JP2009204657A

JP2009204657A - 細胞把持・回転観察装置

Info

Publication number: JP2009204657A
Application number: JP2008043987A
Authority: JP
Inventors: Tateo Matsumoto; 健郎松本; Hironori Ohara; 大典大原; Kazusuke Nagayama; 和亮長山
Original assignee: Nagoya Institute of Technology NUC
Current assignee: Nagoya Institute of Technology NUC
Priority date: 2008-02-26
Filing date: 2008-02-26
Publication date: 2009-09-10

Abstract

【課題】高精度かつ迅速な細胞内3次元微細構造の観察可能な細胞把持・回転観察装置を提供する。
【解決手段】顕微鏡の回転軸に取り付けられたピペット回転軸に空気軸受を導入し，ピペットの回転精度を向上させることによって，より高精度かつ迅速な細胞内3次元微細構造の観察を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は細胞把持・回転観察装置に関する。

細胞は生体組織を構成している最小構成単位であり，その機能によって様々な生命現象が維持されている。最近は，細胞内の核や，アクチンフィラメント，微小管などの細胞骨格の位置関係が，細胞の機能に深く関与していることが指摘されており，細胞内の微細構造物が細胞内で空間的にどのように配置されているかを詳細に知ることが極めて重要と考えられ始めている。

このような細胞内微細構造を3次元的に観察するために，共焦点レーザ顕微鏡を用いて試料の厚み方向に焦点面をずらしながら複数枚の画像を撮影し，それらをコンピュータ処理にて重ね合わせ，3次元再構成する手法が広く用いられている。しかし，この手法では試料の厚み方向の分解能が焦点面内の分解能に比べ低いために，細胞内微細構造の空間的配置を詳細に把握することは困難であった。

そこで本発明者らは、顕微鏡下にマイクロピペットで細胞を吸引・把持し，顕微鏡光軸と直交する軸周りに回転させ，様々な方向からの像を得て細胞内の3次元微細構造を観察する細胞把持回転観察システムの開発を進めており，最近は，CTの原理（非特許文献１）を応用して核や細胞骨格の詳細な3次元像を得ることに成功している（非特許文献２）。しかし，細胞を回転させながら，その位置を常に顕微鏡視野の中心に制御することが難しく，回転画像の撮影に長時間を要するといった問題点があった。
石野洋二郎, 大岩紀生, 日本燃焼学会誌, 46 (137): pp.142-152 (2004) 小川雅之，和家史知，長山和亮，石野洋次郎，松本健郎，日本機械学会2006年度年次大会講演論文集pp.279-280 (2006)従来の細胞把持回転観察装置では，先端が10 mm程度になるように加工したガラスマイクロピペット (以下ピペット) で細胞を吸引・把持し，顕微鏡の光軸と直交する軸周りに回転させ，様々な方向から観察，撮影し画像を取得する。ここで顕微鏡光軸方向をz，ピペット回転方向をy，両方の軸と直交する方向をxと定義する。

従来の装置では，回転に伴うピペット先端の位置ずれを補正するために，まず，ピペット先端位置を粗調整用のマイクロメータヘッドで回転軸上に合せた後，軸受部に取り付けられた2台の微調整用圧電アクチュエータをパーソナルコンピュータで制御し，さらにロータリエンコーダを用いて回転中のピペットの回転角度情報をパーソナルコンピュータにフィードバックすることでピペット先端位置のx，z方向の制御を行っていた。しかし，従来の装置では，軸受けのガタのために，回転に伴いピペット先端が回転軸から最低でもプラスマイナス2 mm程度ずれてしまうことや，ピペット先端が周期的にy方向へ移動してしまうこと，そもそもピペット先端を回転軸上に厳密に合せるのが難しいといった問題点があったため，3次元像を得るには画像の中心位置を手作業で修正する必要があった。また，細胞把持時にはピペット先端を一時的に傾斜させる必要があるが，ピペットが乗ったステージをマイクロメータヘッドを用いた機構により傾斜させる方式を採用していたために，マイクロメータを操作する際に生じる振動によって把持した細胞が脱落してしまうという問題もあった。
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであって、より高精度かつ迅速な細胞内3次元微細構造の観察可能な細胞把持・回転観察装置を提供することを解決すべき課題としている。

本発明の細胞把持・回転観察装置は、顕微鏡ステージ上の回転軸に取り付けられたピペットなどの吸引器具と前記回転軸の軸受としての空気軸受とを備え、前記回転軸を前記空気軸受にゴムなどの弾性体を介して結合し，前記回転軸の角度を前記軸受側に固定された位置決め機構で調整することを特徴とする。
本発明によれば，細胞把持回転観察装置のピペット回転軸に空気軸受を導入し，ピペットの回転精度を向上させることによって，より高精度かつ迅速な細胞内3次元微細構造の観察が可能である。

