JP2009050268A - 転写ｄｎａ結合部位を含む環状ダンベルデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ｃｄｏｄｎ） - Google Patents

Abstract

【課題】転写因子に関連する疾患および障害を処置または予防するためのより効率的かつより有効な手段を提供する。
【解決手段】本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を備えた環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、上記ＣＤＯＤＮを含有する薬学的組成物を、さらに提供する。この薬学的組成物は、このような転写因子に関連する疾患または障害を、処置および／または予防するために、使用され得る。この方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、上記ステム構造は、上記転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。
【選択図】なし

Description

本発明は、遺伝子治療分野の発明である。本発明は特に、新規のデコイオリゴデオキシ
ヌクレオチドおよびその使用に関する。

転写因子の還元性トランス活性のための二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮま
たは「デコイ（ｄｅｃｏｙ）」）は、遺伝子治療および遺伝子産物の機能研究のための、
革新的かつ魅力的な戦略である。幾つかの異なった二本鎖ＤＮＡ構造（非改変オリゴヌク
レオチド二重鎖、脱アノマーオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチ
ド二重鎖、およびダンベルオリゴヌクレオチドが挙げられる）が、転写因子のためのデコ
イとして、導入されている（Ｓｃｈｏｌｅｒ ＨＲおよびＧｒｕｓｓ Ｐ．，Ｃｅｌｌ
１９８４；３６：４０３−４１１；Ｃｅｒｅｇｈｉｎｉ Ｓｅｔら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ
１９８８；２：９５７−９７４；Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ ＬＡら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ １９８９；９：４２７２−４２８１；Ｔａｎａｋａ Ｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９４；２２：３０６９−３０７４；Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ Ａら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９０；２５０：９９７−１０００；Ｃｌｕｓｅｌ Ｃら，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９３；２１：３４０５−３４１１；Ｌｉｍ ＣＳら，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９７；２５：５７５−５８１；Ｈｏｓｏｙａ
Ｔら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９９９；４６１：１３６−１４０；Ｍａｎｎ ＭＪおよ
びＤｚａｕ ＶＪ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：１０７１−１０７
５を、参照のこと）。

二本鎖シスエレメントデコイＯＤＮのトランスフェクションは、同配列の内在性シスエ
レメントからのトランス活性因子の隔離をもたらし、その結果、遺伝子発現の阻害をもた
らす（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ Ａら，１９９０（前出）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒら１９９
８（前出）；およびＳａｗａ Ｙ，Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．，Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９７；９６：ＩＩ−２８０−ＩＩ−２８５を、参照のこと）．
さらに、ＮＦ−κＢ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｃ２、ｃｄｋ２、Ｅ２Ｆ、および
ＣＲＥに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはデコイオリゴヌクレオチドの投与
は、悪液質を減少すること（Ｋａｗａｍｕｒａ Ｉら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９９９；
６：９１−９７）、実験的狭窄におけるインビトロの細胞増殖および内膜肥厚（Ｓｉｍｏ
ｎｓ Ｍら，Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５９：６７−７３；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒら
，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９４；９３：１４５８−１４６４；Ｍｏｒｉｓｈｉ
ｔａ Ｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９３；９０：８４７
４−８４７８；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒら，１９９５（前出）； Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ
Ｒら，Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９７；３：８９４−８９９；Ｋａｎｅｄａ Ｙ ａｎｄ Ｍ
ｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒ，Ｊｐｎ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９９７；４５：９９−
１０５；Ｔｏｍｉｔａら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８；２７５：Ｆ２７８−Ｆ
２８４；Ｍａｅｓｈｉｍａ Ｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９８；１０１：２
５８９−２５９７；Ａｋｉｍｏｔｏ Ｍら，Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．１９９８；６７：
３９５−４０１；Ｍａｎｎ ＭＪら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９９；３５４：１４９３−１４
９８；Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｚａｕ ２０００（前出）；Ｋａｗａｕｃｈｉ Ｍら，Ｃｉ
ｒｃ．Ｒｅｓ．２０００；８７：１０６３−１０６８；Ｍａｎｇｉ ＡＡ ａｎｄ Ｄｚ
ａｕ ＶＪ，Ａｎｎ Ｍｅｄ ２００１；３３：１５３−１５５；Ｅｈｓａｎ Ａら，Ｊ
Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ ２００１；１２１：７１４−７２２
；Ｋａｗａｕｃｈｉ Ｍら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．２００１；３３：４５１
；ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｍ，Ｌａｎｃｅｔ，２００１；３５８：１７０３を参照のこと）、
増殖性胆管炎の抑制（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍら，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．２００２；１０２
：９５−１０１）および癌モデルにおいて腫瘍増殖を遅くし、アポトーシスを誘導するこ
と（Ｐａｒｋ ＹＧら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：１５７３−８０；
Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ ＹＳら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００；２１２：
２９−３４；Ａｌｐｅｒ Ｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１；２１８
：５５−６３）が、それぞれ示されている。

非改変オリゴヌクレオチドＯＤＮの主な制限は、これらが血清中および細胞中のヌクレ
アーゼによって容易に分解されることである。この問題を解決するため、改変結合（例え
ば、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート）を有するオリゴヌクレオチドが、開
発されている。しかし、これらの改変ＯＤＮは、ＲＮａｓｅ Ｈ に対する非反応性、細
胞性ＤＮＡ内への加水分解された改変ヌクレオチドの再利用の可能性、ＯＤＮベースの遺
伝子治療の配列特異的結合効果の欠如、および免疫活性化などの問題点を示す（Ｍｏｏｎ
ＩＪら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：４６４７−４６５３；Ｈｏｓｏ
ｙａ Ｔら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９９；４６１：１３６−１４０；Ｋｈａｌ
ｅｄ Ｚら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９６；２４：７３７−７７５；
Ｇａｏ ＷＹら，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９２；４１：２２３−２２９；Ｂｒ
ｏｗｎ ＤＡら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９４；２６９：２６８０１−２６８０５
；およびＢｕｒｇｅｓｓ ＴＬら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １
９９５；９２：４０５１−４０５５を参照のこと）。

近年、デコイが、転写因子に関連する疾患および障害（新内膜形成を含む）の処置のた
めに提案されている。新内膜形成は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰増殖および中膜
から内膜への転移から生じ、これらは、アテローム性動脈硬化症および再狭窄（経皮的冠
動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の主要な問題である）の病因における、重要な工程である（Ｃ
ｕｒｒｉｅｒ ＪＷ，およびＦａｘｏｎ ＤＰ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ
１９９５；２５：５１６−５２０；Ｃｌｏｗｅｓ ＡＷ，ら，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ
１９８３；４９：２０８−２１５；Ｌｉｕ ＭＷ，ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９８
９；７９：１３７４−１３８７；Ｒｏｓｓ Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；３６２：８
０１−８０９；およびＰａｕｌｅｔｔｏ Ｐ，ら，Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ．１９９４；８７：
４６７−４７９を、参照のこと）。

ＰＴＣＡ後の再狭窄の発生率および割合を減少するために、多くの薬物の試験が行われ
ているが、結果は芳しくない。この十年にわたって、ＶＳＭＣ増殖に主眼を置いた抗遺伝
子治療が、ＰＴＣＡ後の再狭窄を減少するための、可能性のある魅力的な戦略として、出
現している（Ｓｉｍｏｎｓ Ｍ，ら，Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５９：６７−７３；Ｍ
ｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒ，ら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９４；９３：１４５８−
１４６４；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒ，ら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ １９９３；９０：８４７４−８４７８；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒ，ら，Ｐｒｏｃ Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５；９２：５８５５−５８５９；Ｍｏｒｉｓ
ｈｉｔａ Ｒ，ら，Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９７；３：８９４−８９９；Ｍｏｒｉｓｈｉｔ
ａ Ｒら，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２００１；９１：１０５−１１４，Ｍｏｔｏｋｕｎｉ
Ａら，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ ２００１；５９：４３−５２を参照のこと）。

これまでの研究では、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびｃ−Ｊｕｎ ＮＨ
_２−末端キナーゼ（ＪＮＫ）（両方とも分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰ
Ｋ）ファミリーに属する）は、バルーン損傷後に、迅速かつ過渡的に活性化されることが
見出されている（Ｏｈａｓｈｉ Ｎ，ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖ
ａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０００；２０：２５２１−２５２６；Ｋｏｙａｍａ Ｈ，ら，Ｃｉ
ｒｃ Ｒｅｓ．１９９８；８２：７１３−７２１；Ｈｕ Ｙ，ら，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ
ｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．１９９７；１７：２８０８−２８１６；およ
びＰｙｌｅｓ ＪＭ，ら，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９７；８１：９０４−９１０を参照の
こと）。

損傷した血管壁におけるＥＲＫ２活性およびＪＮＫ１活性は、バルーン損傷後迅速に上
昇し、損傷５分後に高レベルに達する。ＥＲＫ２キナーゼ活性における持続的な上昇は、
損傷後７日間にわたって動脈壁において、そして１４日にわたって新内膜において、観察
された。（Ｈｕ Ｙ，ら，１９９７（前出）；およびＩｚｕｍｉ Ｙ，ら，Ｃｉｒｃ Ｒ
ｅｓ．２００１；８８：１１２０−１１２６）。

