JP2012508779A - 腫瘍の治療に適するオリゴヌクレオチドの用法 - Google Patents

Abstract

本発明は、腫瘍増殖因子TGF-β1、TGF-β2及び/又はTGF-β3、VEGF、インターロイキン10、c-jun、c-fos、MIA及び/又はプロスタグランジンE2のmRNAとハイブリダイズし、8個から30個のヌクレオチドビルディングブロックを含む、腫瘍を予防及び/又は治療するための薬剤組成物を調製するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関するものであり、ここで前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、400 mg/m²/治療サイクルから800 mg/m²/治療サイクルの量で静脈内投与するために適する。

Description

本発明は、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、VEGF、インターロイキン10、c-jun、c-fos、MIAおよび/またはプロスタグランジンE2に制御される腫瘍の予防および/または治療用の、静脈投与に適する医薬組成物を調製するためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。

膵臓癌は、最も悪性のヒト腫瘍の一つである。それは、ほぼ一様に致死的であり、西洋世界で癌関連死の最多原因の一つである。それは、女性よりも男性により一般的である。ほとんどの国で、100,000人当たり8人から12人の範囲で発生し、最近数年間に日本で顕著に増大している。臨床症状の欠如により、通常、疾患の最終段階で診断される。診断の時点で、85%の患者が、肝臓又は肺のような膵臓以外の離れた臓器に拡大している、局所的に進行し、切除不可能（ステージIIまたはステージIII）、あるいは転移性ですらある（ステージIV）癌を有している。ほとんどの患者は、腫瘍の転移する傾向、並びに細胞毒性薬剤及び放射線治療に対するその固有の抵抗性により死亡する。利用可能なあらゆる治療を受けるにもかかわらず、診断後5年で3%未満の患者が生存する。膵臓癌は、強力な対症療法を必要とする、悪液質、疼痛、閉塞性黄疸及び消耗のような、重篤な臨床症状を伴う。利用可能な治療オプションはまれである。膵臓癌は化学療法に特に感受性ではないため、5-FU（5-フルオロウラシル）、ゲムスタビン(gemcitabine)及びオキサリプラチン(oxaliplatin)のような治療薬は、症状を軽減するが、平均生存期間は6ヶ月のみである。ゲムスタビンは、約6ヶ月の平均生存期間、及び約20%の1年生存率を示し、代表的な化学治療として受け入れられている。上皮成長因子レセプター(EGFR)を標的とする、チロシンキナーゼインヒビター、エルロチニブ(erlotinib)が、ゲムスタビン単独療法と組み合わせた、局所的に進行し、切除不可能で転移性の膵臓癌の第一線治療として最近認可された(Moore et al., 2007)。

別のタイプの癌は悪性メラノーマであり、それはメラノサイトにより形成され、最初に皮膚に発症し、迅速に体中に転移する。紫外線損傷、免疫抑制、及び先天性母斑が、主な危険因子である。この最悪の皮膚癌の発症は、最近数年間にわたり増大しており、オーストラリアとニュージーランドで最も発生率が高い。進行段階の（遠方への転移）に対する平均生存期間は、影響される臓器の部位に依存し、7から8ヶ月であり、5年生存率は、5%未満である(Young et al., 2006)。増大したレベルのTGF-βが、全ての転移性メラノーマ、及び94%の深部に侵食した原発性メラノーマで発現している(Reed et al., 1994)。主に、リンパ節を含む全てのメラノーマ病斑は、外科的に除去される。放射線治療により、症状の軽減がもたらされる。転移が存在する場合、治療上の潜在性がまれであり、生存率は改善しないにもかかわらず、ニトロースウレア(nitrosurea)またはダカルバジン(dacarbazine)のような（アジュバント）化学療法が第一の選択肢である。反応率は、10から20%は中程度から短期生存であり、約3ヶ月の反応持続である。免疫治療としての高用量のインターフェロンα(IFN-α)またはPEG化IFN-αの添加は、反応率を上昇させるが、全体の生存率に影響を及ぼさず、実質的な副作用に関わる。同様の発見が、インターロイキン-2 (IL-2)を伴う治療にも、むしろ高い毒性とともに現れている。

直腸癌は、疾病率及び死亡率の主原因である。ステージIII及びIVの5年生存率は、それぞれ67%及び10%である(SEER 2004)。直腸癌の最も高い発症率は、北アメリカ、オーストラリア/ニュージーランド、西ヨーロッパ、及び日本でみられ、100,000人あたり男性で30.1から49.3人、女性で20.1から36.0人である。外科手術が直腸癌の主な治療法であり、アジュバント化学、免疫、または放射線治療を、治療の第一線であるFOLFOX-レジメンで、追加することができる。カペシタビン(capecitabine)、イリノテカン(irinotecan)及びオキサリプラチン(oxaliplatin)のような薬剤、ならびにセツキシマブ(cetuximab)、エルロチニブ(erlotinib)及びベバシズマブ(bevacizumab)のような標的薬剤の出現により、結腸癌患者の治療による生存率が延長した。そのような新規標的治療法で治療された、転移性疾患を有する患者は、同時に付加的な維持コストを伴う、下痢、吐き気、大出血及び出血、発疹、アレルギー反応、ならびに心臓疾患のような複数の重篤な副作用を伴うにもかかわらず、およそ2年の平均生存期間を期待することができた(Kallinowski 2005)。この進歩にもかかわらず、5年生存率は、段階IVの患者に対して10%で依然非常に低く、より良好な治療オプションに対する医学的な必要性は高い。複数の進行中の臨床試験は、現在の治療を最適化する目的で、化学治療法と、主にEGFR及びVEGFを標的とする標的治療法との複数の組み合わせの試験である。他の薬剤は、非レセプターチロシンキナーゼの活性を阻害するものを含み、そのため両方のアプローチは、それ自体十分に特異的ではない。

それゆえ、新規の化合物、既知の化合物の組み合わせ、あるいは化合物の投与量の変化により達成されてよい、腫瘍治療法の改善に対する喫緊の必要性が存在する。全ての薬剤基質の特性は、投与される量が増大することに伴い効果が増大することである。腫瘍治療法に使用する特定の基質は、投与する全量と、腫瘍増殖の阻害との間に強い相関を示す。

さらに、細胞の取り込みが、「インビボ」におけるオリゴヌクレオチドの投与の効率に対する制限因子であり、ここで慣用的に高濃度および多量のオリゴヌクレオチドは、各標的タンパク質の生成を阻害するために投与される。

しかし、腫瘍転移、神経疾患及び免疫抑制に罹患した哺乳動物に投与することができる基質の濃度及び総量の増大は、強力な副作用及び毒性の顕著な増大に相関するため、これらの基質の臨床的成功は限られている。

EP 1 008 649及びEP 0 695 354は、TGF-β1および/またはTGF-β2のmRNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、薬剤組成物を製造するために使用することができることを示唆している。EP 1 089 764はさらに、TGFβ、VEGF、インターロイキン10、及びプロスタグランジンE2、ならびにそれらの各レセプターのmRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと組み合わせて免疫系にネガティブに作用する基質の阻害剤を、薬剤組成物を製造するためにも使用することができることを示唆している。しかし、これらの特許は、オリゴヌクレオチドを投与することができる広範囲の濃度を提供している。WO 2006/117400 A2は、癌を予防および/または治療するための薬剤組成物を調製するために使用し、低濃度で局所投与に適するオリゴヌクレオチドの投与量を特定している。

高グレードのグリオーマに機能が類似していることに、TGFβ(-1、-2、および/または-3)は、それぞれ膵臓癌(Friess et al., 1993; von Berstorff, et al., 2001)、悪性メラノーマ(Reed et al., 1994)、及び結腸癌の悪性化及び進行に中心的役割を果たしているようにみえる。特に臨床上の有益における、近年の膵臓癌、悪性メラノーマ及び結腸癌の治療において達成される進行の制限より、生存を延長する点でより有益な治療法の必要性が明確にある。

