＳＴＡＴ５に関連する疾患を処置するために、またはその処置で使用するために、他の抗癌剤、（特に抗白血病薬）、抗転移薬、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、例えば抗プリン剤、抗ピリミジン剤など、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、オルガノプラチン、エチレンイミン、イミダゾールアミドなど、挿入剤、例えばカンプトテシン誘導体、アントラサイクリン、紡錘体に作用する物質、例えば：ビンカアルカロイド剤、タキソイド、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばダサチニブ、エルロチニブ、イマチニブ、ソラフェニブ、スニチニブなど、抗血管新生薬、分化剤、例えば全トランスレチノイン酸およびヒ素塩またはこれらの混合物と組み合わせて投与しようと意図される、本発明のアプタマーまたは本発明の、組成物、医薬組成物または薬剤にも関する。

本発明はまた、対象においてＳＴＡＴ５に関連する疾患を処置するための方法にも関し、この方法は、この対象への有効量の本発明のアプタマーまたは本発明の組成物、医薬組成物または薬剤の投与を含む。

ある実施形態において、本発明の方法は、ＳＴＡＴ５の過剰発現および／またはＳＴＡＴ５の過剰活性化および／またはＳＴＡＴ５の過剰なリン酸化および／またはＤＮＡ上でのＳＴＡＴ５の固定化を阻害し、かつ／または停止し、かつ／または防ぐ。当業者は、タンパク質リン酸化のレベルを免疫化学により測定する方法を知っている。

別の実施形態において、本発明の方法は、癌細胞の増殖を阻害し、かつ／または停止し、かつ／または防ぐ。当業者は、先行技術の周知の方法、例えば計数することを用いて、細胞の増殖を測定することができる。

別の実施形態において、本発明の方法は、癌細胞のアポトーシスの機序を誘導し、かつ／または復元する。当業者は、ＭＴＴ試験、ＬＤＨ試験、タネル（ＴＵＮＥＬ）試験、本発明の図１０におけるものなどの様々なアポトーシスマーカーを特異的に測定することを可能にするキットなどの試験を用いて、アポトーシスの機序における化合物の効果を測定することができる。

別の実施形態において、本発明の方法は、ＳＴＡＴ／Ｊａｋシグナル伝達経路を阻害する。当業者は、免疫化学、ＥＬＩＳＡ、ＳＴＡＴ／Ｊａｋシグナル伝達経路の調整により測定する方法を知っている。

本発明の別の目的は、生体試料中でＳＴＡＴ５をインビトロで検出するための方法であって、
ａ．少なくとも１つの本発明によるアプタマーを予め採取した対象からの細胞の試料と接触させ；
ｂ．この試料に結合したアプタマーの量を決定すること
を含む方法である。

ある実施形態において、検出する方法によって、ＳＴＡＴ５に関連する疾患における変化を追跡することが可能になり得る。

ある実施形態において、細胞の試料中でインビトロでＳＴＡＴ５に関連する疾患を診断する方法は、
ａ．少なくとも１つの本発明によるアプタマーを予め採取した対象からの細胞の試料と接触させ；
ｂ．この試料に結合したアプタマーの量を決定し；
ｃ．この量を参照対照と比較すること；
を含み、試料に連結したこのアプタマーの検出の増加は、本発明の疾患を明らかにすることに対応する。

予め採取された本発明で使用される生体試料という用語は、血液、血清、血漿、組織または臓器からの細胞、脳脊髄液、尿、腹水の試料を含むが限定されない。

ある実施形態において、本発明で使用されるものなどの参照対照は、ＳＴＡＴ５の発現レベルが当業者にとって公知である生体試料に対応する。これは、ＳＴＡＴ５に関連する疾患がない対象の、またはＳＴＡＴ５に関連する疾患がある対象からの生体試料由来のＳＴＡＴ５発現レベルと、対象の生体試料由来のＳＴＡＴ５発現レベルを比較することを必要とし得る。

本発明は、次の実施例によりさらに例示される。
材料および方法
ＳＴＡＴ５組み換えタンパク質を作製するための方法：
消化
ＱｉａＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて２４時間細菌予備培養物を使用して、ｐＴＡＴ／ＨＡプラスミドの抽出を行う。

