JP2009145567A - 走査顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】より確実に標本を観察できるようにする。
【解決手段】コントローラ１２は、標本上の共振型スキャナ２６により励起光が走査される領域と、ガルバノスキャナ２５により刺激光が走査される領域とを一致させるために、ガルバノスキャナ２５の駆動信号を補正する補正値を求める。そして、ガルバノスキャナ２５および共振型スキャナ２６を同時に駆動させて、標本を共焦点観察する場合、コントローラ１２は、求めた補正値により駆動信号を補正し、補正後の駆動信号によりガルバノスキャナ２５を駆動させる。本発明は、共焦点顕微鏡に適用することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は走査顕微鏡に関し、特に、複数のスキャナを用いて標本を観察する場合に用いて好適な走査顕微鏡に関する。

通常、共焦点観察に用いられるレーザ走査顕微鏡では、標本上でレーザ光を走査させるスキャナには、互いに直交する２方向への走査を行うために、２つの走査ミラーが設けられている。すなわち、スキャナに設けられた１つの走査ミラーによりレーザ光の所定方向への走査が行われ、他の走査ミラーにより、その方向と直交する方向への走査が行われる。

従来、観察対象の標本を共焦点観察する場合には、観察目的に適したスキャナが搭載されたレーザ走査顕微鏡が選択的に用いられて、標本の観察が行われていた。例えば、動きのない標本を観察する場合には、低速走査用のスキャナが設けられたレーザ走査顕微鏡が用いられ、生体などの動きのある標本を観察する場合には、高速走査用のスキャナが設けられたレーザ走査顕微鏡が用いられる。

また、近年、標本に照明光を照射して照明すると同時に、標本の刺激など、照明とは異なる目的で、照明光とは異なる光を標本に照射できるようにすることが求められている。そこで、２つのスキャナを設けて、異なる光源からの光のそれぞれを、異なるスキャナで独立に走査できるようにするレーザ走査顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

特開平１０−２０６７４２号公報

しかしながら、標本に対して、２つのスキャナを用いて異なる光を走査させる場合、スキャナの固定位置のずれなどの機械的なずれや、スキャナの駆動信号の電圧誤差などの電気的なずれにより、標本の所望する位置を正確に走査することができず、標本を確実に観察できないことがあった。

例えば、１つのスキャナを用いて標本上で励起光を走査させるとともに、他のスキャナを用いて標本上で刺激光を走査させて、刺激光による刺激を受けた標本からの蛍光を撮像しようとする場合に、標本上の励起光により走査される領域と、刺激光により走査される領域とがずれてしまい、標本の刺激を受けた部位を撮像できなくなる恐れがあった。

また、スキャナの位置を機構的に調整し、スキャナの機械的なずれや電気的なずれによる影響を抑制することは困難であった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、より確実に標本を観察することができるようにするものである。

本発明の第１の走査顕微鏡は、第１の光を反射して観察対象の標本に照射する反射面を有し、その反射面を回動させて前記第１の光を前記標本上で走査させる第１のスキャナと、第２の光を反射して前記標本に照射する反射面を有し、その反射面を回動させて前記第２の光を前記標本上で走査させる第２のスキャナと、前記標本上の前記第１の光により走査される第１の領域と、前記標本上の前記第２の光により走査される第２の領域とのずれに基づいて、前記第１の領域と前記第２の領域とが一致するように、前記第１のスキャナを駆動させる駆動信号の補正値を生成する生成手段とを備えることを特徴とする。

本発明の第２の走査顕微鏡は、第１の光を反射して観察対象の標本に照射する反射面を有し、その反射面を回動させて前記第１の光を前記標本上で走査させる第１のスキャナと、第２の光を反射して前記標本に照射する反射面を有し、その反射面を回動させて前記第２の光を前記標本上で走査させる第２のスキャナと、前記標本上の前記第１の光により走査される第１の領域と、前記標本上の前記第２の光により走査される第２の領域とのずれに基づいて生成された、前記第１の領域と前記第２の領域とを一致させるための補正値を用いて、前記第１のスキャナを駆動させる駆動信号を補正する補正手段とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、より確実に標本を観察することができる。

以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。

図１は、本発明を適用した共焦点観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。

この共焦点観察システムは、レーザ走査顕微鏡１１、コントローラ１２、およびコンピュータ１３から構成される。レーザ走査顕微鏡１１は、観察対象の標本を共焦点観察する共焦点顕微鏡であり、レーザ走査顕微鏡１１により撮像された標本の画像が、コントローラ１２を介してコンピュータ１３に供給されて表示される。

レーザ走査顕微鏡１１は、レーザユニット２１、コリメートレンズ２２、ダイクロイックミラー２３、光路切り替えユニット２４、ガルバノスキャナ２５、高速ガルバノスキャナ２６、光路切り替えユニット２７、リレーレンズ２８、対物レンズ２９、ステージ３０、集光レンズ３１、ピンホール絞り３２、および光検出器３３から構成される。

レーザユニット２１には、標本に照射する励起光を射出するレーザ光源４１と、標本に刺激を与える刺激光を射出するレーザ光源４２とが設けられており、レーザ光源４１からの励起光およびレーザ光源４２からの刺激光は、コンバイナミラー４３により１つの光束とされて音響光学素子４４に入射する。