この問題に対する解決法は、以下に記載され、8から30ヌクレオチドビルディングブロックを含み、腫瘍を予防および/または治療するための薬剤組成物を調製するためのTGFβ- 1、-2、-3、VEGF、インターロイキン10、c-jun、c-fos、MIA及び/又はプロスタグランジンE2のmRNAとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用に係るものであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、静脈内、動脈内、腫瘍内、または皮下投与に適している、本願発明により提供される。

EP 1 008 649 EP 0 695 354 EP 1 089 764 WO 2006/117400 A2

Moore et al., 2007 Young et al., 2006 Reed et al., 1994 SEER 2004 Kallinowski 2005 Friess et al., 1993 von Berstorff, et al., 2001

静脈内、動脈内、腫瘍内、または皮下投与に適している、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物は、それぞれ腫瘍及び転移の治療、特に膵臓癌、悪性メラノーマ、または結腸癌の治療に有効であり、市販の薬剤に比較してより長い生存期間をもたらす。

本発明の薬剤組成物を調製するために使用する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、約8個から約30個のヌクレオチドビルディングブロックの長さを有し、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、VEGF、インターロイキン10、c-jun、c-fos、MIA及び/又はプロスタグランジンE2により制御される疾患の予防および/または治療のために投与される。

特に、TGFβ-1、TGFβ-2及び/又はTGFβ-3とハイブリダイズし、腫瘍を予防および/または治療するための薬剤組成物を調製するために使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、40 mg/m²/日から190 mg/m²/日の用量で静脈内投与するために適している。

驚くべきことに、それぞれ低用量及び少ない総量の薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドそれぞれ、例えば総量400から800 mg/m²/治療サイクル、はすでに、それぞれ高用量または総量の薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドよりもより効率的である。

各用量は、例えば1日から12週の異なる持続時間の投与サイクルを形成する1日以上の日数の間投与するために適する。投与サイクルに無投与期間が続き、これらの無投与期間は、常に同じ期間であるか、または投与サイクルの間で異なる。好ましくは、薬剤組成物は、7日間の投与サイクルとその後の7日間の無投与治療期間、あるいは4日間のサイクルとそれに続く10日間の無投与治療期間の投与に適する。

予想外なことに、7日治療サイクルにおける80 mg/m²/日の低用量、ならびに4日治療サイクルにおける140 mg/m²/日または190 mg/m²/日の低用量はすでに、腫瘍患者の生存の延長に高い効率を示した。

本発明のさらなる有利性は、核酸標的に対する親和性の向上、細胞取り込みの向上、安全性の向上、副作用の減少、およびヌクレアーゼの存在下における安定性の向上である。

TGFβ-1(配列番号1から21)、TGFβ-2(配列番号22から48)、TGFβ-3(配列番号49から77)、プロスタグランジンE2(配列番号78から89)、及び/又はVEGF(配列番号90から93)とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの好ましい配列を表す。 VEGF(配列番号94から126)、インターロイキン10(配列番号127から146)、及び/又はc-jun(配列番号147から191)とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの好ましい配列を表す。 c-jun(配列番号192から205)、c-fos(配列番号206から287)、及び/又はMIA(配列番号288及び289)とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの好ましい配列を表す。 MIA(配列番号290から325)とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの好ましい配列を表す。 配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物を、7日間（1サイクル）40 mg/m²/日、80 mg/m²/日、160 mg/m²/日または240 mg/m²/日の用量で投与した後7日間の無投与期間が続く、患者の4つのコホートを含む第一の治療スケジュール、ならびに配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物を、4日間（1サイクル）140 mg/m²/日、190 mg/m²/日、250 mg/m²/日または330 mg/m²/日の用量で投与した後10日間の無投与期間が続く、第二の治療スケジュールを示す。 7日間2サイクルの同じ用量(mg/m²)でオリゴヌクレオチドを受容した患者の血漿におけるCmaxの容量依存性を表す。患者は、これらの治療サイクルの間にある7日間、治療を受けなかった。異なる患者を、異なる用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療した。黒いカラムは、第一の治療サイクルの結果、灰色のカラムは第二の治療サイクルの結果を示す。 4日間2サイクルの同じ用量(mg/m²)でオリゴヌクレオチドを受容した患者の血漿におけるCmaxの容量依存性を表す。患者は、これらの治療サイクルの間にある10日間、治療を受けなかった。異なる患者を、異なる用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療した。黒いカラムは、第一の治療サイクルの結果、灰色のカラムは第二の治療サイクルの結果を示す。 7日間2サイクルの同じ用量(mg/m²)でオリゴヌクレオチドを受容した患者の血漿におけるAUCの容量依存性を表す。患者は、これらの治療サイクルの間にある7日間、治療を受けなかった。異なる患者を、異なる用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療した。黒いカラムは、第一の治療サイクルの結果、灰色のカラムは第二の治療サイクルの結果を示す。 4日間2サイクルの同じ用量(mg/m²)でオリゴヌクレオチドを受容した患者の血漿におけるAUCの容量依存性を表す。患者は、これらの治療サイクルの間にある10日間、治療を受けなかった。異なる患者を、異なる用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療した。黒いカラムは、第一の治療サイクルの結果、灰色のカラムは第二の治療サイクルの結果を示す。

4日間2サイクルの同じ用量(mg/m²)でオリゴヌクレオチドを受容した患者の血漿におけるAUCの容量依存性を表す。患者は、これらの治療サイクルの間にある10日間、治療を受けなかった。異なる患者を、異なる用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドで治療した。黒いカラムは、第一の治療サイクルの結果、灰色のカラムは第二の治療サイクルの結果を示す。

本発明において、「約」の表現は、テキストで与えられる絶対値から0から100％、より好ましくは1から80%、より好ましくは2から60%、より好ましくは3から40%、より好ましくは4から20%、さらにより好ましくは5から10%の偏差を含む。

本発明において、副作用とは、各薬剤調製物の治療に通常の関連性を必ずしも有さない、薬剤調製物の投与後における患者または臨床上調査対象者における、意図しない医学的な発症のいずれかとして理解される。それゆえ、副作用は、好ましくない、かつ意図しないサイン（異常な実験上の発見を含む）、兆候、または疾患、例えば疾患の悪化のいずれかである可能性がある。副作用の別の表現は、兆候(symptom)である。

本発明における膵臓臓又は結腸の腫瘍と同義として使用される膵臓癌または結腸癌、あるいは悪性メラノーマは、転移、膵臓、結腸もしくは皮膚の他の部分に由来する、または身体の他のいずれかの腫瘍に由来する転移を含む、膵臓、結腸もしくは皮膚の腫瘍のいずれかである。

本発明において、腫瘍の表現は、ヒトまたは動物の身体の良性または悪性腫瘍を含む。

本発明の文脈において、ハイブリダイジングとは、二個のヌクレオチド鎖が少なくとも部分的に、水素結合による二重鎖を形成することを示唆する。二重鎖は、2個のヌクレオチド鎖が正確なアンチセンス配列を有する場合に完全となる。しかし、ヌクレオチドビルディングブロックとも称されるオリゴヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドを別のヌクレオチドに置換する、各ヌクレオチドが改変される、あるいは各ヌクレオチドの位置にスペーサーが存在する場合でさえも、オリゴヌクレオチドは、いまだ標的分子、一般にタンパク質のmRNAとハイブリダイズし、前記タンパク質の生成を阻害することができる。本発明の文脈において、転移とは、少なくとも1個の細胞が、腫瘍組織から分離または脱離し、例えばリンパ系、血管、および/または周辺組織への侵入を介して、哺乳動物、好ましくはヒトの身体の別の部位に移動し、そこに定着して、新たな腫瘍組織を形成することを意味する。