次の条件においてＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩによって遺伝子ｓｔａｔ５Ｂを消化する：プラスミドｐＴＡＴ／ＨＡ／ｓｔａｔ５Ｂ １μｇ、ＫｐｎＩ １単位、ＥｃｏＲＩ １単位、ＮＥＢ−１ １Ｘ、ＢＳＡ １Ｘ、Ｈ_２Ｏ５０μＬまで。混合物を３７℃で１時間温置する。

ベクターｐＲＳＥＴＢにおける遺伝子ｓｔａｔ５Ｂのライゲーション
遺伝子ｓｔａｔ５Ｂと同じ条件でベクターｐＲＳＥＴＢをＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩによって消化する。

ｐＲＳＥＴは、次の条件下でアルカリホスファターゼ、ラピッドアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）の作用によって脱リン酸化される：プラスミドＤＮＡ１μｇ（最大）、ラピッドアルカリホスファターゼ緩衝液１Ｘ、ラピッドアルカリホスファターゼ１単位、Ｈ_２Ｏ２０μＬまで。混合物を３７℃で１０分間、次いで７５℃で２分間温置する。

次の条件でライゲーションを行う：プラスミドＤＮＡ １μｇ（最大）、挿入物１μｇ（最大）、ライゲーション緩衝液１Ｘ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）３単位、Ｈ_２Ｏ３０μＬまで。混合物を１６℃で１２時間温置する。

ｐＲＳＥＴＢ／ｓｔａｔ５Ｂ構築を介した細菌形質転換
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を予めコンピテントにし、ｐＲＳＥＴＢ／ｓｔａｔ５Ｂプラスミド構築によって形質転換する。

凍結融解したばかりの１００μＬのコンピテント細胞に１００ｎｇのＤＮＡを添加し、氷上で保管する。全てを氷上で２０分間温置し、次いで４２℃で４５秒間温置する。次いで、混合物を氷上で２分間冷却する。３７℃に予め加熱した９００μＬのＳＯＣ培地（（１％トリプトン；１％酵母抽出物；１０ｍＭ ＮａＣｌ；２．５ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４；２０ｍＭグルコース）を添加し、軽く撹拌しながら混合物を３７℃で１時間３０分温置する。ＬＢ−寒天／アンピシリン固形培地（１％トリプトン；１％酵母抽出物；１０ｍＭ ＮａＣｌ；２％寒天；アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）を含有するペトリ皿に１００μＬを広げる。クローンを３７℃で終夜増殖させる。クローンを培養に移し、１５％グリセロール中で−８０℃にて保存する。

ＳＴＡＴ５Ｂ組み換えタンパク質の産生、精製および再生
ｐＲＳＥＴＢ／ＳＴＡＴ５Ｂにより形質転換した細胞の１０μＬのグリセロール原液を１０ｍＬのＬＢ／アンピシリン培地（５ｇ ＮａＣｌ、５ｇの酵母抽出物、１０ｇのトリプトン；１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）に添加する。撹拌しながら（１８０ｒｐｍ−ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ）細胞を３７℃で１２時間培養する。

６００ｎｍでの吸収が０．１になるように培養物を希釈し、次いで撹拌しながら３７℃に戻す（１８０ｒｐｍ−ＩＮＦＯＲＳ ＨＴ）。

培養物の６００ｎｍでの吸収が０．４から０．６に到達したらタンパク質産生の誘導を行う。次いでタンパク質を細胞から抽出する。

Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上で組み換えタンパク質を精製する。連続透析を介してＳＴＡＴ５Ｂ組み換えタンパク質を再生する。

タンパク質量の測定（ＢＣＡテスト）
標準範囲の濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を調製する（０；２５；５０；７５；１００；１５０；２００；３００および５００μｇ／ｍＬ）。ＢＣＡ試薬は、ビシンコニン酸の溶液Ａおよび４％硫酸銅である溶液Ｂから構成される（Ａ／Ｂ：５０／１）。１０μＬの一連のおよび各試料を９６ウェルプレートで２つ組で分注する。ＢＣＡ試薬を２００μＬ／ウェルの割合で添加する。このプレートを３７℃で３０分間温置し、次いで５６０ｎｍでの吸収を測定する。色の強度はタンパク質の質量濃度と比例する。

