JP2009077718A - 哺乳動物の甘味およびアミノ酸のヘテロダイマー性の味覚レセプター - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、T1R3ポリペプチドを含む単離された味覚レセプター。
【選択図】なし
Description
本願は、USSN 60/302,898(2001年7月3日付け出願)、USSN
09/927,315(2001年8月10日付け出願)、およびUSSN 60/358,925(2002年2月22日付け出願)に対する優先権を主張する。この各々は、その全体において、本明細書中で参考として援用される。
適用なし。
本発明は、甘味またはアミノ酸の味覚レセプターの単離された核酸配列およびアミノ酸配列(感覚Gタンパク質共役型レセプターのT1Rファミリーに由来する2つの異種Gタンパク質共役型レセプターポリペプチドを含む)、そのようなレセプターに対する抗体、このような核酸およびレセプターを検出する方法、ならびに甘味およびアミノ酸の味覚レセプターのモジュレーターをスクリーニングする方法を提供する。
味覚の感覚は、動物に、食物の品質および栄養価に関する貴重な情報を与える。哺乳動物は、糖類、塩類、酸、および広範な毒性物質を含む、化学的実体の多様なレパートリーを認識し得、そしてそれに応答し得る(例えば、Lindermann,Physiol.Rev.76:718−766(1996)を参照のこと)。我々の味覚の感覚は、甘味、苦味、酸味、塩味、および旨味(umami)刺激を検出し得、そしてそれに応答し得る(Lindemann,Physiol.Rev.76:718−766(1996))。この味覚の感覚はまた、種々の味覚の様相間を(例えば、トニック水の苦味からハチミツの甘みを;海洋の塩味から未成熟果実の酸味を)識別を担う。この識別能力が、有益な感覚のインプットを提供し:苦味レセプターは、有害物質に対する嫌悪挙動反応を誘発し、一方で、甘味レセプターは、高カロリー食物源の認識を可能にする。
lerら,2000)。これらのうちの1つであるT2Rは、約30個の異なる遺伝子のファミリーであり、これは、いくつかの機能的に確証された哺乳動物苦味味覚レセプターを含む(Adlerら,2000;Chandrashekarら,2000;Matsunamiら,2000)。ほぼすべてのT2R遺伝子は、苦味味覚レセプターとしてのその提唱される役割と一致して、ヒトおよびマウスにおいて、多様な苦味の味物質(tastant)に対する応答の制御に遺伝的に関与しているゲノム領域にクラスター形成されている(Adlerら,2000)。
アミノ酸の検出に向けられた味覚経路を有することは、おそらく、重要な進化的意味を有した。本発明者らはここに、哺乳動物のアミノ酸味覚レセプターを同定し、そしてそれを特徴付ける。このレセプターは、T1RファミリーのT1R1 Gタンパク質共役型レセプターおよびT1R3 Gタンパク質共役型レセプターを含む、ヘテロダイマー性レセプターである。本発明者らは、T1R1およびT1R3が組み合わさって、L−アミノ酸センサーとして機能し、標準的な20個のアミノ酸の大半に応答するが、それはこれらのアミノ酸のD−エナンチオマーにも他の化合物にも応答しないことを実証する。
本発明者らはここに、哺乳動物の甘味およびアミノ酸の味覚レセプターの特徴付けを報告する。第1に、トランスジェニックレスキュー(rescue)実験により、Sac遺伝子座が、T1R3(候補味覚レセプターのT1Rファミリーのメンバー)をコードすることを証明する。第2に、異種発現系を使用して、本発明者らは、T1R2およびT1R3が、同じ細胞において発現される場合に、甘味レセプターとして機能し、スクロース、サッカリン、ズルチンおよびアセスルファーム−Kのような多様な甘味の味がする分子ならびに本明細書中に記載される他の分子を認識することを実証する。従って、T1Rファミリーは、T1R2およびT1R3のようなポリペプチドを含むヘテロダイマー性甘味レセプターを形成する。
プチドおよび異種T1Rポリペプチドは、共有結合される。
する工程、を包含する。
(1) T1R3ポリペプチドを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
(2) 前記T1R3ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、項1に記載の単離されたレセプター。
(3) 前記T1R3ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列を有する、項1に記載の単離されたレセプター。
(4) 前記T1R3ポリペプチドが、配列番号14、19、22、24または29のヌクレオチド配列によってコードされる、項1に記載の単離されたレセプター。
(5) 前記T1R3ポリペプチドが組換え体である、項1に記載の単離されたレセプター。
(6) 項5に記載の単離されたレセプターを含む、宿主細胞。
(7) 前記レセプターが、T1R3ポリペプチドと異種ポリペプチドとを含む、項1に記載の単離されたレセプター。
(8) 前記T1R3ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、項7に記載の単離されたレセプター。
(9) 前記T1R3ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、共有結合により結合されている、項7に記載の単離されたレセプター。
(10) 前記T1R3ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、組換え体である、項7に記載の単離されたレセプター。
(11) 項10に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
(12) 前記異種ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R1ポリペプチドである、項7に記載の単離されたレセプター。
(13) 前記異種ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R1ポリペプチドである、項7に記載の単離されたレセプター。
(14) 前記T1R1ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列を有する、項12に記載の単離されたレセプター。
(15) 前記T1R1ポリペプチドが、配列番号4、5、6または26のヌクレオチド配列によってコードされる、項12に記載の単離されたレセプター。
(16) 前記レセプターがアミノ酸味覚リガンドに結合する、項12に記載の単離されたレセプター。
(17) 前記味覚リガンドが、システイン、メチオニン、アルギニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アスパラギン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン酸塩、グルタミン酸一ナトリウムおよびL−AP4からなる群より選択される、項16に記載の単離されたレセプター。
(18) 前記T1R3ポリペプチドおよび前記T1R1ポリペプチドが、組換え体である、項12に記載の単離されたレセプター。
(19) 項18に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
(20) 前記異種ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R2ポリペプチドである、項7に記載の単離されたレセプター。
(21) 前記異種ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R2ポリペプチドである、項7に記載の単離されたレセプター。
(22) 前記T1R2ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列を有する、項20に記載の単離されたレセプター。
(23) 前記T1R2ポリペプチドが、配列番号10、11、12または28のヌクレオチド配列によってコードされる、項20に記載の単離されたレセプター。
(24) 前記レセプターが甘味味覚リガンドに結合する、項20に記載の単離されたレセプター。
(25) 前記甘味味覚リガンドが、スクロース、フルクトース、サッカリン、アセスルファーム−K、ズルチン、アスパルテーム、シクラミン酸塩、ならびにグアニジノ酢酸1およびグアニジノ酢酸2(GA−1およびGA−2)からなる群より選択される、項24に記載の単離されたレセプター。
(26) 前記レセプターがD−アミノ酸味覚リガンドに結合する、項20に記載の単離されたレセプター。
(27) 前記T1R3ポリペプチドおよび前記T1R2ポリペプチドが、組換え体である、項20に記載の単離されたレセプター。
(28) 項27に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
(29) 前記レセプターが、Gタンパク質共役型レセプター活性を有する、項1に記載の単離されたレセプター。
(30) 前記レセプターが、配列番号15、20、23、25または30に対して惹起された抗体に特異的に結合する、項1に記載の単離されたレセプター。
(31) T1R3ポリペプチドとT1R1ポリペプチドとを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ;そしてここで、該T1R1ポリペプチドは、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
(32) T1R3ポリペプチドとT1R2ポリペプチドとを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ;そしてここで、該T1R2ポリペプチドは、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
(33) 項1に記載の味覚レセプターに対して特異的に結合する、抗体。
(34) 前記抗体が、T1R1とT1R3とを含む味覚レセプターに対して特異的に結合する、項33に記載の抗体。
(35) 前記T1R1ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、項34に記載の抗体。
(36) 前記T1R1ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、共有結合により結合されている、項34に記載の抗体。
(37) 前記抗体が、T1R2とT1R3とを含む味覚レセプターに対して特異的に結合する、項33に記載の抗体。
(38) 前記T1R2ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、項37に記載の抗体。
(39) 前記T1R2ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、共有結合により結合されている、項37に記載の抗体。
(40) 味覚細胞において味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程:
(i)T1R3ポリペプチドを含む味覚レセプターと該化合物を接触させる工程であって、ここで、該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる
、工程;および
(ii)該レセプターに対する該化合物の機能的効果を決定する工程であって、それにより味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する、工程
を包含する、方法。
(41) 前記T1R3ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、項40に記載の方法。
(42) 前記レセプターが、T1R3ポリペプチドと異種ポリペプチドとを含む、項40に記載の方法