本発明においてオリゴヌクレオチドの語は、哺乳動物に投与する場合に、生物学的に活性な代謝物またはその残余物を提供することができる、薬学的に受容可能な塩、エステル、または他のいずれかの化合物を含有する。これは、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、VEGF、インターロイキン10、c-jun、c-fos、MIA及び/又はプロスタグランジンE2をコードする1個以上の核酸との、化合物の特異的なハイブリダイゼーションにより達成される。オリゴヌクレオチドの語は、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、miRNAまたはアプタマーを含む。

核酸及びオリゴヌクレオチドの語は、本発明の文脈において、同義的に使用される。複数の実施態様において、核酸は、DNAもしくはRNA種、特に細胞内のゲノムDNAもしくはRNA種、に部分的もしくは完全に相補的に結合することにより機能させず、それにより前記DNAもしくはRNA種、特にゲノムDNAもしくはRNA種の機能を阻害することを意味するアンチセンス核酸ではない。

ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、特許EP 0 695 354号及びEP 1 008 649号、ならびにWO 01/68146、WO 98/33904、WO 99/63975及びWO 99/63975の番号で公開された国際特許出願に記載されたオリゴヌクレオチドも含む。

ある好ましい実施態様において、TGFβとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、配列番号1から78、配列番号79から89、配列番号90から126、配列番号127から146、配列番号147から205、配列番号206から287、または配列番号287から325の少なくとも1個の配列を含む。

オリゴヌクレオチド又は核酸は、同様の機能を有する非天然起源の部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。天然起源ヌクレオチドならびに非天然起源ヌクレオチド、改変物およびスペーサーもまた、ヌクレオチドビルディングブロックとも称される。最も一般的なヌクレオチドビルディングブロックはヌクレオチドである。改変または置換ヌクレオチドならびにスペーサーもまた、クレオチドビルディングブロックの表現により含まれる。

これらの改変または置換ヌクレオチドはしばしば、細胞取り込みの上昇、核酸標的（例えばタンパク質）に対する親和性の向上、細胞内局在の変更、およびヌクレアーゼ存在下の安定性の上昇のような望ましい特性のために、天然形態が好ましい。本明細書でオリゴヌクレオチドの改変は、糖、塩基部分および/またはヌクレオチド間連結部分の化学的改変のいずれかを含む。

ある実施態様において、改変オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドのリボース基の環構造は、N-H、N-R（Rがアルキル、より好ましくは1から20個の炭素を有するアルキル、非常に好ましくはアルキルはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルであるか、あるいはRはアリール置換基である）、Sおよび/またはメチレンで置換されている環構造中に酸素を有する。

本発明の文脈において、薬剤調製物は、薬学的に受容可能な担体中に、本発明のオリゴヌクレオチドを含む。ある実施態様において、共有結合的に改変された塩基および/または糖を有する核酸またはオリゴヌクレオチドは、例えば、3’および/または2’部位のヒドロキシル基、あるいは5’部位のリン酸基と異なる低分子量有機基に共有結合で連結した、主鎖糖を有する核酸を含む。そして、改変核酸はさらに、少なくとも1つの2’-O-置換リボース基を含んでよい。本発明のために、「2’-置換」とは、リボース分子の2’-OHの置換を意味する。Oは、N、Sと置換されてよく、置換体はさらに、1から20個の炭素を有するアルキル、例えばO-アルキル、S-アルキル、NH-アルキル、N-ジアルキル、O-アリール、S-アリール、NH-アリール、O-アラリキル、S-アラリキル、及びNH-アラリキルを含む。2’-O-アルキル基の好ましい実施態様は、メトキシ-、エトキシ-、プロプロキシ-、イソプロピロキシ-、及びメトキシ-エトキシである。ヌクレオチドビルディングブロックのさらなる改変は、特許US 6,143,881、US 5,591,721、US 5,652,355、US 5,962,425、US 5,969,116及びUS 5,914,396により与えられる。別の好ましい実施態様は、2’炭素に結合したアルキル基を有する少なくとも1個のデオキシリボースを含むヌクレオチドビルディングブロックである。アルキルは、約1から約30個の炭素、約1から約20個の炭素、約1から約10個の炭素、または約1から約5個の炭素を有してよい。好ましいアルキル基は、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル基であり、特に好ましいのはメチル基である。

さらに別の実施態様において、改変核酸は、リボースの代わりにアラビノースのような糖を含む。そして核酸は、主鎖組成物において不均一であり、それにより、（核酸塩基に連結したアミノ酸主鎖を有する）ペプチド-核酸のような、一緒に連結したポリマー単位の、可能性があるいずれかの組み合わせを含む。ある実施態様において、核酸は、主鎖組成物において不均一である。核酸の置換プリン及びピリミジンは、シトシンのような標準的なプリン及びピリミジン、ならびに置換塩基のような塩基アナログを含む(Wagner et al. 1993)。プリン及びピリミジンは、制限されないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、イノシン、5-メチルシトシン、2-アミノプリン、2-アミノ-6-クロロプリン、2,6-ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然及び非天然起源の核酸塩基、置換及び非置換芳香族部分を含む。

各オリゴヌクレオチドの単一ヌクレオチドは、同一の修飾を含んでよく、これらの修飾の組み合わせを含んでよく、またはホスホジエステル結合とこれらの修飾を組み合わせてもよい。オリゴヌクレオチドを抵抗性にする方法は、制限されないが、共有結合で修飾したプリンまたはピリミジン塩基を含む。例えば、塩基は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、実質的にヌクレアーゼ抵抗性であるように、メチル化、ヒドロキシメチル化、あるいは別に置換（例えばグリコシル化）されていてよい。好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つの末端は、ビオチン、ビオチンアナログ、アビジンまたはアビジンアナログである。これらの分子は、保護オリゴヌクレオチドの分解をブロックする能力を有しており、固体支持体に対する修飾核酸の高い親和性結合のための手段を提供する。本発明の試薬を調製するために使用することができるアビジン及びビオチン誘導体は、ストレプトアビジン、スクシニル化アビジン、モノマーアビジン、ビオシチン（ビオチン-イプシロン-N-リジン）、ビオシチンヒドラジド、2-イミノビオチンのアミンまたはスルフヒドリル誘導体、ならびにビオチニル-イプシロン-アミノカプロン酸ヒドラジドを含む。ビオチン-N-ヒドロキシスクシミドエステル、ビオチニル-イプシロン-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシミドエステル、スルホスクシミジル6-(ビオチンアミド)ヘキサノエート、N-ヒドロキシスクシミドイミノビオチン、ビオチンブロモアセチルヒドラジド、p-ジアソベンゾイルビオシチン及び3-(N-マレイミドプロピニル)-ビオシチンのような、付加的なビオチン誘導体もまた、本発明のオリゴヌクレオチドにおいて末端ブロッキング基として使用することができる。

さらに好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド3’および/または5’において、ならびに/あるいはWO 2008/077956 A2に記載されるようなオリゴヌクレオチドの内部ヌクレオチドにおいて、ポリマー、特にPEGと接合されている。

別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、DNAまたはRNA配列と相互作用するアプタマーまたはギャップマー(gapmer)である。

さらに別の実施態様において、塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために保持される。そのようなオリゴマー化合物の一つであり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、主鎖を含有するアミド、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は、主鎖のアミド部位のアザ窒素原子に、直接又は間接的に結合する。PNA化合物の調製を示唆する代表的な米国特許は、限定されないが、US 5,539,082、US 5,714,331及びUS 5,719,262を含む。PNA化合物のさらなる示唆は、Nielsen et al. 1991に発見することができる。

さらなる主鎖修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、アミノアルキル-ホスホロトリエステル、3’-アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル-及び他のアルキル-ホスホネート、ホスフィネート、3’-アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノ-ホスホル-アミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホラミデート、ならびに通常3’-5連結を有するボラノホスフェート、これらの2’-5連結アナログ、ならびに逆転させた極性を有するものを含み、ここでヌクレオチド単位の隣接した対は、3’-5’に5’-3’、または2’-5’に5’-2’に連結されている。種々の塩、混合塩、および遊離酸形態もまた含まれる。ある好ましい実施態様は、核酸のナトリウム塩である。