音響光学素子４４は、コントローラ１２の制御に基づいて、透過させる光の波長や強度を変化させる。すなわち、音響光学素子４４は、コンバイナミラー４３から入射した励起光および刺激光の何れか一方または両方を、所定の強度で透過させ、ファイバカプラ４５によりレーザユニット２１に接続されている光ファイバ４６に入射させる。

光ファイバ４６は、音響光学素子４４から入射した光を伝送し、コリメートレンズ２２に入射させ、コリメートレンズ２２は、光ファイバ４６からの光を集光して平行光とし、ダイクロイックミラー２３を介して光路切り替えユニット２４に入射させる。

光路切り替えユニット２４は、例えば、複数のダイクロイックミラー、全反射ミラー、ハーフミラーなどからなり、コントローラ１２の制御に基づいて、入射した光の光路を切り替える。例えば、光路切り替えユニット２４は、ダイクロイックミラー２３からの光のうち、刺激光を反射してガルバノスキャナ２５に入射させ、励起光を透過させて高速ガルバノスキャナ２６に入射させる。

ガルバノスキャナ２５（周波数約500Hz）は、標本に照射される光を、標本上で図中、左右方向（以下、ｘ方向と称する）に走査させる主走査ミラーと、光を標本上でｘ方向と垂直な図中、奥行き方向（以下、ｙ方向と称する）に走査させる副走査ミラーとを備えている。ガルバノスキャナ２５は、光路切り替えユニット２４からの光を、主走査ミラーおよび副走査ミラーの反射面で反射して光路切り替えユニット２７に入射させるとともに、主走査ミラーおよび副走査ミラーを回動させて、標本上で光を走査させる。

高速ガルバノスキャナ２６は、高速走査可能なスキャナ（周波数約2000Hz）であり、標本に照射される光を、標本上でｘ方向に走査させる主走査ミラーと、光を標本上でｙ方向に走査させる副走査ミラーとを備えている。高速ガルバノスキャナ２６は、光路切り替えユニット２４からの光を主走査ミラーおよび副走査ミラーの反射面で反射して光路切り替えユニット２７に入射させるとともに、主走査ミラーおよび副走査ミラーを回動させて標本上で光を走査させる。なお、以下の説明において、主走査ミラーおよび副走査ミラーを特に区別する必要のない場合、単に走査ミラーとも称する。

光路切り替えユニット２７は、例えば、複数のダイクロイックミラー、全反射ミラー、ハーフミラーなどからなり、コントローラ１２の制御に基づいて、入射した光の光路を切り替える。例えば、光路切り替えユニット２７は、ガルバノスキャナ２５からの刺激光を反射してリレーレンズ２８に入射させるとともに、高速ガルバノスキャナ２６からの励起光を透過させてリレーレンズ２８に入射させる。

リレーレンズ２８は、例えば複数のレンズからなり、光路切り替えユニット２７からの光を、対物レンズ２９を介してステージ３０上に載置された標本に照射する。

また、標本からの光は、標本に入射した光の光路を逆方向に通って、ダイクロイックミラー２３に入射する。例えば、標本に励起光が照射されると、標本は蛍光を発現する。そして、この蛍光は、対物レンズ２９乃至光路切り替えユニット２７を介して高速ガルバノスキャナ２６に入射し、さらに高速ガルバノスキャナ２６の反射面で反射し、光路切り替えユニット２４を介してダイクロイックミラー２３に入射する。

ダイクロイックミラー２３は、光路切り替えユニット２４からの光を反射して、集光レンズ３１を介してピンホール絞り３２に入射させる。つまり、ダイクロイックミラー２３は、励起光および刺激光の波長の光を透過させ、蛍光の波長の光を反射する。

ピンホール絞り３２は、標本の観察面と光学的に共役な位置に配置され、標本からの光のうち、観察面からの光だけがピンホール絞り３２に設けられたピンホールを通過するようになされている。光検出器３３は、ピンホール絞り３２からの光を検出し、これにより得られた光強度値（その後、電気信号に変換）を、蛍光の２次元の光強度分布データとしてコントローラ１２に供給する。

コントローラ１２は、コンピュータ１３の指示に応じて、レーザ走査顕微鏡１１のレーザユニット２１、光検出器３３、および光路切り替えユニット２４乃至光路切り替えユニット２７の動作を制御する。また、コントローラ１２は、光検出器３３からの光強度値に基づいて、標本の観察面の２次元画像を生成してコンピュータ１３に供給し、表示させる。

ところで、コントローラ１２がガルバノスキャナ２５および高速ガルバノスキャナ２６の動作を制御する場合、コントローラ１２は、駆動テーブルを用いて主走査ミラーおよび副走査ミラーを、一定の周期および振幅で回動させる。