(43) 前記T1R3ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、項41に記載の方法。
(44) 前記異種ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R1ポリペプチドである、項41に記載の方法。
(45) 前記異種ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R1ポリペプチドである、項41に記載の方法。
(46) 前記T1R1ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列を有する、項41に記載の方法。
(47) 前記異種ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R2ポリペプチドである、項41に記載の方法。
(48) 前記異種ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R2ポリペプチドである、項41に記載の方法。
(49) 前記T1R2ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列を有する、項41に記載の方法。
(50) 前記レセプターが組換え体である、項40に記載の方法。
(51) 前記レセプターが、Gタンパク質共役型レセプター活性を有する、項40に記載の方法。
(52) 前記機能的効果がインビトロで測定される、項40に記載の方法。
(53) 前記機能的効果が物理的効果である、項52に記載の方法。
(54) 前記レセプターが固相に結合されている、項52に記載の方法。
(55) 前記機能的効果が、前記レセプターに対する化合物の結合を測定することによって決定される、項52に記載の方法。
(56) 前記機能的効果が、前記レセプターの細胞外ドメインに対する化合物の結合を測定することによって決定される、項55に記載の方法。
(57) 前記レセプターが、細胞または細胞膜において発現される、項40に記載の方法。
(58) 前記機能的効果が物理的効果である、項57に記載の方法。
(59) 前記機能的効果が、前記レセプターに対するリガンドの結合を測定することによって決定される、項58に記載の方法。
(60) 前記機能的効果が、前記レセプターの細胞外ドメインに対する化合物の結合を測定することによって決定される、項59に記載の方法。
(61) 前記機能的効果が、化学的効果または表現型的効果である、項57に記載の方法。
(62) 前記機能的効果が、細胞内cAMP、IP3またはCa 2+ における変化を測定することによって決定される、項61に記載の方法。
(63) 前記細胞が哺乳動物細胞である、項57に記載の方法。
(64) 前記細胞がヒト細胞である、項63に記載の方法。
(65) 味覚細胞において味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程:
(i)T1R3ポリペプチドとT1R2ポリペプチドとを含む味覚レセプターを発現する細胞と該化合物を接触させる工程であって、ここで、該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ;そしてここで、該T1R2ポリペプチドは、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、工程;および
(ii)該レセプターに対する該化合物の機能的効果を決定する工程であって、それにより味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する、工程
を包含する、方法。
(66) 前記T1R2ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、項65に記載の方法。
(67) 前記T1R2ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、共有結合により結合されている、項65に記載の方法。
(68) 味覚細胞において味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程:
(i)T1R3ポリペプチドとT1R1ポリペプチドとを含む味覚レセプターを発現する細胞と該化合物を接触させる工程であって、ここで、該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ;そしてここで、該T1R1ポリペプチドは、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、工程;および
(ii)該レセプターに対する該化合物の機能的効果を決定する工程であって、それにより味覚シグナル伝達を調節する化合物を同定する、工程
を包含する、方法。
(69) 前記T1R1ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、項68に記載の方法。
(70) 前記T1R1ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、共有結合により結合されている、項68に記載の方法。
(71) 配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
(72) 前記核酸が、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、項71に記載の核酸。
(73) 前記核酸が、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする、項71に記載の核酸。
(74) 前記核酸が、配列番号14、19、22、24または29のヌクレオチド配列を有する、項71に記載の核酸。
(75) 項71に記載の核酸を含む、発現ベクター。
(76) 項75に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
(77) 配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、単離されたポリペプチド。
(78) 前記ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、項77に記載のポリペプチド。
(79) 前記ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされる、項77に記載のポリペプチド。
(80) 前記ポリペプチドが、配列番号14、19、22、24または29のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる、項77に記載のポリペプチド。
(81) 項77に記載のポリペプチドに対して特異的に結合する、抗体。
T1RおよびT2Rは、味覚レセプター細胞のサブセットにおいて選択的に発現されるGタンパク質共役型レセプター(GPCR)の2つのファミリーである:(Hoonら,Cell 96:541−551(1999);Adlerら,Cell 100:693−702(2000);Chandrashekarら,Cell 100:703−711(2000);Matsunamiら,Nature 404:601−604(2000);Nelsonら,Cell 106:381−390(2001);Kitagawaら,Biochem.Biophys.Res.Cummun.283:236−242(2001);Montmayeurら,Nature Neurosci.4:492−498(2001);Maxら,Nature Genet.28:58−63(2001);Sainzら,J.Neurochem.77:896−903(2001))。T2Rは、苦味の味覚検出に関与し(Adlerら,Cell 100:693−702(2000);Chandrashekarら,Cell,100:703−711(2000));T1R2およびT1R3は、組み合わされて、本明細書中に記載されるように、甘味味覚レセプターとして機能する(Nelsonら,Cell 106:381−390(2001)もまた参考のこと);そしてT1R1およびT1R3は、組み合わされて、本明細書中に記載されるように、アミノ酸味覚レセプターとして機能する(Nelsonら,Nature,2002年2月24日;WO 01/66563)もまた参考のこと)。これらのヘテロダイマー性味覚レセプターは、以下に記載されるように、ヘテロダイマーの形態にある。
態が、T1R1およびT1R2の両方とのヘテロダイマー性レセプターへとアセンブルすることもまた示された。しかし、T1R3のテイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子を用いた実験により、Sac遺伝子座が、T1R2+3レセプターに選択的に影響を及ぼすことが示された。
むキメラタンパク質を含むレセプターを使用した、インビトロリガンド結合アッセイ、および卵母細胞T1R3レセプター発現のようなインビボ(細胞ベースおよび動物での)アッセイ;組織培養細胞のT1R3レセプター発現;T1R3の転写活性化;GPCRのリン酸化および脱リン酸化;GPCRへのGタンパク質の結合;リガンド結合アッセイ;電圧、膜電位およびコンダクタンスの変化;イオンフラックスアッセイ;細胞内第2メッセンジャー(例えば、cAMPおよびイノシトール三リン酸)の変化;細胞内カルシウムレベルの変化;および神経伝達物質の放出。
「T1Rファミリー味覚レセプター」は、Gタンパク質共役型レセプターのT1Rファミリーのなかの1つのメンバー(例えば、T1R1、T1R2、およびT1R3)またはそれらの任意の組み合わせを含むレセプターをいう。1つの実施形態において、T1Rファミリーレセプターは、T1R3(「T1R3含有味覚レセプター」または「T1R3含有甘味味覚レセプター」または「T1R3含有アミノ酸味覚レセプター」)およびT1Rファミリーの異種ポリペプチドを含む。1つの実施形態において、このレセプターは、T1R1およびT1R3を含む。別の実施形態において、このレセプターは、T1R2およびT1R3を含む。1つの実施形態において、T1R3含有レセプターは、これらのレセプターの2つのメンバー(例えば、T1R1およびT1R3、または、T1R2およびT1R3)が同じ細胞において共発現される場合に活性である。別の実施形態では、T1Rポリペプチドが、同じ細胞において共発現され、そしてヘテロダイマー性レセプターを形成し、ここでレセプターのT1Rポリペプチドは、非共有結合または共有結合されている。このレセプターは、例えば、本明細書中に記載されるような、甘味の味がする分子(例えば、スクロース、サッカリン、ズルチン、アセスルファーム−K)ならびに他の分子(例えば、D−アミノ酸および/またはL−アミノ酸(甘味および非甘味))を認識する能力を有する。これらの分子は、T1R3を含有する味覚伝達Gタンパク質共役型レセプターに対してリガンドとして作用することによって、「甘味およびアミノ酸の味覚シグナル伝達を調節する」化合物の例である。
60%より高い配列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、好ましくは、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%またはそれより高いヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有する。本発明のT1Rファミリーポリペプチド(例えば、T1R1、T1R2またはT1R3)またはT1R3含有レセプター(例えば、T1R1+3またはT1R2+3)はさらに、単独で、もしくは同じ細胞において共発現される場合に、または別のT1Rファミリーのメンバーとヘテロダイマーとして共発現される場合のいずれかで、Gタンパク質共役型レセプター活性を有する。ヒト、ラットおよびマウスのT1R1、T1R2、およびT1R3のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列についての登録番号は、GenBankにおいて見出され得る(ヒトのT1R1アミノ酸配列については、例えば、登録番号DAA00012およびNP_619642を参照のこと;ヒトT1R1ヌクレオチド配列については、例えば、登録番号BK000153を参照のこと;ヒトT1R2アミノ酸配列については、例えば、登録番号DAA00019、AAM12239およびNP_619642.1を参照のこと;ヒトT1R2ヌクレオチド配列については、例えば、登録番号BK000151、NM_138697.1、AF458149S1−6を参照のこと;ヒトT1R3アミノ酸配列については、例えば、登録番号DAA00013を参照のこと;ヒトT1R3ヌクレオチド配列については、例えば、登録番号BK000152を参照のこと)。T1R1、T1R2およびT1R3のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列については、WO00/06592、WO00/06593およびWO01/66563もまた参照のこと。