アプタマーに対するＳＥＬＥＸ単離法：
Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇら（２００５ Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ．３８３（１）：８３−９１）から始まったオリゴヌクレオチドのランダムバンクを次の形態で合成した（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）：
５’ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ Ｎ６０ ＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ３’（式中、Ｎは無作為にＡ、Ｔ、ＧまたはＣである。）（配列番号８４）。

捕捉および溶出
２ｍｇのビーズを１５０から２００μｇのＳＴＡＴ５Ｂタンパク質と温置すること（周囲温度で１時間）によって、ダイナビーズ（登録商標）Ｈｉｓ−Ｔａｇ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＆ Ｐｕｌｌｄｏｗｎ（Ｄｙｎａｌ）ビーズ上で精製ＳＴＡＴ５Ｂタンパク質を捕捉する。オリゴヌクレオチドバンクを３ｎｍｏｌ（ラウンド１）または２００ｐｍｏｌ（ｎでラウンド２）の割合で添加する。結合／洗浄緩衝液を最大で７００μＬ、ビーズに添加し、これを４℃で撹拌しながら一晩温置する。

２００μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭ ＥＤＴＡ；４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；３．５ｍＭ尿素；０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加することによって、および８０℃で７分間温置することによって、ＳＴＡＴ５Ｂに固定化されたアプタマーの溶出を行う。溶出を２回繰り返す。

アプタマーの増幅および分離
次のプライマー、一方の（センス）蛍光性、他方の（アンチセンス）荷電プライマーを用いて、ＰＣＲによってアプタマーを増幅する：
センス５’−フルオ−ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴ−３’（配列番号９）；
アンチセンス５’−ポリ−ｄＡ２０−ＡＧＡＴＴＧＣＡＣＴＴＡＣＴＡＴＣＴ−３’（配列番号１０）。

ＰＣＲ混合物は次のとおりである：アプタマー（完全に回収、すなわち約３ｐｍｏｌ）；ポリメラーゼＤＮＡ（Ｖｅｎｔポリメラーゼ−Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）２単位；センスプライマー１０μＭ；アンチセンスプライマー１０μＭ；ＰＣＲの緩衝液１Ｘ；ｄＮＴＰ２５ｍＭ；Ｈ_２Ｏ５０μＬまで。

次のプログラムに従いＢｉｏｒａｄ Ｃ１０００ ＴＭ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにおいて温度サイクルを行う（表１）：

表１：選択したアプタマーの増幅のためのＰＣＲサイクル

ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）での精製後、ＰＡＧＥ−尿素７Ｍ電気泳動によってセンスおよびアンチセンス鎖を分離する。結果はＵＶで顕色させる。

次いで、ＵＶで検出されたバンドを用いてセンス鎖を精製する。このバンドを切り出し、１００ｎｇのゲルに対して２００μＬの割合でＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）の拡散緩衝液に入れる。ゲル片を粉砕し、３７℃で一晩温置し、次いで１３，０００ｇで５分間遠心する。２体積のＮＴＣ緩衝液（キットにより供給）を上清に添加する。溶出の段階を５回反復することによって、アプタマーをＣｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）で精製する。

選択されたアプタマーの配列決定
適応発現系で保持された配列をクローニングすることによって、選択したアプタマーの分析を行う。発現ベクターｐＧＥＭＴ（登録商標）の介在によってクローニングを行う。標準的プライマーＴ７を用いて配列決定を行う。

アプタマー−ＳＴＡＴ５相互作用の顕示
活性化ＳＴＡＴ５細胞タンパク質の抽出
ＳＴＡＴ５の２つの活性化細胞供給源を使用した：
−ＳＴＡＴ５Ｂ１^＊６と呼ばれるＳＴＡＴ５Ｂの発癌形態により形質転換されたＢａ／Ｆ３前リンパ球性マウス株；
−慢性骨髄性白血病に罹患した患者（染色体Ｐｈあり）を使用して樹立されたＫＵ−８１２骨髄ヒト株。

