JP2009060895A - PRODUCTION METHOD OF SOLUBLE beta-D-GLUCAN POWDER - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微生物、特にオーレオバシジウム属（Aureobasidium sp）に属する微生物の培養液から、清涼飲料水、健康食品素材、又は食品用増粘剤などとして有用な多糖類でβ-Ｄ−グルカン、特にβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを効率的、かつ簡便に分離・精製し、可溶性高純度β−Ｄ−グルカン粉末を得る製造方法に関する。 The present invention is a polysaccharide useful as a soft drink, a health food material, or a food thickener from a culture solution of microorganisms, particularly microorganisms belonging to the genus Aureobasidium sp, β-D-glucan, In particular, the present invention relates to a production method for efficiently and simply separating and purifying β-1,3-1,6-D-glucan to obtain soluble high-purity β-D-glucan powder.
従来、オ−レオバシディウム（Aureobasidium sp.）属に代表される微生物がβ-Ｄ−グルカンを生産することが知られている（非特許文献１）。β-Ｄ−グルカンは、制ガン作用や免疫活性化作用を有することが示唆されており、健康食品素材として有用である。 Conventionally, it is known that microorganisms represented by the genus Aureobasidium sp. Produce β-D-glucan (Non-patent Document 1). β-D-glucan has been suggested to have an anticancer effect and an immune activation effect, and is useful as a health food material.
一般に、β-Ｄ−グルカンはその構造から水溶液中で１重らせんや３重らせん構造を取るため、β-Ｄ−グルカン水溶液はゲルを形成し易い。このためβ-Ｄ−グルカンが菌体外に生産された微生物培養液は高粘度で、その精製は困難である（非特許文献２）。例に漏れず、オーレオバシジウム属微生物の培養液も、菌体外生産されたβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを含むことから粘度が高く、その培養液から菌体を除去し、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを回収、精製することは非常に困難である。このため、オーレオバシジウム属微生物の培養液からβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを分離、精製する工業的方法は殆ど報告されていない。
また、β-Ｄ−グルカン溶液は粘度が高いため低濃度にする必要があり、輸送や貯蔵の点から、またサプルメントや化粧品用途では水を含まない原料が求められていることから可溶性高純度β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン粉末の製法が求められている。
In general, β-D-glucan has a single-helix or triple-helix structure in an aqueous solution due to its structure, and thus a β-D-glucan aqueous solution easily forms a gel. For this reason, the microorganism culture solution in which β-D-glucan is produced outside the cells has a high viscosity and is difficult to purify (Non-patent Document 2). As usual, the culture solution of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium also contains β-1,3-1,6-D-glucan produced outside the cell body, so that the viscosity is high and the cell body is removed from the culture solution. However, it is very difficult to recover and purify β-1,3-1,6-D-glucan. For this reason, there are few reports on industrial methods for separating and purifying β-1,3-1,6-D-glucan from the culture solution of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium.
In addition, β-D-glucan solution has a high viscosity and therefore needs to be made low in concentration. From the viewpoint of transportation and storage, and for raw materials containing no water in supplements and cosmetics, soluble high-purity β There is a need for a process for producing -1,3-1,6-D-glucan powder.
オーレオバシジウム属微生物の培養液よりβ-Ｄ−グルカン粉末を製造する方法としては、オーレオバシジウム属微生物の培養液をアルカリ処理により低粘度化後、中和処理を行い、微生物を除去し、ついでエタノールを添加し析出したβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを噴霧乾燥し粉末化する製法（特許文献１）が知られている。 As a method for producing β-D-glucan powder from a culture solution of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium, the culture solution of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium is reduced in viscosity by alkali treatment, neutralized, Next, a production method (Patent Document 1) is known in which ethanol is added and the precipitated β-1,3-1,6-D-glucan is spray-dried to form a powder.
経済的観点から、より高純度のβ-Ｄ-グルカン粉末を高収率で製造するための、方法の改良が望まれていた。 From an economical point of view, it has been desired to improve the method for producing a higher purity β-D-glucan powder in a high yield.
本発明は、可溶性β−Ｄ−グルカン粉末を高純度、高収率で経済的に製造する方法を提供する。 The present invention provides a method for economically producing soluble β-D-glucan powder with high purity and high yield.
本発明は
下記、第１から第５の工程において脱塩工程を含むことなく、
第１工程において、β-Ｄ−グルカン含有水性液をｐＨ１２以上に調整し、
第２工程において、上記β-Ｄ−グルカン含有水性液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第３工程において、上記上清をｐＨ４．０未満の酸性に調整し、
第４工程において、上記酸性に調整した溶液にアルコールを添加してβ-Ｄ−グルカンを析出させ、
第５工程において、上記析出して得られたβ-Ｄ−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β-Ｄ−グルカン粉末の製造方法に関する。
また、本発明は、上記第２工程と第３工程を入れ替えた態様である、
下記、第１から第５の工程において脱塩工程を含むことなく、
第１工程において、β−Ｄ−グルカン含有水性液をｐＨ１２以上に調整し、
第２工程において、上記β−Ｄ−グルカン含有水性液をｐＨ４．０未満の酸性に調整し、
第３工程において、上記酸性に調整した溶液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第４工程において、上記上清にアルコールを添加してβ−Ｄ−グルカンを析出させ、
第５工程において、上記析出して得られたβ−Ｄ−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β−Ｄ−グルカン粉末の製造方法に関する。
さらに、本発明は、上記製造方法により製造されたβ−Ｄ−グルカンに関する。
The present invention includes the following desalting steps in the first to fifth steps,
In the first step, the β-D-glucan-containing aqueous liquid is adjusted to pH 12 or higher,
In the second step, microorganisms or insoluble contaminants are removed from the β-D-glucan-containing aqueous liquid to obtain a supernatant,
In the third step, the supernatant is adjusted to an acidity of less than pH 4.0,
In the fourth step, alcohol is added to the acidified solution to precipitate β-D-glucan,
In the fifth step, the β-D-glucan obtained by precipitation is dried and powdered.
The present invention relates to a method for producing water-soluble β-D-glucan powder.
Moreover, this invention is the aspect which replaced the said 2nd process and the 3rd process,
Without including a desalting step in the following first to fifth steps,
In the first step, the β-D-glucan-containing aqueous liquid is adjusted to pH 12 or higher,
In the second step, the β-D-glucan-containing aqueous liquid is adjusted to an acidity of less than pH 4.0,
In the third step, microorganisms or insoluble impurities are removed from the acidified solution to obtain a supernatant,
In the fourth step, alcohol is added to the supernatant to precipitate β-D-glucan,
In the fifth step, the β-D-glucan obtained by precipitation is dried and powdered.