性を決定する。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列された場合に、一致するかまたはいくらかのポジティブ値の閾値Tを満たすかのいずれかである、クエリー配列におけるショートワードの長さWを同定することによって、高スコア配列対(HSP)をまず同定することを包含する。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschulら、前出)。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。このワードヒットを、累積アラインメントスコアが増大し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータM(一致した残基対の報酬(reward)スコア;常に0より大きい)およびN(一致しない残基のペナルティースコア;常に0より小さい)を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコア付けマトリクスが、累積スコアを算出するために使用される。各方向におけるそのワードヒットの伸長は、以下の場合停止される:累積アラインメントスコアが、最大達成値から量Xだけ減少する場合;1つ以上の負のスコア残基アラインメントの蓄積に起因して、累積スコアが、ゼロ以下になる場合;または、いずれかの配列の末端に到達した場合。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=−4および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の期待値(E)、および50のBLOSUM62のスコア付けマトリクス(HenikoffおよびHenikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989)を参照のこと)アラインメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=−4、および両鎖の比較を用いる。
たは二本鎖のいずれかの形態であるそれらのポリマー、ならびに任意のそのような配列の相補体をいう。DNA、cDNA、RNA、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドなどもまた含まれる。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは結合を含む核酸(これらは、合成したもの、天然に存在するもの、および天然に存在しないものであり、参照核酸と類似した結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似した様式で代謝される)を含む。そのようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(PNA)が挙げられるが、これらに限定されない。
on and the strategy of nucleic acid assays」(1993)において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度pHでの特定の配列についての熱融点(Tm)より約5〜10℃低くなるように選択される。このTmは、標的に相補的なプローブの50%が、平衡状態(Tmで標的配列が過剰に存在する場合、プローブの50%が平衡状態で占められる)で標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度の下)である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加により達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションについて、ポジティブシグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくは、バックグラウンドの10倍のハイブリダイゼーションである。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下のようなものあり得る:50%ホルムアミド、5×SSC、および1%SDSで42℃でのインキュベーションまたは5×SSC、1%SDSで65℃でのインキュベーションと、0.2×SSCおよび0.1%SDS中で65℃での洗浄。
a)および1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のN末端は、抗原の認識を主に担う約100〜110アミノ酸以上の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)との用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
イブラリー(例えば、McCaffertyら、Nature 348:552−554(1990)を参照のこと)を用いて同定される抗体フラグメントのいずれかを含む。
本発明は、組換え遺伝学の分野における慣用的な技術による。本発明において使用される一般的方法を開示する基本的なテキストとしては、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(第2版、1989);Kriegler、Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1994)が挙げられる。
のフラグメントを生じるように、機械的に剪断されるかまたは酵素的に消化されるかのいずれかである。次いで、フラグメントは、勾配遠心分離によって望ましくないサイズから分離され、そしてバクテリオファージλベクター中において構築される。これらのベクターおよびファージは、インビトロでパッケージングされる。組換えファージは、Benton&Davis、Science 196:180〜182(1977)に記載されるようなプラークハイブリダイゼーションによって分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、一般に、Grunsteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72:3961〜3965(1975)に記載されるように実施される。
クローン化された遺伝子(例えば、T1Rタンパク質をコードするcDNA)の高レベルの発現を得るために、代表的には、T1Rを、転写を指示するための強力なプロモータ
ー、転写/翻訳ターミネーター、およびタンパク質をコードする核酸に対する場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含む発現ベクターへサブクローン化する。T1R核酸は、同じベクターまたは異なるベクターにおいて、共発現され得るかまたは別々に発現され得、好ましくは、共発現され得る。適切な細菌性プロモーターは、当該分野で周知であり、そして例えば、SambrookらおよびAusubelら(前出)に記載されている。T1Rタンパク質を発現するための細菌性発現系は、例えば、E.coli、Bacillus sp.およびSalmonellaにおいて利用可能である(Palvaら、Gene 22:229〜235(1983);Mosbachら、Nature302:543〜545(1983))。このような発現系についてのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた、市販されている。1つの好ましい実施形態において、レトロウイルス発現系が本発明において使用される。
であると示されている他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
伝子操作手順は、少なくとも1つの遺伝子を、T1Rを発現し得る宿主細胞へ首尾よく導入し得ることのみが必要とされる。
天然に存在するかまたは組換えのT1RポリペプチドまたはT1R3含有レセプターのいずれかは、機能的アッセイにおける使用のために精製され得る。天然に存在するT1Rタンパク質またはT1R3含有レセプターは、例えば、ヒト組織から精製され得る。組換えT1Rタンパク質またはT1R3含有レセプターは、任意の適切な発現系から精製され得る。T1Rポリペプチドは代表的に、T1R3含有レセプターを形成するように、同じ細胞中において共発現される。
組換えタンパク質は、大量に、代表的にはプロモーター誘導後に、形質転換された細菌によって発現される;しかし、発現は構成的であり得る。IPTGによるプロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の一例である。細菌は、当該分野で標準的な手順に従って増殖される。新鮮な細菌細胞または凍結された細菌細胞が、タンパク質の単離のために使用される。
適合性の緩衝液を用いて希釈または透析することによって再生され得る。適切な溶媒としては、尿素(約4M〜約8M)、ホルムアミド(少なくとも約80%、容量/容量基準)、およびグアニジン塩酸塩(約4M〜約8M)が挙げられるが、これらに限定されない。凝集物形成タンパク質を可溶化し得るいくつかの溶媒(例えば、SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、70%ギ酸)は、免疫原性および/または活性の欠失に付随する、タンパク質の不可逆的変性があり得ることから、この手順での使用には不適切である。グアニジン塩酸塩および類似の薬剤は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、そして、変性剤の除去(例えば、透析による)または希釈によって、再生が生じ得、これにより免疫学的および/または生物学的に活性なタンパク質の再形成が可能となる。他の適切な緩衝液は、当業者に公知である。ヒトT1Rタンパク質またはT1R3含有レセプターは、標準的な分離技術(例えば、Ni−NTAアガロース樹脂を用いる)によって、他の細菌性タンパク質から分離される。
(溶解度分画)
しばしば最初の工程として、特に、タンパク質混合物が複合体である場合、最初の塩分画は、目的の組換えタンパク質から、望ましくない宿主細胞タンパク質(または細胞培養培地由来のタンパク質)の多くを分離し得る。好ましい塩は、硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水分量を効率的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質は、これらの溶解度に基づいて沈殿される。タンパク質が疎水性になるにつれ、このタンパク質はより低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する確率が高まる。代表的なプロトコルとしては、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が、20〜30%の間であるように、タンパク質溶液に対して飽和硫酸アンモニウムを添加することを含む。この濃度は、ほとんどの疎水性のタンパク質を沈殿させる。次いで、沈殿物がデカントされ(目的のタンパク質が疎水性でないかぎり)、そして目的のタンパク質を沈殿させることが知られている濃度まで、硫酸アンモニウムをこの上清に添加する。次いで、沈殿物は、緩衝液中に可溶化され、そして、必要であれば、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって、過剰な塩が除去される。タンパク質の溶解度に依存する他の方法(例えば、冷エタノール沈殿)は当業者に周知であり、そして複合体タンパク質混合物を分画するために使用され得る。