ここで、駆動テーブルとは、各時刻における走査ミラー（主走査ミラーまたは副走査ミラー）の回動角度を示す電圧値が並べられたデータをいい、駆動テーブルは走査ミラーごとに設けられている。例えば、コントローラ１２が、駆動テーブルから時刻ｔ０の電圧値を読み出して、その電圧値の駆動信号をガルバノスキャナ２５の主走査ミラーに供給すると、主走査ミラーは、回動角度が駆動信号により示される角度θ０となるように回動する。さらに、コントローラ１２が、駆動テーブルから時刻ｔ１の電圧値を読み出して、その電圧値の駆動信号を主走査ミラーに供給すると、主走査ミラーは、回動角度が駆動信号により示される角度θ１となるように、回動角度θ０の位置から回動角度θ１の位置まで回動する。

このようにして、コントローラ１２が駆動テーブルから順次、各時刻の電圧値を読み出して、その電圧値の駆動信号を走査ミラーに供給することで、走査ミラーを所望の振幅かつ周波数で回動（揺動）させることができる。なお、走査ミラーの周波数とは、所定の振幅で走査ミラーが周期的に回動するときの１秒間当たりの往復回数（振動回数）をいい、周波数は、駆動テーブルから各時刻の電圧値を読み出す時間間隔を変更することで、調整される。

ガルバノスキャナ２５および高速ガルバノスキャナ２６のそれぞれに設けられた走査ミラーの駆動テーブルは、例えば図２に示すように、コントローラ１２に設けられたＲＯＭ（Read Only Memory）７１に記録されている。図２では、コントローラ１２には、ＲＯＭ７１、制御部７２、ＲＡＭ（Random Access Memory）７３、Ｄ／Ａ（Digital/Analog）コンバータ７４、および増幅器７５が設けられている。

制御部７２は、ＲＯＭ７１から駆動テーブルを読み出してＲＡＭ７３に供給し、一時的に記録させる。また、制御部７２は、ＲＡＭ７３を制御し、コンピュータ１３から指定された時間間隔で、ＲＡＭ７３に記録されている駆動テーブルの各時刻の電圧値を、順次Ｄ／Ａコンバータ７４に供給させる。

すると、Ｄ／Ａコンバータ７４は、ＲＡＭ７３からの電圧値をデジタル／アナログ変換し、これにより得られたアナログの駆動信号を増幅器７５に供給する。そして、増幅器７５は、Ｄ／Ａコンバータ７４からの駆動信号を増幅し、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーに供給する。増幅器７５から駆動信号の供給を受けた主走査ミラーは、駆動信号に応じて回動する。

なお、図２の例では、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーに駆動信号を供給するためのＤ／Ａコンバータ７４および増幅器７５だけが図示されているが、実際には、ガルバノスキャナ２５の副走査ミラー、並びに高速ガルバノスキャナ２６の主走査ミラーおよび副走査ミラーのそれぞれに、駆動信号を供給するためのＤ／Ａコンバータおよび増幅器のそれぞれが、ＲＡＭ７３に接続されて設けられている。

このようにして、ガルバノスキャナ２５および高速ガルバノスキャナ２６が制御されると、標本には、励起光および刺激光が照射される。ところが、それらの光を標本の同じ領域に照射しようとしても、ガルバノスキャナ２５および高速ガルバノスキャナ２６の機械的および電気的なずれの影響により、例えば、図３Ａに示すように、標本において励起光が走査される領域と、刺激光が走査される領域とにずれが生じることがある。

図３Ａにおいて、図中、横方向はｘ方向とされ、縦方向はｙ方向とされている。また、領域Ｒ１１は、励起光が走査される領域を表しており、領域Ｒ１２は、刺激光が走査される領域を表している。領域Ｒ１１は、ｘ方向の長さがＸ１であり、ｙ方向の長さがＹ１である矩形の領域であり、領域Ｒ１２は、ｘ方向の長さがＸ２であり、ｙ方向の長さがＹ２である矩形の領域である。

図３Ａの例では、領域Ｒ１２は領域Ｒ１１に対して図中、右方向に△ｘ、下方向に△ｙだけずれた位置の領域となっている。ｘ方向の位置のずれ量△ｘは、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーと、高速ガルバノスキャナ２６の主走査ミラーとの回動角度のずれにより生じる。そのため、△ｘに対応する角度だけ回動角度がずれるように、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの駆動信号を補正すれば、△ｘを０とすることができる。例えば、主走査ミラーを回動（振動）させる角度の範囲が所定の位置を基準として０度から１５度であり、△ｘに対応する角度が１度である場合、回動角度の範囲が１度から１６度となるように、駆動信号が補正される。

同様に、ｙ方向の位置のずれ量△ｙは、ガルバノスキャナ２５の副走査ミラーと、高速ガルバノスキャナ２６の副走査ミラーとの回動角度のずれにより生じるため、△ｙに対応する角度だけ回動角度がずれるように、ガルバノスキャナ２５の副走査ミラーの駆動信号を補正すれば、△ｙを０とすることができる。

また、領域Ｒ１１と領域Ｒ１２とは、ｘ方向の長さおよびｙ方向の長さが異なっている。領域Ｒ１１および領域Ｒ１２は、光検出器３３において観察される標本の視野となる領域である。つまり、標本の領域Ｒ１１（または領域Ｒ１２）の部分の画像が、２次元画像としてコンピュータ１３に表示されることになるため、標本を観察するズーム倍率は、領域Ｒ１１の大きさにより定まる。