次の実験を非放射性で行う（氷上および４℃で遠心）。

１０，０００，０００個の細胞を２６０ｇで２分間遠心する。非放射性ＰＢＳを介して細胞ペレットを洗浄し（５ｍＬ、次いで１ｍＬ）、次に同じように遠心する。細胞を５０μＬの緩衝液ＥＣ（Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ ｐＨ７．９；ＫＣｌ １０ｍＭ；ＥＤＴＡ １ｍＭ；ＮＰ４０−テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（登録商標）０．２％；グリセロール１０％、これに次のものを即時添加：フッ化フェニルメチルスルホニル２ｍＭ；ジチオスレイトール１ｍＭ；オルトバナジウム酸ナトリウム１ｍＭ；完全ＥＤＴＡ不含−Ｒｏｃｈｅ）に入れ、氷上で５分間温置し、次いで１２，０００ｇで２分間遠心する。上清は、細胞質のＳＴＡＴ５タンパク質を含有する。

次いでペレットを５０μＬの緩衝液ＥＮ（Ｈｅｐｅｓ ２０ｍＭ ｐＨ７．９；ＫＣｌ １０ｍＭ；ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＮａＣｌ ４００ｍＭ、グリセロール２０％、これに次のものを即時添加：フッ化フェニルメチルスルホニル２ｍＭ；ジチオスレイトール１ｍＭ；オルトバナジウム酸ナトリウム１ｍＭ；完全ＥＤＴＡ不含−Ｒｏｃｈｅ）により吸収させ、時折試験管を撹拌することによって氷中で３０分間温置する。次いで混合物を１６，１００ｇで２分間遠心する。上清は核ＳＴＡＴ５タンパク質を含有する。

プルダウン
結合／洗浄緩衝液（５Ｘ：Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ ５０ｍＭ；ＮａＣｌ ５０ｍＭ；ＥＤＴＡ ５ｍＭ；ＰＭＳＦ ２．５ｍＭ；グリセロール２５％；ＮＰ４０−テルギトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（登録商標）０．５％）中、氷上で２時間にわたり細胞質および核抽出物の２００μｇのタンパク質とともに２００ｐｍｏｌのビオチン化アプタマーを温置する。次いで混合物を４℃で撹拌しながら１００μＬのストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ）と３０分間接触させる。全体を洗浄緩衝液で３時間洗浄する。次いでタンパク質を４０μＬの溶出緩衝液（Ｔｒｉｓ ０．５Ｍ ２５０ｍＭ ｐＨ６．８；グリセロール２５％、ＳＤＳ８％、β−メルカプトエタノール２０％；Ｈ_２Ｏ１０ｍＬまで）を添加することにより、および９０℃で５分間加熱することによって溶出する。

電気泳動およびウエスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での電気泳動後、ウエスタンブロットによってタンパク質を分析する。

２つの抗体（供給者により指示される濃度）：ウサギで作製された抗体抗ＳＴＡＴ５（Ｃ−１７ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；ウサギで作製された抗体抗ホスホＳＴＡＴ５（Ｙ６９４）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）を用いることによって、活性化ＳＴＡＴ５タンパク質を検出する。

次いで、１／５０００に希釈した、ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でマークされた二次抗体（抗ウサギＩｇＧ）によって、これらの抗体の特異的な認識を明らかにする。

細胞株におけるアプタマーの効果の測定
３７℃、５％ＣＯ_２湿潤雰囲気で温置することによって、ＲＰＭＩ培地、１０％ＳＶＦ、１％グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン中の培養物中で白血病細胞株を維持する。５００，０００個の細胞においてアプタマーの遺伝子移入を行う。６μｇのビオチン化アプタマーおよび１２μＬのＪｅｔＰＥＩ（−ポリプラス・トランスフェクション（商標））を個々に１００μＬのＮａＣｌ １５０ｍＭ中で希釈する。２種類の溶液を混合し、処理しようとする細胞に注ぐ。細胞を２４時間置温する。