T1Rタンパク質またはT1R3含有レセプターの分子量は、異なる孔サイズの膜(例えば、Amiconの膜またはMilliporeの膜)を通す限外濾過を使用して、T1Rタンパク質またはT1R3含有レセプターを、より大きなサイズおよびより小さなサイズのタンパク質から単離するために利用され得る。第1工程として、タンパク質混合物は、目的のタンパク質の分子量よりも低分子量のカットオフを有する孔サイズを有する膜を通して限外濾過される。次いで、限外濾過の保持物(retentate)は、目的のタンパク質の分子量よりも大きな分子カットオフを有する膜に対して限外濾過される。組
換えタンパク質は、その膜を通過して濾液へと行く。次いで、この濾液が、以下で記載されるようにクロマトグラフィーされ得る。
T1Rタンパク質またはT1R3含有レセプターはまた、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、およびリガンドに対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離され得る。さらに、タンパク質に対して惹起される抗体は、カラムマトリクスに結合体化され得、そしてタンパク質が免疫精製され得る。これらの方法の全ては、当該分野で周知である。クロマトグラフィー技術が任意のスケールで実施され得、そして多くの異なる製造業者(例えば、Pharmacia Biotech)からの装置を使用し得ることが、当業者に明らかである。
(A.アッセイ)
T1R3含有味覚レセプターの調節、および味覚に関する対応する調節は、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して評価され得る。このようなアッセイは、T1R3含有味覚レセプターのインヒビターおよびアクチベーター、そして結果として味覚のインヒビターおよびアクチベーターについて試験するために使用され得る。T1R3を含有する甘味および/またはアミノ酸の味覚レセプターのこのようなモジュレーターは、味覚シグナル伝達に関与する。T1R3含有味覚レセプターのモジュレーターは、組換えT1R3含有味覚レセプターまたは天然に存在するT1R3含有味覚レセプターのいずれか(好ましくは、ヒトレセプター)を使用して試験される。
T1R3含有味覚レセプター調節活性を有する化合物を同定するためのアッセイは、インビトロで実施され得る。このようなアッセイは、全長T1R3含有味覚レセプターもしくはその改変体、またはキメラを形成するように異種タンパク質に融合されたT1R3含
有味覚レセプターのフラグメント(例えば、細胞外ドメイン)を使用し得る。精製された組換えT1R3含有味覚レセプターまたは天然に存在するT1R3含有味覚レセプターは、本発明のインビトロ方法において使用され得る。精製されたT1R3含有味覚レセプターに加えて、組換えまたは天然に存在するT1R3含有味覚レセプターは、細胞溶解産物または細胞膜の部分であり得る。以下に記載されるように、結合アッセイは、固相または可溶性のいずれかであり得る。好ましくは、タンパク質または膜が、共有結合または非共有結合のいずれかによって固体支持体に結合される。しばしば、本発明のインビトロアッセイは、非競合的または競合的(本明細書中に記載されるような既知の細胞外リガンドとかまたは既知の細胞内リガンドGTPと)のいずれかである、リガンド結合アッセイまたはリガンド親和性アッセイである。他のインビトロアッセイは、タンパク質についての分光学的特徴(例えば、蛍光性、吸着度、屈折率)、流体力学特性(例えば、形状)、クロマトグラフィーの特性、または可溶度特性における変化の測定を含む。
別の実施形態において、T1R3含有味覚レセプターは、細胞において発現され(例えば、T1Rファミリーの2つの異種のメンバー(例えば、T1R1およびT1R3、または、T1R2およびT1R3)を共発現させることによって)、そして機能的(例えば、物理的および化学的または表現型的)な変化をアッセイして、T1R3含有味覚レセプターの味覚モジュレーターを同定する。T1R3含有味覚レセプターを発現する細胞はまた、結合アッセイにおいて使用され得る。任意の適切な機能的効果が、本明細書中に記載のようにして、測定され得る。例えば、リガンドの結合、Gタンパク質の結合およびGPCRシグナル伝達(例えば、細胞内Ca2+レベルの変化)はすべて、細胞ベースの系を使用して、潜在的なモジュレーターを同定するために適切なアッセイである。このような細胞ベースのアッセイのために適切な細胞は、本明細書中に記載されるような、初代細胞および細胞株の両方を含む。T1R3含有味覚レセプターは、天然物または組換え体であり得る。また、上記のように、GPCR活性を有するキメラT1R3含有味覚レセプターが、細胞ベースのアッセイにおいて使用され得る。例えば、T1Rタンパク質の細胞外ドメインが、異種タンパク質の膜貫通ドメインおよび/または細胞質ドメインに融合され得、好ましくは、異種GPCRに融合され得る。このようなキメラGPCRは、GPCR活性を有し、そして本発明の細胞ベースのアッセイにおいて使用され得る。
NAレベルで測定することによって決定する。T1Rシグナル伝達に関連するT1Rタンパク質(1つまたは複数)のレベルは、T1R3含有味覚レセプターまたはそのフラグメントに選択的に結合する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング、ELISAなどのようなイムノアッセイを使用して測定される。mRNAの測定のためには、増幅(例えば、PCR、LCRを使用する)またはハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、RNAseプロテクション、ドットブロッティング)が好ましい。タンパク質レベルまたはmRNAレベルは、本明細書中に記載されるように、直接的または間接的に標識された検出因子(例えば、蛍光標識された核酸または放射性標識された核酸、放射性標識された抗体または酵素的に標識された抗体など)を使用して、検出される。
348:125−32(1990);Pitcherら、Annu.Rev.Biochem.67:653−92(1998)を参照のこと。
じる蛍光応答を区別するために、必要に応じて、キレート剤(例えば、EGTA)を補充したカルシウム非含有緩衝液においてこのようなアッセイを行うことが所望され得るが、これは必須ではない。
受性、または膜電圧蛍光指示薬をそれぞれ用いてモニターされる。とりわけイオン感受性指示薬および電圧プローブの中でも用いられ得るのは、Molecular Probes1997カタログに開示されるものである。Gタンパク質共役型レセプターについて、無差別なGタンパク質(例えば、Gα15およびGα16)が、選り抜きのアッセイにおいて用いられ得る(Wilkieら、Proc.Nat’l Acad.Sci.USA
88:10049−10053(1991))。このような無差別なGタンパク質は、広範囲のレセプターのカップリングを可能にする。
味覚に関する動物モデル(例えば、本明細書中に記載されるような、Sacテイスターマウス系統および非テイスターマウス系統)はまた、味覚のモジュレーターについてのスクリーニングにおける用途を見出す。同様に、トランスジェニック動物技術(例えば、適切な遺伝子標的化ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子の過剰発現の結果としての遺伝子ノックアウト技術を含む)は、T1R3含有レセプターまたはその成分の発現の欠損または増加を引き起こす。所望される場合には、T1R3含有レセプターまたはその成分の組織特異的な発現またはノックアウトが必要とされ得る。このような方法によって作製されたトランスジェニック動物は、味覚の調節に関する動物モデルとしての用途を見出し、そして味覚調節のモジュレーターのためのスクリーニングにおいてさらに有用である。
T1R3含有味覚レセプターのモジュレーターとして試験される化合物は、任意の有機低分子か、または生物学的実体(例えば、タンパク質(例えば、抗体またはペプチド)、糖、核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイム)または脂質)であり得る。あるいは、モジュレーターは、T1R3含有味覚レセプターの遺伝子改変されたバージョンであり得る。代表的には、試験化合物は、有機低分子、ペプチド、脂質および脂質アナログである。
数の化学的「ビルディングブロック」(例えば、試薬)を組み合わせることによって生成される多様な化学物質の収集物である。例えば、線形コンビナトリアル化学ライブラリー(例えば、ポリペプチドライブラリー)は、所定の化合物長(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)について可能なあらゆる様式において、一組の化学的ビルディングブロック(アミノ酸)を組み合せることによって形成される。何百万もの化学的化合物が、化学的ビルディングブロックのこのようなコンビナトリアル混合を通して合成され得る。
354:84−88(1991)を参照のこと)が挙げられるが、これに限定されない。化学的に多様なライブラリーを作製するための他の化学もまた用いられ得る。このような化学としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ペプトイド(例えば、PCT公開番号WO91/19735)、コード化ペプチド(例えば、PCT公開番号WO93/20242)、ランダムバイオオリゴマー(例えば、PCT公開番号WO92/00091)、ベンゾジアゼピン(例えば、米国特許第5,288,514号)、ダイバーソマー(diversomer)(例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド(Hobbsら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90:6909−6913(1993))、ビニローグ(vinylogous)ポリペプチド(Hagiharaら、J.Amer.Chem.Soc.114:6568(1992))、グルコース骨格を有する非ペプチド性のペプチド模倣物(Hirschmannら、J.Amer.Chem.Soc.114:9217−9218(1992))、低分子化合物ライブラリーのアナログ有機合成(Chenら、J.Amer.Chem.Soc.116:2661(1994))、オリゴカルバメート(Choら、Science 261:1303(1993))、および/またはペプチジルホスホネート(Campbellら、J.Org.Chem.59:658(1994))、核酸ライブラリー(Ausubel,BergerおよびSambrook、全て前出、を参照のこと)、ペプチド核酸ライブラリー(例えば、米国特許第5,539,083号を参照のこと)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughnら、Nature Biotechnology,14(3):309−314(1996)およびPCT/US96/10287を参照のこと)、炭水化物ライブラリー(例えば、Liangら、Science,274:1520−1522(1996)および米国特許第5,593,853号を参照のこと)、有機低分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン、BaumC&EN,1月18日、33頁(1993));イソプレノイド、米国特許第5,569,588号;チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号;ピロリジン、米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号;モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号;ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号などを参照のこと)。