領域Ｒ１１および領域Ｒ１２のｘ方向の長さのずれは、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーと、高速ガルバノスキャナ２６の主走査ミラーとの回動の振幅のずれにより生じる。そのため、ｘ方向の長さのずれに対応する分だけ振幅が変化するように、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの駆動信号を補正すれば、領域Ｒ１１と領域Ｒ１２のｘ方向の長さを同じ長さとすることができる。

同様に、領域Ｒ１１および領域Ｒ１２のｙ方向の長さのずれに対応する分だけ振幅が変化するように、ガルバノスキャナ２５の副走査ミラーの駆動信号を補正すれば、領域Ｒ１１と領域Ｒ１２のｙ方向の長さを同じ長さとすることができる。

ここで、主走査ミラーの駆動信号を補正することを考える。主走査ミラーの駆動信号では、例えば図３Ｂに示すように、駆動信号の電圧方向の位置や傾きのずれは、領域Ｒ１１と領域Ｒ１２のｘ方向の位置や長さのずれとなって現れる。なお、図３Ｂにおいて、縦軸は主走査ミラーの角度に対応する電圧を示しており、横軸は時間を示している。

鋸歯状波Ｋ１１は高速ガルバノスキャナ２６の主走査ミラーの駆動信号を示しており、鋸歯状波Ｋ１２は、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの駆動信号を示している。より詳細には、鋸歯状波Ｋ１１および鋸歯状波Ｋ１２は、主走査ミラーが基準となる位置から所定の角度θだけ回動し、さらに、その位置から反対方向に角度θだけ回動して元の位置に戻るように主走査ミラーを駆動させる駆動信号、つまり主走査ミラーの振動の１周期分の駆動信号を示している。

例えば、鋸歯状波Ｋ１２が鋸歯状波Ｋ１１に対して、図中、上下方向にずれると、領域Ｒ１２の領域Ｒ１１に対するｘ方向の位置ずれが生じることになり、鋸歯状波Ｋ１２の傾きと鋸歯状波Ｋ１１の傾きとのずれが生じると、領域Ｒ１１と領域Ｒ１２とのｘ方向の長さのずれが生じる。

そこで、各時刻における鋸歯状波Ｋ１２の電圧値Ｄｎを次式（１）に基づいて補正し、電圧値Ｄｎ’とすることで、鋸歯状波Ｋ１２と鋸歯状波Ｋ１１とを一致させ、領域Ｒ１１と領域Ｒ１２とのｘ方向の位置や長さのずれを補正することができる。

Ｄｎ’＝ａ×Ｄｎ＋ｂ ・・・（１）

なお、式（１）においてａは倍率補正係数であり、鋸歯状波Ｋ１２の傾きを変化させる係数を示しており、ｂはオフセット値であり、鋸歯状波Ｋ１２の上下方向の位置を変化させる係数を示している。このように、鋸歯状波Ｋ１１に対して鋸歯状波Ｋ１２の適切な倍率補正係数ａおよびオフセット値ｂを求め、式（１）により各時刻の電圧値を補正して駆動テーブルを変更（補正）することで、領域Ｒ１１と領域Ｒ１２とのｘ方向のずれを補正することができる。

同様に、ｙ方向についてもガルバノスキャナ２５の副走査ミラーの駆動テーブルを補正することで、領域Ｒ１１と領域Ｒ１２とのｙ方向のずれを補正することができる。

つまり、制御部７２がガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの駆動テーブル、および副走査ミラーの駆動テーブルを補正することで、標本の励起光により走査される領域と、刺激光により走査される領域とを一致させることができ、確実に標本を観察することができるようになる。

標本を共焦点観察する場合、ユーザはコンピュータ１３を操作し、標本を観察する視野のズーム倍率および２次元画像のフレームレート、すなわち走査ミラーの振幅および周波数を指定する。そして、コントローラ１２は、ユーザにより指定された振幅および周波数の駆動テーブルに基づいて、ガルバノスキャナ２５および高速ガルバノスキャナ２６を制御する。

そのため、共焦点観察システムは、標本の共焦点観察の準備段階の処理として、振幅および周波数ごとの倍率補正係数ａとオフセット値ｂとからなる補正テーブルを生成する処理を行う。この補正テーブルは、例えば図４に示すように、図中、横方向をズーム倍率、つまり振幅とし、縦方向を周波数として、各振幅および周波数についての倍率補正係数ａｉｊとオフセット値ｂｉｊ（但し、１≦ｉ≦ｍ，１≦ｊ≦ｎ）とが並べられたものとされる。なお、以下、各周波数および振幅についての倍率補正係数ａとオフセット値ｂとのセットを、単に補正値とも称する。

このような補正テーブルが生成されて、ユーザにより振幅および周波数が指定されると、共焦点観察システムは、指定された振幅および周波数の補正値に基づいて駆動信号、すなわち駆動テーブルを補正し、標本の共焦点観察を開始する。

例えば、図４に示した補正テーブルが、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの補正テーブルであり、標本の共焦点観察時に、ユーザが周波数として１／２を指定し、ズーム倍率（振幅）として２を指定した場合には、倍率補正係数ａ２２およびオフセット値ｂ２２が用いられてガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの駆動テーブルが補正される。