細胞生存能を推定するために、トリパンブルーでの排除テストに従い、マラッセの細胞遺残において生細胞数を数える。

遺伝子発現におけるアプタマーの効果の測定
予め遺伝子移入した白血病細胞での遺伝子一式の発現におけるアプタマーの効果を試験した。タンパク質を抽出し、ヒトアポトーシス抗体アレイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてウエスタンブロットにより分析する。

アポトーシスの研究
タネル技術（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）は、低分子量（モノまたはオリゴヌクレオソーム）の２本鎖ＤＮＡ断片だけでなく高分子量の１本鎖断片の、アポトーシス細胞における存在に基づく。これらは、アポトーシス過程中のＤＮＡの断片化の結果である。タネル技術の原理は、自由３’ＯＨ末端でフルオレセインでマークされたヌクレオチドの付加を触媒する末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用することによりこれらの断片の末端を標識することに存する。

実施例１：ＳＴＡＴ５タンパク質の操作：
消化、ライゲーション、細菌形質転換の段階によりサブクローニングされたベクターｐＴＡＴ−ＨＡ／ｓｔａｔＢ５ベクターを使用してＳＴＡＴ５Ｂマウスタンパク質（配列番号８）を作製する。先行技術からＳＴＡＴ５Ａマウス組み換えタンパク質（配列番号７）に関してＳＴＡＴ５Ｂ組み換えタンパク質のより良好な産生が示される場合、ＳＴＡＴ５の特異的なアプタマーを作製するためにＳＴＡＴ５Ｂを作製することを決定した。配列決定後、組み換えタンパク質を産生させる目的で、原核発現系にベクター構築物を導入した。殆どの組み換えタンパク質と同様に、ＳＴＡＴ５Ｂタンパク質は、細胞質において凝集し、封入体を形成する傾向がある。したがって、変性緩衝液によってこれらの封入体を用いてタンパク質を抽出した。次いで、産生されたタンパク質と一体化された６−Ｈｉｓ標識によってＮｉ−ＮＴＡ樹脂上でタンパク質を精製する。この段階に続いて、装置および方法に記載のものなどの再生段階を行う。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ１０％ゲル上でＳＴＡＴ５Ｂ組み換えタンパク質の産生／精製バランスを行う。Ｓｔａｔ５ｂに対応するバンドの同定は、ウエスタンブロットによって検証する。ＳＴＡＴ５Ｂタンパク質を実際に抽出し、精製する。その純度は、ＳＥＬＥＸ手順のための標的として使用するのに十分である。

ビーズの飽和を最適化する。非保持分画中に測定可能な量（＞２５μｇ／ｍＬ、ＢＣＡテストの感度限界）が存在する場合、ビーズを飽和させる。

実施例２：ＳＴＡＴ５アプタマーの単離、特性評価
本明細書中上記で作製したＳＴＡＴ５Ｂ組み換えタンパク質の特異的な阻害剤を選択するために、実行されるストラテジーはアプタマーの選択に基づいた。アプタマーは、複雑な三次元構造に組み立てることができるＤＮＡまたはＲＮＡの合成オリゴヌクレオチドである。したがって、アプタマーの選択は、核酸バンクを用いて最も相補的な標的構造、言い換えると最も安定な相互作用を生成させるものを同定することに戻る。

アプタマーはまた、その特性によって特徴付けられる。これらは、それらの免疫原性を低下させる核酸から構成される小さいサイズの分子である。これらは、それらの標的および選択性に対して高い親和性および顕著な特異性を有する。ペプチドおよび他のタンパク質を含め、小さな有機分子からインタクトな細胞にわたる非常に多様な性質の標的に対してアプタマーを作製することができる。

ＳＥＬＥＸ法と呼ばれる反復選択法によってアプタマーをインビトロで単離する。ＳＥＬＥＸ法は、フランキング配列が既知である核酸バンクを使用して開始される。従来から使用されるバンクは、１０^１３から１０^１５個の異なる配列を含有する。この方法によって、試験されるタンパク質に対する高親和性および特異性がある構造化されたリガンドを選択することが可能になる。

