JP2009207364A - 植物由来高重合度フルクタン合成スクロース:フルクタン−6−フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】所定のDNAからなるスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びそれによってコードされるタンパク質。
【選択図】なし
Description
[1] 以下の(a)〜(f)のいずれかのDNAからなる、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子:
(a) 配列番号1に示される塩基配列上の少なくとも68位〜1939位を含む塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号1に示される塩基配列上の少なくとも245位〜1939位を含む塩基配列からなるDNA
(c) 配列番号1に示される塩基配列上の少なくとも245位〜1939位を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(d) 配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードするDNA
(e) 配列番号2に示されるアミノ酸配列上の少なくとも60位〜623位を含むアミノ酸配列をコードするDNA
(f) 配列番号2に示されるアミノ酸配列上の少なくとも60位〜623位を含むアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列上の少なくとも60位〜623位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 配列番号2に示されるアミノ酸配列上の少なくとも60位〜623位を含むアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
このタンパク質は、1-ケストースに対するよりも6-ケストースに対してより高い基質特異性を有することが好ましい。
[4] 上記[1]の遺伝子又は上記[3]の組換えベクターが導入された形質転換体。一実施形態では、この形質転換体は形質転換植物であってよい。
[5] 上記[4]の形質転換体において前記遺伝子を発現させて、産生されたタンパク質を採取することを含む、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼタンパク質の製造方法。
[6] 上記[2]のタンパク質に基質としてスクロースを加えて反応させることを含む、フルクタンを製造する方法。この方法では、基質としてさらにフルクタンを加えてもよい。
[7] 上記[1]の遺伝子又は上記[3]の組換えベクターを導入して植物を形質転換することを含む、植物におけるフルクタン含量を増加させる方法。
1.本発明のスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ
一般にスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ(6-SFT)は、スクロースを基質として反応させると、スクロースを分解してグルコースとフルクトースを生成する活性を有するとともに、生成したフルクトースをスクロースにβ-2,1結合又はβ-2,6結合で転移させて1-ケストース又は6-ケストース(3糖フルクタン)を合成し、さらにフルクトースを1-ケストースや6-ケストース等のフルクタンにβ-2,6結合で転移させてより長鎖のレバン型フルクタンを合成する活性を有する。レバン型フルクタンとは、スクロースのフルクトース残基にβ-2,6結合で重合した1個又は2個以上のフルクトース残基を含むフルクタンをいう。本発明においてスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ活性とは、基質として加えたスクロースから3糖以上のレバン型フルクタンを合成できる活性をいう。
- 使用機器:イオンクロマトグラフDX500(ダイオネックス社)
- 分離カラム:PA1
- 分離溶液:150mM 水酸化ナトリウム(A液)と150mM 水酸化ナトリウム, 0.5M 酢酸ナトリウム(B液)によるグラジエント溶出
- 流速:毎分1ml
- 分離温度:室温
本発明の遺伝子は、上述のスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ(6-SFT)タンパク質をコードする遺伝子である。
上記のようにして単離される本発明の6-SFT遺伝子は、ベクター中にクローニングして組換えベクターを作製することが好ましい。
本発明では、本発明の6-SFT遺伝子を宿主に導入することにより形質転換体(形質転換細胞、形質転換植物など)を作製することができる。具体的には、例えば、本発明の6-SFT遺伝子を宿主細胞に導入することにより形質転換細胞を作製することができる。宿主細胞には、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞(例えば、哺乳動物細胞)、植物細胞等、いずれを使用してもよい。本発明においては、例えば本発明の6-SFTを生産する目的では、特に酵母細胞(メタノール資化性酵母(Pichia pastoris)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces pombe)等)を宿主細胞として使用することがより好ましい。一方、形質転換植物を作製するためには、本発明の6-SFT遺伝子を植物細胞に導入する必要がある。
本発明の6-SFTタンパク質のスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ活性を利用して、高重合度フルクタンを製造することができる。
〔実施例1〕スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の単離
1)低温条件下のチモシーに由来するcDNAライブラリーの作製
札幌市の自然条件下で圃場において栽培したイネ科牧草のチモシー(Phleum pratense L.)の品種「ホクシュウ」のクラウン部分をハードニングがかかっていると考えられる11月15日にサンプリングし、常法に従って全RNAを抽出した(例えば、Sambrookら, 1989,「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照されたい)。この全RNAより、mRNAをOligotexTM-dT30 <Super>(TAKARA社製)を用いて単離した。得られたmRNA 5μgを鋳型として用いて、cDNA合成キット(STRATAGENE社製)を利用してRT-PCRを行い、cDNAを合成した。具体的方法は、cDNA合成キット添付のマニュアルに従った。