次に、図５のフローチャートを参照して、共焦点観察システムが補正テーブルを生成する補正テーブル生成処理について説明する。なお、補正テーブル生成処理では、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーおよび副走査ミラーのそれぞれの補正テーブルが生成される。

ステップＳ１１において、制御部７２は、これから補正値（倍率補正係数およびオフセット値）を求めようとする振幅および周波数を設定する。

すなわち、制御部７２は、まだ補正値の求められていない走査ミラーの補正テーブルを保持し、各周波数および振幅を順番に選択して、それらの周波数および振幅の補正値を求めていく。そして、制御部７２は、求められた補正値を、順次、保持している補正テーブルに書き込んで補正テーブルを更新し、各周波数および振幅の補正値の書き込まれた最終的な補正テーブルを得る。

例えば、ステップＳ１１において、制御部７２は、まだ補正値の求められていない主走査ミラーの周波数および振幅のうち、図４の「周波数１，ズーム（振幅）１」を選択して設定する。

ステップＳ１２において、コントローラ１２は、高速ガルバノスキャナ２６を用いて標本を観察したときの撮像画像である基準画像を生成する。

すなわち、コントローラ１２の制御部７２は、所定の周波数および振幅で高速ガルバノスキャナ２６の主走査ミラー、および副走査ミラーのそれぞれを回動させるときの駆動テーブルのそれぞれをＲＯＭ７１から読み出して、ＲＡＭ７３に記録させる。そして、制御部７２は、ＲＡＭ７３を制御し、駆動テーブルの各時刻の電圧値を順次、Ｄ／Ａコンバータに供給させる。すると、Ｄ／Ａコンバータは、ＲＡＭ７３からの電圧値をデジタル／アナログ変換して得られた駆動信号を、増幅器を介して主走査ミラーおよび副走査ミラーに供給する。ここで、高速ガルバノスキャナ２６の振幅は、ガルバノスキャナ２５が、ステップＳ１１で設定された振幅で回動したときに標本上で光が走査される領域と、高速ガルバノスキャナ２６により光が走査される標本上の領域とが一致するような振幅（実際にはずれが生じる）とされる。

また、コントローラ１２は、レーザ走査顕微鏡１１の各部を制御して、標本を撮像させる。すなわち、レーザ光源４１は励起光を射出し、励起光をコンバイナミラー４３乃至ダイクロイックミラー２３を介して光路切り替えユニット２４に入射させる。光路切り替えユニット２４は、コントローラ１２の制御に基づいて、ダイクロイックミラー２３からの励起光を透過させ、高速ガルバノスキャナ２６に入射させる。

高速ガルバノスキャナ２６の主走査ミラーおよび副走査ミラーは、光路切り替えユニット２４からの励起光を反射して光路切り替えユニット２７に入射させるとともに、コントローラ１２からの駆動信号に応じて回動し、標本上で励起光を走査させる。高速ガルバノスキャナ２６からの励起光は、光路切り替えユニット２７乃至対物レンズ２９を介して、ステージ３０上の標本に照射される。

標本に励起光が照射されると、標本からは蛍光が発光する。この蛍光は、対物レンズ２９乃至光路切り替えユニット２７を介して高速ガルバノスキャナ２６に入射する。高速ガルバノスキャナ２６は、入射した蛍光を反射して、光路切り替えユニット２４を介してダイクロイックミラー２３に入射させる。また、ダイクロイックミラー２３に入射した蛍光は、ダイクロイックミラー２３において反射され、集光レンズ３１およびピンホール絞り３２を介して光検出器３３に入射し、受光される。

コントローラ１２は、光検出器３３が蛍光を受光することで得られた光強度値（その後、電気信号に変換）から、基準画像としての標本の２次元画像を生成する。

ステップＳ１３において、コントローラ１２は、ガルバノスキャナ２５を用いて標本を観察したときの比較画像を生成する。

すなわち、コントローラ１２は、ステップＳ１１において設定した周波数および振幅でガルバノスキャナ２５の主走査ミラーおよび副走査ミラーを回動させるときの駆動テーブルに基づいて、駆動信号をガルバノスキャナ２５の主走査ミラーおよび副走査ミラーに供給する。

また、コントローラ１２は、レーザ走査顕微鏡１１の各部を制御して、標本を撮像させる。すなわち、レーザ光源４１は励起光を射出し、励起光をコンバイナミラー４３乃至ダイクロイックミラー２３を介して光路切り替えユニット２４に入射させる。光路切り替えユニット２４は、コントローラ１２の制御に基づいて、ダイクロイックミラー２３からの励起光を反射して、ガルバノスキャナ２５に入射させる。

ガルバノスキャナ２５は、光路切り替えユニット２４からの励起光を反射して光路切り替えユニット２７に入射させるとともに、コントローラ１２からの駆動信号に応じて回動し、標本上で励起光を走査させる。ガルバノスキャナ２５からの励起光は、光路切り替えユニット２７乃至対物レンズ２９を介して、ステージ３０上の標本に照射される。