The present invention relates to a method for producing water-soluble β-D-glucan powder.
Furthermore, the present invention relates to β-D-glucan produced by the above production method.
本発明の方法は、粗β−Ｄ−グルカン水溶液を特定酸性条件下でアルコールを加え析出させることを特徴としており、本方法によれば可溶性β−Ｄ−グルカン粉末を高純度、高収率に製造することができる。 The method of the present invention is characterized in that a crude β-D-glucan aqueous solution is precipitated by adding alcohol under specific acidic conditions. According to this method, soluble β-D-glucan powder is purified with high purity and high yield. Can be manufactured.
以下、本発明を詳細に説明する。
精製β-Ｄ−グルカンの製造方法
一実施態様において、本発明は、β-Ｄ−グルカン含有水性液をｐＨ１２以上に調整する第１工程、微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得る第２工程、上清をｐＨ＝４．０未満の酸性に調整する第３工程、酸性に調整した溶液にエタノールを添加してβ-Ｄ−グルカンを沈殿させる第４工程と、得られたβ-Ｄ−グルカンを乾燥、粉末化する第５工程を含む水可溶性β-Ｄ−グルカン粉末の製造方法を提供する。
ここで、β-Ｄ-グルカン含有水性液は、β-Ｄ-グルカンを含む水溶液であり、β-Ｄ-グルカンの由来には限定されない。β-Ｄ-グルカン含有水性液は、例えば、β-Ｄ-グルカンを産生する微生物の培養液又は該微生物の破砕液である。
β−Ｄ−グルカン含有水性液の提供
＜微生物・β−Ｄ−グルカン＞
微生物はβ−Ｄ−グルカンを生産できる微生物であればよく特に限定されない。β−Ｄ−グルカンとしては、β−１，３−Ｄ−グルカン、β−１，６−Ｄ−グルカン、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカン等が挙げられる。これらのβ-Ｄ−グルカンは、有用な生理活性を示すことが知られている。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In one embodiment of the method for producing purified β-D-glucan , the present invention comprises a first step of adjusting the β-D-glucan-containing aqueous liquid to pH 12 or higher, removing microorganisms or insoluble contaminants to obtain a supernatant. 2 steps, a 3rd step of adjusting the supernatant to an acidity of less than pH = 4.0, a 4th step of adding ethanol to the acidified solution to precipitate β-D-glucan, and the obtained β- Provided is a method for producing water-soluble β-D-glucan powder, which comprises a fifth step of drying and pulverizing D-glucan.
Here, the β-D-glucan-containing aqueous liquid is an aqueous solution containing β-D-glucan, and is not limited to the origin of β-D-glucan. The β-D-glucan-containing aqueous solution is, for example, a culture solution of microorganisms that produce β-D-glucan or a disruption solution of the microorganisms.
Provision of β-D-glucan-containing aqueous liquid
<Microbe / β-D-glucan>
The microorganism is not particularly limited as long as it can produce β-D-glucan. Examples of β-D-glucan include β-1,3-D-glucan, β-1,6-D-glucan, β-1,3-1,6-D-glucan and the like. These β-D-glucans are known to exhibit useful physiological activities.
これらのβ-Ｄ−グルカンを生産する微生物としては、オーレオバシジウム属（Aurebasidium sp.）微生物、パン酵母（S.cerevisiae)、担子菌(Lentinus edodes,Schizophyllum commune,Coriolus versicolor)などが挙げられる。中でも、制ガン作用や免疫活性化作用を有することが報告されているβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを主に生産する点で、オーレオバシジウム属微生物が好ましい。オーレオバシジウム属微生物としては、オーレオバシジウム・プルランス（Aurebasidium pullulans）などの微生物が挙げられる。 Examples of microorganisms that produce these β-D-glucans include Aurebasidium sp. Microorganisms, baker's yeast (S. cerevisiae), basidiomycetes (Lentinus edodes, Schizophyllum commune, Coriolus versicolor) and the like. Among these, Aureobasidium microorganisms are preferred because they mainly produce β-1,3-1,6-D-glucan, which has been reported to have an anticancer action and an immune activation action. Examples of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium include microorganisms such as Aurebasidium pullulans.
特に、培養液が比較的低粘度であること、及びβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを高生産する点で、オーレオバシジウム・プルランスが好ましく、Aureobasidium sp. Ｋ−１株(以下、「Ｋ−１株」ということがある）の変異菌株であるAureobasidium pullulans GM-NH-1A1株（以下、「ＧＭ１Ａ１株」ということがある）、及びAureobasidium pullulans GM-NH-1A2株（以下、「ＧＭ１Ａ２株」ということがある）がより好ましい。これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにそれぞれFERM BP-10294及びFERM BP-10295として寄託済みである。オーレオバシジウム属Ｋ−１株は、分子量２００万以上と１００万程度の２種類のβ-１，３-１，６-Ｄ-グルカンを生産することが知られている。また、Ｋ−１株の生産するβ-Ｄ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている（Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)）,科学と工業,64,131-135（1990））。 In particular, aureobasidium pullulans is preferable in that the culture medium has a relatively low viscosity and high production of β-1,3-1,6-D-glucan. Aureobasidium sp. K-1 strain ( Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (hereinafter sometimes referred to as “GM1A1 strain”) and Aureobasidium pullulans GM-NH-1A2 strain (hereinafter also referred to as “K-1 strain”) , Sometimes referred to as “GM1A2 strain”). These strains have been deposited as FERM BP-10294 and FERM BP-10295 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary, respectively. The Aureobasidium genus K-1 strain is known to produce two types of β-1,3-1,6-D-glucan having a molecular weight of 2 million or more and about 1 million. In addition, β-D-glucan produced by the K-1 strain is known to have a sulfoacetic acid group (Arg. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)), Science and Industry, 64, 131- 135 (1990)).