ＪＮＫおよびＥＲＫは、核内に転座し、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓ（二量体化し、転
写因子複合体ＡＰ−１を形成する）を活性化することが公知である。ＡＰ−１は、多様な
範囲の細胞増殖性応答（例えば、細胞外マトリックス産生）（Ｋａｒｉｎ Ｍ．，Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１６４８３−１６４８６；およびＷｈｉｔｍａｒ
ｃｈ ＡＪ，ａｎｄ Ｄａｖｉｓ ＲＪ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．１９９６；７４：５８
９−６０７を参照）、アポトーシス（Ｌｅ−Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ Ｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１９９９；１９：７５１−７６３；Ｔａｉｍｏｒ Ｇ．ら，ＦＡＳＥＢ
Ｊ．２００１；１５：２５１８−２５２０）、血管再形成（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒら，
Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９８；２４３：３６１−
３６７；Ｌａｕｔｈ Ｍ．ら，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０００；７８：４４１−４５０；
Ｗａｇｎｅｒ ＡＨ ら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２０００；５８：１３３３−１３４０；
Ｃａｔｔａｒｕｚｚａ Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：３６９９
９−３７００３）、ＣＯＸ−２媒介性炎症（Ａｄｄｅｒｌｅｙ，ＳＲおよびＦｉｔｚｇｅ
ｒａｌｄ ＤＪ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ １９９９；２７４：５０３８−５０４６；ｖ
ｏｎ Ｋｎｅｔｈｅｎ Ａら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ １９９９；１０：３６１−
３７２；ｖｏｎ Ｋｎｅｔｈｅｎ Ａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９９９；１６３
：２８５８−２８６６；Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ Ｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
００１；２７６：１２４４９−１２４４８）および１型プラスミノーゲンアクチベーター
インヒビター（ＰＡＩ−１）の産生（Ａｈｎ ＪＤ．ら，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２
００１；４４：７１３−７２０）ＴＧＦ−β（Ｊｉｎ ＧおよびＨｏｗｅ ＰＨ，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：２６６２０−２６６２６）およびＩＬ−６（Ｖｉ
ｅｄｔ Ｃ ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ ２０００；１４：２３７０−２３７２）に関連する多
くの遺伝子の中に存在する、特定のＤＮＡ配列に結合する。

これらの結果は、ＡＰ−１結合が、血管損傷における血管平滑筋細胞増殖に関連し得る
ことを示唆する。しかし、ＡＰ−１結合の阻害が、新内膜形成を阻害するか否かは、知ら
れていない。

近年の報告はまた、転写因子Ｅ２Ｆ（サイクリンＡ、ｃｄｋ２、およびｐＲＢと複合体
を形成し、これらの細胞周期調節遺伝子を活性化およびリン酸化する）が、細胞成長およ
び細胞増殖を維持するために重要であることを示している（Ｐａｇａｎｏ Ｍら ＥＭＢ
Ｏ Ｊ １９９２；１１：９６１−９７１；Ｐａｒｄｅｅ ＡＢ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９７４；７１：１２８６−１２９０；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ
ＳＪ，ら Ｎａｔｕｒｅ １９９２；３５８：２５９−２６１；Ｐａｇａｎｏ ＭＧ，
ら Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２；２５５：１１４４−１１４７；およびＲｏｓｅｎｂｌａ
ｔｔ Ｊ，ら Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９２；８９：２８
２４−２８２８）。

転写因子である核因子−κＢ（ＮＦκＢ）は、サイトカインおよび接着分子遺伝子（虚
血および再灌流後の心筋障害に関連し得る）の協調的トランス活性化において、中心的な
役割を果たす。ＮＦκＢに特異的なデコイは、転写因子に結合し、心筋の炎症を仲介する
遺伝子の活性を阻害するためにインビボで使用され、従って、心筋炎症に対する効果的な
治療を提供する（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒ．ら，Ｎａｔ Ｍｅｄ １９９７ Ａｕｇ；３
（８）：８９４−９）。

転写因子に関連する幾つかの疾患および障害に対して、成功したデコイの適用はあるが
、上述の非改変オリゴヌクレオチドＯＤＮの、これらが血清中および細胞中に存在するヌ
クレアーゼによって容易に分解されるという主な制限は、これらの疾患および障害を処置
しかつ予防する際の、デコイの有効性をかなり低下させる。

インビトロ研究において、共有結合的に閉じたＯＤＮが、これらの制限を克服する目的
で、２つの相同な分子の酵素的な結合によってエキソヌクレアーゼ活性を避けるために、
開発されている。酵素的結合による３’端および５’端の連結によってオリゴヌクレオチ
ドを環状化して作製された、天然のＤＮＡに似た非毒性非改変バックボーンを有する、環
状ダンベルオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに対するより高い安定性を有し、
化学改変直鎖状オリゴヌクレオチドと比較してより高い細胞内への取り込みを有していた
（Ｃｈｕ ＢＣＦおよびＯｒｇａｌ Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９
９２；２０：５８５７−５８５８；およびＡｂｅ Ｔ，ら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９
８；４２５：９１−９６を参照のこと）。

しかし、このような共有結合的に閉じたＯＤＮまたは環状ダンベルオリゴヌクレオチド
が、疾患または障害の処置または予防において有効であることを示す報告は、存在してい
ない。

従って、本発明の目的は、転写因子に関連する疾患および障害を処置または予防するた
めの、より効率的かつより有効な手段を、提供することである。

さらに、本発明の目的は、ＶＳＭＣのトランスフェクションのための転写因子（例えば
、ＡＰ−１）結合部位を含むデコイＯＤＮのような手段を提供することであり、この結合
部位は、デコイを効果的にＡＰ−１に結合させ、細胞増殖性応答に関連する不可欠な遺伝
子のトランス活性化を防ぎ、そしてそれにより新内膜形成を阻害する。

従って、本発明の別の目的は、環状ダンベル構造（ＣＤＯＤＮ）を有する新規のＡＰ−
１デコイＯＤＮを提供し、バルーン損傷におけるＡＰ−１活性化の役割を明らかにするこ
とである。環状ダンベル構造（ＣＤＯＤＮ）を有するＡＰ−１デコイＯＤＮは、センダイ
ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームを用いてトランスフェクトされ得る。この発明において
、本発明者らは、ＣＤＯＤＮの安定性および有効性を、インビトロおよびインビボで評価
した。ここで、本発明者らは、ＡＰ−１活性化が、損傷への応答におけるＶＳＭＣ増殖に
おいて重要な役割を果たすこと、およびバルーン損傷工程前のラット動脈への新規ＣＤＯ
ＤＮのトランスフェクションが、バルーン損傷したラット動脈における新内膜形成をほぼ
完全に防ぐことを実証した。

本発明のさらなる目的は、血管形成術後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発する
ことであり、この戦略は、血管形成術の前、その間、またはその後に、有効量のＣＤＯＤ
Ｎ ＡＰ−１デコイまたは他のＡＰ−１阻害的化合物を、患者に投与する工程を包含する
。

本発明のなおさらなる目的は、新規のＥ２Ｆデコイを提供することであり、この新規の
Ｅ２Ｆデコイは、エキソヌクレアーゼ活性を避けるため、２つの相同なオリゴ分子の共有
結合閉環によって作製される。本発明者らは、不可欠な細胞周期調節遺伝子のトランス活
性化の際、ならびにＶＳＭＣ増殖および新内膜形成の際の、この環状ダンベルＥ２Ｆデコ
イ（ＣＤ−Ｅ２Ｆ）の安定性および配列特異的阻害効果を調査した。

本発明のなおさらなる目的は、血管形成術後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発
することであり、この戦略は、血管形成術の前、その間、またはその後に、有効量のＣＤ
−Ｅ２Ｆデコイを、患者に投与する工程を包含する。

（発明の要旨）
本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を含む環状ダンベルオリゴデオキ
シヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメ
インに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、さらに、上記ＣＤＯＤＮを含有す
る薬学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、このような転写因子に関連する疾患ま
たは障害を処置および／または予防するために、使用され得る。本発明はまた、このよう
な転写因子に関連する疾患および／または障害を処置または予防する方法を提供し、この
方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮを被
験体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、該転写因子のＤＮＡ結合ドメ
インに結合し得るヌクレオチド配列を含む。

好ましくは、この転写因子は、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６
、ＡＰ−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される。好ましくは、ＮＦ
−κＢデコイは、配列５’−ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番
号９）を含み得る（ＮＦ−κＢデコイ）；ＳＴＡＴ−１デコイは、配列５’−ＧＡＴＣＴ
ＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１０）を含み得る（
ＳＴＡＴ−１デコイ）；ＧＡＴＡ−３デコイは、配列５’−ＡＧＣＴＴＧＡＧＡＴＡＧＡ
ＧＣＴ−３’（配列番号１１）を含み得る（ＧＡＴＡ−３デコイ）；ＳＴＡＴ−６デコイ
は、配列５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ−３’（配
列番号１２）を含み得る（ＳＴＡＴ−６デコイ）；ＡＰ−１デコイは、配列５’−ＡＧＣ
ＴＴＧＴＧＡＧＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１３）または５’−ＴＧＡＣＴＣＡ
−３’を含み得る（ＡＰ−１ デコイ）；ｅｔｓデコイは、配列５’−ＡＡＴＴＣＡＣＣ
ＧＧＡＡＧＴＡＴＴＣＧＡ−３’（配列番号１４）を含み得る（Ｅｔｓデコイ）；ＣＲＥ
デコイは、配列５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’を含み得る（ＣＲＥデコイ）；およびＥ２
Ｆデコイは、配列５’−ＴＴＴＣＧＣＧＣ−３’を含み得る（Ｅ２Ｆ デコイ）。

血管平滑筋細胞の過剰増殖および新内膜形成は、アテローム性動脈硬化症および経皮的
血管形成術後の再狭窄の病因における重大な工程である。このような疾患および障害の処
置または予防におけるＡＰ−１のＣＤＯＤＮの有効性を示すため、以下の研究が行われ、
転写因子ＡＰ−１は、これらの過程において重要な役割を果たすという本発明者らの仮説
を試験し、そして血管形成後の再狭窄についての新規の治療戦略を開発した。全体的に、
本発明者らの結果は、ＡＰ−１活性化は、血管損傷における平滑筋細胞増殖の媒介におい
て、重要であることを示した。従って、本発明は、再狭窄を導く平滑筋細胞増殖に対する
新規の戦略を提供する。