また、標本からの蛍光は、対物レンズ２９乃至光路切り替えユニット２７を介してガルバノスキャナ２５に入射し、ガルバノスキャナ２５は、入射した蛍光を反射して、光路切り替えユニット２４乃至ピンホール絞り３２を介して光検出器３３に入射させ、受光させる。コントローラ１２は、光検出器３３が蛍光を受光することで得られた光強度値（その後、電気信号に変換）から、比較画像としての標本の２次元画像を生成する。

ステップＳ１４において、コントローラ１２の制御部７２は、生成した基準画像と比較画像とから、設定された周波数および振幅の倍率補正係数ａｉｊを求める。

例えば制御部７２は、基準画像および比較画像を用いてマッチング処理を行い、標本におけるガルバノスキャナ２５により励起光が走査された領域と、高速ガルバノスキャナ２６により励起光が走査された領域とのｘ方向の位置のずれ量△ｘ、およびそれらの領域のｘ方向の長さの比Ｘ２／Ｘ１を求める。そして、制御部７２は、求めた長さの比Ｘ２／Ｘ１に基づいて、主走査ミラーの倍率補正係数ａｉｊを求める。

ステップＳ１５において、制御部７２は走査ミラーのオフセット値ｂｉｊを求める。例えば、制御部７２は、ｘ方向の位置のずれ量△ｘに基づいて、主走査ミラーのオフセット値ｂｉｊを求める。なお、ステップＳ１４およびステップＳ１５において、制御部７２は、ｙ方向の位置のずれ量や領域の長さの比に基づいて、副走査ミラーの補正値も求める。

そして、ステップＳ１６において、制御部７２は、求めた倍率補正係数ａｉｊおよびオフセット値ｂｉｊからなる補正値を、保持している補正テーブルの設定された周波数および振幅の欄に書き込んで、補正テーブルを更新する。

ステップＳ１７において、制御部７２は、補正テーブルの全ての周波数および振幅について、補正値を求めたか否かを判定する。ステップＳ１７において、まだ全ての周波数および振幅について、補正値を求めていないと判定された場合、処理はステップＳ１１に戻り、次の周波数および振幅が設定される。

これに対して、ステップＳ１７において、全ての周波数および振幅について、補正値が求められたと判定された場合、最終的な補正テーブルが得られたので、制御部７２は、最終的な補正テーブルをＲＡＭ７３に供給して記録させ、補正テーブル生成処理は終了する。

このようにして、共焦点観察システムは、基準画像と比較画像とから、各周波数および振幅についての補正値からなる補正テーブルを生成する。このように、補正テーブルを生成することで、標本の共焦点観察時に、ユーザにより指定されたズーム倍率（振幅）およびフレームレート（周波数）に対して、補正テーブルを用いて駆動テーブルを補正し、励起光および刺激光が走査される領域を一致させることができる。したがって、より確実に標本を観察することができる。

なお、ガルバノスキャナ２５を基準として、高速ガルバノスキャナ２６の駆動テーブルを補正するようにしてもよいが、高速ガルバノスキャナ２６の周波数は、変化させることができないことが多いので、高速ガルバノスキャナ２６を基準としてガルバノスキャナ２５の駆動テーブルを補正することが望ましい。

また、各周波数および振幅の基準画像と比較画像との位置のずれ量や長さの比、補正値の生成に必要な、走査される領域のずれに起因する値などが、予めＲＯＭ７１に記録されているようにしてもよい。そのような場合、補正テーブル生成処理において、それらの記録されているずれ量や長さの比等が用いられて補正値が求められる。

以上のようにして、補正テーブルが生成されると、共焦点観察システムは、補正テーブルを用いて駆動テーブルを補正し、ユーザにより指定されたズーム倍率およびフレームレートで、標本の共焦点観察を開始する。

以下、図６のフローチャートを参照して、共焦点観察システムが標本の共焦点観察を行う観察処理について説明する。

ステップＳ７１において、制御部７２は、ＲＯＭ７１からガルバノスキャナ２５の駆動テーブル、および高速ガルバノスキャナ２６の駆動テーブルを読み出す。すなわち、ユーザがコンピュータ１３を操作して、所望のズーム倍率およびフレームレートを指定すると、コンピュータ１３からコントローラ１２には、ユーザの操作に応じた信号が供給される。

コントローラ１２は、コンピュータ１３からの信号に基づいて、ガルバノスキャナ２５および高速ガルバノスキャナ２６のそれぞれについて、ユーザにより指定されたズーム倍率およびフレームレートに対応する振幅および周波数の駆動テーブルをＲＯＭ７１から読み出す。

ステップＳ７２において、制御部７２は、ＲＡＭ７３に記録されている補正テーブルに基づいて、読み出したガルバノスキャナ２５の駆動テーブルを補正する。例えば、ＲＡＭ７３に、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの補正テーブルとして、図４に示した補正テーブルが記録されており、ユーザにより「ズーム（振幅）１，周波数１」に対応するズーム倍率およびフレームレートが指定されたとする。

この場合、制御部７２は、補正テーブルにおける「振幅１，周波数１」により特定される補正値（倍率補正係数ａ１１およびオフセット値ｂ１１）に基づいて、式（１）を計算し、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの駆動テーブルを補正する。つまり、駆動テーブルの各時刻の電圧値をＤｎとした場合に、ａ１１×Ｄｎ＋ｂ１１が、補正後の各時刻の電圧値とされる。