iences,Columbia,MDなどを参照のこと)。
1つの実施形態では、本発明は、天然物または組換え体のいずれかの、T1R3含有味覚レセプター、またはT1R3含有味覚レセプターを発現する細胞もしくは組織を用いる可溶性アッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、ハイスループット様式にある固相ベースのインビトロアッセイを提供し、ここでは、T1R3含有味覚レセプターを固相基材に結合させる。本明細書中に記載されるアッセイのいずれもが、ハイスループットスクリーニング(例えば、リガンドの結合、細胞増殖、細胞表面マーカーのフラックス(例えば、スクリーニング)、放射性標識GTPの結合、第2メッセンジャーのフラックス(例えば、Ca2+、IP3、cGMPまたはcAMP、サイトカイン生成など))のために適合され得る。
system)を用いて可能である。
バインダーとの対として適切である。例えば、細胞膜レセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト(例えば、トランスフェリン、c−kit、ウイルスレセプターリガンド、サイトカインレセプター、ケモカインレセプター、インターロイキンレセプター、免疫グロブリンレセプターおよび抗体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリーなどのような細胞レセプター−リガンド相互作用;例えば、PigottおよびPower,The Adhesion Molecule Facts Book I(1993)を参照のこと)。同様に、毒素および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン(例えば、アヘン剤、ステロイドなど)、細胞内レセプター(例えば、これは、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミンDを含む、種々の小さなリガンドの効果を媒介する;ペプチド)、薬物、レクチン、糖類、核酸(直鎖配置および環状ポリマー配置の両方)、オリゴサッカリド、タンパク質、リン脂質および抗体はすべて、種々の細胞レセプターと相互作用し得る。
T1R遺伝子の検出、および核酸ハイブリダイゼーション技術を使用する遺伝子発現に加えて、本発明のT1R3含有味覚レセプターを検出するために、イムノアッセイがまた使用され得る。このようなアッセイは、T1R3含有味覚レセプターのモジュレーターに
ついてスクリーニングするため、ならびに治療的適用および診断的適用のために、有用である。イムノアッセイは、T1R3含有味覚レセプターを定性的または定量的に分析するために使用され得る。適用可能な技術の一般的な概要は、Harlow&Lane、Antibodies:A Laboratory Manual(1988)に見出され得る。
T1Rタンパク質およびT1R3含有味覚レセプターと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成する方法は、当業者に公知である(例えば、Coligan、Current Protocols in Immunology(1991);Harlow&Lane、前出;Goding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版、1986);ならびにKohler&Milstein、Nature 256:495〜497(1975)を参照のこと)。このような技術としては、ファージベクターまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体の調製、ならびにウサギまたはマウスを免疫することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製が挙げられる(例えば、Huseら、Science 246:1275〜1281(1989);Wardら、Nature 341:544〜546(1989)を参照のこと)。
ル抗体またはその結合フラグメントをコードするDNA配列を、Huseら、Science 246:1275−1281(1989)によって概説された一般的プロトコールに従って、ヒトB細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離し得る。
T1R3含有味覚レセプターは、十分に容認された多くの免疫学的結合アッセイ(例えば、米国特許第4,366,241号;同第4,376,110号;同第4,517,288号;および同第4,837,168号を参照のこと)のいずれかを使用して、検出および/または定量化され得る。一般的なイムノアッセイの概説については、Methods in Cell Biology:Antibodies in Cell Biology、第37巻(Asai編、1993);Basic and Clinical
Immunology(StitesおよびTerr編、第7版、1991)もまた参照のこと。免疫学的結合アッセイ(すなわち、イムノアッセイ)は、代表的に、選択されたタンパク質または抗原(この場合、T1R3含有味覚レセプターまたはその抗原性部分配列)に特異的に結合する抗体を使用する。抗体(例えば、抗T1R3含有味覚レセプター)は、当業者に周知でありかつ上記のような多くの手段のいずれかによって生成され得る。
らのタンパク質は、種々の種由来の免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性反応性を示す(例えば、Kronvalら、J.Immunol.111:1401−1406(1973);Akerstromら、J.Immunol.135:2589−2542(1985)を参照のこと)。標識化剤は、別の分子(例えば、ストレプトアビジン)が特異的に結合し得る検出可能部分(例えば、ビオチン)で改変され得る。種々の検出可能部分が当業者に周知である。
サンプル中のT1R3含有味覚レセプターを検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的のいずれかであり得る。非競合的イムノアッセイとは、抗原の量を直接的に測定するアッセイである。1つの好ましい「サンドウィッチ」アッセイでは、例えば、抗T1R3含有味覚レセプター抗体を、固体基材に直接結合し得、この固体支持体上で抗体を固定する。次いで、これらの固定された抗体が、試験サンプル中に存在するT1R3含有味覚レセプターを捕捉する。次いで、このように固定されたT1R3含有味覚レセプターを、標識化剤(例えば、標識を保有する第2のT1R3含有味覚レセプター抗体)に結合させる。あるいは、二次抗体は標識を欠いてもよいが、これは、次いで、二次抗体が由来する種の抗体に対して特異的な標識化三次抗体に結合され得る。二次抗体または三次抗体は、代表的には、別の分子(例えば、ストレプトアビジン)が特異的に結合する検出可能な部分(例えば、ビオチン)で改変されて、検出可能部分を提供する。
競合的アッセイにおいては、サンプル中に存在するT1R3含有味覚レセプターの量は、サンプル中に存在する未知のT1R3含有味覚レセプターによって、抗T1R3含有味覚レセプター抗体から置換される(競合により取り除かれる(competed away))既知の添加された(外因性)T1R3含有味覚レセプターの量を測定することによって、間接的に測定される。1つの競合的アッセイにおいて、既知の量のT1R3含有味覚レセプターがサンプルに添加され、次いでこのサンプルを、T1R3含有味覚レセプターに特異的に結合する抗体と接触させる。この抗体に結合する外因性のT1R3含有味覚レセプターの量は、サンプル中に存在するT1R3含有味覚レセプターの濃度に反比例する。特に好ましい実施形態において、抗体は固体基材に固定される。抗体に結合するT1R3含有味覚レセプターの量は、T1R3含有味覚レセプター/抗体の複合体中に存在するT1R3含有味覚レセプターの量を測定することによって、あるいは残存している未複合体化タンパク質の量を測定することによってのいずれかで決定され得る。T1R3含有味覚レセプターの量は、標識されたT1R3含有味覚レセプター分子を提供することによって検出され得る。
、直接的であり得るか(ここでは、抗体が標識される)、または上記のように抗体に特異的に結合する標識化部分の引き続く添加によって、間接的であり得る。
競合的結合様式におけるイムノアッセイはまた、交差反応性の測定のために使用され得る。例えば、T1R3含有味覚レセプターが、固体支持体上に固定され得る。タンパク質(例えば、T1R3含有味覚レセプターおよびホモログ)は、この固定化された抗原への抗血清の結合について競合するアッセイに添加される。添加されたタンパク質が、固定されたタンパク質への抗血清の結合に対して競合する能力が、T1R3含有味覚レセプターがそれ自体と競合する能力と比較される。上記のタンパク質についての交差反応性の%は、標準的な計算を使用して算出される。上記に列挙される添加されたタンパク質の各々と10%未満の交差反応性を有する抗血清を選択し、そしてプールする。必要に応じて、交差反応性抗体は、考慮される添加されたタンパク質(例えば、遠縁のホモログ)での免疫吸着によって、プールされた抗血清から取り除かれる。
ウェスタンブロット(イムノブロット)分析が、サンプル中のT1R3含有味覚レセプターの存在を検出および定量化するために使用される。この技術は一般に、以下の工程を包含する:分子量に基づいてゲル電気泳動によってサンプルのタンパク質を分離させる工程、分離されたタンパク質を適切な固体支持体(例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、または誘導体化されたナイロンフィルター)に転写する工程、およびT1R3含有味覚レセプターを特異的に結合する抗体とサンプルをインキュベートする工程。抗T1R3含有味覚レセプター抗体は、固体支持体上のT1R3含有味覚レセプターに特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識され得るか、あるいは抗T1R3含有味覚レセプター抗体に特異的に結合する標識化抗体(例えば、標識されたヒツジ抗マウス抗体)を用いて、引き続き検出され得る。
当業者は、イムノアッセイにおいて非特異的結合を最小化することが多くの場合に所望されることを理解する。特に、アッセイが固体基材に固定化された抗原または抗体を含む場合、この基材への非特異的結合の量を最小化することが所望される。このような非特異的結合を低減する手段は、当業者に周知である。代表的には、この技術は、基板をタンパク質様組成物でコーティングすることを含む。特に、ウシ血清アルブミン(BSA)、脱脂粉乳、およびゼラチンのようなタンパク質組成物が広範に用いられ、粉乳が最も好まし
い。
このアッセイで使用される特定の標識または検出可能な基は、それがこのアッセイにおいて使用される抗体の特異的結合を有意に阻害しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的特性または化学的特性を有する任意の物質であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野においてよく開発されており、そして一般的に、このような方法において有用な大半の任意の標識が、本発明に適用され得る。従って、標識は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段によって検出され得る任意の組成物である。本発明において有用な標識としては、以下が挙げられる;磁気ビーズ(例えば、DYNABEADSTM)、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど)、放射性標識(例えば、3H、125I、35S、14C、または32P)、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAにおいて一般的に使用される他の酵素)、および比色標識(例えば、金コロイド、または着色ガラスビーズもしくは着色プラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)。