本発明者らは、エキソヌクレアーゼによる破壊を避けるために、環状ダンベル構造（Ｃ
ＤＯＤＮ）を有する新規のＡＰ−１デコイＯＤＮを開発した。この新しい形態のＡＰ−１
デコイＯＤＮは、ホスホチオエート直鎖状デコイＯＤＮ（ＰＳＯＤＮ）よりも、より安定
で、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは血清のどちらかの存在下でのインキュベーション後
、その構造的完全性を大いに保った。ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションは、
血管平滑筋細胞の増殖および転移の両方を、強く阻害した。ＡＰ−１デコイＯＤＮはまた
、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの、高濃度グルコース誘導性転写発現および血清誘導性転
写発現も、阻害した。インビトロでのデータと一致して、センダイウイルス（ＨＶＪ）−
リポソーム法を使用したＡＰ−１デコイＯＤＮのインビボの投与は、ラット頚動脈のバル
ーン損傷後の新内膜形成を、ほぼ完全に阻害した。従来のＰＳＯＤＮと比較して、ＣＤＯ
ＤＮは、インビトロの平滑筋細胞の増殖阻害およびインビボの新内膜形成の阻害において
より効果的であった。ＰＳＯＤＮと比較しておよそ半分の用量のＣＤＯＤＮが、インビト
ロおよびインビボの血管平滑筋細胞の増殖阻害において同様の結果を得るために、十分で
あった。その上、ＡＰ−１のＣＤＯＤＮ結合の配列特異性は、予想外に、従来のＰＳＯＤ
Ｎよりも１０倍以上高かった。

従って、本発明は、非常に効果的なＨＶＪ−リポソーム送達法を用いた、ＡＰ−１に対
しより安定なＣＤＯＤＮの使用は、ヒトにおいて、血管形成後の再狭窄の予防のための新
規の治療戦略を提供することを、示す。

さらに、本発明は、細胞周期調節に関する幾つかの分子のトランス活性化において重要
な役割を果たす、転写因子Ｅ２Ｆに関係する。先行研究は、Ｅ２Ｆ結合ドメインに対応す
るシスエレメント二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（デコイ）のトランスフェクション
は、損傷した血管における血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖および新内膜肥厚を阻害し得
ることを示している。本研究において、本発明者らは、環状ダンベル構造を有する新規の
Ｅ２Ｆデコイ（ＣＤ−Ｅ２Ｆ）を開発し、そしてこのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を、従来のホス
ホチオエート化Ｅ２Ｆデコイ（ＰＳ−Ｅ２Ｆ）と比較した。本発明者らは、ＣＤ−Ｅ２Ｆ
は、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも、より安定で、ヌクレアーゼまたは血清のどちらかの存在下での
インキュベーション後、その構造的完全性を大いに保った。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、細胞周期調
節遺伝子の高濃度グルコース誘導性転写発現および血清誘導性転写発現を、ＰＳ−Ｅ２Ｆ
と比較して、より強く阻害した。ＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、ＶＳＭＣ増殖
およびインビボの新内膜形成の阻害において、ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、より効果的であ
った。ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、４０〜５０％減少した用量のＣＤ−Ｅ２Ｆが、インビト
ロのＶＳＭＣ増殖阻害およびインビボの新内膜形成において同様の結果を得るために、十
分であった。その上ＣＤ−Ｅ２Ｆは、予想外にも、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも１０倍高いＥ２Ｆ
に対する配列特異性を示した。

結論として、本発明者らの結果は、例えば、血管形成後の再狭窄の処置において、ＣＤ
−Ｅ２Ｆが、ＶＳＭＣ増殖を阻害する遺伝子治療（のため、そして転写調節の研究のため
に、従来のＥ２Ｆデコイより、価値の高い薬剤であることを示す。

（課題を解決するための手段）
本発明は、以下を提供する：
１．２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌ
クレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、このステム構造が、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン
に結合し得るヌクレオチド配列を含む、環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド。

２．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ−
１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目１に記載のＣＤＯＤＮ
。

３．酵素的結合によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有する、項目１
に記載のＣＤＯＤＮ。

４．いかなる化学改変されたヌクレオチドも含まない、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。

５．上記ステム構造が、２つ以上の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレ
オチド配列をさらに含む、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。

６．上記転写因子がＡＰ−１である、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。

７．上記ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＧ
ＡＣＴＣＡ−３’である、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。

８．上記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号３の配列を有する、項目６に
記載のＣＤＯＤＮ。

９．ステム構造が、別の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列
をさらに含む、項目６に記載のＣＤＯＤＮ。

１０．インビトロ競合結合アッセイで評価した場合に、配列番号４の配列を有するリン
酸化オリゴヌクレオチドより、約５倍強いＡＰ−１配列特異性を有する、項目６に記載の
ＣＤＯＤＮ。

１１．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。

１２．上記Ｅ２ＦのＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列が、５’−ＴＴ
ＴＣＧＣＧＣ−３’である、項目１１に記載のＣＤＯＤＮ。

１３．上記相同なステムループ構造のそれぞれが、配列番号６の配列を有する、項目１
１に記載のＣＤＯＤＮ。

１４．インビトロ競合結合アッセイで評価した場合に、配列番号７の配列を有するリン
酸化オリゴヌクレオチドより、約５倍強いＥ２Ｆ配列特異性を有する、項目１１に記載の
ＣＤＯＤＮ。

１５．上記転写因子がＮＦκＢである、項目１に記載のＣＤＯＤＮ。

１６．被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防する方法
であって、この方法は、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えた
ＣＤＯＤＮを被験体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、この転写因子
のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、方法。

１７．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ
−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目１６に記載の方法。

１８．薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、項目１６に記載
の方法。

１９．上記転写因子がＡＰ−１である、項目１６に記載の方法。

２０．上記転写因子に関連する疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体に
おける血管損傷後の新内膜過形成を含む、項目１８に記載の方法。

２１．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目
１９に記載の方法。

２２．上記化合物が、血管損傷前に投与される、項目２０に記載の方法。

２３．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目１６に記載の方法。

２４．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の
新内膜過形成を含む、項目２３に記載の方法。

２５．被験体において、上記治療有効量のＣＤＯＤＮが、被験体において再狭窄を防ぐ
ために有効である、項目２３に記載の方法。

２６．上記ＣＤＯＤＮが、血管損傷後に投与される、項目２４に記載の方法。

２７．上記転写因子がＮＦκＢである、項目１６に記載の方法。

２８．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目１６に記載の方法。

２９．被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するため
の薬学的組成物であって、この薬学的組成物は、治療有効量の２つのループ構造および１
つの該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含むステム構造を
備えたＣＤＯＤＮ、ならびに薬学的受容可能キャリアを含有する、薬学的組成物。

３０．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ
−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目２９に記載の薬学的
組成物。

３１．上記薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、項目２９に
記載の薬学的組成物。

３２．上記転写因子がＡＰ−１である、項目２９に記載の薬学的組成物。

３３．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の
新内膜過形成である、項目２９に記載の薬学的組成物。

３４．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目
２９に記載の薬学的組成物。

３５．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目２９に記載の薬学的組成物。

３６．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の
新内膜過形成である、項目３５に記載の薬学的組成物。

３７．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目
３６に記載の薬学的組成物。

３８．上記転写因子がＮＦκＢである、項目２９に記載の薬学的組成物。

３９．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目２９に記載の薬学的組成物。

４０．被験体において転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための
医薬品の製造における、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えた
ＣＤＯＤＮの使用であって、ここで、このステム構造は、この転写因子のＤＮＡ結合ドメ
インに結合し得るヌクレオチド配列を含む、使用。

４１．上記転写因子が、ＮＦκＢ、ＳＴＡＴ−１、ＧＡＴＡ−３、ＳＴＡＴ−６、ＡＰ
−１、Ｅ２Ｆ、ＥｔｓおよびＣＲＥからなる群から選択される、項目４０に記載の使用。

４２．上記医薬品が、ＨＶＪ−リポソーム組成物の形態である、項目４０に記載の使用
。

４３．上記転写因子がＡＰ−１である、項目４０に記載の使用。

４４．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の
新内膜過形成である、項目４３に記載の使用。

４５．被験体において、上記ＣＤＯＤＮの量が、再狭窄を防ぐために十分である、項目
４３に記載の使用。

４６．上記転写因子がＥ２Ｆである、項目４０に記載の使用。

４７．上記疾患または障害が、血管平滑筋細胞増殖または被験体における血管損傷後の
新内膜過形成である、項目４６に記載の使用。

４８．被験体において、上記治療有効量のＣＤＯＤＮが、被験体において再狭窄を防ぐ
ために有効である、項目４０に記載の使用。

４９．上記転写因子がＮＦκＢである、項目４０に記載の使用。

５０．上記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、項目４６に記載の使用。

本発明の別の局面において、本発明は、ＡＰ−１に関連する疾患または障害を処置する
方法をさらに提供し、この方法は、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキナー
ゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物、および薬学的受容可能
キャリアを被験体に投与する工程を包含する。

さらに、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増殖または新内膜肥厚
を予防する方法を提供し、この方法は、治療有効量の、分裂促進因子活性化プロテインキ
ナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物、および薬学的受容
可能キャリアを被験体に投与する工程を包含する。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモ
ーターに結合する能力を、阻害し得る。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナ
ログである。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を
、競合的に阻害し得る。

本発明の好ましい実施形態において、この化合物は、２つのループ構造および１つのス
テム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、こ
のステム構造は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。

本発明の１つの実施形態において、ＣＤＯＤＮの量は、被験体において再狭窄を防ぐた
めに十分であり得る。

本発明の１つの実施形態において、薬学的受容可能キャリアは、ＨＶＪ−リポソーム組
成物であり得る。

本発明の別の局面において、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増
殖または新内膜肥厚を予防する薬学的組成物を提供し、この薬学的組成物は、治療有効量
の、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を
阻害し得る化合物、および薬学的受容可能キャリアを含有する。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモ
ーターに結合する能力を、阻害し得る。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナ
ログである。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を
、競合的に阻害し得る。