複数の実施態様において、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドが、上述の修飾の一つに記載されるように修飾される。修飾は、連続的に、またはイレギュラーにオリゴヌクレオチドをカバーすることができる。

さらに別の実施態様において、上述の少なくとも2つの修飾を、1個のオリゴヌクレオチド内で組み合わせる。別の実施態様において、1から約12、または1から約8、または1から約4、または1から約2個のオリゴヌクレオチド、ならびに/あるいはオリゴヌクレオチドの3’および/または5’末端を、上述のように修飾する。

ある実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的、例えばTGFβ、あるいはそのサブタイプでより好ましいTGFβ-1、TGFβ-2、および/またはTGFβ-3とハイブリダイズする。前記標的のmRNAのアンチセンス構造は、PCT/EP2004/053604に記載されている。

鎖伸長は、列記した配列のオリゴヌクレオチド、ならびに前記標的のmRNAの各アンチセンス構造の配列の付加的なヌクレオチドを有する他のオリゴヌクレオチドが、本願発明の範囲内にあることを意味する。付加的なヌクレオチドは、ある実施態様において、mRNAのコード領域によるものであり、特に別の実施態様において、付加的なヌクレオチドはまた、イントロンとエクソンを含む、mRNAの非コード領域にも由来する。付加的なヌクレオチドは、3’および/または5’末端の少なくとも一つに、別の実施態様では、2’または5’末端の少なくとも一つに結合する、約1から約10,000ヌクレオチド、約1から約5,000ヌクレオチド、約1から約3,000ヌクレオチド、約1から約1,000ヌクレオチド、約1から約500ヌクレオチド、約1から約100ヌクレオチド、約1から約50ヌクレオチド、約1から約25ヌクレオチド、約1から約10ヌクレオチド、約1から約5ヌクレオチドまたは約1から約2ヌクレオチドを含む。さらに別の実施態様では、これらのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの複数のヌクレオチドビルディングブロックを、本明細書に記載されているように、スペーサーおよび/または修飾物により、修飾または置換してよい。

薬学的に受容可能な塩とは、本発明で使用する化合物の生理学的及び薬学的に受容可能な塩を指し、塩が、望ましくない毒性効果を伴わずに、親化合物の生物学的活性を保持することを意味する。

ある実施態様において、オリゴヌクレオチドまたはその活性誘導体は、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり、それは、オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの正確なアンチセンス構造の約50％から約100％を有する第二のオリゴヌクレオチドと、完全にまたは部分的にハイブリダイズすることを意味する。これは、二本鎖をもたらしてよく、ここで両方のオリゴヌクレオチドは、より弱い結合強度で、あるいは重複した末端の二重鎖で、ハイブリダイズする。2個のオリゴヌクレオチドは、同一の長さを有していてよく、言い換えれば、それらは同一の量のヌクレオチドビルディングブロックを有していてよく、あるいはそれらの長さは異なっていてよく、また片方または両方の末端で、重複した末端をもたらしてよい。

本発明の文脈において、スペーサーの表現は、明確にヌクレオチドの誘導体または修飾物ではないが、結果生じるオリゴヌクレオチドが、その標的、例えばTGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、VEGF、プロスタグランジンE2、c-jun、c-fos、MIA及び/又はインターロイキン10のmRNAとなおハイブリダイズするように、2個のヌクレオチドビルディングブロックを連結する、ヌクレオチドビルディングブロックのいずれかを含む。

本発明のある実施態様は、腫瘍の予防および/または治療用薬剤組成物を調製するための、TGFβ-1、-2、および/または-3のmRNAとハイブリダイズする、8から30個のヌクレオチドビルディングブロックを含む、オリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を指し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、少なくとも0.5から40ヶ月、少なくとも1から40ヶ月、または少なくとも3から40ヶ月生存期間を延長させるために、80 mg/m/日、140 mg/m²/日または190 mg/m²/日の用量で静脈内投与される。

本発明の別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、10 mg/m²/日から500 mg/m²/日の用量で、好ましくは40 mg/m²/日から400 mg/m²/日の用量で、より好ましくは40 mg/m²/日から250 mg/m²/日、80 mg/m²/日から250 mg/m²/日、140 mg/m²/日から250 mg/m²/日、160 mg/m²/日から250 mg/m²/日、190 mg/m²/日から250 mg/m²/日、または40 mg/m²/日から190 mg/m²/日、80 mg/m²/日から190 mg/m²/日、160 mg/m²/日から190 mg/m²/日、または40 mg/m²/日から160 mg/m²/日、80 mg/m²/日から160 mg/m²/日の用量で、さらにより好ましくは40 mg/m²/日から140 mg/m²/日、80 mg/m²/日から140 mg/m²/日の用量で投与される。最も好ましいオリゴヌクレオチドの用量は、20 mg/m²/日、40 mg/m²/日、60 mg/m²/日、80 mg/m²/日、100 mg/m²/日、120 mg/m²/日、140 mg/m²/日、160 mg/m²/日、180 mg/m²/日、190 mg/m²/日、200 mg/m²/日、210 mg/m²/日、220 mg/m²/日、230 mg/m²/日、240 mg/m²/日、250 mg/m²/日、300 mg/m²/日、350 mg/m²/日、400 mg/m²/日、450 mg/m²/日、または500 mg/m²/日である。

好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドは、40 mg/m²/日、80 mg/m²/日、140 mg/m²/日、160 mg/m²/日、190 mg/m²/日、240 mg/m²/日、250 mg/m²/日、300 mg/m²/日、330 mg/m²/日、または350 mg/m²/日の用量である。

本発明の別の実施態様において、上述の用量の薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ、少なくともまたは約0.5から60ヶ月、0.5から48ヶ月、0.5から36ヶ月、0.5から24ヶ月、0.5から12ヶ月、0.5から9ヶ月、0.5から6ヶ月、or 1から60ヶ月、1から48ヶ月、1から36ヶ月、1から24ヶ月、1から12ヶ月、1から9ヶ月、1から6ヶ月、好ましくは少なくともまたは約2から60ヶ月、2から48ヶ月、2から36ヶ月、2から24ヶ月、2から12ヶ月、2から9ヶ月、2から6ヶ月、より好ましくは少なくともまたは約3から60ヶ月、3から48ヶ月、3から36ヶ月、3から24ヶ月、3から12ヶ月、3から9ヶ月、さらにより好ましくは少なくともまたは約0.5ヶ月、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、13ヶ月、14ヶ月、15ヶ月、16ヶ月、17ヶ月、18ヶ月、19ヶ月、20ヶ月、21ヶ月、22ヶ月、23ヶ月、24ヶ月、25ヶ月、26ヶ月、27ヶ月、28ヶ月、29ヶ月、30ヶ月、31ヶ月、32ヶ月、33ヶ月、34ヶ月、35ヶ月、36ヶ月、37ヶ月、38ヶ月、39ヶ月、40ヶ月、41ヶ月、42ヶ月、43ヶ月、44ヶ月、45ヶ月、46ヶ月、47ヶ月、48ヶ月、49ヶ月、50ヶ月、51ヶ月、52ヶ月、53ヶ月、54ヶ月、55ヶ月、56ヶ月、57ヶ月、58ヶ月、59ヶ月、60ヶ月、最も好ましくは少なくとも10年、15年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年、100年、膵臓癌、悪性メラノーマまたは結腸癌のような悪性腫瘍に罹患した患者の生存期間を延長することができる。

一方、本発明のオリゴヌクレオチドは、一本鎖であり、複数の実施態様において、少なくとも一本鎖核酸の一部は二本鎖である。二本鎖分子は、in vivoでより安定であり、一方一本鎖分子は活性が増大している。

ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは、約8から約30ヌクレオチドの間の長さを有し、標的TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3、VEGF、インターロイキン10、c-jun、c-fos、MIA及びプロスタグランジンE2のmRNAに相補的である。より好ましい実施態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、約7から約25ヌクレオチド、約8から約30ヌクレオチド、さらにより好ましくは約12から約18ヌクレオチドの長さを有する。本発明で使用できるオリゴヌクレオチドの好ましい実施態様は、配列番号1から78、非常に好ましくは配列番号22から48、さらにより好ましくは配列番号1、22または58に列記された配列に示される。ある好ましい実施態様において、配列番号22が、オリゴヌクレオチドあたり約54分子の結晶水からなる水和物としてそれぞれ7115.3 g、分子量6142.4 gを有するナトリウム塩の形態で投与される。

本発明の薬剤調製物で使用できる他のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、EP 1 089 764、EP 0 695 534、PCT/EP98/00497およびPCT/EP2005/002101の実施例に列記された配列に記載されたオリゴヌクレオチドである。

別の実施態様において、薬剤組成物を製造するための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドは、2個のヌクレオチドビルディングブロックの間の少なくとも1つのホスホロチオエート連結を含む。ホスホロチオエート連結は、連結の0%から5%、5%から10%、10%から15%、15%から20%、20%から25%、25%から30%、30%から35%、35%から40%、40%から45%、45%から50%、50%から55%、55%から60%、60%から65%、65%から70%、70%から75%、75%から80%、80%から85%、85%から90%、90%から95% または95%から100%をカバーしてよい。ホスホロチオエート連結は、オリゴヌクレオチドにわたって規則的または不規則に分散していてよい。複数の実施態様において、ホスホロチオエートは、オリゴヌクレオチドの3’および/または5’末端の一方または両方のいずれかに蓄積している。別の好ましい実施態様は、ヌクレオチド間の全ての連結がホスホロチオエートであるオリゴヌクレオチドである。ある実施態様において、オリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドである。一本鎖とは、全てのヌクレオチドビルディングブロックが、一本であり、第二のオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとハイブリダイズせず、ほかに結合しないことを意味する。

好ましい実施態様において、薬剤組成物及びオリゴヌクレオチドはそれぞれ、静脈内、あるいは組織、腫瘍または体腔への注入により投与される。より好ましい実施態様において、組織は、胆管、膀胱、骨、骨髄、脳、乳、結腸、子宮内膜、上皮、胆嚢、頭部、頭頸部、心臓、腸、関節、腎臓、喉頭、肝臓、肺、リンパ節、リンパ管、筋肉、食道、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、尿管、皮膚及びその層、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、扁桃腺、または子宮からなる群より選択される、ならびに/あるいはこの組織の各腫瘍に投与される。

別の実施態様において、オリゴヌクレオチドの薬剤調製物は、胆管、膀胱、大腸、胆嚢、関節腔、胸腔、腹腔内、直腸、腸管、尿管、膀胱、および心室のスペース、特に脳室スペース(cerebro ventricular space)からなる群より選択される体腔に投与される。

本発明のさらに別の実施態様において、薬剤組成物は、例えば、約0.01から約1 ml/h、0.01から約10 ml/時間、約0.1 ml/時間から約1 mL/時間、約0.1 ml/時間から約10 mL/時間、1 mL/時間から10 mL/時間、または5 mL/時間から10 mL/時間の流速で静脈内投与される。さらに好ましくは、約0.2 mL/分から約9 mL/分、0.3 mL/時間から8 mL/時間、0.4 mL/時間から7 mL/時間、0.5 mL/時間から6 mL/時間、0.6 mL/時間から5 mL/時間、0.7 mL/時間から5 mL/時間、0.8 mL/時間から5 mL/時間、0.9 mL/時間から5 mL/時間、より好ましくは約0.1 mL/時間、0.2 mL/時間、0.25 mL/時間、0.3 mL/時間、0.4 mL/時間、0.5 mL/時間、0.6 mL/時間、0.7 mL/時間、0.8 mL/時間、0.9 mL/時間、1.0 mL/時間、1.1 mL/時間、1.2 mL/時間、1.3 mL/時間、1.4 mL/時間、1.5 mL/時間、1.6 mL/時間、1.7 mL/時間、1.8 mL/時間、1.9 mL/時間、または2.0 mL/時間の流速である。ある実施態様において、薬剤組成物は、シリンジのような適用システムで投与するために適している。好ましい適用システムは、フレキシブルチューブでポートシステムに連結されたポータブルポンプを含む。ポートシステムは、注入カテーテルに連結されている。本発明に使用できる適用システムは、例えば国際特許出願PCT/EP 2004/ 004211に記載されている。

好ましくは、1日あたりの薬剤組成物及びオリゴヌクレオチド総量は、それぞれ、例えば静脈内に、約1 mL/日から約500 mL/日、約2 mL/日から約250 mL/日、より好ましくは約5 mL/日から約200 mL/日、さらにより好ましくは約7 mL/日から約150 mL/日、らにより好ましくは約10 mL/日から約100 mL/日、さらにより好ましくは約15 mL/日から約50 mL/日の範囲で、最も好ましくは約20 mL/日または約50 mL/日で投与される。

ある実施態様において、薬剤組成物及びオリゴヌクレオチド総量は、それぞれ、例えば静脈内にまたは腫瘍、組織もしくは体腔中に、1日以上投与される、1から100サイクル、1から50サイクル、1から25サイクル、1から20サイクル、1から15サイクル、1から10サイクル、好ましくは2から10サイクル、2から8サイクル、2から6サイクル、または2から4サイクル、より好ましくは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25サイクルで投与され、各サイクルの持続時間は同じであるか、変動する。

好ましい実施態様において、薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ、少なくともまたは約5時間、10時間、15時間、20時間、24時間、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、または12週間投与された。より好ましくは、薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ、1治療サイクルとして、少なくともまたは約5時間、10時間、15時間、20時間、1日、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、3週間、4週間、5週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、または12週間静脈内投与され、ここで薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ、毎日、2日おき、3日おき、4日おき、5日おき、6日おき、7日おき、毎週、2週おき、3週おき、4週おき、5週おき、6週おき、7週おき、8週おき、9週おき、10週おき、11週おき、または12週おき、投与するために適している。

好ましい実施態様において、治療サイクルと別のサイクルの間の間隔は、少なくともまたは約約5時間、10時間、15時間、20時間、24時間、36時間、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、3週間、4週間、5週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、または12週間であり、ここで治療サイクルの間の時間間隔は同じであるか、変動する。投与サイクルの間のこれらの時間間隔の間、薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それぞれ、投与されない。あるいは、投与サイクルの間の時間間隔の間、化学治療薬、例えば5-フルオロウラシル、BCNU、またはビンカアルカロイドのような別の化合物が投与される。

ある実施態様において、被験者の細胞中または血漿中における投与オリゴヌクレオチドの生物学的利用能は、予想外に増大し、同じ総量のオリゴヌクレオチドが投与される場合、治療サイクルの持続時間において減少する。患者の細胞中または血漿中におけるオリゴヌクレオチドの濃度は、治療サイクルの持続時間に依存せず、投与オリゴヌクレオチドの用量の増大とともに増大する（図３及び４）。C_maxは、媒体中における基質の最大濃度として定義され、図３及び４で、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に被験者の血漿中におけるTGFβ-2アンチセンスオリゴヌクレオチドの最大濃度を示す。

この好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドの用量の増大は、被験者の細胞中または血漿中におけるこのオリゴヌクレオチドの生物学的利用能の増大をもたらし、ここで同じ総量のオリゴヌクレオチドは、、治療サイクルの持続時間が減少すれば、より高い生物学的利用能をもたらす。生物学的利用能は、治療上活性薬剤、例えば体循環に到達するアンチセンスオリゴヌクレオチドの程度の測定値であり、作用部位で利用可能である。生物学的利用能は、AUC（曲線下面積）により解析され、それは所定の期間、例えば実施例６における4または7日間の血漿濃度曲線下の面積として定義される。