なお、本発明は、担子菌やパン酵母等が生産する水不溶性のβ-Ｄ−グルカンを精製する場合にも、アルカリ処理により可溶化できるβ-Ｄ−グルカンであれば適用できる。この場合、例えばキノコ細胞を緩衝液中で破砕してグルカンを含む破砕液を調製して、第１工程に供すればよい。また、パン酵母などの培養液をそのまま、又は一旦集菌して緩衝液などに懸濁した懸濁液を、超音波などを用いて破砕して、菌体外にβ-Ｄ-グルカンを放出させ、この微生物破砕液を第１工程に供すれば良い。更に本発明は別の方法で作成された不純物の多い可溶性β−Ｄ−グルカンの精製にも適用できる。
＜微生物の培養＞
β-Ｄ−グルカンを培養液中に分泌させる微生物培養方法は公知である。例えば、オーレオバシジウム属微生物を培養して、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産させる方法が、Biosci. Biotech. Biochem., 57(8), 1348-1349, 1993；特開平６−３４０７０１号公報；特願平９−５６３９１号公報；特開平７−５１０８１号公報などに報告されている。
The present invention is also applicable to the purification of water-insoluble β-D-glucan produced by basidiomycetes, baker's yeast, etc., as long as it is β-D-glucan that can be solubilized by alkali treatment. In this case, for example, mushroom cells may be crushed in a buffer solution to prepare a crushed solution containing glucan and used for the first step. In addition, the culture solution of baker's yeast or the like is collected as it is or once suspended and suspended in a buffer solution or the like, the suspension is disrupted using ultrasonic waves to release β-D-glucan outside the cells. The microorganism disruption solution may be used for the first step. Furthermore, the present invention can also be applied to the purification of soluble β-D-glucan having a large amount of impurities prepared by another method.
<Culture of microorganisms>
Microbial culture methods for secreting β-D-glucan into the culture medium are known. For example, a method of culturing an aureobasidium microorganism to produce β-1,3-1,6-D-glucan is described in Biosci. Biotech. Biochem., 57 (8), 1348-1349, 1993; No. 6-340701; Japanese Patent Application No. 9-56391; Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-51081.
オーレオバシジウム属微生物の培養に使用できる炭素源としては、シュ−クロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトン、酵母エキスなどを挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源を挙げることができる。場合によってはβ-Ｄ−グルカンの生産量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、さらには鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類、グルコン酸を添加するのも有効な方法である。 Examples of carbon sources that can be used for cultivation of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium include carbohydrates such as sucrose, glucose and fructose, peptone, yeast extract and the like. Examples of the nitrogen source include inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, sodium nitrate, and potassium nitrate. In some cases, in order to increase the production amount of β-D-glucan, inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, phosphate, magnesium salt and calcium salt, and trace metal salts such as iron, copper and manganese are appropriately used. Adding vitamins and gluconic acid is also an effective method.
また、例えばオーレオバシジウム属（Aureobasidium. sp）に属する微生物を炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを生産することが報告されている（Agric. Biol.Chem., 47, 1167-1172 (1983)；科学と工業, 64, 131-135 (1990)；特願平５−２２２２９号公報）。シュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加し、さらに必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加したものも好適に使用できる。 Further, for example, when a microorganism belonging to the genus Aureobasidium. Sp is cultured in a medium in which ascorbic acid is added to a tourpec medium containing sucrose as a carbon source, a high concentration of β-1,3-1,6- It has been reported to produce D-glucan (Agric. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983); Science and Industry, 64, 131-135 (1990); Japanese Patent Application No. 5-22229 ). What added ascorbic acid to the tour peck culture medium containing sucrose, and also added organic nutrients, such as a yeast extract and peptone as needed, can also be used conveniently.
オーレオバシジウム属（Aureobasidium. sp）微生物は、通常、通気攪拌により好気培養すればよい。培養温度は１０〜４５℃程度が好ましく、２０〜３５℃程度がより好ましい。また、培養液のｐＨは３〜７程度が好ましく、３．５〜５程度がより好ましい。培養中、アルカリ、又は酸を用いて培養液ｐＨを上記範囲に制御することも好ましい。さらに、培養液の泡立ちを抑えるために消泡剤を添加しても良い。培養時間は１〜１０日間程度もあれば十分量のβ−Ｄ−グルカンを生産することができるが、通常は１〜４日間程度でよい。β−Ｄ−グルカンの生産量を測定しながら培養時間を決めても良い。
上記のようにしてオーレオバシジウム属微生物を培養した培養液にはβ−１，３−１，６−Ｄ−グルカンを主成分とするβ−Ｄ−グルカン多糖が０．１％から数％(w/v)含有されており、その培養液の粘度は、ＢＭ型回転粘度計（東機産業社製）を用いて３０℃で測定する場合に、数百〜数千ｃＰ ([ｍＰａ・s] )という非常に高い粘度を示す。微生物破砕液も同様である。
第１工程
Aureobasidium sp. Microorganisms are usually aerobically cultured by aeration and agitation. The culture temperature is preferably about 10 to 45 ° C, more preferably about 20 to 35 ° C. Moreover, about 3-7 are preferable and, as for pH of a culture solution, about 3.5-5 are more preferable. It is also preferable to control the culture solution pH within the above range using an alkali or an acid during the culture. Further, an antifoaming agent may be added to suppress foaming of the culture solution. If the culture time is about 1 to 10 days, a sufficient amount of β-D-glucan can be produced, but usually about 1 to 4 days. The culture time may be determined while measuring the production amount of β-D-glucan.
Β-D-glucan polysaccharide containing β-1,3-1,6-D-glucan as a main component is from 0.1% to several% in the culture solution in which the microorganism of the genus Aureobasidium is cultured as described above. The viscosity of the culture solution is several hundred to several thousand cP ([mPa · s) when measured at 30 ° C. using a BM type rotational viscometer (manufactured by Toki Sangyo Co., Ltd.). ]) Very high viscosity. The same applies to the microorganism disruption liquid.
First step
第１工程では、上記微生物の培養液又は破砕液のｐＨを１２以上、好ましくは１３以上に調整する。培養液又は破砕液を攪拌しつつアルカリを添加すればｐＨを高くすることができる。アルカリの種類は水に溶解するものであればよく特に制限されない。例えば、水酸化ナトリウムを用いる場合、培養液中の水酸化ナトリウムの最終濃度が０．２〜４％(w/v)、好ましくは０．４〜２．４％(w/v)、更に好ましくは０．５〜２．０％(w/v)になるように添加する。アルカリの添加量が多すぎると得られるβ-Ｄ−グルカン粉末の純度が低下する傾向がある。 In the first step, the pH of the culture solution or crushed solution of the microorganism is adjusted to 12 or more, preferably 13 or more. If an alkali is added while stirring the culture solution or crushed solution, the pH can be increased. The type of alkali is not particularly limited as long as it is soluble in water. For example, when using sodium hydroxide, the final concentration of sodium hydroxide in the culture solution is 0.2-4% (w / v), preferably 0.4-2.4% (w / v), more preferably Is added to 0.5 to 2.0% (w / v). When there is too much addition amount of an alkali, there exists a tendency for the purity of the beta-D-glucan powder obtained to fall.