本発明の好ましい実施形態において、この化合物は、２つのループ構造および１つのス
テム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であり得、こ
のステム構造は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。

本発明の１つの実施形態において、ＣＤＯＤＮの量は、被験体において再狭窄を防ぐた
めに十分であり得る。

本発明の１つの実施形態において、薬学的受容可能キャリアは、ＨＶＪ−リポソーム組
成物であり得る。

本発明の別の局面において、本発明は、被験体において血管損傷後の血管平滑筋細胞増
殖または新内膜肥厚を予防する薬物の製造における、治療有効量の、分裂促進因子活性化
プロテインキナーゼの遺伝子のＡＰ−１によるトランス活性化を阻害し得る化合物の使用
を、提供する。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、上記ＡＰ−１が上記遺伝子のプロモ
ーターに結合する能力を、阻害し得る。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、抗体、または核酸もしくは核酸アナ
ログである。

本発明の１つの実施形態において、この化合物は、ＡＰ−１のプロモーターへの結合を
、競合的に阻害し得る。

単数形の冠詞（例えば、英語において「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など；ドイツ語に
おいて「ｅｉｎ」、「ｄｅｒ」、「ｄａｓ」、「ｄｉｅ」などおよびその活用形；フラン
ス語において「ｕｎ」、「ｕｎｅ」、「ｌａ」、「ｌｅ」など；他の言語においては、冠
詞、形容詞、または任意の他の等価物など）は、他に言及されない限り、その複数形の概
念を含むということが、本明細書全体にわたって理解されるべきである。また、本明細書
中で使用される用語は、他に言及されない限り、当該分野で通常使用されている定義を有
することも理解されるべきである。

他に明記しない限り、本発明の実施は、タンパク質化学、ウイルス免疫生物学、分子生
物学および当該分野の技術の範囲内の組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このよ
うな技術は、文献にて完全に例示される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅ
ｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。

特に明記しない限り、本明細書中で使用される用語は、当該分野で使用されるものと同
じ意味を有する。簡便のために、本明細書中、実施例および添付の特許請求の範囲で使用
される用語をここに集める。

本明細書中で使用される場合、用語「動物」とは、哺乳動物をいう。好ましくは、哺乳
動物はヒトなどの霊長類であり得る。同様に、本発明の方法によって処置される「患者」
または「被験体」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを意味し得る。好ましくは、この
ような被験体または患者はヒトであり得る。

本明細書中で使用される場合、用語「デコイ」または「デコイ化合物」とは、ＡＰ−１
もしくはＥ２Ｆのような転写因子する染色体の部位を模倣するか、または、転写調節因子
が結合する、ＡＰ−１もしくはＥ２Ｆなどのような転写因子によって制御される遺伝子の
染色体部位（本明細書中で後に、「標的結合部位」と称する）を模倣して、それによって
染色体結合部位の転写因子への結合に競合する、化合物をいう。

本明細書中で使用される場合、「ダンベルデコイ」または「ＣＤＯＤＮ」とは、２本鎖
ステム領域および２つのループ構造を有する環状のオリゴヌクレオチドをいう。このステ
ム領域は、デコイとして働く配列を含む。好ましくは、ＣＤＯＤＮは、２つの同一のステ
ム−ループ構造の連結から形成される。

用語「ＥＤ_５０」とは、その最大応答または効果の５０％を生じる薬物の量を意味する
。用語「ＬＤ_５０」は、処置される集団の５０％に対して致死的である薬物の量を意味す
る。

本発明の方法に関して、本発明の化合物（例えば、デコイ）または組成物の「有効量」
は、Ｅ２ＦまたはＡＰ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するために有効な
量をいう。本発明の方法に関して、本発明の化合物（例えば、デコイ）または組成物の「
治療有効量」または「薬理学的有効量」とは、所望の薬理学的効果（例えば、処置される
疾患または障害の緩和、治癒または発症の遅延）に十分な量をいう。

投与される量は、処置される被験体または処置される疾患もしくは障害を含む種々の因
子に依存し、そして、好ましくは、このような量は、重大な副作用を伴わずに所望の効果
が得られるように最適化されるべきである。このような量は、当業者によって決定され得
る。本発明の化合物または組成物の「有効量」、「治療有効量」または「薬理学的有効量
」は、ＥＤ_５０および／またはＬＤ_５０を用いて決定され得る。治療指数は、治療効果と
毒性効果の間の用量比であり、ＥＤ_５０／ＬＤ_５０の比として表され得る。このような薬
学的組成物が有する治療指数が大きいほど、より好ましい効果が得られ得る。ＥＤ_５０お
よびＬＤ_５０の決定のために、細胞培養アッセイおよび動物実験が用いられ得、そこから
得られたデータを用いて、ヒトへの用途のための用量範囲を外挿し得る。好ましくは、本
発明は毒性効果がほとんどないか、または毒性効果がまったくない。このような用量は、
投与の形態、被験体の感受性、投与経路などに依存して変化する。

用語「器官（臓器）」とは、組織の２つ以上の近接する層をいい、この組織の層は、細
胞−細胞および／または細胞−マトリクス相互作用のいくつかの形態を維持して、微小構
造を形成する。用語「組織」は、同様に特定化された細胞の集団または層をいい、一緒に
なってある特定化された機能を行う。

用語「異種」とは、核酸に関して使用される場合、核酸が自然状態においては互いに同
じ関係性で見出されない、２つ以上のサブ配列を含むことを指す。例えば、この核酸は、
代表的には組み替え的に作製され、新しい機能的な核酸を生じるように配置された無関係
の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。例えば、１つの実施形態において、この核酸は
、異なる遺伝子由来のコード配列の発現に向かうように配置された１つの遺伝子由来のプ
ロモーターを有する。従って、このコード配列に関して、このプロモーターは異種性であ
る。

２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」とは、最大の一致で
配置されたときに、同じである、２つの配列における残基をいう。配列同一性の割合がタ
ンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一でない残ステム分は、保存的アミ
ノ酸置換によってしばしば異なり、ここで、アミノ酸残基は、同様な化学特性（例えば、
電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、従って、分子の機能的特性は
変化しない。保存的置換において配列が異なる場合、配列同一性の割合は、置換基の保存
的性質について補正するように上向きに調整され得る。この調整を行う手段は当業者に周
知である。代表的には、この手段は、完全なミスマッチよりはむしろ、部分的なミスマッ
チとして保存的置換をスコア付け、それによって、配列同一性の割合を上昇させる工程を
含む。従って、例えば、同一なアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のス
コアを与えられる場合、保存的置換は、０〜１の間のスコアを与えられる。保存的置換の
スコア付けは、例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌ
ｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムに従って、 例
えば、 プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉ
ｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）において実行されるように、計算される。

比較のための配列のアラインメントの方法は、当該分野で周知である。比較のための配
列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍ
ｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）
によって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム
（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４
４３）によって：ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの同様の方法についての検索（Ｐｅ
ａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８５：２４４４）によって；これらのアルゴリズムのコンピュータ制御の実行（Ｉ
ｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．、ＧＡＰ製
のＰＣ／ＧｅｎｅプログラムにおけるＣＬＵＳＴＡＬ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、お
よびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄ
ｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡにおけるＴＦＡＳＴＡが挙げられるがこれらに
限定されない）によって実行され得る。；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ
およびＳｈａｒｐ（１９８８）Ｇｅｎｅ，７３：２３７−２４４ならびにＨｉｇｇｉｎｓ
およびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔら（１
９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６，１０８８１−９０；Ｈｕ
ａｎｇら（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂ
ｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ８，１５５−６５，ならびにＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４，３０７−３１によって
十分に記載される。アラインメントはまた、しばしば、目視および手動の整列によって行
われる。

サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハ
イブリダイゼーション実験の文脈において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン洗浄条件」は、配列依存的であり、かつ、異なる環境パラメータ下において異なる。核
酸のハイブリダイゼーションへの広範囲にわたる手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎ
ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２「ｏｖｅ
ｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａ
ｙ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に見出される。一般に、高度にストリンジェントなハ
イブリダイゼーションおよび洗浄条件は、所定のイオン強度およびｐＨにて特定の配列に
対する熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（所定のイオン強
度およびｐＨ下で）標的配列の５０％が、完全に適合するプローブにハイブリダイズする
温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴｍと同じにな
るように選択される。

用語「核酸」とは、１本鎖または２本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチド
またはリボヌクレオチドポリマーをいう。他に限定されないが、この用語は、ＤＮＡまた
はＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含むポリマー配列を包含し、これらの塩基ア
ナログとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−
ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、
５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウ
ラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル
アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、
１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイ
ノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メ
チルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−
メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−
マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル
、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエ
ステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン
、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラ
シル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−
５−オキシ酢酸、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミ
ノプリン。

用語「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体（例えば、ｃ−ｍｙｃ）の産生に必須
のコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列をいう。このポリペプチドは、全長ポリ
ペプチドまたは活性フラグメントの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リ
ガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限り、全長のコード配列によってか、また
は任意の部分のコード配列によってコードされ得る。この用語はまた、構造遺伝子のコー
ド領域を含み、いずれかの端の約１ｋｂ以上の距離で、５’末端および３’末端の両方の
コード領域に近接して配置される配列を含み、その結果、遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに
対応する。コード領域の５’に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配
列と称される。コード領域の３’に位置し、かつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻
訳配列と称される。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムの形態の両方を包
含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「干渉領域」また
は「干渉配列」と呼ばれる非コード領域によって中断されるコード領域を含む。イントロ
ンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり、イントロンは、
エンハンサーのような調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または最初の転写物
から除去されるかまたは「スプライスアウト」される。従って、イントロンは、メッセン
ジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に機能して、新生
（ｎａｓｃｅｎｔ）ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を特定する。