はしばしばピンクのように見え、一方で種々の結合体化されたビーズは、そのビーズの色に見える。
薬学的に受容可能なキャリアは、投与される特定の組成物(例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、有機低分子、脂質、炭水化物、粒子、または形質導入された細胞)によって、およびこの組成物を投与するために用いられる特定の方法によって一部決定される。従って、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方が存在する(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版、1989を参照のこと)。投与は、任意の都合の良い様式(例えば、注射、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与による)であり得る。
本発明は、インビトロおよびインビボにおいて細胞をトランスフェクションするためのT1R3含有味覚レセプターの核酸を提供する。これらの核酸は、以下に記載されるような、標的細胞および生物体のトランスフェクションのための任意の多数の周知のベクターに挿入され得る。核酸は、ベクターと標的細胞との相互作用を通して、エキソビボまたはインビボで細胞にトランスフェクトされる。次いで、プロモーターの制御下にある核酸は、T1Rファミリーの2つのメンバーを共発現することによって、本発明のT1R3含有味覚レセプターを発現し、それにより、T1R3含有味覚レセプターの異常な影響、部分的な不活性化、または異常な発現を緩和する。この組成物は、患者において治療的な応答を誘発するために十分な量で、患者に投与される。これを達成するために十分な量を、「治療的に有効な用量または量」として規定する。
以下の実施例を、例示のために提供するが、これは本願発明を制限するために提供されるのではない。
(結果)
(T1R3は、Sac遺伝子座によってコードされる)
以前の研究において、本発明者らは、舌および口蓋上皮の味覚レセプター細胞のサブセットにおいて選択的に発現されるT1Rファミリーの2つの新規なGタンパク質共役型レセプター(T1R1およびT1R2)を同定した(Hoonら,1999;Genbank登録番号AY032620−AY032623)。本発明者らはまた以前に、機能的な
苦味味覚レセプター遺伝子であるT2Rファミリーを同定した(Adlerら,2000;Chandrashekarら,2000)。T1R1およびT1R2は共に、最初は、第4染色体遠位端のSacの近位にマッピングされた(Hoonら、1999)。しかし、放射線ハイブリッド分析および高分解能遺伝子マッピングによって、これらのレセプターは、Sac遺伝子区画(Liら、2001)と分離され、これにより、候補Sac遺伝子としてそれらは排除された(図1)。近年、6つの独立したグループが、関連のレセプター遺伝子であるT1R3が、Sac遺伝子座と密接に連鎖していること(Kitagawaら,2001;Maxら,2001;Montmayeurら,2001;Sainzら,2001およびLiら,2001 Achems XXIII,Sarasota FL)、およびこのT1R3の多型性改変体が、Sacのテイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子と共分離することを報告した。この遺伝子連鎖は、T1R3が、Sac遺伝子に対応するという仮定を立てるために使用された。本発明者らはまた、T1R3を単離し、そしてT1R3を特徴付け、そして、Sacが実際にT1R3をコードするのであれば、この候補レセプターのテイスター対立遺伝子の導入が、Sac非テイスターマウスの味覚欠損をレスキューするはずであると考えた。
近年、T1R3は、種々の味覚乳頭にある味覚レセプター細胞のサブセットにおいて発現されることが示された(Kitagawaら,2001;Maxら,2001;Montmayeurら,2001;Sainzら,2001)。しかし、報告された発現パターンの間にはかなりの矛盾が存在し、結果は、舌の前方で発現があるとしてもほとんど無いというもの(茸状乳頭;Sainzら,2001)から、すべての味蕾でかなり発現す
るというもの(Kitagawaら,2001)までに及ぶ。本発明者らは、有郭、葉状、茸状および口蓋の味蕾におけるT1R3の発現を試験し、そしてT1R3が、すべての型の味蕾から、約30%の細胞において発現されることを見出した(図3;Montmayeurら,2001もまた参照のこと)。この局所解剖学的な発現パターンは、T1R1およびT1R2の発現の凝集と密接に近似し(図3、Hoonら、1999)、そしてT1R1とT1R3との、および、T1R2とT1R3との、共発現の可能性を示唆する。有郭乳頭(Maxら,2001;Montmayeurら,2001)および葉状乳頭(Montmayeurら,2001)におけるT1R2およびT1R3の共発現が近年、RT−PCRおよびインサイチュハイブリダイゼーションによって試験されたが、異なるクラスの味蕾における3つすべてのT1Rに関する包括的な研究は欠如していた。従って、本発明者らは、二色蛍光性インサイチュハイブリダイゼーションを使用して、二重標識化実験を実施した。本発明者らの結果は、T1R3が、すべての有郭、葉状および口蓋の味蕾においてT1R2と共発現され、すべてのT1R2ポジティブ細胞がT1R3も発現することを実証した(図4)。同様に、T1R1は、茸状および口蓋の味覚レセプター細胞においてT1R3と共発現される。しかし、茸状および口蓋の味蕾には、T1R3が重複せずに発現する細胞の画分が存在する。従って、本発明者らは、そのT1R発現プロフィールに基づいて、主要な3つのクラスの細胞型を規定し得る:T1R1およびT1R3(T1R1+3)、T1R2およびT1R3(T1R2+3)、およびT1R3。
T1Rが甘味レセプターをコードするということを証明するには、機能的な確証が必要である。形質膜に対するレセプターのトランスロケーションをモニターするために、T1R1、T1R2およびT1R3に対する抗体を惹起し、そして、ネイティブおよびエピトープタグ化されたマウス、ヒトおよびラットのレセプターの、種々の組織培養細胞株における発現を試験した。本発明者らは、ラットのT1Rが効率的に発現されることを観察した;従って、本発明者らは、すべての異種発現の研究においてこのラット遺伝子を使用した。機能をアッセイするために、本発明者らは、T1Rを、Gα16−GzキメラおよびGα15(共に、Gs、Gi、Gqおよびガストデューシン連結型レセプターをホスホリパーゼCβに効率的に結合させる2つのGタンパク質αサブユニット)と共に発現させた(OffermannsおよびSimon、1995;Krautwurstら、1998;Chandrashekarら、2000;Modyら、2000)。この系において、レセプターの活性化は、細胞内カルシウム[Ca2+]iの増加を導き、この増加は、FURA−2カルシウム指示薬色素を使用して、単一細胞レベルでモニターされ得る(Tsienら、1985)。
アスパルテームを含む多数のモノサッカリドおよびジサッカリドならびに人工甘味料には応答しなかった(図6a)。他方、この応答は、T1R2およびT1R3の両方の存在に依存し;いずれかのレセプター単独では、その生物学的に適切な作用範囲を極端に超える濃度であっても、これらの研究においてアッセイされたいかなる化合物にも応答しなかった(データは示さず)。これらの結果により、T1R2およびT1R3が、同じ細胞において共発現される場合に、甘味味覚レセプターとして機能することが実証される。
他の味覚様相と絡めたT1Rの発現の研究によって、末梢における甘味味覚のコード化の提示に関する見解が与えられ得る。近年、本発明者らは、苦味味覚レセプターのT2Rファミリーのメンバーが、茸状味蕾において稀に発現されるが、有郭、葉状および口蓋のすべての味蕾の細胞では15〜20%で存在することを示した。T1Rもまた同じ味蕾において発現されることを考慮し、本発明者らは、T1Rを発現する細胞とT2Rを発現する細胞との間に重複が存在するか否かを試験した。T1RプローブおよびT2Rプローブ
の混合物を使用した二重標識化実験によって、T2Rが、T1Rファミリーのメンバーのいずれとも共発現しないことが示された(図7、Adlerら、2000もまた参照のこと)。これは、すべての味蕾において観察され、そして20個もの多いT2Rを含んだ混合物を用いて観察された。これらの2つのレセプターファミリーの発現プロフィールにおける強度の分離は、甘味および苦味が、異なる細胞型の活性化によってコードされるという、味蕾レベルでの味覚のコード化および識別の論理に関する重要な予測を築き上げた。
(T1R3の分子クローニング)
ヒトT1R3を、T1R1に対する相同性によって、BACクローンRP5−890O3のドラフト配列において同定した。ラットT1R3のフラグメントを、このヒト配列に基づいて設計された縮重PCRプライマーを使用して、ゲノムDNAから増幅した。PCRにより導き出されたプローブを使用して、有郭cDNAライブラリーから、全長ラットT1R3を同定し(Hoonら、1999)、そしてマウスのBACフィルターアレイ(Incyte Genomics and Research Genetics)を探索した。Sacテイスターマウス系統および非テイスターマウス系統(C57BL/6および129/Sv)のT1R3の配列を、ゲノムクローンから決定した。甘味感受性である他のマウス系統(SWR,ST,C57L,FVB/N)および甘味非感受性である他のマウス系統(DBA/lLac,DBA/2,C3H,AKR,BALB/c)の遺伝子のコード領域全体の配列を、増幅されたゲノムDNA(Jackson Laboratory)から決定した。SWRマウスについて、T1R3はまた、増幅された味覚組織cDNAからも配列決定された。11の近交系系統のなかで、本発明者らは、2つのテイスター対立遺伝子(テイスター1:C57BL/6,C57L,およびテイスター2:SWR,ST,FVB/N)、および1つの非テイスター対立遺伝子(DBA/lLac,DBA/2,C3H,AKR,BALB/c,129/Sv)を見出した。テイスター1対立遺伝子およびテイスター2対立遺伝子は、6つのアミノ酸位置(P61L、C261R、R371Q、S692L、I706T、G855E;このうちの1つであるG855Eは、(Kitagawaら、2001;Maxら、2001)では見逃された。これはおそらく、彼らの増幅反応に使用されたプライマー中にそれが含まれていたことに起因する)で、互いと異なる。非テイスターは、6つの残基(A55T、T60I、L61P、Q371R、T706I、E855G)でテイスター1対立遺伝子と異なり、そして4つのアミノ酸残基(A55T、T60I、R261C、L692S)でテイスター2と異なる。
−マーカーの存在に関するT1R3ポジティブBACクローンのPCRベースのタイピングを含んだ。