最も好ましい実施態様において、例えば、生理学的（＝等張）溶液に溶解したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくともまたは約1または2から50サイクル、1または2から40サイクル、1または2から30サイクル、1または2から20サイクル、1または2から10サイクル、1または2から8サイクル、1または2から6サイクル、1または2から4サイクル、1または2サイクルで投与され、ここで1サイクルは4日からなり、サイクル間の時間間隔は10日である、または1サイクルは4日からなり、サイクル間の時間間隔は7日である、または1サイクルは10日からなり、サイクル間の時間間隔は4日である、または1サイクルは7日からなり、サイクル間の時間間隔は7日である、または1サイクルは7日からなり、サイクル間の時間間隔は10日である、または1サイクルは10日からなり、サイクル間の時間間隔は7日であり、ここで腫瘍は好ましくは、膵臓癌、悪性メラノーマ、または結腸癌である。

薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ、少なくともまたは約150から5.000mg/m/サイクル、150から4.500mg/m²/サイクル、150から4.000mg/m²/サイクル、150から3.500mg/m²/サイクル、150から3.000mg/m²/サイクル、150から2.500mg/m²/サイクル、150から2.000mg/m²/サイクル、150から1.500mg/m²/サイクル、150から1.000mg/m²/サイクル、150から500mg/m²/サイクル、または150から250mg/m²/サイクル、より好ましくは少なくともまたは約300、400、500、600、700、800、900または1000mg/m²/サイクル、最も好ましくは少なくともまたは約510、520、530、540、550、560、570、580、または590mg/m²/サイクルの総量で投与される。

本発明で最も驚くべきことは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も高くない用量及び量が最も良好な効果を示す、あるいは例えば560 mg/m²/サイクルのより少ない量が、腫瘍の治療において最良の効果を提示することである（本願発明の実施例を参照）。

薬剤組成物及びアンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ、第一の治療として、すなわち前もっていかなる腫瘍治療も伴わない、第二の治療として、すなわち前もって一回の腫瘍治療を伴う、第三の治療として、すなわち前もって二回の腫瘍治療を伴う、または第四の治療として、すなわち前もって三回の腫瘍治療を伴う、あるいは少なくとも第五の治療として、すなわち前もって少なくとも四回の腫瘍治療を伴う、治療として使用され、ここで先行する腫瘍治療は、例えば化学治療または放射線治療である。

さらに別の実施態様において、薬剤組成物は、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドと、さらに少なくとも1つの付加的なアジュバント治療剤とを含む。アジュバントに関してより詳細には、免疫刺激剤としても言及され、EP 1 089 764を参照されたい。好ましい実施態様において、アジュバントは、CpGモーティブ(motive)を含むオリゴヌクレオチドである。CpGモーティブに関してより詳細には、Krieg 2002を参照されたい。

本発明の薬剤組成物の好ましい実施態様は、哺乳動物において使用され、ここで哺乳動物の好ましい実施態様は、ヒトである。ヒトの治療に有用であるほかに、本発明はまた、哺乳動物、齧歯類などを含む、獣医動物、珍しい動物、および家畜を含む他の対象に対しても有用である。哺乳動物は、ヒト、ウマ、イヌ、ブタ、ネコ、または霊長類（例えば、サル、チンパンジー、またはキツネザル）を含む。齧歯類は、ラット、マウス、リス、またはテンジクネズミを含む。

薬剤組成物は、少なくともまたは約1 mMから約25 M、1 mMから約20 M、1 mMから約10 M、1 mMから約5 M、1 mMから約1 Mの濃度でオリゴヌクレオチドを含む液体薬剤組成物を含む。別の実施態様において、薬剤組成物は、少なくともまたは約10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mMまたは100から約150 mM、200 mM、250 mM、300 mM、350 mM、400 mM、450 mM、500 mM、550 mM、600 mM、650 mM、700 mM、750 mM、800 mM、850 mM、900 mM、950 mM、1 M、2 M、3 M、4 M、5 M、6 M、7 M、8 M、9 M、10 M、11 M、12 M、13 M、14 M、15 M、16 M、17 M、18 M、19 M、または20 Mの濃度でオリゴヌクレオチドを含む。

薬剤組成物は、限定されないが、浸透増強剤、受容可能な担体または賦形剤のような、バッファー、希釈剤、及び他の適切な添加物もまた含んでよい無菌水性溶液を含んでよい。薬剤組成物の語は、この組成物の液体または基剤は、純粋である、および/または薬学的に許容可能な担体と組み合わせることを示唆する。

薬学的に許容可能な担体の語は、ヒトまたは他の哺乳動物に投与するために適する1つ以上の使用可能な液体フィラー、希釈剤またはカプセル化基剤を意味する。「担体」の語は、天然または合成の有機または無機成分を示し、それに活性成分を組み合わせて適用を容易にする。薬剤組成物の組成を、所望の薬剤効率に負の影響を与えずに、本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。そのような担体により、本発明のオリゴヌクレオチドを、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物またはエマルションとして配合することができる。

上述のとおり、薬剤組成物はまた、マイクロカプセル、ナノカプセル、マイクロ-及びナノ粒子及び懸濁物、微細金粒子状にコートされるオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを持続的に放出する調製物も含んでよく、調製物の中には、崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨張剤、滑剤または可溶化剤のような賦形剤及び添加物、ならびに/あるいは助剤が慣用的に使用されている。胃、腸、結腸、または直腸への注入には、例えば浣腸が有用である。薬剤送達の現在の方法の簡単な概要には、Langer (1990)を参照のこと。さらに別の実施態様において、化合物の懸濁物は、適切な油性注射物として調製される。適切な親油性溶媒またはビヒクルは、ごま油のような脂肪油、あるいはエチルオレイエートまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、あるいはリポソームを含む。水性注射懸濁物は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランのような、懸濁物の粘性を増大させる基剤を含む。任意に、懸濁物はまた、化合物の溶解度を増大させて、高度に濃縮した溶液の調製を可能にする、適切な可溶化剤または薬剤も含んでよい。

さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、使用前に適切なビヒクル、例えば無菌ピロゲンフリー水で再構成するための粉末形態であってよい。別の実施態様において、オリゴヌクレオチドを、等張水で再構成する。等張水は、身体の浸透圧と同程度の浸透圧を有するいずれかの水性溶液である。一般に使用されているのは、塩、糖などの溶液である。好ましい実施態様において、等張液は、0.9%塩化ナトリウム溶液であるか、またはリンガー乳酸(Ringer-lactate)溶液（例えばDAB7）である。

さらに別の実施態様において、活性化合物、例えばオリゴヌクレオチドは、使用前に適切なビヒクル、例えば無菌ピロゲンフリー水を有する溶液のための濃縮物の形態であってもよい。さらに別の実施態様において、化合物を、例えばココアバターまたは他の不利せりどのような市販の慣用的な坐剤基剤を含む、坐剤または停留浣腸または錠剤のような、直腸または腟組成物注に配合する。

さらに別の実施態様において、化合物を、貯蔵調製物として配合する。ある実施態様において、そのような長期活性調製物を、適切なポリマー性または疎水性材料（例えば、受容可能な油中のエマルションとして）、あるいはイオン交換樹脂、あるいは例えば難溶塩として、難溶誘導体として、配合する。

別の実施態様において、送達システムは、時間放出、遅延放出、または持続放出送達システムを含む。そのようなシステムにより、化合物の繰り返し投与を回避し、それにより被験者と医師の都合を改善することができる。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。ある実施態様において、送達システムは、ポリ(ラクチド-グリコシド)、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸、およびポリ無水物、より好ましくは 20,000 Daより大きい分子量のポリ無水物のようなポリマーベースのシステムを含む。ある好ましい実施態様において、ポリ無水物は、高分子量のジカルボン酸重縮合物である。より詳細には、EP 0 260 415を参照のこと。薬物を含む上記ポリマーのマイクロカプセルは、例えば米国特許5,075,109号に記載されている。