また、ユーザにより指定されたズーム倍率およびフレームレートに対応する振幅および周波数が、補正テーブルにない振幅および周波数である場合、制御部７２は、補正テーブルに基づいて、対応する振幅および周波数の補正値を求める。

倍率補正係数またはオフセット値の大きさは、例えば図７に示すように、振幅または周波数が大きくなる（または小さくなる）にしたがって、大きくなるため、補正テーブルにない振幅および周波数の補正値を近似により求めても、充分な精度の補正値を得ることができる。なお、図７において、縦軸は倍率補正係数またはオフセット値を示しており、横軸は振幅または周波数を示している。

具体的には、例えば、指定されたズーム倍率およびフレームレートに対応する振幅および周波数が、「振幅１．５，周波数１」である場合、制御部７２は、「振幅１，周波数１」の補正値「ａ１１，ｂ１１」と、「振幅２，周波数１」の補正値「ａ１２，ｂ１２」とから、線形補間により補正値を求める。これにより、倍率補正係数（ａ１１＋ａ１２）／２、およびオフセット値（ｂ１１＋ｂ１２）／２が補正値として求まる。そして、制御部７２は、求められた補正値に基づいて、ガルバノスキャナ２５の主走査ミラーの駆動テーブルを補正する。

また、例えば、指定されたズーム倍率およびフレームレートに対応する振幅および周波数が、「振幅１，周波数３／４」である場合には、「振幅１，周波数１」の補正値「ａ１１，ｂ１１」と、「振幅１，周波数１／２」の補正値「ａ２１，ｂ２１」とから、線形補間により補正値が求められる。

制御部７２は、同様にして、ガルバノスキャナ２５の副走査ミラーの補正テーブルに基づいて、副走査ミラーの駆動テーブルも補正する。

図６のフローチャートの説明に戻り、ガルバノスキャナ２５の駆動テーブルが補正されると、制御部７２は、補正したガルバノスキャナ２５の駆動テーブルと、読み出した高速ガルバノスキャナ２６の駆動テーブルとをＲＡＭ７３に供給して記録させる。

そして、ステップＳ７３において、共焦点観察システムは、標本の共焦点観察を開始する。すなわち、コントローラ１２は、ＲＡＭ７３に記録されている駆動テーブルに基づいて、駆動信号をガルバノスキャナ２５および高速ガルバノスキャナ２６に供給する。

また、レーザユニット２１は、励起光および刺激光を、光ファイバ４６乃至ダイクロイックミラー２３を介して光路切り替えユニット２４に入射させる。光路切り替えユニット２４は、コントローラ１２の制御に基づいて、ダイクロイックミラー２３からの励起光を透過させて高速ガルバノスキャナ２６に入射させるとともに、刺激光を反射してガルバノスキャナ２５に入射させる。

ガルバノスキャナ２５は、光路切り替えユニット２４からの刺激光を反射して光路切り替えユニット２７に入射させるとともに、コントローラ１２からの駆動信号に応じて回動し、標本上で刺激光を走査させる。また、高速ガルバノスキャナ２６は、光路切り替えユニット２４からの励起光を反射して光路切り替えユニット２７に入射させるとともに、コントローラ１２からの駆動信号に応じて回動し、標本上で励起光を走査させる。

さらに、ガルバノスキャナ２５からの刺激光、および高速ガルバノスキャナ２６からの励起光は、光路切り替えユニット２７乃至対物レンズ２９を介して、ステージ３０上の標本に照射される。

また、標本からの蛍光は、対物レンズ２９乃至光路切り替えユニット２７を介して高速ガルバノスキャナ２６に入射し、高速ガルバノスキャナ２６は、入射した蛍光を反射して、光路切り替えユニット２４乃至ピンホール絞り３２を介して光検出器３３に入射させ、受光させる。コントローラ１２は、光検出器３３が蛍光を受光することで得られた撮像画像を取得し、取得した撮像画像から標本の２次元画像を生成する。

ステップＳ７４において、コンピュータ１３は、生成された２次元画像をコントローラ１２から取得して表示し、観察処理は終了する。

このようにして、コントローラ１２は、補正テーブルに基づいて駆動テーブルを補正し、補正した駆動テーブルに基づいてガルバノスキャナ２５を駆動させる。このように、駆動テーブルを補正することにより、標本上において、励起光が走査される領域と、刺激光が走査される領域とを一致させることができ、その結果、より確実に標本を観察することができる。つまり、標本上の蛍光観察される領域とは異なる領域に刺激光が照射されてしまうようなことはない。

なお、以上においては、レーザ走査顕微鏡１１を制御するコントローラ１２が、レーザ走査顕微鏡１１とは別に設けられていると説明したが、レーザ走査顕微鏡１１にコントローラ１２が設けられるようにしてもよい。