ｐＨを１２以上にすると、培養液の粘度が通常数ｃＰ（[ｍＰａ・s]）程度まで、急激ないしは瞬時に低下する。アルカリは公知のものを制限なく使用できる。公知のアルカリとしては、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液のような炭酸アルカリ塩水溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液のような水酸化アルカリ水溶液；アンモニア水溶液などが挙げられる。食用には、食品添加物として認められている水酸化ナトリウム水溶液が好ましい。
第２工程
第２工程では、アルカリ性培養液又は破砕液から菌体や、菌体破砕物のような不溶性夾雑物を除去する。
When the pH is set to 12 or more, the viscosity of the culture solution is rapidly or instantaneously decreased to about several cP ([mPa · s]). Any known alkali can be used without limitation. Known alkalis include alkali carbonate aqueous solutions such as calcium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution and ammonium carbonate aqueous solution; alkali hydroxide aqueous solution such as sodium hydroxide aqueous solution, potassium hydroxide aqueous solution and calcium hydroxide aqueous solution. An aqueous ammonia solution or the like. For edible use, an aqueous sodium hydroxide solution recognized as a food additive is preferred.
Second Step In the second step, insoluble contaminants such as microbial cells and microbial cells are removed from the alkaline culture solution or crushed liquid.
従来、粘度の高い培養液から菌体を除去するのは困難であった。そのため、例えば現在市販されているアウレオバシジウム属微生物の培養液は菌体を含む。これに対して、アルカリ処理により粘度を低下させた培養液又は微生物破砕液は菌体や不溶性物質が沈降し易いため、これらを容易に除去することができる。
不溶性夾雑物を除去前のβ−Ｄ−グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性夾雑物除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β−Ｄ−グルカン濃度は、0.1mg/ml〜20mg/ml、好ましくは0.5mg/ml〜10mg/ml、さらに好ましくは1mg/ml〜5mg/mlが良い。
Conventionally, it has been difficult to remove cells from a highly viscous culture solution. For this reason, for example, a commercially available culture solution of the microorganism belonging to the genus Aureobasidium contains bacterial cells. On the other hand, the culture solution or microorganism disruption solution whose viscosity has been reduced by the alkali treatment tends to settle the cells and insoluble substances, and therefore these can be easily removed.
The β-D-glucan solution before removal of insoluble impurities may be diluted with water as necessary. If the concentration is too high, it is difficult to remove insoluble impurities, and if it is too low, it is not efficient. The β-D-glucan concentration is 0.1 mg / ml to 20 mg / ml, preferably 0.5 mg / ml to 10 mg / ml, more preferably 1 mg / ml to 5 mg / ml.
培養液又は破砕液から菌体や不溶性夾雑物を分離、除去する方法は周知である。本発明方法ではどのような除去方法を採用してもよいが、工業的にはフィルタープレス、連続遠心分離装置による菌体除去が好ましい。これにより、通常、菌体以外の不溶性夾雑物の一部又は全部も除去される。菌体とともに不溶性夾雑物を完全に除去することが好ましい。
第３工程
第３工程では、アルコールを加えβ−Ｄ−グルカン析出させるための前段階として、培養液のｐＨを４．０未満、好ましくは３．８以下、更に好ましく２．０〜３．７、特に３．０〜３．７の酸性に調整する。これにより、β−Ｄ-グルカン析出時にβ−Ｄ−グルカン以外の低分子物質や塩類の沈降を防ぐことができる。
ｐＨが４．０以上ではβ−Ｄ−グルカン純度が悪くなる。
Methods for separating and removing bacterial cells and insoluble impurities from the culture solution or crushed solution are well known. Any removal method may be employed in the method of the present invention, but industrially, removal of cells by a filter press or a continuous centrifugal separator is preferred. Thereby, a part or all of insoluble impurities other than the cells are usually removed. It is preferable to completely remove insoluble impurities together with the cells.
Third Step In the third step, the pH of the culture solution is less than 4.0, preferably 3.8 or less, more preferably 2.0 to 3.7, as a pre-stage for adding alcohol to precipitate β-D-glucan. In particular, the acidity is adjusted to 3.0 to 3.7. Thereby, precipitation of low molecular weight substances and salts other than β-D-glucan can be prevented during the precipitation of β-D-glucan.
When the pH is 4.0 or more, the purity of β-D-glucan is deteriorated.
ｐＨ調整用の酸の種類は特に限定されず、公知の酸を用いることができる。公知の酸として、塩酸、燐酸、硫酸などの無機酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、アミノ酸、アスコルビン酸などの有機酸が挙げられる。好ましくは、食品添加物として認められているクエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、アスコルビン酸、特にクエン酸である。 The kind of acid for adjusting the pH is not particularly limited, and a known acid can be used. Known acids include inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid and sulfuric acid, and organic acids such as citric acid, malic acid, gluconic acid, amino acids and ascorbic acid. Preferred are citric acid, malic acid, gluconic acid, ascorbic acid, especially citric acid, which are recognized as food additives.
なお、上記第２工程と第３工程の順を入れ替えることもできる。
すなわち、菌体除去工程の前に、アルカリ性の培養液に酸を添加して、ｐＨを４．０未満、好ましくは３．８以下、更に好ましく２．０〜３．７、特に３．０〜３．７の酸性に調整し、その後菌体を除去してもよい。ｐＨを中性付近から酸性付近に調整しても多糖がゲル化することは無く、低粘度が維持される。
この場合も、ｐＨ調整用の酸の種類は特に限定されず、公知の酸を用いることができる。公知の酸として、塩酸、燐酸、硫酸、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸、アミノ酸、アスコルビン酸などが挙げられる。食用には、食品添加物として認められているクエン酸、リンゴ酸、グルコン酸が好ましい。
Note that the order of the second step and the third step can be switched.
That is, before the microbial cell removal step, an acid is added to the alkaline culture solution, and the pH is less than 4.0, preferably 3.8 or less, more preferably 2.0 to 3.7, particularly 3.0 to 3.7. You may adjust to the acidity of 3.7, and you may remove a microbial cell after that. Even if the pH is adjusted from near neutral to near acidic, the polysaccharide does not gel, and a low viscosity is maintained.
Also in this case, the kind of acid for adjusting the pH is not particularly limited, and a known acid can be used. Known acids include hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, citric acid, malic acid, gluconic acid, amino acids, ascorbic acid and the like. For edible use, citric acid, malic acid and gluconic acid which are recognized as food additives are preferred.