本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子発現」は、遺伝子にコードされている遺伝
情報を、遺伝子のＲＮＡへの「転写」を介して（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作
用を介して）、および、タンパク質をコードする遺伝子については、タンパク質へのｍＲ
ＮＡの「翻訳」を介して、ｍＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎ
ＲＮＡ）に変換するプロセスをいう。遺伝子発現は、プロセスにおいて多くの段階で調節
され得る。「アップレギュレーション」または「活性化」は、遺伝子発現産物（すなわち
、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加する調節をいい、他方、「ダウンレギュレーシ
ョン」または「抑制」は、産生を減少する調節をいう。アップレギュレーションまたはダ
ウンレギュレーションに関する分子（例えば、転写因子）は、しばしば、それぞれ「アク
チベーター」および「リプレッサー」と呼ばれる。

用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産
物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団において最も
頻繁に観察される遺伝子であり、従って、遺伝子の「正常な」または「野生型」形態を任
意に設計する。それに対して、用語「改変された」または「変異体」は、野生型の遺伝子
または遺伝子産物と比較する場合に、配列および／または機能的特性における改変（すな
わち、改変された特性）を示す遺伝子または遺伝子産物をいう。天然に存在する変異体が
単離され得；野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較する場合に、それらが改変された特
性を有するという事実によって同定されることに留意されたい。

ＤＮＡ分子は、「５’末端」および「３’末端」を有するといわれる。なぜなら、１つ
のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、ホスホジエステル結合を介して一方向
にある、１つのその隣接する３’酸素に結合する様式で、モノヌクレオチドが、オリゴヌ
クレオチドまたはポリヌクレオチドを生じるように反応するからである。従って、オリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペン
トース環の３’酸素に連結されない場合に「５’末端」、そしてその３’末端の酸素が続
くモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結されない場合に「３’末端」と称さ
れる。本明細書中で使用される場合、核酸配列はまた、より長いオリゴヌクレオチドまた
はポリヌクレオチドの内部であったとしても、５’末端および３’末端を有すると言われ
得る。鎖状または環状のいずれかのＤＮＡ分子において、異なるエレメントが「下流」ま
たは３’に対してまたは「上流」または５’にあると言われる。この用語は、転写がＤＮ
Ａ鎖にそって５’から３’の様式で進む事実に反映される。連結された遺伝子の転写に指
向するプロモーターおよびエンハンサーは、一般に、５’またはコード領域の上流に配置
される。しかし、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントおよびコード領域
の３’に配置された場合でさえも、その効果を発揮し得る。転写終止シグナルおよびポリ
アデニル化シグナルは、コード領域の３’下流に配置される。

本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、短い長さの１本鎖ポリ
ヌクレオチド鎖をいう。オリゴヌクレオチドは、代表的には１００残基長以下（例えば、
１５〜５０の間）であるが、本明細書中で使用される場合、この用語はまた、より長いポ
リヌクレオチド鎖を包含することが意図される。オリゴヌクレオチドはしばしば、その長
さによって称される。例えば、２４残基のオリゴヌクレオチドは、「２４マー」と呼ばれ
る。オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイズによってかまたは他のポリヌクレオチド
とのハイブリダイズによって、二次構造および三次構造を形成し得る。このような構造と
しては、二重鎖、ヘアピン、十字形、屈曲型および三重鎖が挙げられ得るがこれらに限定
されない。

本明細書中で使用される場合、用語「プライマー」は、精製された制限酵素消化（ｒｅ
ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔ）において天然に生じるか、または合成的に産生され
るかのいずれかのオリゴヌクレオチドをいい、これは、核酸鎖に相補的なプライマー伸長
産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドの存在下、かつＤＮＡポリメラ
ーゼのような試薬を含み、そして適切な温度およびｐＨ）に配置される場合に、合成の開
始点として作用し得る。プライマーは、好ましくは、増幅における最大効率のために１本
鎖であるか、あるいは、２本鎖であり得る。２本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調
製するために使用される前に、まず処理されてその鎖を分離する。好ましくは、プライマ
ーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産
物の合成を初回刺激する（ｐｒｉｍｅ）のに十分長くなければならない。プライマーの正
確な長さは、多くの因子に依存し、これらとしては、温度、プライマーの供給源および使
用方法が挙げられる。

用語「単離された」は、核酸に関して「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離
されたポリヌクレオチド」のように使用される場合、その天然の環境下では通常付随する
、少なくとも１つの混入した核酸から同定および分離された核酸配列をいう。単離された
核酸は、天然で見出される形態とは異なる形態またはセッティングで存在するような核酸
である。それに対し、単離されていない核酸は、天然において存在する状態で見出される
ＤＮＡおよびＲＮＡのような核酸である。例えば、所定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子）
は、近傍遺伝子に近接する宿主細胞染色体上で見出される。ＲＮＡ配列（例えば、特定の
タンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列）は、多数のタンパク質をコードする多数の
他のｍＲＮＡとの混合物として細胞において見出される。しかし、所定のタンパク質をコ
ードする単離された核酸は、例として、細胞において所定のタンパク質を通常発現するよ
うな核酸を含み、この核酸は、天然の細胞の位置とは異なる染色体位置にあるか、または
、そうでなければ、天然で見出される核酸配列以外の異なる核酸配列によって隣接してい
る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、１本鎖または２本
鎖の形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが
タンパク質を発現させるのに使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ドは、最低限でセンス鎖または有意鎖を有する（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポ
リヌクレオチドは１本鎖であり得る）が、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得
る（すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは２本鎖であり得る）。

本明細書中で使用される場合、用語「プローブ」は、精製された制限酵素消化によって
天然に生じたか、または合成的に、組換え的に、もしくはＰＣＲ増幅によって合成され、
目的の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド（すなわち、
ヌクレオチドの配列）をいう。プローブは、１本鎖または２本鎖であり得る。プローブは
、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。本発明において使用される任
意のプローブは、任意の「レポーター分子」で標識され、その結果、任意の検出システム
（酵素（例えば、ＥＬＩＳＡならびに酵素ベースの組織化学的アッセイ）、蛍光、放射活
性および発光システムが挙げられるがこれらに限定されない）で検出され得ることが企図
される。本発明は、任意の特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない
。

本明細書中で使用される場合、用語「転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃ
ｔｏｒ）」または「転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｆａｃｔｏｒ）」とは
、互いにおよびＲＮＡポリメラーゼ酵素と相互作用して転写を調節するタンパク質をいう
。転写因子は、特定のＤＮＡ調節配列（例えば、エンハンサー）または他の転写因子を認
識することによって遺伝子を標的化する。転写因子はしばしば、「シスエレメント」（例
えば、エンハンサー）と相互作用する「トランス因子」と呼ばれる。なぜならば、これら
は、代表的にはその調節部位（シス）から離れて位置する遺伝子（トランス）から産生さ
れる。いくつかの転写因子は、それ自体の別のコピー（すなわち、「ホモ二量体化ドメイ
ン」を介して連結するホモ二量体）にか、または他の転写因子（すなわち、「ヘテロ二量
体化ドメイン」を介して連結するヘテロ二量体）に結合する場合にのみ生物学的に活性で
ある。多くの転写因子について、タンパク質の特定かつ別個の領域は、ＤＮＡ結合（すな
わち、「ｔＤＮＡ結合ドメイン」）および転写の活性化（すなわち、「活性化ドメイン」
）を媒介する。最も重要なレベルの遺伝子発現調節は、遺伝子からメッセンジャーＲＮＡ
分子へのこの情報の移動プロセスで発揮される。このプロセスは、転写と呼ばれる。これ
らのタンパク質または転写因子は、その作用様式に従って４群に分類される：一般的な転
写因子、アクチベーター、コアクチベーターおよびリプレッサー。転写因子に関して、無
虹彩症、ルービンスタイン−テービ症候群およびホジキン病のような疾患が関連しており
、そしていくらかは分子が原因であり、すなわち、転写因子の分子不全の原因である変異
体が明らかにされている。用語「ＡＰ−１」とは、細胞分化応答および細胞外マトリクス
産生に関する多数の遺伝子に存在する特異的なＤＮＡ配列に結合する転写因子をいう。「
Ｅ２Ｆ」とは、アデノウイルスＥ２プロモーターのＥ１Ａ媒介性活性化に重大な意味を持
つことが示された転写因子をいう。Ｅ２Ｆは、元々はＦ９胚性癌腫細胞の分化の間にダウ
ンレギュレートされた転写因子として説明された、分化調節転写因子であるＤＲＴＦと同
一であることが現在知られている。Ｅ２Ｆは、サイクリンＡ、ｃｄｋ２およびｐＲＢと複
合体を形成し、活性化し、そしてこれらの細胞周期調節遺伝子をリン酸化して、細胞増殖
（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）のプロセスに重大な意味を
持つ。

本明細書中で使用される場合、用語「転写因子に関連する疾患または障害」とは、病変
した細胞または組織におけるこのような転写因子が増加したかもしくは減少したレベル、
または不適切な（増強された、改変された、または減じられた、など）機能を伴う疾患ま
たは障害をいう。好ましくは、このような疾患としては、炎症性疾患（慢性関節性リウマ
チ、変形性関節炎など）、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、乾癬など）、動脈瘤、動脈硬化症
、血管炎、ＰＴＣＡおよびＰＴＡ後の再狭窄、癌または癌腫、喘息などが挙げられる。ダ
ンベルデコイを用いることによって、本発明はヌクレアーゼに対する抵抗性のような先行
技術にわたる有意な効果を達成し、そして、細胞または組織における長期作用を有意に改
善した。