細胞の３次元微細構造を観察するために，ピペットで細胞を把持するなどして，これを顕微鏡下に回転させ，様々な方向からの像を得て，これをもとに細胞内部の微細構造を３次元再構築する装置である。従来よりこのアイディアはあったが，ピペットを回転軸回りに正確に軸あわせをして回転させることが困難であったこと，また，通常の軸受けでは回転軸自体が回転に伴い動揺することなどから，実現可能性は低かった。また，ピペット先端位置を画像処理により得て，これをフィードバックすることで先端位置を一定に保つ方法もあったが，落射蛍光観察などピペット先端が見えない条件では使用できなかった．そこで，軸受に空気軸受を採用し，さらに軸あわせの機構を工夫することで顕微鏡視野内でほぼズレのない回転を実現することができた。これにより，顕微鏡下の細胞などの微小物体をリアルタイムで３次元的に回してみることができるようになり，細胞回転観察法を実施可能なレベルに引き上げることに成功した。また，この方法を顕微鏡下の微細操作に応用することで，その自由度が格段に向上することになる．

以下、本発明を具体化した実施例を図面を参照しつつ説明する。

本発明では、回転に伴うピペット先端の位置ずれを解消するために，回転機構に小型の空気軸受 (AB-30R, Canon) を導入した。空気軸受とは，加圧空気を軸受内部に通気して回転軸との間に薄い空気膜を形成することにより，低摩擦かつ高精度で軸を回転することができる軸受である。この軸受を導入した新たな回転観察機構の概要を図１に示す。ピペットを取り付けるためのステンレス軸を空気軸受に弾性的に固定するために，ステンレス軸にシリコーンゴムを巻き，空気軸受の片側とステンレス軸に押さえ板を取り付け，それぞれの押さえ板でシリコーンゴムを挟むことで空気軸受にステンレス軸を1カ所で固定する（図２）。固定を1カ所に限ることによってステンレス軸の角度を容易に変えることができるようにした。そして，回転中心軸に垂直な面内の直交する2方向からマイクロメータヘッドとバネを用いてステンレス軸の芯出しを行えるようにした。このとき，各マイクロメータヘッドの対面にマイクロメータヘッドと同重量のバランサを取り付け，空気軸受の回転バランスを保てるよう工夫した。

さらに，細胞把持時にピペットを傾斜させる際の振動を取り除くために，ステージの傾斜は液圧マニピュレータ (HYM-EP501R, シグマ光機) で調整する方式とした。このことにより，把持した細胞がピペットから外れることなくピペットの角度を調整することができるようになった(図３)。
試作した機構を用いてピペット先端の位置ずれの評価実験を行った。ピペットをステンレス軸に取り付け，装置を倒立顕微鏡に設置した。そしてピペットを回転させ，対物レンズの倍率を段階的に上げながらピペット先端のずれを確認し，芯出しをおこなった。芯出し作業終了後，回転中のピペット先端の様子をCCDカメラ (ORCA, 浜松ホトニクス) で撮影し，画像解析ソフト (ImageJ, NIH) を用いて得られた画像からピペット先端の座標を求め，回転中のピペットの移動量を求めた (図４，５)。
従来の装置では，ピペットの移動量は回転軸を中心にプラスマイナス2 mm程度であり，さらにピペット先端が不規則に移動していた。これは，圧電アクチュエータを用いて位置制御を行っていたため，圧電アクチュエータが伸縮する際に生じるヒステリシスの影響ではないかと考えられる。一方で空気軸受を導入することでピペット先端の移動量は0.5 mm未満に抑えることが可能となり，滑らかな回転を実現することが可能となった (図４) 。また，従来のシステムではピペット先端が周期的にy方向 (軸方向) に移動するという問題が生じていたが，この問題も空気軸受を導入することによって大幅に改善されたことが確認できた (図５)。さらに，一回転あたり最低でも20 秒の時間を要していたが，空気軸受を導入することによって，そのような時間的制約を受けることがなくなった。
本装置を用いて，実際に細胞の回転観察を行った。試料には基板から剥離し丸くなった状態のラット胸大動脈由来培養血管平滑筋細胞を用いた。予め細胞核を蛍光染色しておき，本装置を用いて正立顕微鏡 (BX61, Olympus) 下で把持し，4.5°間隔で0°から180°回転させ，細胞の微分干渉画像と核の蛍光画像をそれぞれ40枚ずつ撮影した。細胞核については，撮影した蛍光画像を用いて3次元再構築画像を作成した。

観察，撮影に要した時間は10分程度であり，位置合わせすることなく観察することができた(図６)。

本発明の細胞把持・回転観察装置は，細胞をはじめとする微小物体の３次元微細構造を観察するような分野，あるいは例えば顕微授精のように微小物体の移動・回転などの操作をリアルタイムで必要とする様々な分野に利用可能である。

空気軸受を導入した本発明の回転観察機構の概要図を示す説明図である。回転軸を空気軸受に1カ所で固定することを示す説明図である。把持した細胞がピペットから外れることなくピペットの角度を調整することができるようになったことを説明する図である。画像解析ソフト (ImageJ, NIH) を用いて得られた画像からピペット先端の座標を求め，回転中のピペットのＸ方向の移動量を求めたことを示す図である。画像解析ソフト (ImageJ, NIH) を用いて得られた画像からピペット先端の座標を求め，回転中のピペットのＹ方向の移動量を求めたことを示す図である。実際に細胞の回転観察を示す撮影図である。

Claims

顕微鏡ステージ上の回転軸に取り付けられたピペットなどの吸引器具と前記回転軸の軸受としての空気軸受とを備え、前記回転軸を前記空気軸受にゴムなどの弾性体を介して結合し，前記回転軸の角度を前記軸受側に固定された位置決め機構で調整することを特徴とする細胞把持・回転観察装置。