この技術は、オリゴヌクレオチドの幅広いランダム化バンドを本明細書中上記で作製した、−単離され−精製、再折り畳みされた、ＳＴＡＴ５Ｂ組み換えタンパク質と接触させることに存する。温置後、洗浄を介して標的タンパク質に固定化されていないオリゴヌクレオチドを除去し、一方でさらなるＤＮＡ配列を溶出し、ＰＣＲにより増幅する。この段階によって、２本鎖ＤＮＡの新しいプールを作製することができるようになる。（配列の一方がアプタマーと相同であり、他方が相補的である）さらなる鎖を分離し、このようにして、ＳＴＡＴタンパク質に対して多かれ少なかれ高い完全親和性を有する新しい配列に富むバンクを構築するために、ＰＡＧＥ上での精製段階が必要とされる。

ＳＥＬＥＸの第二のサイクルは、精巧性が次第に低くなる配列を連続的に削除するために、この新しいＤＮＡに富むバンクを標的タンパク質とともに温置することに存する。

したがって、ＳＥＬＥＸ法は洗浄／溶出／増幅および精製段階の反復に基づく。

したがって、第一の段階において、混合物の不均一性を確認するために、ＤＮＡバンクの多様性を検証する必要があった。これを行うために、ｐＧＥＭＴ発現系およびコンピテントＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌に導入されたプラスミド構築物においてこのバンクをクローニングした。コロニーにおいてＰＣＲを介して、得られた様々なクローンを試験し、ＰＣＲ産物を配列決定に送った。２０個の配列決定クローンに関する結果によって、配列冗長性がないことを強調し、最初のバンクからのオリゴヌクレオチドがサービス提供者（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）によりなされた要求に準拠していることを検証することができるようになる。数回のサイクル後、選択圧により、１つのみまたは数個のＤＮＡ配列が保持される。選択したら、オリゴヌクレオチドの配列決定を行い、ＳＴＡＴ５転写因子に対するそれらの阻害力を決定するために試験を行う。

バンクおよびＳＴＡＴ５Ｂ（配列番号８）タンパク質を、接触させ、洗浄し、溶出させた後、ＰＣＲを介して、選択したアプタマーを増幅する。特徴を調べるためにＰＣＲの結果得られたものをＰＡＧＥ−尿素７Ｍゲル上に置く（図１）。

蛍光基による５’での修飾プライマーを用いたＰＣＲ増幅を介して、センス鎖を蛍光にする（図１Ａ、バンド（Ａ））。蛍光で明らかになるバンド（Ｆ）（図１Ａ）は、過剰な蛍光プライマーの顕色に相当する。センスとアンチセンス鎖との間の区別は、ポリアデニル化およびＰＥＧ化が５’に帯電した増幅プライマーの使用により行う。図１Ｂにおいて、メチレンブルーで染色した泳動ゲルで、帯電した鎖（Ａ）に対応するバンド（Ａ）、センスバンド（Ｆ）および過剰なプライマーバンド（Ｅ）はこのように見ることができる。各選択ラウンドでバンドを切り出し、精製した後に回収されるアプタマーの量は、２６０ｎｍでの吸収を測定することによって推定する。この量の変化は、標的の特異的なアプタマーでのバンクの濃縮、傾向曲線により具体化される濃縮を示す（図２）。図２は明らかに高度に分散した変化を示すが、傾向曲線は、１．３３倍の濃縮があることを示す。アプタマーをクローニングし、次いで配列決定を行う。

アプタマーの次の配列を選択した：
Ａｐｔａ１：５’ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＣＣＡＣＣＴＡＧＣＧＣＣＣＴＡＣＣＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ−３’（配列番号３）；
Ａｐｔａ２：５’ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＣＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ−３’（配列番号４）；
Ａｐｔａ３：５’ＡＴＡＣＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＣＧＴＣＧＡＴＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＣＴＣＡＡＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＣＣＡＧＡＴＡＧＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＴ−３’（配列番号５８）。