本明細書中で使用される場合、「ＡＰ−１に関連する疾患または障害」とは、病変した
細胞または組織において増殖したかもしくは減少したレベルのＡＰ−１に関連する疾患も
しくは障害、または、ＡＰ−１によって活性化された遺伝子の増加した発現に関連する疾
患もしくは障害をいう。好ましくは、このような疾患は、炎症および細胞増殖に関連する
。より好ましくは、このような疾患または障害は、血管平滑筋細胞の増殖または新内膜の
過形成であり得る。用語「Ｅ２Ｆに関する疾患または障害」とは、病変した細胞または組
織において増殖したレベルのＥ２Ｆに関する疾患もしくは障害、または、Ｅ２Ｆによって
活性化された遺伝子の増加した発現に関する疾患もしくは障害をいう。好ましくは、この
ような疾患または障害は、血管平滑筋細胞増殖または新内膜過形成であり得る。

用語「生物学的に活性」とは、本明細書中で使用される場合、天然に存在する分子（例
えば、転写活性、または遺伝子の特定の部位に対する結合親和性を有する分子）の構造的
、調節的または生化学的機能を有するタンパク質または他の分子をいう。

（ｉｉ．本発明の好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を含む環状のダンベルオリゴデオ
キシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮ
Ａ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、上記ＣＤＯＤＮを含む
薬学的組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、このような転写因子に起因する疾患ま
たは障害を処置および／または予防するために使用され得る。本発明はまた、このような
転写因子に起因する疾患または障害を処置および／または予防するための方法を提供し、
この方法は、２つのループ構造および１つのステム構造を含むＣＤＯＤＮの治療有効量を
被験体に投与する工程を包含する。このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに
結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明は、環状のダンベルデコイまたはデコイ組成
物を提供し、それによって被験体に投与した後のデコイまたはデコイ組成物の有意に改善
した安定性を提供することによって、従来のデコイまたはデコイ組成物と比較して、転写
因子に関する疾患または障害を処置および／または予防するための改善された効果を達成
した。

本発明は、新規なＡＰ−１デコイＯＤＮの転移が、インビトロでのＶＳＭＣ増殖および
、インビボでのバルーン損傷後の新内膜形成（新内膜）を防いだことを示す。これらの結
果は、転写因子であるＡＰ−１が、ＶＳＭＣの増殖およびバルーン損傷後の新内膜形成に
おいて重要な役割を果たすことを示す。

積み重ねた証拠が、ＭＡＰキナーゼカスケードの活性化が損傷に対する応答におけるＶ
ＳＭＣの増殖および細胞増殖の重要な事象であることを示唆する（Ｏｈａｓｈｉ Ｎら、
Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０００：２０：２５
２１−２５２６；Ｋｏｙａｍａ Ｈら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９８；８２：７１３−７
２１；Ｈｕ Ｙら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．１
９９７：１７：２８０８−２８１６；Ｐｙｌｅｓ ＪＭら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９７
：８１：９０４−９１０；およびＩｚｕｍｉ Ｙら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００１：８８
：１１２０−１１２６を参照のこと）。これらのＪＮＫおよびＥＲＫのようなＭＡＰキナ
ーゼは、ＡＰ−１転写因子の発現および活性化を制御する（Ｄａｖｉｓ ＲＪ．，Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９３：２６８：１４５５３−１４５５６；およびＳｅｇｅｒ Ｒ
ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９５：９：７２６−７３）。ＡＰ−１は、ＶＳＭＣの増殖応答
および細胞外マトリクスの産生に関連する多数の遺伝子において存在する特異的なＤＮＡ
配列に結合する（Ｋａｒｉｎ Ｍ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９５；２７０：１６
４８３−１６４８６；およびＷｈｉｔｍａｒｃｈ ＡＪ，Ｄａｖｉｓ ＲＪ，Ｊ Ｍｏｌ
Ｍｅｄ．１９９６：７４：５８９−６０７を参照のこと）。これらの知見は、ＡＰ−１
の活性化が新内膜形成をもたらす重要な段階であり得ることを示唆する。しかし、新内膜
形成の要因におけるＡＰ−１の役割の直接的な証明は、ＡＰ−１の特異的かつ潜在的な薬
理学的インヒビターが存在しないことによって妨害されている。ＡＰ−１がＶＳＭＣの増
殖および新内膜形成において重要な役割を果たすという仮説を検証するために、本発明者
らは、新しいＡＰ−１ ＯＤＮトランスフェクション方法を用いた。２本鎖のシスエレメ
ントデコイＯＤＮのトランスフェクションは、同じ配列の内因性のシスエレメント由来の
全てのトランス因子の除去をもたらし、その後、遺伝子発現を阻害した。従って、本発明
は、まず、ＶＳＭＣの増殖および新内膜形成におけるＡＰ−１の関与を直接的に示す。本
発明において、発明者らは、ＶＳＭＣの増殖および遊走を増強するための刺激物質として
高血糖および血清を用いた。これらの刺激因子は、ＭＡＰＫ経路を介して多くの初期遺伝
子、増殖因子および分裂促進因子を誘導する（Ｍｉａｎｏ ＪＭら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃ
ｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ．１９９３：１３：２１１−２１９：Ｂｅｎｎｅｔｔ ＭＲら、Ｊ
Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４：９３：８２０−８２８；Ｂｒｉａｔａ Ｐら、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９：１６５：１１２３−
１１２９；Ｉｎａｂａ Ｔら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ １９９６：４５：５０７−５１２：Ｄ
ｉ Ｐａｏｌｏ Ｓら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９９６；１４９：２０９５−２１０
６；Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＳＭら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９５：７７：４４５−４６５；
Ｌｉｎｄｎｅｒ Ｖら、Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９１；６８：１０６−１１３を参照のこ
と）。本発明はまた、高血糖および血清が、細胞周期がＧ１期からＳ期への進行に必要と
される細胞周期調節遺伝子、サイクリンＡおよびＰＣＮＡの内因性の発現を刺激すること
を実証する。ＡＰ−１ ＯＤＮは、高血糖および血清によって誘導される、ＶＳＭＣの増
殖、遊走ならびにサイクリンＡ遺伝子およびＰＣＮＡ遺伝子の発現を効率的に消滅させる
。さらに、サイクリンＡプロモーターの連続欠損または変異構築物を用いた本発明者らの
データは、ＡＰ−１タンパク質のような転写因子の結合に重大な意味を有するＡＴＦ（活
性化転写因子）部位が高血糖によるサイクリンＡ遺伝子の発現のアップレギュレーション
を媒介することを示した。ルシフェラーゼレポーター構築物を有するが、ＯＤＮにはミス
マッチでないＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションはまた、高血糖および血清に
より誘導されるサイクリンＡのルシフェラーゼ発現を完全に消滅させる。これらの観察は
、ＡＰ−１デコイを用いたトランスフェクションがＶＳＭＣの増殖および遊走を阻害した
というインビトロでの結果と合わせて、ＶＳＭＣの増殖およびＶＳＭＣの遊走の抑制が、
ＡＰ−１デコイによる新内膜形成の阻害に関与したことを実証した。

ラット頸動脈中へとＡＰ−１デコイＯＤＮをトランスフェクトするために、本発明者ら
は、ＨＶＪ−リポソーム技術を使用した。このＨＶＪ−リポソーム技術は、内皮露出に供
されていないインタクトな動脈の内側ＶＳＭＣ中への遺伝子移入において非常に有効な方
法である。ＨＶＪ−リポソーム法によるＦＩＴＣ標識ＯＤＮのトランスフェクションは、
強力な蛍光を生じた。この蛍光は、動脈の全ての層において容易に検出された。本発明は
また、ＡＰ−１ ＯＤＮが、バルーン損傷後の新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成を有
効に防止することも示す。興味深いのは、デコイＯＤＮを用いる事前処置が、事後処置よ
りも有効であったという知見である。この知見は、損傷した動脈におけるＡＰ−１活性化
の時間経過によって説明され得る。以前の研究によって、脈管壁におけるＥＲＫ活性およ
びＪＮＫ活性が、容易に増加し、損傷後５分でプラトーに達し、バルーン血管形成術後１
時間維持されることが、報告された。極初期遺伝子であるｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓの
発現は、バルーン損傷後３０分でピークに達する。本発明者らの結果はまた、ＡＰ−１活
性が、バルーン損傷後３０分で留意され、そしてバルーン損傷後３時間で最大値に達する
ことを示す。これらのデータは、バルーン損傷に応答したシグナル伝達が迅速であること
、そしてブロックの時期が、バルーン損傷による引き起こされるシグナルの流れをブロッ
クするためには重要であることを、示す。