第４工程
第４工程では、ｐＨを酸性に調整した培養液にアルコールを添加することにより、培養液中の高分子物質、すなわちβ−Ｄ−グルカンのみを沈殿させることができる。アルコールとしては炭素数２〜６のアルコールを使用できるが、好ましくは炭素数２〜４のアルコールであり、特にエタノールが好ましい。
また、アルコールを加える前の工程では透析などの脱塩処理は必要ない。脱塩工程を行わないことにより得られる精製β-Ｄ−グルカン粉末の回収率が向上する。
明細書および特許請求の範囲において、「脱塩工程」は、透析により試料中の塩濃度を１／１０以下に、好ましくは１／５以下に、より好ましくは１／２以下に、低下させる工程である。
本発明においては、アルコール添加前に、透析膜を用いてβ−Ｄ−グルカン溶液を濃縮してもよいが、この場合は、β−Ｄ−グルカン溶液中の塩濃度が低下しないので、勿論本発明における「脱塩工程」には該当しない。
Fourth Step In the fourth step, only a high-molecular substance in the culture solution, that is, β-D-glucan can be precipitated by adding alcohol to the culture solution whose pH is adjusted to be acidic. As the alcohol, an alcohol having 2 to 6 carbon atoms can be used, but an alcohol having 2 to 4 carbon atoms is preferable, and ethanol is particularly preferable.
In addition, desalting treatment such as dialysis is not necessary in the process before adding alcohol. The recovery rate of the purified β-D-glucan powder obtained by not performing the desalting step is improved.
In the specification and claims, the “desalting step” is a step of reducing the salt concentration in the sample to 1/10 or less, preferably 1/5 or less, more preferably 1/2 or less by dialysis. It is.
In the present invention, the β-D-glucan solution may be concentrated using a dialysis membrane before the addition of alcohol. However, in this case, the salt concentration in the β-D-glucan solution does not decrease. It does not correspond to the “desalting step” in the invention.
酸性にｐＨ調整した培養液上清に、エタノールを培養上清の４倍容量（８０％）以下、好ましくは３倍容量(７７％)以下、さらに好ましくは２〜２．５（６６−７１％）倍容量程度することでβ−Ｄ−グルカンを沈殿させることができる。このときエタノールの最終濃度は４０〜８０％、好ましくは５０〜７５％、さらに好ましくは６０〜７０％にすることが好ましい。 Ethanol is added to the culture supernatant whose pH is adjusted to acidic, 4 times volume (80%) or less, preferably 3 times volume (77%) or less, more preferably 2 to 2.5 (66-71%) of the culture supernatant. ) Β-D-glucan can be precipitated by increasing the volume to about twice. At this time, the final concentration of ethanol is preferably 40 to 80%, preferably 50 to 75%, more preferably 60 to 70%.
また培養液上清とエタノールの混合については、培養上清にエタノールを添加してもよいし、エタノールに培養上清を添加してもよい。このとき培養上清をスターラーなどで混合し、エタノールを少しずつ添加することがより好ましい。また、添加するエタノールの濃度は、最終濃度が適正範囲であればいずれでもよいが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９５％以上がよい。
第５工程
第４工程でアルコールを添加することによりβ−Ｄ−グルカンが析出する。第５工程では、この析出したβ-Ｄグルカンを回収し、乾燥させ、粉末化する。
Regarding the mixing of the culture supernatant and ethanol, ethanol may be added to the culture supernatant, or the culture supernatant may be added to ethanol. At this time, it is more preferable to mix the culture supernatant with a stirrer and add ethanol little by little. The concentration of ethanol to be added may be any as long as the final concentration is in an appropriate range, but is preferably 85% or more, more preferably 95% or more.
Fifth Step β-D-glucan is precipitated by adding alcohol in the fourth step. In the fifth step, the precipitated β-D glucan is collected, dried and powdered.
析出した沈殿物のみを回収し、上清を除去する方法としては、どのような除去方法を採用してもよいが、吸引ろ過法、遠心分離法が好ましい。工業的にはメッシュを用いた遠心分離法、連続遠心分離装置、シャープレスを用いた回収が好ましい。さらには第４工程において用いたアルコールと同一、同濃度のアルコール水溶液を用いて沈殿物を洗浄することができる。 As a method for collecting only the deposited precipitate and removing the supernatant, any removal method may be adopted, but suction filtration and centrifugation are preferred. Industrially, a centrifugal method using a mesh, a continuous centrifugal device, and recovery using a shear press are preferable. Further, the precipitate can be washed using an alcohol aqueous solution having the same concentration as the alcohol used in the fourth step.
得られたβ−Ｄ−グルカンの乾燥方法は特に限定されず公知の方法を用いることができる。公知の方法として、棚乾燥、加温乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、スプレードライ法などが挙げられる。得られたβ−Ｄ−グルカン乾燥物を粉砕し、粉末をそのまま、または溶解させて水溶液にして使用することができる。 The drying method of the obtained β-D-glucan is not particularly limited, and a known method can be used. Known methods include shelf drying, warm drying, reduced pressure drying, freeze drying, spray drying, and the like. The obtained dried β-D-glucan can be pulverized, and the powder can be used as it is or dissolved to form an aqueous solution.
また、粉末化後のβ−Ｄ−グルカンの一次構造は、培養後の天然型のβ−Ｄ−グルカンと同じであると考えられる。即ち、１Ｎ水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とするβ−Ｄ−グルカン溶液の１Ｈ ＮＭＲスペクトルが約４．７ｐｐｍ及び約４．５ｐｐｍの２つのシグナルを有するものである。ＮＭＲの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約４．７ｐｐｍ」「約４．５ｐｐｍ」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅（例えば±０．２）を含む数値を意味する。
本発明において、微生物としてオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A1株（FERM BP-10294)、又はオーレオバシジウム・プルランスGM-NH-1A2株（FERM BP-10295)を用いる場合、得られる多糖は、β−１，３−１，６−Ｄ−グルカンであることが、２次元NMR(13C-1H COSY NMR）分析を用いて常法により確認された。
Further, the primary structure of β-D-glucan after pulverization is considered to be the same as that of natural β-D-glucan after culturing. That is, the 1 H NMR spectrum of a β-D-glucan solution using 1N sodium hydroxide heavy aqueous solution as a solvent has two signals of about 4.7 ppm and about 4.5 ppm. Since it is well known that NMR measurement values change due to subtle changes in conditions and are accompanied by errors, “about 4.7 ppm” and “about 4.5 ppm” are measured values within the normally expected range. A numerical value including a fluctuation range (for example, ± 0.2).