ｍｆｏｌｄソフトウェアによるこれらの分子のモデリングから、示される構造が得られる（Ａｐｔａ１に対して図３、Ａｐｔａ２に対して図４およびＡｐｔａ３に対して図５）。

選択したアプタマーの二次構造は、例えばＭｉｃｈａｅｌ Ｚｕｋｅｒ研究室：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍａｔｈ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／〜ｚｕｋｅｒｍのウェブサイト上または次のアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｍｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ／ｄｏｗｎｌｏａｄ−ｍｆｏｌｄで入手可能なｍｆｏｌｄソフトウェアを用いて行う。このソフトウェアにより使用されるアルゴリズムは、Ｍａｔｈｅｗｓ ＤＨら（１９９９ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８８：９１１−９４０）に記載の研究にも基づく。Ａｐｔａ１の構造を図３で示す。Ａｐｔａ２の構造を図４で示す。Ａｐｔａ３の構造を図５で示す。

（細胞質および核由来の）細胞性ＳＴＡＴ５においてウエスタンブロットによってアプタマーＡｐｔａ１の活性を試験する。ネイティブＳＴＡＴ５Ｂ転写因子に対して選択したオリゴヌクレオチドの相補性の検証は、ＫＵ−８１２細胞およびＢａ／ｆ３ ＳＴＡＴ５Ｂ １^＊６細胞でのプルダウン実験により行う（図６）。この実験は、実際に、組み換えＳＴＡＴ５Ｂタンパク質に対して選択されたにもかかわらず、Ａｐｔａ１が細胞性ＳＴＡＴ５タンパク質を認識することを示す。

実施例３：細胞株におけるＡｐｔａ１の効果
Ａｐｔａ１により遺伝子移入したＫＵ−８１２細胞の増殖を図７で示す。

増殖の測定から、ＪｅｔＰＥＩを用いて遺伝子移入したＡｐｔａ１存在下での細胞数の減少が示される。ＤＮＡ鎖が細胞ヌクレアーゼ、特に核、により非常に急速に（数時間で）分解されることを考慮すると、この減少は、僅かであるものの、Ａｐｔａ１がＳＴＡＴ５の白血病誘発活性を負の方向に制御する可能性を示す。この仮説は、一層、測定される効果が、独立に行われる実験（異なる未凍結融解、異なる実験者、盲検でのカウント）中に体系的に観察される場合に有効である。さらに、Ａｐｔａ１は細胞の死に影響がある（図８）。

次いで、アポトーシスに関与する遺伝子における効果を測定する（図９）。これらの測定によれば、Ａｐｔａ１は、アポトーシスを促進し、また白血病細胞の抗アポトーシス遺伝子の発現も低下させる遺伝子の活性を顕著に上昇させる。

まとめると、Ａｐｔａ１は、組み換えＳＴＡＴ５Ｂタンパク質、細胞から抽出されたＳＴＡＴ５タンパク質を認識し、白血病細胞の細胞増殖を低下させ、アポトーシスに関与する遺伝子の発現を制御する。

実施例４：細胞株の増殖におけるＡｐｔａ２の効果
ＫＵ−８１２細胞にＡｐｔａ２を遺伝子移入した。Ａｐｔａ２を遺伝子移入したＫＵ−８１２細胞の増殖を図１０で示す。Ａｐｔａ２は、ＫＵ−８１２細胞の増殖を低下させる。

Ａｐｔａ２の効果が細胞における１本鎖ＤＮＡ鎖の半減期に照らして一過性でしかない（すなわち１から３ｈ）可能性があることを考慮して、発明者らは、連続遺伝子移入中のＡｐｔａ２の累積効果を調べ、２４時間ごとに行った（図１１）。２４時間後、細胞数を数え、次いで再び同じ条件で遺伝子移入する。この方法を３回反復する。

Ａｐｔａ２を遺伝子移入した細胞が、体系的に、遺伝子移入していない細胞またはＪｅｔＰＥＩでのみ処理した細胞よりも増殖が少ないことが認められ、このことから、本明細書中上記で認められた効果が確認される。一方で、４８時間（２回目の遺伝子移入）後に細胞は劣化しており、これらは対照ウェル（遺伝子移入なし）において増殖さえしない。