別の実施態様において、オリゴヌクレオチド取り込みの改善を、リポソーム（中性、カチオン性、免疫リポソーム）、マイクロ-及びナノ粒子、ポリマーまたは担体への共有結合を含むベクトル化の、異なるシステムで達成した(Lefebure et al., 1995)。脂質介在トランスフェクションもまた使用して、オリゴヌクレオチドを送達した(Wang and Martini, 1996)。別の実施態様において、送達システムは、例えば、コレステロール、コレステロールエステルのようなステロールを含む脂質、脂肪酸、あるいはモノ-、ジ-、及びトリグリセリドのような中性脂肪である非ポリマーシステム、ヒドロゲル放出システム、シラスティック(silastic)システム、ペプチドベースシステムなどを含む。

特異的な例は、それに限定されないが、(a)本発明の試薬が、US 4,452,775, US 4,675,189及びUS 5,736,152に記載されているもののようなマトリックス中の形態で含まれる侵食システム、ならびに(b)活性成分が、US 3,854,480, US 5,133,974及びUS 5,407,686に記載されているもののようなポリマーから、制御された速度で浸透する、分散システムを含む。

さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ゆっくりと分解する修飾コラーゲン繊維からなる市販製品であるGELFOAM(登録商標)と配合される。

ある実施態様において、薬剤組成物はまた、適切な固体またはゲル相担体または賦形剤も含む。そのような担体または賦形剤の例は、限定されないが、カルボン酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーを含む。

ある実施態様において、オリゴヌクレオチドを、そのまま、あるいは薬学的に許容可能な塩の形態で投与する。塩は、薬学的に許容可能でなければならないが、薬学的に許容可能でない塩は、好都合にはその薬学的に許容可能な塩を調整するために使用される。そのような塩は、限定されないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されるものを含む。そのような塩をまた、カルボン酸基の、ナトリウム塩、カリウム塩、またはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ度類金属塩として調製することができる。

別の実施態様において、薬剤組成物はさらに、少なくとも1つのバッファーおよび/または少なくとも1つの保存剤を含む。ある実施態様において、適切なバッファー剤は、限定されないが、酢酸及び塩（例えば1-2% w/v）、クエン酸及び塩（例えば1-3% w/v）、ホウ酸及び塩（例えば0.5-2.5% w/v）、ならびにリン酸及び塩（例えば0.8-2% w/v）を含む。適切な保存剤は、塩化ベンズアルコニウム（例えば0.003-0.03% w/v）、クロロブタノール（例えば0.3-0.9% w/v）、パラベン（例えば0.01-0.25% w/v）、及びチオマーサル（例えば0.004-0.02% w/v）を含む。

さらに別の実施態様において、薬剤組成物はまた、栄養送達を増大させるために、浸透増強剤も含む。浸透増強剤は、5つの広いカテゴリー、すなわち脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、界面活性剤、および非界面活性剤に属するものとして分類されてよい(Lee et al., 1991; Muranishi, 1990)。1つ以上の広いカテゴリー由来の1つ以上の浸透増強剤が含まれてよい。

浸透増強剤として作用する、種々の脂肪酸およびその誘導体は、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプロン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプロン酸、トリカプロン酸、リシノール酸、モノオレイン酸(1-モノオレイル-rac-グリセロール)、ジラウリン酸、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール1-モノカプロン酸、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ-及びジ-グリセリド、及び生理学的に許容可能なそれらの塩（すなわち、オレイエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレートなど）を含む(Lee et al., 1991; Muranishi, 1990; El-Hariri et al., 1992)。現在好ましい脂肪酸の複数の例は、カプレートおよびナトリウムラウレートであり、例えば0.5から5%の濃度で、単独でまたは組み合わせて使用される。

胆汁の生理学的な役割は、脂肪及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収を容易にすることを含む(Brunton, 1996)。種々の天然胆汁塩およびその合成誘導体は、浸透増強剤として作用する。そして、「胆汁塩」の語は、胆汁の天然発生成分のいずれか、ならびにその合成誘導体を含む。現在好ましい胆汁塩は、ケノデオキシコリン酸(chenodeoxycholic acid (CDCA)) (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo.)であり、例えば0.5から2%の濃度で使用される。

1つ以上の浸透増強剤を含む複合配合物を使用してよい。例えば、胆汁塩を、脂肪酸と組み合わせて使用して、複合配合物を製造してよい。好ましい組み合わせは、ナトリウムカプレートまたはナトリウムラウレート（例えば0.5から5%）と組み合わせたCDCAを含む。

ある実施態様において、付加的なキレート化剤を使用してよく、それは、限定されないが、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム(EDTA)、クエン酸、サリチレート（例えば、ナトリウムサリチレート、5-メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのN-アシル誘導体、ベータジケトンのラウレス-9およびN-アミノアシル誘導体（エナミン）を含む(Lee et al., 1991 ; Muranishi, 1990; Buur et al. 1990)。キレート化剤は、DNaseインヒビターとしてはたらく、付加的に有利な点を有している。さらに別の実施態様において、付加的な界面活性剤を使用する。界面活性剤は、例えば、ナトリウムラウリルサルフェート、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン-20-セチルエーテル(Lee et al., 1991)、及び FC-43のようなパーフルオロケミカルエマルション(Takahashi et al., 1988)を含む。非界面活性剤は、例えば、不飽和環状ウレア、1-アルキル及び1-アルケニルアザシクロアルカノン誘導体(Lee et al., 1991)、ならびにジクロフェナックナトリウム、インドメタシン、及びフェニルブタゾンのような非ステロール抗炎症剤(Yamashita et al., 1987)を含む。

ある実施態様において、本発明の薬剤組成物は、付加的に当業者に確立されたレベルで、薬剤組成物中で伝統的に見出される他の補助成分を含む。そして、例えば、組成物は、例えばかゆみ止め薬、局所麻酔剤、または抗炎症剤のような、付加的に利用可能な薬学的活性物質を含んでよく、あるいは染料、芳香剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤のような、本発明の組成物の種々の生理学的配合形態において有用な付加的な物質を含んでよい。しかし、そのような物質は、添加した場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に阻害してはならない。

これらの実施例において、患者における全身性毒性試験ならびに臨床試験の結果が報告される。これらの試験全ては、現在のGood Clinical Practice (GCP)ガイドラインに従って実行され、地域倫理委員会によって承認されている。患者の試験はさらに、ヒトの試験に対する現在のヘルシンキ国際宣言に従った。以下の実施例は、本発明の特定の実施態様を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

実施例１
膵臓癌の7日治療サイクルにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物を、進行した膵臓癌に罹患した患者に２次、３次、または４次治療として静脈内投与した、すなわち、患者は1回、2回、または3回の他の腫瘍治療法により事前に治療されていた。ポータブルポンプを使用して、事前にインプラントしたポートアクセスシステムを介して、注入速度0.8 mL/時間で、薬剤組成物及び配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ、静脈内に注入した。あるいは、薬剤組成物及び配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ、シリンジで静脈内に投与した。

配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物を、1から10治療サイクルで、静脈内投与し、ここで1サイクルは7日間と、それに続く7日間非治療間隔からなる。

17人の患者を、この治療スケジュール、すなわち配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物の連続した7日間の静脈内注入と、7日間非治療間隔で治療した。
これらの患者を、用量の増大とともに、4つの一連のコホート(cohort)に分類した：
コホート１：40 mg/m²/日（すなわち280 mg/m²/サイクル）を受け取る4人の患者
コホート２：80 mg/m²/日（すなわち560 mg/m²/サイクル）を受け取る3人の患者
コホート３：160 mg/m²/日（すなわち1120 mg/m²/サイクル）を受け取る6人の患者
コホート４：240 mg/m²/日（すなわち1680 mg/m²/サイクル）を受け取る4人の患者。