また、レーザ走査顕微鏡１１に２つのスキャナが設けられる例について説明したが、３以上のスキャナが設けられ、それらのスキャナの駆動テーブルが補正されるようにしてもよい。さらに、標本上の励起光が走査される領域と、刺激光が走査される領域とは、必ずしも同じ領域とされなくてもよい。レーザ走査顕微鏡１１によれば、これらの領域が異なる場合であっても、駆動テーブルを補正することにより領域同士のずれを相殺し、励起光および刺激光を所望の領域上で走査させることができる。

さらに、また、補正値（補正テーブル）により駆動テーブルが補正されると説明したが、駆動テーブルでなく、補正値により駆動信号そのものが補正されるようにしてもよい。

本実施形態では、複数のスキャナとして、ガルバノスキャナ２５と高速ガルバノスキャナ２６を用いた例を説明したが、高速ガルバノスキャナ２６を共振型スキャナに置き換えてもよい。

共振型スキャナは、主走査ミラーが機械的な共振点でしか振動できないため、周波数（走査周波数）を変更することはできない（副走査ミラーは、ガルバノスキャナの各走査ミラーと同じ）。したがって、その主走査ミラー固有の周波数に合致したサイン波の駆動信号で走査する必要がある。但し、振幅は、サイン波の波高値を決定する駆動テーブルの各時刻の電圧値を変更することで調整することができる。

このような事情から、各スキャナ間の走査領域のずれの補正は、専らガルバノスキャナ２５の主走査ミラーおよび副走査ミラーの各駆動信号を補正することより行う。補正方法は、前述したような方法が用いられる。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

本発明を適用した共焦点観察システムの一実施の形態の構成例を示す図である。 コントローラの詳細な構成例を示す図である。 光が照射される領域のずれについて説明する図である。 補正テーブルの一例を示す図である。 補正テーブル生成処理を説明するフローチャートである。 観察処理を説明するフローチャートである。 補正値の補間について説明する図である。

符号の説明

１１ レーザ走査顕微鏡， １２ コントローラ， １３ コンピュータ， ２１ レーザユニット， ２４ 光路切り替えユニット， ２５ ガルバノスキャナ， ２６ 高速ガルバノスキャナ， ２７ 光路切り替えユニット， ７１ ＲＯＭ， ７２ 制御部， ７３ ＲＡＭ

Claims (9)

1. 第１の光を反射して観察対象の標本に照射する反射面を有し、その反射面を回動させて前記第１の光を前記標本上で走査させる第１のスキャナと、
   第２の光を反射して前記標本に照射する反射面を有し、その反射面を回動させて前記第２の光を前記標本上で走査させる第２のスキャナと、
   前記標本上の前記第１の光により走査される第１の領域と、前記標本上の前記第２の光により走査される第２の領域とのずれに基づいて、前記第１の領域と前記第２の領域とが一致するように、前記第１のスキャナを駆動させる駆動信号の補正値を生成する生成手段と
   を備えることを特徴とする走査顕微鏡。
2. 前記生成手段は、前記第１の領域と前記第２の領域との位置のずれ量に基づいて、前記第１のスキャナの反射面の回動角度を補正する補正値を生成する
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
3. 前記生成手段は、前記第１の領域と前記第２の領域との所定方向の長さの比に基づいて、前記第１のスキャナの反射面を周期的に回動させる振幅を補正する補正値を生成する
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
4. 前記生成手段は、前記第１のスキャナの反射面を周期的に回動させる振幅および周波数ごとに、前記補正値を生成する
   ことを特徴とする請求項１に記載の走査顕微鏡。
5. 第１の光を反射して観察対象の標本に照射する反射面を有し、その反射面を回動させて前記第１の光を前記標本上で走査させる第１のスキャナと、
   第２の光を反射して前記標本に照射する反射面を有し、その反射面を回動させて前記第２の光を前記標本上で走査させる第２のスキャナと、
   前記標本上の前記第１の光により走査される第１の領域と、前記標本上の前記第２の光により走査される第２の領域とのずれに基づいて生成された、前記第１の領域と前記第２の領域とを一致させるための補正値を用いて、前記第１のスキャナを駆動させる駆動信号を補正する補正手段と
   を備えることを特徴とする走査顕微鏡。
6. 前記補正手段は、前記第１の領域と、前記第２の領域との位置のずれ量に基づいて生成された前記補正値を用いて前記駆動信号を補正することで、前記第１のスキャナの反射面の回動角度を補正する
   ことを特徴とする請求項５に記載の走査顕微鏡。
7. 前記補正手段は、前記第１の領域と、前記第２の領域との所定方向の長さの比に基づいて生成された前記補正値を用いて前記駆動信号を補正することで、前記第１のスキャナの反射面を周期的に回動させる振幅を補正する
   ことを特徴とする請求項５に記載の走査顕微鏡。
8. 前記補正手段は、前記第１のスキャナの反射面を周期的に回動させる振幅および周波数ごとに生成された前記補正値を用いて、前記駆動信号を補正する
   ことを特徴とする請求項５に記載の走査顕微鏡。
9. 前記補正手段は、前記振幅および周波数ごとの前記補正値のいくつかを用いて、所定の振幅および周波数で前記第１のスキャナの反射面を回動させる駆動信号の補正値を求め、求めた補正値により、前記駆動信号を補正する
   ことを特徴とする請求項８に記載の走査顕微鏡。

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