In the present invention, when Aureobasidium pullulans GM-NH-1A1 strain (FERM BP-10294) or Aureobasidium pullulans GM-NH-1A2 strain (FERM BP-10295) is used as the microorganism, the resulting polysaccharide is , Β-1,3-1,6-D-glucan was confirmed by a conventional method using two-dimensional NMR ( 13 C- 1 H COZY NMR) analysis.
β−Ｄ−グルカン粉末を水に溶かしβ−Ｄ−グルカン水溶液として食品用途に供する場合、溶解後に加熱滅菌、ろ過殺菌、又は紫外線滅菌などの方法で滅菌することが好ましい。食品用途に供する場合の加熱滅菌は、通常ｐＨ３．５〜１０程度の下、６５〜９０℃程度で行うべきことが定められている。
上記ｐＨ調整を行う場合、滅菌は、その前後のいずれに行ってもよい。
本発明方法における殺菌を除く各工程は、５〜５０℃程度の温度下で行うことができ、通常は、常温ないしは室温下で行えばよい。
また、本発明の製造方法により製造されるβ−Ｄ−グルカン粉末は、化粧品としても提供される。
When the β-D-glucan powder is dissolved in water and used as a β-D-glucan aqueous solution for food applications, it is preferably sterilized by a method such as heat sterilization, filter sterilization, or ultraviolet sterilization after dissolution. It is stipulated that heat sterilization for food use should be performed at a temperature of about 65 to 90 ° C. under a pH of about 3.5 to 10.
When the pH adjustment is performed, sterilization may be performed before or after that.
Each process except the sterilization in the method of the present invention can be performed at a temperature of about 5 to 50 ° C., and it may be normally performed at room temperature or room temperature.
Moreover, the β-D-glucan powder produced by the production method of the present invention is also provided as a cosmetic.
実施例１
以下、本発明を実施例、及び試験例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）β-Ｄ−グルカンの培養生産
後掲の表１の組成からなる１００ｍｌの液体培地を５００ｍｌ肩付きフラスコに入れ、１２１℃、１５分間、加圧蒸気滅菌を行った後、ＧＭ１Ａ１株を同培地組成のスラントより無菌的に１白金耳植菌し、２４時間、３０℃で１３０ｒｐｍの通気攪拌培養を行い種培養液を調製した。
Example 1
EXAMPLES Hereinafter, although an Example and a test example are given and this invention is demonstrated in detail, this invention is not limited to these Examples.
(1) Culture production of β-D-glucan After putting 100 ml of liquid medium having the composition shown in Table 1 into a 500 ml shoulder flask and autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes, GM1A1 strain was obtained. One platinum ear was inoculated aseptically from a slant having the same medium composition, and a seed culture solution was prepared by aeration-stirring culture at 30 rpm at 30 ° C. for 24 hours.
次いで、同組成の培地２００Ｌを３００Ｌ容培養装置（丸菱バイオエンジ製）に入れ、１２１℃、１５分間、加圧蒸気滅菌を行ったものに、上記種培養液を無菌的に植菌し、２００ｒｐｍ、２８℃、４０Ｌ／分の通気攪拌培養を行った。 Next, 200 L of the medium having the same composition was placed in a 300 L culture apparatus (manufactured by Maruhishi Bioengineering), and the above seed culture solution was aseptically inoculated into those subjected to autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes, Aeration stirring culture was performed at 200 rpm, 28 ° C., 40 L / min.
培養開始時のｐＨは３．５であった。また、１２０時間培養後のｐＨは４．３０、菌体濁度はＯＤ ６６０ｎｍで３０ ＯＤで、β−Ｄ−グルカン濃度は０．９％(ｗ／ｖ)であった。β−Ｄ−グルカン濃度は、培養液を数ｍＬサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が６６％(ｖ／ｖ)となるようにエタノールを加えてβ−Ｄ−グルカンを沈殿させ、回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。 The pH at the start of the culture was 3.5. Further, the pH after 120-hour culture was 4.30, the turbidity was 30 OD at OD 660 nm, and the β-D-glucan concentration was 0.9% (w / v). The β-D-glucan concentration was measured by sampling several mL of the culture solution, centrifuging and removing the cells, and then adding ethanol to the supernatant so that the final concentration was 66% (v / v). -After glucan was precipitated and collected, it was dissolved in ion-exchanged water and quantified by the phenol-sulfuric acid method.
（２）アルカリ処理
（１）で得られた培養液をＢＭ型回転粘度計により測定したところ、粘度は３０℃で１２００ [ｍＰａ・s]であった。この培養液に最終濃度が２．４％(ｗ／ｖ)となるように２５％(ｗ／ｗ)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところｐＨ１３．２となり、瞬時に粘度が低下した。
(2) When the culture solution obtained by the alkali treatment (1) was measured with a BM type rotational viscometer, the viscosity was 1200 [mPa · s] at 30 ° C. When 25% (w / w) sodium hydroxide was added to this culture broth to a final concentration of 2.4% (w / v) and stirred, the pH became 13.2 and the viscosity decreased instantaneously.
引き続いて１０００Ｌ容タンクに培養液を移し、飲料水で３倍量に希釈し、同様にして粘度を測定したところ、粘度は１０ [ｍＰａ・s ]であった。
水溶液の粘度は、ＴＯＫＩＭＥＣ製ＢＭ型粘度計を用いて測定した。
（３）除菌
次いで、この培養液に珪藻土を１ｗｔ％添加し、薮田式ろ過圧搾機（薮田機械製）を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液約６００Ｌを得た。そのβ−Ｄ−グルカン濃度をフェノール硫酸法で定量したところ、０．２％(ｗ／ｖ)で、ほぼ１００％のβ−Ｄ−グルカン回収率であった。
（４）β-Ｄ−グルカン水溶液のｐＨ調整
上記のβ-Ｄ−グルカン水溶液（培養除菌液、β-Ｄ−グルカン濃度２ｇ/Ｌ）１Ｌに５０％クエン酸水溶液を加えて、ｐＨ３．０に調整したものを実施例１−１、ｐＨ３．５に調整したものを実施例１−２、ｐＨ３．７に調整したものを実施例１−３、ｐＨ４．０に調整したものを比較例１−１、ｐＨ４．５に調整したものを比較例１−２、ｐＨ５．０に調整したものを比較例１−３、ｐＨ７．０に調整したものを比較例１−４、ｐＨ１３．２のままのものを比較例１−５とした。
（５）β-Ｄ−グルカン水溶液のエタノール沈殿
それぞれのβ-Ｄ−グルカン水溶液（実施例１−１〜３、比較例１−１〜５）をスターラーで撹拌、混合し、２倍容量の９９．５％エタノールを少量ずつ添加した。その後、２５℃で静置し沈殿させた。
（６）β-Ｄ−グルカンの回収、乾燥、粉末化
沈殿物はろ紙（桐山製作所 ＮＯ．５Ｂ ９５φ）を用いて吸引ろ過法により回収し、回収物は凍結乾燥させ、乾燥後に乳鉢を用いて粉末化した。
Subsequently, the culture solution was transferred to a 1000 L tank, diluted to 3 times with drinking water, and the viscosity was measured in the same manner. The viscosity was 10 [mPa · s].