組織を、成体マウスから得た。発現パターンの性別特異的な差異は観察されなかった。従って、雄性動物および雌性動物を、交換可能に使用した。葉状切片について、乳頭間で発現パターンの差異は観察されなかった。新鮮凍結切片(16μm/切片)を、シラン処理したスライドに取り付け、そして以前に記載されたように(Hoonら、1999)、インサイチュハイブリダイゼーションのために調製した。すべてのインサイチュハイブリダイゼーションを、高ストリンジェンシー(ハイブリダイゼーション、5×SSC、50%ホルムアミド、65〜72℃;洗浄、0.2×SSC、72℃)で行った。単一標識検出のために、シグナルを、ジゴキシゲニンに対するアルカリホスファターゼ結合体化抗体および標準的な発色基質(Boehringer Mannheim)を使用して、顕色化した。センスプローブを用いたコントロールハイブリダイゼーションは、すべての味覚乳頭で、特異的なシグナルを生成しなかった。細胞を、以前に記載されたようにして(Boughterら,1997)、その核の位置に基づいてカウントした。二重標識蛍光性検出のために、プローブを、フルオレセインまたはジゴキシゲニンのいずれかで標識した。少なくとも3つの異なる動物由来の少なくとも50個の味蕾を、任意のプローブの組み合わせで分析した。アルカリホスファターゼ結合体化抗フルオレセイン抗体(Amersham)および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ジゴキシゲニン抗体を、ファストレッド(fast−red)およびチラミド(tyramide)の蛍光発生基質(Boehringer MannheimおよびNew England Nuclear)と組み合わせて使用した。共焦点画像を、アルゴン−クリプトンレーザーを使用して、Leica TSC共焦点顕微鏡により得た;1〜2μmの光学切片を記録し、すべての重複シグナルが単一の細胞に由来することを確実にした。
T1R3の6つのコードエキソンおよび開始ATGの上流の約12kbを含む約15kbのEcoRIフラグメントを、C57BL/6 BACクローンから単離した。このフラグメントは、T1R3コード配列の停止コドンを含むが、3’−UTRの大半を欠失する。15kbクローンの全体の配列を、テイスター系統および非テイスター系統から決定した。このフラグメントはまた、T1R3の約3kb上流に糖脂質トランスフェラーゼ様の遺伝子についての全長配列を含むが、Sacテイスター(SWR)系統間または非テイスター(129/Sv)系統間で、この遺伝子には、発現上の差異もアミノ酸配列上の差異も存在しない。導入遺伝子構築物において、pCDNA3.0(Invitrogen)由来のウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGH)シグナルを、T1R3遺伝子の3’末端に連結した。この改変により、マウスのPCRに基づく遺伝子型決定が可能となり、そして導入遺伝子由来のT1R3の発現と、通常の遺伝子由来の発現とを直接的に比較することが可能になる。トランスジェニックマウスを、FVB/N卵母細胞の前核注入によって作製した。本発明者らは、FVB/Nマウスが甘味味物質に感受性でありかつT1R3テイスター対立遺伝子を有することを決定したので、トランスジェニック初代動物を、129/SvJと交雑した。次いで、この導入遺伝子を有するF1マウスを、129/SvJに戻し交雑した。F2マウスを、BGHタグを使用して、導入遺伝子の存在についてタイピングし、そして、FVB/Nと129/SvJとの間のBsp120I制限多型性を使用して、内因性の非テイスターT1R3対立遺伝子のホモ接合性についてタイピングした(図2aを参照のこと)。4つすべての遺伝子群を、行動について試験した。マウスを3週間目に離乳させ、そして、試験を開始する前に、2本の水のボトルから飲むことに対して、7〜10日間訓練した。
ンスジェニック初代動物に由来する(ならびに雄性および雌性の)マウスを、別々に配置して、生データの比較を可能にした。アッセイに使用された群のサイズは、4以上のケージからなり、各々が最少で2匹の動物を有した。マウスは常に、まず低い濃度でアッセイされた(Fuller、1974)。すべての場合において、動物には、濃度シリーズの間に、少なくとも2日間の水を与えられた。各試験は、48時間の期間にわたる2本のボトルの選択アッセイからなり;ボトルの提供を24時間後に切り替えた。嗜好の比率を、総摂取量で試験溶液の消費量を除算することによって算出した。各ケージからのデータを個別に分析して、系統的な偏りを回避した。同じアッセイを使用して、129/Sv、C57BL/6およびFVB/Nコントロールマウスの味覚嗜好を分析した。
すべてのレセプターを、pEAK10哺乳動物発現ベクター(Edge Biosystems,MD)にクローン化した。改変されたHEK−293細胞(PEAKrapid細胞;Edge BioSystems,MD)を、5%ウシ胎仔血清、100μg/ml硫酸ゲンタマイシン(Fisher)、1μg/mlアンホテリシンBおよび2mM
GlutaMax I(Lifetechnologies)を補充されたUltra
Culture培地(Bio Whittaker)において、37℃にて増殖および維持した。トランスフェクションのために、細胞を、マトリゲルコーティングされた6ウェル培養プレート、24ウェル培養プレートまたは35mm記録チャンバーに播種した。37℃で24時間後に、細胞を、OptiMEM培地(Lifetechnologies)において洗浄し、そしてLipofectAMINE試薬(Lifetechnologies)を使用してトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、GFPリポータープラスミドの同時トランスフェクションによって概算した。トランスフェクション効率は、代表的に、70%より高かった。活性アッセイを、24ウェル培養プレートおよび35mm記録チャンバーにおいてトランスフェクトされた細胞について、トランスフェクションから36〜48時間後に実施した;6ウェル培養プレートにおいてトランスフェクトされた細胞は、一晩増殖され、トリプシン処理され、96ウェル培養プレートに移され、そして再播種から36〜48時間後にアッセイされた。
トランスフェクトされた細胞を、1mMピルビン酸ナトリウムおよび10mM HEPES、pH7.4(アッセイ緩衝液)を含むハンクス平衡塩溶液中で一旦洗浄し、そして室温で1時間にわたり2μM FURA−2 AM(Molecular Probes)を負荷した。負荷溶液を取り除き、そして24ウェルプレートの細胞を、1時間にわたり、250μlのアッセイ緩衝液と共に培養し(96ウェルプレートの細胞は、50μlと共に培養された)、AMエステルの切断を可能にした。24ウェル組織培養プレートにおいてT1RおよびGタンパク質(OffermannsおよびSimon,1995;Chandrashekarら,2000;Modyら,2000)を発現する細胞を、250μlの2×味物質溶液で刺激した(96ウェルプレートの細胞は、50μlの2×味物質溶液で刺激された)。Gα15およびGα16−Gzシグナル伝達についてのコントロールとして、1セットのプレートを、mGluR1およびμ−オピオイドレセプターで同時トランスフェクトし、そしてACPDおよびDAMGOに対する応答についてアッセイした。
感CCDカメラ(Sutter Instruments)を備えたOlympus IX−70/FLA顕微鏡を利用した。VideoProbeソフトウェア(Instrutech)を、これらの蛍光画像の取得および分析のために使用した。一般的に、個々の応答は、60秒間測定された。F340/F380比を分析して、[Ca2+]iを測定した。
以下の味物質を、以下の代表的な最大濃度で用いて、試験した:スクロース(250mM)、サッカリンナトリウム(25mM)、N−メチルサッカリン(5mM)、ズルチン(2mM)、アスパルテーム(2mM)、パラチノース(250mM)、シクラミン酸ナトリウム(15mM)、グアニジノ酢酸−1(1mM)、グアニジノ酢酸−2(1mM)、グアニジノ酢酸−3(1mM)、アセスルファーム−K(10mM)、グルコース(250mM)、マルトース(250mM)、ラクトース(250mM)、フルクトース(250mM)、ガラクトース(250mM)、キシリトール(250mM)、ラフィノース(250mM)、ソルビトール(250mM)、トレハロース(250mM)、タウマチン(0.1%)、モネリン(0.1%)、アラニン(20mM)、グリシン(20mM)、アルギニン(20mM)、グルタミン酸一ナトリウム(20mM)、シクロヘキシミド(5μM)、デナトニウム(10mM)、フェニル−チオカルバミド(2.5mM)。
(結果)
T1R味覚レセプターは、アミノ酸のグルタミン酸塩(Nakanishi,Science,258:597−603(1992))(向代謝性グルタミン酸塩レセプター,mGluR)、GABA(Kaupmannら,Nature,386:239−246(1997))(γ−アミノ酪酸;GABA−Bレセプター)およびアルギニン(Specaら,Neuron,23:487−498(1999))(R5−24レセプター)と別々に関連付けられるので、本発明者らは、T1Rファミリーのメンバーを試験することから始めた。T1Rの発現パターンは、少なくとも3つの異なる細胞型を規定する:T1R2およびT1R3を共発現する細胞(T1R2+3、甘味レセプター)、T1R1およびT1R3を共発現する細胞(例えば、T1R1+3)、およびT1R3のみを発現する細胞(Nelsonら,Cell,106:381−390(2001))。まず、本発明者らは、20種すべての標準的なアミノ酸および種々のD−アミノ酸に対するT1R2+3甘味味覚レセプターの応答をアッセイした。ヒトに甘味の味がし、そしてマウスに誘因性であるいくつかのD−アミノ酸は、T1R2+3甘味味覚レセプターの強力な活性化を誘発する(図1a、b)。しかし、試験されたL−アミノ酸はいずれも、このレセプターを活性化しない。
る(図1)。この応答は、T1R1およびT1R3の組み合わされた存在に厳密に依存しており、そしてL−アミノ酸に対して高度に選択的である;D−アミノ酸ならびに他の天然甘味料および人工甘味料は、T1R1+3レセプターの組み合わせを活性化しなかった。これらの結果は、T1R1+3をL−アミノ酸についてのレセプターとして立証し、そしてサブユニットの組み合わせ配置によってその選択性を急激に改変するヘテロマー性GPCRレセプターの特筆すべき例を提供する。
1);Bachmanovら,J.Nutr.130:9355−9415(2000))。従って、T1R3が、甘味レセプターおよびアミノ酸レセプターの共通のパートナーとして機能するならば、本発明者らは、T1R3非テイスター対立遺伝子は、T1R2+3の組み合わせに選択的に影響を与えるはずであると考えた。
udhariら、Nature Neurosci.3:113−119(2000))。本発明者の結果は、T1R1およびT1R3が組み合わされて、広範に調整されるアミノ酸レセプターとして機能することを実証する。注目すべきことに、T1R1+3は、L−AP4に応答し(図1)、MSGおよび他のアミノ酸は、プリンヌクレオチドによって著しく増強される。従って、本発明者らは、T1R1+3が、旨味レセプターの構成要素であることを提案する。苦味、甘味、そしてここでアミノ酸の味覚レセプターの同定は、種々の味覚様相の間の相互作用の解明、および末梢(味覚レセプター細胞)での事象と中枢神経系(認知および行動)との間の関係の解明の助けとなる強力な土台を提供する。
(異種発現およびカルシウム画像化)
細胞を、全く以前に記載されたようにして(Nelsonら,Cell 106:381−390(2001))、増殖し、維持し、そしてトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、緑色蛍光タンパク質(GFP)リポータープラスミドでの同時トランスフェクションによって概算した。トランスフェクション効率は、代表的に、70%より高かった。FURA−2アセトメチルエステルを使用して、細胞内カルシウム濃度([Ca2+]i)を測定し、そしてアッセイ条件は、以前に記載された条件(Nelsonら,Cell 106:381−390(2001))と同一であった。応答を、60秒間測定し、そして340nmおよび380nmの波長における蛍光比(F340/F380)を使用して、[Ca2+]iを測定した。データ分析のために、応答は、約300個のトランスフェクトされた細胞の視野において応答する細胞の数を言及する。細胞を、F340/F380が、味物質の添加後に0.27より上に上昇した場合に、応答動物としてカウントした。一般に、応答する細胞の90%より多くが、0.35より高いF340/F380を有した。用量応答関数を、記号論理式を使用して当てはめた。T1R3のテイスター対立遺伝子および非テイスター対立遺伝子に関する研究は、それぞれ、C57BL/6および129/Svマウス由来のT1R3についての相補的DNAコードの構築物を使用した(Nelsonら,Cell 106:381−390(2001);Kitagawaら,Biochem.Biophys.Res.Cummun.283:236−242(2001);Montmayeurら,Nature Neurosci.4:492−498(2001);Maxら,Nature Genet.28:58−63(2001);Sainzら,J.Neurochem.77:896−903(2001);Bachmanovら,Chem.Senses,26:925−933(2001))。