本発明において顕著であるのは、ＡＰ−１環状ダンベルデコイＯＤＮ（ＣＤＯＤＮ）が
、化学的に改変されたＯＤＮよりも安定かつ有効であったことである。このＣＤＯＤＮは
、開口端を有さない単一のデコイ分子においてＡＰ−１の２つの結合部位を含み、これに
より、１つよりも多くのプロモーター部位の多重標的化が可能である。以前の研究におい
て、改変されたＯＤＮ（例えば、ホスホロチオエートおよびメチルホスホネート）が、ヌ
クレアーゼに対する安定性を増強するために広範に使用された（Ｋｈａｌｅｄ ＡＲら、
Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９８；８６：１７０〜１７
９；Ｌａｒｒｏｕｙ Ｂら、Ｇｅｎｅ １９９２；１２１：１８９〜１９４を参照のこと
）。アンチセンスとしてｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｍｙｃ、ｃｄｃ２およびｃｄｋ２に対するこれ
らの改変されたＯＤＮ、またはデコイとしてＮＦ−κＢおよびＥ２Ｆに対するこれらの改
変されたＯＤＮは、実験的再狭窄において内膜肥厚を減少した（Ｓｉｍｏｓ Ｍら、Ｊ．
Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９４；９３：１４５８〜１４６４、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ
Ｒら、１９９３（上記）、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ Ｒら、１９９４（上記）、Ｍｏｒｉｓｈ
ｉｔａ Ｒら、１９９７（上記）を参照のこと）。しかし、これらの改変されたＯＤＮは
、ＲＮａｓｅＨに対する非感受性、加水分解された改変されたヌクレオチドをゲノムＤＮ
Ａへと再利用される可能性、配列特異的結合効果の欠如、および免疫活性化などの問題を
示す。最近の報告（Ｃｈｕ ＢＣＦら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９２
：２０：５８７３〜５８５８；およびＡｂｅ Ｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８；４
２５：９１〜９６を参照のこと）に従って、ＣＤＯＤＮは、血清の存在下のＰＳＯＤＮ、
エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼよりも安定であった。ＡＰ−１につい
ての結合部位を含むＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの配列特異性を評価するために、本発明
者らは、インビトロ競合アッセイを設定した。非標識ＣＤＯＤＮおよび非標識ＰＳＯＤＮ
を競合因子として使用した場合、ＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの両方が、標識プローブへ
のＡＰ−１の結合を完全に阻害したが、ＣＤＯＤＮの配列特異性は、ＰＳＯＤＮの効果よ
りも約１０倍大きかった。さらに、本発明者らは、ＶＳＭＣにおける高濃度グルコースま
たは血清によって誘導される、ＡＰ−１結合活性に対するＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの
阻害効果を評価した。ＣＤＯＤＮおよびＰＳＯＤＮの両方は、ＡＰ−１結合活性を有意に
減弱したが、ＣＤＯＤＮの阻害効果は、より大きかった。これらの結果は、ＣＤＯＤＮが
、ＰＳＯＤＮよりも高い親和性を、ＡＰ−１結合タンパク質に対して有することを示す。
これらのインビトロデータに従って、ＣＤＯＤＮは、脈管損傷後の新生内膜（ｎｅｏｉｎ
ｔｉｍａ）形成を防止する際により有効であった。ダンベルデコイＯＤＮのさらなる可能
な利点は、ＤＮＡ複製の間でのゲノムＤＮＡ中への導入または加水分解された改変された
ヌクレオチドの再利用の際の修復に起因する、変異能の欠如である。

結論として、本発明は、ダンベルデコイＯＤＮが、以前に試みられた改変されたＯＤＮ
と比較して、顕著に増強された安定性を有することを示す。さらに、デコイＯＤＮによる
ＡＰ−１活性の阻害は、細胞の増殖および遊走をインビボで有効に減少させ、ならびにイ
ンビボでの新生内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成を有効に減少させた。本発明は、ＣＤＯ
ＤＮを最低限の副作用しか伴わずに使用し、そして非常に有効なＨＶＪ−リポソーム遺伝
子送達技術を使用することによって、再狭窄の処置のために可能な新規な治療ストラテジ
ーを提供する。

本発明の別の局面において、本発明は、新規なＥ２Ｆ−デコイを提供する。いくつかの
研究によって、細胞周期調節遺伝子の阻害は、損傷した脈管におけるＶＳＭＣ増殖および
新生内膜形成を首尾良くブロックしたことが、示された。しかし、単一の細胞周期調節遺
伝子の阻害は、ＶＳＭＣ増殖および新生内膜形成を防止するには不十分である。従って、
本発明者らは、転写因子Ｅ２Ｆに焦点を合わせた。Ｅ２Ｆは、Ｇ１／Ｓ細胞周期進行に関
与する種々の遺伝子（ＰＣＮＡ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃｄｃ２、およびｃｄｋ２を
含む）のアップレギュレートされた発現に関係する（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ Ａら、１９９
０（上記）；Ｃｈｕ ＢＣＦ，Ｏｒｇａｎ Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１９９２；２０：５８５７〜５８５８；およびＡｂｅ Ｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１
９９８；４２５：９１〜９６を参照のこと）。本発明において、本発明者らは、Ｅ２Ｆデ
コイの転写が、損傷した脈管における平滑筋細胞の増殖および新生内膜肥厚を首尾良くブ
ロックしたことを示す。このことは、以前のインビトロ研究およびインビボ研究と一致す
る。

本発明において、本発明者らは、ヌクレアーゼに対する安定性を改善するための新規な
環状ダンベルデコイを考案した。以前の研究において、ホスホロチオエート、メチルホス
ホネート、または他の外来物質を用いるＯＤＮの改変が、ヌクレアーゼに対する安定性を
増強するために使用された（Ｔａｎａｋａ Ｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
１９９４；２２：３０６９〜３０７４；Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ Ａら、１９９０（上記）
を参照のこと）。ヌクレアーゼに対するＯＤＮの安定性は、化学的改変によって増強され
たが、これらの改変されたＯＤＮは、ＯＤＮを改変するための外来物質の使用が原因であ
る他の異なる問題を誘導し得る。最近、ダンベル型ＯＤＮが、化学的に改変された線状Ｏ
ＤＮと比較して、ヌクレアーゼ耐性および細胞中への取り込みを増強すると、報告されて
いる（Ｃｈｕ ＢＣら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９９２：２０：５８５
７〜５８５８；Ａｂｅ Ｔら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ １９９８；４２５：９１〜９６を参
照のこと）。従って、本発明者らは、Ｅ２Ｆ結合部位のための新規な環状ダンベルデコイ
ＯＤＮを設計した。本発明者らのＣＤ−Ｅ２Ｆは、開放端を有さない単一のデコイ分子に
おいて、Ｅ２Ｆの２つの結合部位を含み、これにより、１つの標的プロモーター部位の多
重標的化または１つより多くのプロモーター部位を標的化することが、可能である。予期
されるように、このＣＤ−Ｅ２Ｆは、ヌクレアーゼおよび血清の存在下で、ＰＳ−Ｅ２Ｆ
よりも安定であった。さらに、ＣＤ−Ｅ２Ｆの配列特異性は、インビトロ競合結合アッセ
イによって評価した場合、ＰＳ−Ｅ２Ｆの配列特異性よりもほぼ１０倍大きかった。さら
に、ＶＳＭＣにおけるグルコース誘導性Ｅ２Ｆ結合活性および血清誘導性Ｅ２Ｆ結合活性
に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果もまた、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも大きかった。これらの結果
は、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、増強された安定性、およびＥ２Ｆ結合部位に対する優れた配列特異
的阻害効果を有することを示す。

従来のリポソーム方法によって送達されたＯＤＮの、乏しい細胞取り込みおよびエンド
サイトーシス後のリポソーム分解が、ＯＤＮ治療についての主要な障壁であった（Ｍａｒ
ｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒｅ ＣＪ．、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｍ １９８８；１７２：２８９〜
２９５；Ｓｔｅｉｎ ＣＡ，Ｃｏｈｅｎ ＪＳ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８８；４
８：２６５９〜２６６８を参照のこと）。この障壁を克服するために、本発明者らは、Ｈ
ＶＪ−リポソーム技術を使用して、Ｅ２Ｆデコイをラット頸動脈中にトランスフェクトし
た。この送達系において、外因性分子（例えば、プラスミドＤＮＡまたはＯＤＮ）は、リ
ン脂質とコレステロールとを含むリポソーム中に、包まれる。その後、これらのリポソー
ムは、ＵＶ照射したＨＶＪと融合されて、ＨＶＪ−リポソームを形成する。ＨＶＪからの
融合タンパク質は、これらのリポソームと細胞膜との融合、およびその細胞中への分子の
配置を促進する。本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム方法を使用してＦＩＴＣ標識デコイ
を培養ヒトＶＳＭＣ中へトランスフェクションすると、従来のトランスフェクション方法
（Ａｈｎ ＪＤら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２００１；４４：７１３〜７２０を参照
のこと）よりも遺伝子移入において非常に有効であったことを報告した。これに従って、
インビボでのＨＶＪ−リポソーム方法によるＦＩＴＣ標識デコイのトランスフェクション
は、強力な蛍光を生じ、この蛍光は、その動脈のすべての層において容易に検出された。

高血糖は、糖尿病患者における大血管合併症の発症に寄与することが示唆されているが
、ＶＳＭＣに対するグルコース濃度上昇の直接的効果に対して焦点を合わせた研究は、ほ
とんどない（Ａｈｎ ＪＤら、２００１（上記）；Ｎａｔａｒａｊａｎ Ｒら、Ｈｙｐｅ
ｒｔｅｎｓｉｏｎ １９９９；３３：３７８〜３８４；Ｙａｓｕｎａｒｉ Ｋら、Ｃｉｒ
ｃ Ｒｅｓ １９９７；８１：９５３〜９６２）。本発明において、本発明者らは、ＶＳ
ＭＣにおけるＥ２Ｆ ＤＮＡ結合活性、ならびに細胞周期調節遺伝子、およびＶＳＭＣの
増殖に対する、高濃度グルコース濃度の効果を試験した。本発明者らの研究は、［Ｅ２Ｆ
］×４−ルシフェラーゼ構築物（これは、プロモーター領域中に４つのＥ２Ｆ結合部位を
含む）のＥ２Ｆ ＤＮＡ結合活性およびルシフェラーゼ活性は、ＶＳＭＣにおける高濃度
グルコース濃度処理後に、有意に増加されたことを示す。これらの効果は、血清と相加的
であった。本発明はまた、高濃度グルコースおよび血清が、細胞周期調節遺伝子（例えば
、サイクリンＡおよびＰＣＮＡ）（これらは、Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行のために
重要である）の内因性発現を刺激する。Ｅ２Ｆデコイ（しかし、ミスマッチ配列オリゴヌ
クレオチド（Ｍ−Ｅ２Ｆ）ではない）のトランスフェクションは、ＶＳＭＣ増殖、ならび
に高濃度グルコースおよび血清により誘導されるＰＣＮＡ遺伝子およびサイクリンＡ遺伝
子の発現を効果的に減弱した。このことは、サイクリンＡのプロモーター研究の結果と一
致した。さらに、サイクリンＡプロモーター連続欠失または変異構築物の使用から導かれ
る本発明者らのこの結果は、サイクリンＡ遺伝子発現のグルコース刺激性アップレギュレ
ーションは、サイクリンＡプロモーターにおけるＥ２Ｆ部位によって媒介されることを実
証する。Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−Ｅ２Ｆではない）とルシフェラーゼレポーター構築物との同
時トランスフェクションはまた、高濃度グルコースにより誘導されるサイクリンＡプロモ
ーター下のルシフェラーゼ発現を、完全に排除した。