The viscosity of the aqueous solution was measured using a BM viscometer manufactured by TOKIMEC.
(3) Sterilization Next, 1 wt% of diatomaceous earth was added to this culture solution, and the cells were removed using a Kamata type filter press (manufactured by Kamata Machinery Co., Ltd.) to finally obtain about 600 L of a culture filtrate. When the β-D-glucan concentration was quantified by the phenol sulfate method, it was 0.2% (w / v), and the recovery rate of β-D-glucan was almost 100%.
(4) pH adjustment of β-D-glucan aqueous solution 50% citric acid aqueous solution was added to 1 L of the above β-D-glucan aqueous solution (cultured disinfectant, β-D-glucan concentration 2 g / L) to obtain a pH of 3.0 Example 1-1 adjusted to pH 3.5 Example 1-2 adjusted to pH 3.5 Example 1-3 adjusted to pH 3.7 Example 1-3 adjusted to pH 4.0 Comparative Example 1 -1, adjusted to pH 4.5, Comparative Example 1-2, adjusted to pH 5.0, Comparative Example 1-3, adjusted to pH 7.0, remained as Comparative Example 1-4, pH 13.2. This was designated as Comparative Example 1-5.
(5) Precipitation of ethanol in β-D-glucan aqueous solution Each β-D-glucan aqueous solution (Examples 1-1 to 3 and Comparative Examples 1-1 to 5) was stirred and mixed with a stirrer to double the volume of 99. .5% ethanol was added in small portions. Then, it left still at 25 degreeC and precipitated.
(6) Recovery, drying and pulverization of β-D-glucan The precipitate is recovered by suction filtration using filter paper (Kiriyama Seisakusho No. 5B 95φ), and the recovered product is freeze-dried and dried using a mortar. Powdered.
β-Ｄ−グルカン粉末の純度測定
実施例１−１〜３、比較例１−１〜５で得られたβ-Ｄ−グルカン乾燥粉末の純度を測定した。それぞれのβ-Ｄ−グルカン乾燥粉末を１０ｍｇ／ｍｌ（１．０重量％）になるように溶解し、β-Ｄ−グルカン水溶液を作成し、少量をサンプリングし、以下のフェノール硫酸法で定量した。
Purity measurement of β-D-glucan powder The purity of the dried β-D-glucan powder obtained in Examples 1-1 to 1-3 and Comparative examples 1-1 to 5 was measured. Each β-D-glucan dry powder was dissolved to 10 mg / ml (1.0% by weight) to prepare a β-D-glucan aqueous solution, a small amount was sampled, and quantified by the following phenol-sulfuric acid method. .
具体的には、精製β-Ｄ−グルカン溶液０．１（ｍｌ）をサンプリングし、そこにイオン交換水０．９（ｍｌ)加えて撹拌した。この溶液５０（μｌ)とイオン交換水４５０（μl）、５（％（ｗ／ｖ））フェノール溶液５００（μｌ)を攪拌混合し、そこに濃硫酸２．５（ｍｌ）を加え、攪拌した。室温で３０分放置冷却した溶液の吸光度（Ａｂｓ４９０ｎｍ）を測定し、グルコースを用いて作成した検量線より定量した。（「糖質の化学」（朝倉書店）新家龍、南浦能至、北畑寿美雄、大西正健 編参照）。 Specifically, purified β-D-glucan solution 0.1 (ml) was sampled, and ion-exchanged water 0.9 (ml) was added thereto and stirred. This solution 50 (μl) and ion-exchanged water 450 (μl), 5 (% (w / v)) phenol solution 500 (μl) were stirred and mixed, and concentrated sulfuric acid 2.5 (ml) was added thereto and stirred. . The absorbance (Abs 490 nm) of the solution that was allowed to cool at room temperature for 30 minutes was measured, and quantified from a calibration curve prepared using glucose. (See "Sugar Chemistry" (Asakura Shoten) edited by Shinjiryu, Nozomi Minamiura, Toshio Kithata, Masatake Onishi).
上記方法により、実施例１−１〜３、比較例１−１〜５で得たβ−Ｄ−グルカン粉末中のβ-Ｄ-グルカンの純度（重量％）（下表ではパウダー純度と記載する）を求めたところ、ｐＨ３．０に調整したもので８７．０重量％（実施例１−１）、ｐＨ３．５に調整したもので９７．０重量％（実施例１−２）、ｐＨ３．７に調整したもので９７．０重量％（実施例１−３）、ｐＨ４．０に調整したもので７．９重量％（比較例１−１）、ｐＨ４．５のもので７．３重量％（比較例１−２）、ｐＨ５．０に調整したもので５．９重量％（比較例１−３）、ｐＨ７．０に調整したもので１６．０重量％（比較例１−４）、ｐＨ１３．２に調整したもので６１．０重量％（比較例１−５）となった。 Purity (% by weight) of β-D-glucan in the β-D-glucan powders obtained in Examples 1-1 to 3 and Comparative Examples 1-1 to 5 by the above method (in the table below, described as powder purity) ) Was adjusted to pH 3.0, 87.0 wt% (Example 1-1), adjusted to pH 3.5, 97.0 wt% (Example 1-2), pH 3. 97.0% by weight (Example 1-3) adjusted to 7, 7.9% by weight (Comparative Example 1-1) adjusted to pH 4.0, 7.3% by weight pH 4.5 % (Comparative Example 1-2), adjusted to pH 5.0, 5.9% by weight (Comparative Example 1-3), adjusted to pH 7.0, 16.0% by weight (Comparative Example 1-4) The pH was adjusted to 13.2 to 61.0% by weight (Comparative Example 1-5).