実施例５：細胞株生存能におけるＡｐｔａ２の効果
用量依存性について試験するために、ＫＵ８１２細胞に異なる濃度のＡｐｔａ２：５０ｎＭ、１５０ｎＭおよび３００ｎＭを遺伝子移入した（図１２）。次いで、時間の関数として細胞生存能を試験した。このために、遺伝子移入６時間、１２時間および２４時間に、これらの濃度のそれぞれに対して細胞計数を行った。

この結果から、時間およびアプタマー用量の関数として、ａｐｔａ２の顕著な効果が示される。１５０ｎＭのＡｐｔａ２による遺伝子移入の僅か６時間後の生細胞数の統計学的に有意な減少が認められる。対照状態に関する生細胞のパーセンテージの計算から、細胞の２０％のみが９μｇ（３００ｎＭ）のＡｐｔａ２による遺伝子移入２４時間後に生存し続けることが示される。

実施例６：細胞株のアポトーシスにおけるＡｐｔａ２の効果
ＤＡＰＩで核をマークし、次いで断片を自由３’ＯＨ末端でフルオレセインとカップリングされたｄＵＴＰでマークすることによって、遺伝子移入後のＤＮＡの断片化の観察を行った。遺伝子移入の６時間、１２時間および２４時間後に、１５０ｎＭのａｐｔａ２およびＡｐｔａ ｃｔｒｌ（変性させた配列Ａｐｔａ２）により処理した細胞において、タネルを介した分析を行った（（図１３）。

Ａｐｔａ２存在下でのタネルの結果から、細胞にＡｐｔａ２を遺伝子移入した場合に、ＦＩＴＣによる蛍光強度の上昇が示される。この蛍光は時間とともにより強くなり、このことから死細胞数の増加が示され、このように、細胞生存能の実験の結果が確認される。Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅソフトウェアを用いてＦＩＴＣの強度を定量した。

Claims (9)

1. 配列、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号５７またはそれらの断片または、配列番号１、配列番号２もしくは配列番号５７と少なくとも７０％の配列同一性を有する変異体を含むことを特徴とする、ＳＴＡＴ５、好ましくはＳＴＡＴ５Ｂに特異的に結合する核酸アプタマー。
2. さらなる安定化基および／またはベクトル化のためのさらなる基をさらに含む、請求項１に記載のＳＴＡＴ５に特異的に結合する核酸アプタマー。
3. 請求項１から２の何れかに記載の少なくとも１つのアプタマーと、医薬的に許容可能な賦形剤と、を含む、医薬組成物。
4. 請求項１から２の何れかに記載の少なくとも１つのアプタマーを含む、薬剤。
5. 癌、好ましくは白血病の処置において使用するための、請求項１から２の何れかに記載の核酸アプタマー、請求項３に記載の医薬組成物または請求項４に記載の薬剤。
6. 抗癌剤、抗血管新生薬、抗転移薬、抗白血病薬、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、アルキル化剤、挿入剤、紡錘体に作用する物質、チロシンキナーゼ阻害剤、分化剤またはその混合物から選択される別の活性物質と組み合わせて使用するための、請求項１から２の何れかに記載の核酸アプタマー、請求項３に記載の医薬組成物または請求項４に記載の薬剤。
7. 癌、好ましくは白血病の処置において使用するための、抗癌剤、抗血管新生薬、抗転移薬、抗白血病薬、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、アルキル化剤、挿入剤、紡錘体に作用する物質、チロシンキナーゼ阻害剤、分化剤またはそれらの混合物から選択される別の活性物質と組み合わせた、請求項１から２の何れかに記載の核酸アプタマー。
8. 癌、好ましくは白血病の処置において使用するための、抗癌剤、抗血管新生薬、抗転移薬、抗白血病薬、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、アルキル化剤、挿入剤、紡錘体に作用する物質、チロシンキナーゼ阻害剤、分化剤またはそれらの混合物から選択される別の活性物質と組み合わせた、請求項３に記載の医薬組成物または請求項４に記載の薬剤。
9. 生体試料中でＳＴＡＴ５を検出するための方法であって、
   ａ．請求項１から２の何れかに記載のアプタマーを対象から前もって採取した前記試料と接触させ；
   ｂ．前記試料に結合した前記アプタマーの量を決定すること
   を含む、方法。

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