まず既知のフルクトシルトランスフェラーゼの保存配列に基づいてプライマーを設計し、上記のcDNAライブラリーをテンプレートとしてPCRを行った。その結果、プライマー(5'- GAGATGCTGCAGTGGCAGCG -3'(配列番号4)、5'- CCNARYGMGTAGTAGTCGTG -3'(配列番号5))を用いてPCRを行ったところ、フルクトシルトランスフェラーゼと推測されるcDNA部分断片(配列番号3)を得ることができた。このcDNA部分断片は725bpからなり、BLAST検索の結果、ドクムギ(Lolium temulentum)の推定6-フルクトシルトランスフェラーゼmRNAの配列(Gallagher et al. J. Exp. Bot. 55: 557-569 (2004))に対して最も高い塩基配列相同性(83%の同一性)を示した。
実施例1で取得したチモシー由来遺伝子について、以下のようにして活性確認を行って、その遺伝子がスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを確認した。
1)酵母形質転換体の作製
実施例1で示したcDNAクローンの成熟型タンパク質コード領域と予想される領域(配列番号1の245位〜1939位の塩基配列;配列番号2のアミノ酸配列の60位〜623位の配列をコードする)を、上記クローンを鋳型としてPCRにより増幅し、酵母用発現ベクターpPICZαA(Invitrogen社製、Easy Select Pichia Expression Kit)のマルチクローニングサイト内に組み込み、組換え発現ベクターを作製した。このようにして作製した組換え発現ベクターを、エレクトロポレーション法によりメタノール資化性酵母(Pichia pastoris)中に導入した。
上記のようにして組換え発現ベクターにより形質転換したメタノール資化性酵母を、前培養として3ml BMGY培地(1% 酵母エキス、2% ペプトン、1.34% YNB(yeast nitrogen base;酵母窒素源基礎培地)、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、0.00004% ビオチン、1% グリセロール)中で150rpmで振とうしながら30℃で2日間培養した。次に本培養として、前培養液から遠心分離により得られた菌体を20ml BMMY培地(1% 酵母エキス、2% ペプトン、1.34% YNB(yeast nitrogen base;酵母窒素源基礎培地)、100mM リン酸カリウム(pH6.0)、0.00004% ビオチン、0.5% メタノール)中に移し、250rpmにて振とうしながら30℃で7日間培養した。培養中は毎日400μl メタノールを追加した。
<HPAEC-PAD分析条件>
- 使用機器:イオンクロマトグラフDX500(ダイオネックス社)
- 分離カラム:PA1
- 分離溶液:150mM 水酸化ナトリウム(A液)と150mM 水酸化ナトリウム, 0.5M 酢酸ナトリウム(B液)によるグラジエント溶出
- 流速:毎分1ml
- 分離温度:室温
チモシー由来6-SFTの基質特異性を調べるため、25mM スクロースと100mM 1-ケストース、又は25mM スクロースと100mM 6−ケストースを混合して含む20mM クエン酸リン酸緩衝液(pH 5.0)に、上記で得たチモシー由来粗酵素液を総液量の1/10量混合して、25℃で3時間インキュベートして反応させた。比較のため、既知のコムギ由来スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼを同様に調製し、酵素反応させた。これらの反応産物を、上記と同様の条件で、陰イオン交換クロマトグラフィーとパルスドアンペロメトリ検出法を利用するHPAEC-PAD分析にかけた。
Claims (11)
- 以下の(a)〜(f)のいずれかのDNAからなる、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ遺伝子。
(a) 配列番号1に示される塩基配列上の少なくとも68位〜1939位を含む塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号1に示される塩基配列上の少なくとも245位〜1939位を含む塩基配列からなるDNA
(c) 配列番号1に示される塩基配列上の少なくとも245位〜1939位を含む塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
(d) 配列番号2に示されるアミノ酸配列をコードするDNA
(e) 配列番号2に示されるアミノ酸配列上の少なくとも60位〜623位を含むアミノ酸配列をコードするDNA
(f) 配列番号2に示されるアミノ酸配列上の少なくとも60位〜623位を含むアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA - 1-ケストースに対するよりも6-ケストースに対してより高い基質特異性を有するスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼをコードする、請求項1に記載の遺伝子。
- 以下の(a)〜(c)のいずれか1つであるスクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼタンパク質。
(a) 配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号2に示されるアミノ酸配列上の少なくとも60位〜623位を含むアミノ酸配列からなるタンパク質
(c) 配列番号2に示されるアミノ酸配列上の少なくとも60位〜623位を含むアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質 - 1-ケストースに対するよりも6-ケストースに対してより高い基質特異性を有する、請求項3に記載のタンパク質。
- 請求項1又は2に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項1若しくは2に記載の遺伝子又は請求項5記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
- 形質転換植物である、請求項6に記載の形質転換体。
- 請求項6に記載の形質転換体において前記遺伝子を発現させて、産生されたタンパク質を採取することを含む、スクロース:フルクタン-6-フルクトシルトランスフェラーゼタンパク質の製造方法。
- 請求項3又は4に記載のタンパク質に基質としてスクロースを加えて反応させることを含む、フルクタンを製造する方法。
- 基質としてさらにフルクタンを加える、請求項9に記載の方法。
- 請求項1若しくは2に記載の遺伝子又は請求項5記載の組換えベクターを導入して植物を形質転換することを含む、植物におけるフルクタン含量を増加させる方法。
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