実施例２
実施例１の（３）に記載の除菌工程で得られた除菌後の低粘度培養ろ液２Lを実施例1に従い、50%クエン酸水溶液でpH3.5に調整した後、2倍容のエタノールで該培養液中のβグルカンを沈澱させた。その後、実施例１の（６）記載の方法に従って得られた該βグルカンの回収、乾燥、そして粉末化を行った。その結果、パウダー純度（βグルカン純度）97％のβグルカン乾燥粉末3.0ｇを得た。除菌低粘度培養ろ液からの回収率は81％であった。
比較例２
実施例１の（３）に記載の除菌工程で得られた除菌後の低粘度化培養ろ液２Lを、スペクトラム社製の限外ろ過膜（分子量カット50K、膜面積8000cm2）を用いて該培養液の塩濃度が1/64になるまで透析により脱塩を行った。次いで、得られた脱塩培養液を50％クエン酸水溶液を添加してpＨを3.5に調整した後、２倍容の99.5%エタノールを添加して、培養液中のβグルカンを沈澱させた。その後、実施例１の（６）記載の方法に従って得られた該βグルカンの回収、乾燥、そして粉末化を行った。その結果、パウダー純度（βグルカン純度）95％のβグルカン粉末2.3ｇを得た。脱塩前の除菌低粘度培養ろ液からの回収率は61％であった。
実施例３
実施例１−（３）に記載の除菌工程で得られた除菌後の低粘度化培養ろ過液を、各種有機酸を添加してpHを3.5に調整した。pH調整用の有機酸として、クエン酸、リンゴ酸、グルコン酸を使用した。その後、実施例１−（５）に記載の方法に従ってエタノール沈殿を実施し、実施例１−（６）に記載の方法に従ってβグルカンの回収、乾燥、そして粉末化を行った。
実施例１と同様にして、実施例３−１〜３で得たβ-D-グルカン粉末中のβ-D-グルカンの純度（重量％）（下表ではパウダー純度と記載する）を求めたところ、クエン酸で調整したもので９６．６重量％（実施例３−１）、リンゴ酸で調整したもので９８．０重量％（実施例３−２)、グルコン酸で調整したもので９０．４重量％（実施例３−３）となった。
Example 2
2 L of the low-viscosity culture filtrate after sterilization obtained in the sterilization step described in (3) of Example 1 was adjusted to pH 3.5 with 50% citric acid aqueous solution according to Example 1, and then doubled. The β-glucan in the culture solution was precipitated with ethanol. Thereafter, the β-glucan obtained according to the method described in Example 1 (6) was recovered, dried, and powdered. As a result, 3.0 g of β-glucan dry powder having a powder purity (β-glucan purity) of 97% was obtained. The recovery rate from the sterilized low-viscosity culture filtrate was 81%.
Comparative Example 2
Using the ultrafiltration membrane (molecular weight cut 50K, membrane area 8000 cm 2 ) manufactured by Spectrum Co., Ltd., 2 L of the low-viscosity culture filtrate after sterilization obtained in the sterilization step described in Example 1 (3) Then, desalting was performed by dialysis until the salt concentration of the culture solution became 1/64. Next, 50% aqueous citric acid solution was added to the obtained desalted culture solution to adjust the pH to 3.5, and then 2 volumes of 99.5% ethanol was added to precipitate β-glucan in the culture solution. Thereafter, the β-glucan obtained according to the method described in Example 1 (6) was recovered, dried, and powdered. As a result, 2.3 g of β-glucan powder having 95% powder purity (β-glucan purity) was obtained. The recovery rate from the sterilized low-viscosity culture filtrate before desalting was 61%.
Example 3
Various organic acids were added to the reduced viscosity culture filtrate after sterilization obtained in the sterilization step described in Example 1- (3) to adjust the pH to 3.5. Citric acid, malic acid, and gluconic acid were used as organic acids for pH adjustment. Thereafter, ethanol precipitation was performed according to the method described in Example 1- (5), and β-glucan was collected, dried, and powdered according to the method described in Example 1- (6).
In the same manner as in Example 1, the purity (% by weight) of β-D-glucan in the β-D-glucan powder obtained in Examples 3-1 to 3 (denoted as powder purity in the table below) was determined. However, 96.6% by weight (Example 3-1) prepared with citric acid, 98.0% by weight (Example 3-2) adjusted with malic acid, 90% adjusted with gluconic acid. It became 4 weight% (Example 3-3).
Claims (12)
第１工程において、β−Ｄ−グルカン含有水性液をｐＨ１２以上に調整し、
第２工程において、上記β−Ｄ−グルカン含有水性液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第３工程において、上記上清をｐＨ４．０未満の酸性に調整し、
第４工程において、上記酸性に調整した溶液にアルコールを添加してβ−Ｄ−グルカンを析出させ、
第５工程において、上記析出して得られたβ−Ｄ−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β−Ｄ−グルカン粉末の製造方法。 Without including a desalting step in the following first to fifth steps,
In the first step, the β-D-glucan-containing aqueous liquid is adjusted to pH 12 or higher,
In the second step, microorganisms or insoluble contaminants are removed from the β-D-glucan-containing aqueous liquid to obtain a supernatant,
In the third step, the supernatant is adjusted to an acidity of less than pH 4.0,
In the fourth step, alcohol is added to the acid adjusted solution to precipitate β-D-glucan,
In the fifth step, the β-D-glucan obtained by precipitation is dried and powdered.
A method for producing water-soluble β-D-glucan powder.
第１工程において、β−Ｄ−グルカン含有水性液をｐＨ１２以上に調整し、
第２工程において、上記β−Ｄ−グルカン含有水性液をｐＨ４．０未満の酸性に調整し、
第３工程において、上記酸性に調整した溶液から微生物又は不溶性夾雑物を除去して上清を得、
第４工程において、上記上清にアルコールを添加してβ−Ｄ−グルカンを析出させ、
第５工程において、上記析出して得られたβ−Ｄ−グルカンを乾燥、粉末化する、
ことを含む水可溶性β−Ｄ−グルカン粉末の製造方法。 Without including a desalting step in the following first to fifth steps,
In the first step, the β-D-glucan-containing aqueous liquid is adjusted to pH 12 or higher,
In the second step, the β-D-glucan-containing aqueous liquid is adjusted to an acidity of less than pH 4.0,
In the third step, microorganisms or insoluble impurities are removed from the acidified solution to obtain a supernatant,
In the fourth step, alcohol is added to the supernatant to precipitate β-D-glucan,
In the fifth step, the β-D-glucan obtained by precipitation is dried and powdered.
A method for producing water-soluble β-D-glucan powder.
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