表１の結果は、7日間の治療サイクルにおける80 mg/m/日の用量、すなわち総量560 mg/m²/サイクルのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、予想外に、患者の生存率の延長（13.8か月）に最も有効であった。対照的に、160 mg/m²/日または240 mg/m²/日の用量では、40 mg/m²/日の効果に比べてより低い効果が示された。

実施例２
膵臓癌の4日治療サイクルにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
別の試験において、配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物を、1から10サイクルで静脈内投与し、ここで1回の治療サイクルは4日間と、それに続く10日間の非治療間隔からなる。

17人の患者を、配列番号22の用量を増大して治療する、4つの一連のコホートに分類した：
コホートＡ１：140 mg/m²/日（すなわち560 mg/m²/サイクル）を受け取る5人の患者
コホートＡ２：190 mg/m²/日（すなわち760 mg/m²/サイクル）を受け取る3人の患者
コホートＡ３：250 mg/m²/日（すなわち1000 mg/m²/サイクル）を受け取る5人の患者
コホートＡ４：330 mg/m²/日（すなわち1320 mg/m²/サイクル）を受け取る3人の患者。
患者１は65歳の男性で、治療の開始から5.5ヶ月で死亡し、患者２は50歳の男性で、治療の開始から15.6ヶ月で死亡し、患者３は44歳の男性で、治療の開始から4.9ヶ月で死亡し、患者５は63歳の女性で、治療の開始から13.4ヶ月で死亡した。コホートＡ１の患者４は、治療の開始から14.8ヶ月後なお生存している。

コホートＡ２の結果は、5.5ヶ月と9.3ヶ月の間の、より低い総生存期間中央値(Median Overall Survival)を提示する。患者１は53歳の女性で、治療の開始から3ヶ月で死亡し、患者２は63歳の女性で、治療の開始から9.3ヶ月で死亡し、患者３は治療から5.5ヶ月後なお生存している。

異なるコホートの結果が表２に提示され、4日間の治療サイクルにおける140 mg/m/日の用量、すなわち総量560 mg/m²/サイクルの配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、生存率に最も高い有効性を示した。この用量は、13.4ヶ月という、予想外に長い生存率をもたらした。4日間の治療サイクルにおける140 mg/m/日の用量は、7日間の治療サイクルにおける80 mg/m/日の用量の生存率と同程度の生存率の延長をもたらした。

実施例３
膵臓癌を治療するための薬剤組成物を調製するための、オリゴヌクレオチドの良好な使用
糖尿病、動脈性高血圧症、リンパ浮腫、左睾丸の奇形腫を含む病歴を有する54歳の男性患者を、膵臓癌AJCC (米国癌共同委員会American Joint Committee on Cancer)のステージ１で診断した。病歴は、グレード２の管状腺癌を示した。患者はすぐに、腫瘍の外科的切除（Whippleの手順、切除グレードR0）を行い、（5-フルオロウラシル、ロイコボリン及びゲムシタビンを含む）3回の治療レジメンを受けた。

転移性膵臓癌をベースとする転移性肝臓転移を伴う腫瘍切除後、総量560 mg/m²/サイクルとなる7日間の治療サイクルにおける80 mg/m/日の用量で、配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物で患者を治療した。患者は、7日間の治療期間を7サイクル実行し、ここで全てのサイクルの後、7日間非治療間隔を伴った。

同定した肝臓転移は、治療開始後8週間以内に縮小し、治療を始めて16週間以内に完全に消失した。2009年2月までに、配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物で治療を開始して45.6ヶ月で、一次腫瘍も、新規な転移のいずれも、定期的な間隔で実施された腹部CTに観測されなかった。患者は、配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物を伴う治療の完了後、腫瘍治療を受けなかった。薬剤組成物で治療を開始して45.6ヶ月後の2009年2月に実施された最後の利用可能な対照CTにより、完全な応答を確認した。

実施例４
膵臓癌、悪性メラノーマ、および結腸癌における生存期間中央値
進行した膵臓癌に罹患した11人の患者、進行した悪性メラノーマに罹患した2人の患者、及び進行した結腸癌に罹患した4人の患者を、7日間（1サイクル）の80 mg/m/日の用量とそれに続く7日間の非治療間隔、または4日間（1サイクル）の140 mg/m/日の用量とそれに続く10日間の非治療間隔で、配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物で治療した。患者を、1から10サイクルの間治療した。表３は、生存期間中央値が週または月で示され、80 mg/m/日の用量の配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、癌のタイプに依存せず、明確に患者の生存期間を伸長した。

実施例７
血漿におけるC_maxの用量依存性
用量依存性を、有効なキャピラリーゲル電気泳動法で測定した。実施例１（コホートＡ１からＡ４）及び実施例２（コホートＡ１からＡ４）で言及した患者の血漿サンプルを、配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度について調査し（図３及び４）、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記言及された用量で、7日間または4日間投与された。7日間の80 mg/m/日の用量（図３）、または4日間の140 mg/m/日の用量（図４）の、配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与により、両者ともに総量560 mg/m²/日のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与に至った。しかし、4日間のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与（図４）は、驚くべきことに7日間の投与（図３）よりも高いC_maxに至った。

実施例８
血漿におけるAUC_{0からt最後}の用量依存性
用量依存性を、有効なキャピラリーゲル電気泳動法、ならびにそれに続く有効なWinNonlin薬物動力学ソフトウェアを伴う薬物動力学解析で測定した。実施例１および２の患者の血漿サンプルを、7日間または4日間投与された配列番号22のアンチセンスオリゴヌクレオチドの異なる用量のAUC_{0からt最後}について、さらに調査した。結果は、7日間の80 mg/m/日の投与、または4日間の140 mg/m/日の投与は、総量560 mg/m²/日のアンチセンスオリゴヌクレオチドに至るものの、予想外に、4日間の投与（図５）は、7日間の投与（図６）よりも高いAUC、すなわち血漿中におけるより高いアンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的利用能に至ったことを示した。
［参考文献］

Claims (12)

1. 腫瘍増殖因子TGF-β2、TGF-β1および/またはTGF-β3のmRNAとハイブリダイズし、8個から30個のヌクレオチドビルディングブロックを含む、腫瘍を予防および/または治療するための薬剤組成物を調製するための、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用であって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを、400 mg/m²/治療サイクルから800 mg/m²/治療サイクルの量で静脈内投与する、使用。
2. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、560 mg/m²/治療サイクルから760 mg/m²/治療サイクルの量で静脈内投与される、請求項１に記載の使用。
3. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号２２、配列番号１及び配列番号５８からなる群より選択される、請求項１または２に記載の使用。
4. 腫瘍が、膵臓癌、悪性メラノーマ、及び結腸癌からなる群より選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
5. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15サイクル投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
6. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが1サイクルあたり1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、又は15日投与される、請求項５に記載の使用。
7. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが連続した複数の日に投与される、請求項６に記載の使用。
8. サイクルの間の時間間隔が、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、又は15日である、請求項５から７のいずれか一項に記載の使用。
9. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが1サイクルから10サイクル投与される、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
10. 治療サイクルが、7日の80 mg/m²/日の投与とそれに続く7日の無治療間隔、あるいは4日の140 mg/m²/日又は190 mg/m²/日の投与とそれに続く10日の無治療間隔を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
11. 4日の治療サイクルに対するAUCが、7日の治療サイクルに対するものより高い、請求項１０に記載の使用。
12. 腫瘍増殖因子TGF-β2、TGF-β1及び/又はTGF-β3のmRNAとハイブリダイズし、8個から30個のヌクレオチドビルディングブロックを含む、腫瘍を予防及び/又は治療するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、400 mg/m²/治療サイクルから800 mg/m²/治療サイクルの量で静脈内投与するために適するアンチセンスオリゴヌクレオチド。