T1R3に対する抗体を、マウスレセプターの残基824〜845に対応するペプチドを用いて作製した。PEAKrapid細胞(Edge Biosciences)に、HA−T1R1、HA−T1R2およびT1R3を種々の組み合わせでトランスフェクトし、そして50mM Tris−HCl(pH 7.5)、300mM NaCl、1%NP−40、0.5%(w/v)デオキシコール酸ナトリウムおよびプロテアーゼインヒビター(Roche)を含有する緩衝液中に集め、そして破壊した。溶解産物を、一晩4℃で、マウスモノクローナル抗HA抗体(Santa Cruz)と共にインキュベートし、そして免疫複合体を、タンパク質AG−アガロースビーズを用いて収集した。サンプルを、SDS−PAGEによって分画し、ニトロセルロース膜に移し、そして抗T1R3抗体を用いて探索した。相互作用の特異性についてのコントロールとして、本発明者らは、T1R3を発現する細胞由来の抽出物と、タグ化されたT1R1またはT1R2を発現する細胞由来の抽出物を人為的に混合したものが、複合体を生成しないことを示した。同様に、Rho−タグ化されたmGluR1レセプター(Nakanishi,Science,258:597−603(1992)の同時トランスフェクションは、T1R−GluR1複合体を生じない。
舌の刺激および記録の手順を、以前に記載されたようにして(Dahlら,Brain
Res.,756:22−34(1997))実施した。神経シグナルを、Grass
P511 AC増幅器(Astro−Med)を使用して増幅し(2,000×)、Digidata 1200B A/Dコンバーター(Axon Instruments)を使用してデジタル化し、そして0.5秒の時間定数で積分した(r.m.s.電圧)。味覚刺激を、20秒間の間隔(提示の間に、2分間のリンスにより中断される)に4ml/分間の一定流速で提示する。すべてのデータ分析は、刺激適用直後の25秒間にわたる積分応答を使用した。各実験シリーズは、記録の安定性を保証するための0.1Mクエン酸の提示により一纏めにされる、6回の味物質の適用からなった。0.1Mクエン酸に対する応答平均を、各実験シリーズに対する応答を正規化するために使用した。
(配列表)
Claims (50)
- T1R3ポリペプチドを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドが、配列番号14、19、22、24または29のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項1に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドが組換え体である、請求項1に記載の単離されたレセプター。
- 請求項5に記載の単離されたレセプターを含む、宿主細胞。
- 前記レセプターが、T1R3ポリペプチドと異種ポリペプチドとを含む、請求項1に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項7に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、共有結合により結合されている、請求項7に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドおよび前記異種ポリペプチドが、組換え体である、請求項7に記載の単離されたレセプター。
- 請求項10に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
- 前記異種ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R1ポリペプチドである、請求項7に記載の単離されたレセプター。
- 前記異種ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R1ポリペプチドである、請求項7に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R1ポリペプチドが、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R1ポリペプチドが、配列番号4、5、6または26のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項12に記載の単離されたレセプター。
- 前記レセプターがアミノ酸味覚リガンドに結合する、請求項12に記載の単離されたレセプター。
- 前記味覚リガンドが、システイン、メチオニン、アルギニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、プロリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アスパラギン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、セリン、スレオニン、グリシン、グルタミン酸塩、グルタミン酸一ナトリウムおよびL−AP4からなる群より選択される、請求項16に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドおよび前記T1R1ポリペプチドが、組換え体である、請求項12に記載の単離されたレセプター。
- 請求項18に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
- 前記異種ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R2ポリペプチドである、請求項7に記載の単離されたレセプター。
- 前記異種ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるT1R2ポリペプチドである、請求項7に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R2ポリペプチドが、配列番号7、8または9のアミノ酸配列を有する、請求項20に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R2ポリペプチドが、配列番号10、11、12または28のヌクレオチド配列によってコードされる、請求項20に記載の単離されたレセプター。
- 前記レセプターが甘味味覚リガンドに結合する、請求項20に記載の単離されたレセプター。
- 前記甘味味覚リガンドが、スクロース、フルクトース、サッカリン、アセスルファーム−K、ズルチン、アスパルテーム、シクラミン酸塩、ならびにグアニジノ酢酸1およびグアニジノ酢酸2(GA−1およびGA−2)からなる群より選択される、請求項24に記載の単離されたレセプター。
- 前記レセプターがD−アミノ酸味覚リガンドに結合する、請求項20に記載の単離されたレセプター。
- 前記T1R3ポリペプチドおよび前記T1R2ポリペプチドが、組換え体である、請求項20に記載の単離されたレセプター。
- 請求項27に記載の組換え体のレセプターを発現する、宿主細胞。
- 前記レセプターが、Gタンパク質共役型レセプター活性を有する、請求項1に記載の単離されたレセプター。
- 前記レセプターが、配列番号15、20、23、25または30に対して惹起された抗体に特異的に結合する、請求項1に記載の単離されたレセプター。
- T1R3ポリペプチドとT1R1ポリペプチドとを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ;そしてここで、該T1R1ポリペプチドは、配列番号1、2、3または27のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
- T1R3ポリペプチドとT1R2ポリペプチドとを含む単離された味覚レセプターであって、ここで該T1R3ポリペプチドは、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ;そしてここで、該T1R2ポリペプチドは、配列番号7、8または9のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる、単離された味覚レセプター。
- 請求項1に記載の味覚レセプターに対して特異的に結合する、抗体。
- 前記抗体が、T1R1とT1R3とを含む味覚レセプターに対して特異的に結合する、請求項33に記載の抗体。
- 前記T1R1ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項34に記載の抗体。
- 前記T1R1ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、共有結合により結合されている、請求項34に記載の抗体。
- 前記抗体が、T1R2とT1R3とを含む味覚レセプターに対して特異的に結合する、請求項33に記載の抗体。
- 前記T1R2ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、非共有結合により結合されている、請求項37に記載の抗体。
- 前記T1R2ポリペプチドおよび前記T1R3ポリペプチドが、共有結合により結合されている、請求項37に記載の抗体。
- 配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、単離された核酸。
- 前記核酸が、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項40に記載の核酸。
- 前記核酸が、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする、請求項40に記載の核酸。
- 前記核酸が、配列番号14、19、22、24または29のヌクレオチド配列を有する、請求項40に記載の核酸。
- 請求項40に記載の核酸を含む、発現ベクター。
- 請求項44に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、単離されたポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸に対して、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされる、請求項46に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号15、20、23、25または30のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされる、請求項46に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号14、19、22、24または29のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる、請求項46に記載のポリペプチド。
- 請求項46に記載のポリペプチドに対して特異的に結合する、抗体。
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