最後に、ＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、バルーン損傷後の新生内膜形成を、
ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも有効に防止した。ＣＤ−Ｅ２Ｆで処理した脈管中のＰＣＮＡ染色につ
いて陽性である細胞はまた、ＰＳ−Ｅ２Ｆで処理した脈管または非トランスフェクション
脈管においてよりもかなり少ないことが、見出された。これらの知見は、インビトロ研究
の結果とまとめると、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、ＶＳＭＣ増殖の抑制および脈管損傷後の新生内膜
形成の防止において、より有効であることを示す。ＣＤ−Ｅ２Ｆのさらなる潜在的な治療
利益は、変異の可能性がないことであり、一方、外来物質を用いて改変されたＯＤＮは、
加水分解されたヌクレオチドがＤＮＡ複製の間に再利用されてゲノムＤＮＡ中に導入され
た場合に、変異する可能性を有し得る。

結論として、本発明は、ＣＤ−Ｅ２Ｆが、従来の改変されたＯＤＮと比較して顕著に増
加した安定性と、優れた配列特異的デコイ効果とを有することを、示す。さらに、ＣＤ−
Ｅ２Ｆを使用してＥ２ＦのＤＮＡ結合活性を阻害すると、インビトロならびにインビボで
、細胞周期調節遺伝子の発現および細胞増殖が有意に減少された。新規なＣＤ−Ｅ２Ｆと
非常に有効なＨＶＪ−リポソーム送達技術とを使用する本発明は、ヒトにおける脈管形成
術後の再狭窄を、副作用を最小限しか伴わずに防止するための新規な治療ストラテジーを
提供する。

従って、本発明の好ましい実施形態において、本発明は、種々のＡＰ−１関連疾患また
はＥ２Ｆ関連疾患の治療または予防のための薬学的組成物を提供し、この治療および予防
のための方法を提供する。この組成物は、ＡＰ−１を含み、あるいはまたはさらに、Ｅ２
Ｆデコイを活性成分として含み、必要に応じて別の転写因子（例えば、ＮＦκＢ）デコイ
を含む。

本発明の治療組成物／予防組成物が示される疾患は、ＡＰ−１関連疾患であり、そして
またＥ２Ｆ関連疾患である。これらは、すなわち、転写調節因子であるＡＰ−１またはＥ
２Ｆの制御下にある遺伝子の望ましくない活性化によって引き起こされる疾患である。こ
のような疾患としては、炎症疾患（慢性関節リウマチ、変形性関節症など）、皮膚炎（ア
トピー性皮膚炎、乾癬など）、動脈瘤、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、血管炎、
ＰＴＣＡおよびＰＴＡ後の再狭窄、癌または癌腫、喘息などが挙げられるが、これらに限
定されない。

ＡＰ−１は、種々の重要な遺伝子の重要な調節因子であり、これらの遺伝子は、（ｉ）
組織破壊を引き起こす酵素の生成に関与する遺伝子、（ｉｉ）慢性炎症に関連するサイト
カインの生成に関与する遺伝子、および（ｉｉｉ）細胞増殖に必要なタンパク質の生成に
関与する遺伝子を包含する。従って、ＡＰ−１ダンベルデコイは、慢性炎症疾患を処置す
る際の潜在的に強力な因子であり得る。

転写因子のＥ２Ｆファミリーは、細胞増殖の調節において重要な役割を果す。従って、
本発明により提供される新規なＥ２Ｆデコイは、異常な細胞増殖に関連する疾患を処置す
る際の潜在的に強力な因子であり得る。

本発明の別の実施形態において、本発明の治療組成物／予防組成物が示される疾患は、
ＮＦ−κＢ関連疾患であり、この疾患は、すなわち、転写調節因子であるＮＦ−κＢの制
御下にある遺伝子の望ましくない活性化により引き起こされる疾患である。そのような疾
患には、虚血性疾患、炎症疾患、自己免疫疾患、癌転移および癌浸潤、ならびに悪液質が
数えられ得る。この虚血性疾患としては、器官の虚血性疾患（例えば、虚血性心不全（例
えば、心筋梗塞、急性心不全、慢性心不全など）、虚血性脳疾患（例えば、脳梗塞）、お
よび虚血性肺疾患（例えば、肺梗塞）、器官移植または器官手術の予後の悪化（例えば、
心臓移植、心臓手術、腎臓移植、腎臓手術、肝臓移植、肝臓手術、骨髄移植、皮膚移植、
角膜移植、および肺移植の、予後の悪化）、再灌流障害、ならびにＰＴＣＡ後の再狭窄が
挙げられる。上記の炎症疾患としては、とりわけ、種々の炎症疾患（例えば、腎炎、肝炎
、関節炎など）、急性腎不全、慢性腎不全、および動脈硬化症が挙げられる。上記の自己
免疫疾患としては、リウマチ、多発性硬化症、および橋本甲状腺炎が挙げられるが、これ
らに限定されない。特に、本発明に従うＮＦ−κＢデコイを活性成分として含む薬学的組
成物は、虚血性疾患における再灌流障害、器官移植もしくは器官手術の予後の悪化、ＰＴ
ＣＡ後の再狭窄、癌の転移および浸潤、ならびに悪液質（例えば、癌の発症後の体重減少
）を治療および予防するために非常に適切である。

転写因子が関連する他の任意の疾患が、本発明のデコイによって処置または予防され得
る。そのような疾患としては、Ｅ２Ｆに関連する疾患、障害、または状態（例えば、新生
内膜肥厚、新形成、糸球体腎炎、新脈管形成、炎症）；ＡＰ−Ｉに関連する疾患、障害、
または状態（例えば、新生内膜肥厚、心筋細胞の増殖／分化）；ＮＦκＢに関連する疾患
、障害、または状態（例えば、炎症、免疫応答、移植片拒絶、虚血再灌流損傷、糸球体腎
炎、炎症腸疾患）；ＳＳＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、新生内膜肥厚
、バイパス移植片、新脈管形成、側副枝形成）；ＣＲＥＢに関連する疾患、障害、または
状態（例えば、ｃＡＭＰ活性化事象）；ＭＥＦ−２に関連する疾患、障害、または状態（
例えば、心筋氏亜傍の分化および増殖）；ＣＡｒＧボックスに関連する疾患、障害、また
は状態（例えば、心筋細胞の分化および増殖）；ｔａｘに関連する疾患、障害、または状
態（例えば、ＨＴＬＶ関連）；ＶＰ１６に関連する疾患、障害、または状態（例えば、Ｈ
ＩＶ感染）；ＧＲＥ／ＨＲＥ ＭＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、ステ
ロイドホルモンプロセス）（乳房もしくは前立腺の細胞増殖））；熱ショックＲＥに関連
する疾患、障害、または状態（例えば、細胞ストレス（例えば、虚血性低酸素症））；Ｓ
ＲＥに関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞の増殖／分化）；ＡＰ−２に関連
する疾患、障害、または状態（例えば、細胞増殖）；ステロール応答エレメントに関連す
る疾患、障害、または状態（例えば、高コレステロール血症）；ＴＲＥ（ＴＧＦｂ応答エ
レメント）に関連する疾患、障害、または状態（例えば、細胞の増殖、分化、遊走、新脈
管形成、内膜応答性肥厚、マトリックス生成、エレメントアポトーシス）が挙げられるが
、これらに限定されない。

特に、本発明に従うデコイを活性成分として含む薬学的組成物は、虚血性疾患における
再灌流障害、器官移植もしくは器官手術の予後の悪化、ＰＴＣＡ後の再狭窄、癌の転移お
よび浸潤、ならびに悪液質（例えば、癌の発症後の体重減少）を処置および予防するため
に非常に適切である。

本発明において使用され得るデコイは、転写因子の型に対応する染色体の結合部位と特
異的に拮抗する任意の化合物であり得、このデコイとしては、核酸およびそれらのアナロ
グが挙げられるが、これらに限定されない。上記デコイの好ましい例として、ＴＧＡＣＴ
ＣＡ（ＡＰ−１）のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド、およびＴＴＴＣＧＣＧ
Ｃ（Ｅ２Ｆ）のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド（それぞれ、配列表の配列番
号１および２の５’末端から7番目〜１３番目のヌクレオチドの配列、ならびに５’末端
から８番目〜１５番目のヌクレオチドの配列）、ＧＧＧＡＴＴＴＣ（ＮＦκＢ）のヌクレ
オチド配列を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチド、
それらのムテイン、ならびに上記オリゴヌクレオチド配列のうちのいずれかを含む化合物
が、言及され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても
よく、そしてまた、改変されたヌクレオチドおよび／または擬性ヌクレオチドを含み得る
。さらに、それらのオリゴヌクレオチド、その改変体、またはそれらのうちのいずれかを
含む化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、そして直鎖状であっても環状で
あってもよい。改変体とは、転写因子が結合する染色体結合部位と特異的に拮抗する、上
記の配列のうちの何らかの部分の変異（例えば、置換、付加、および／または欠失）を含
む核酸配列である。より好ましいデコイとしては、上記のヌクレオチド配列のうちの１つ
または複数を各々が含む二本鎖オリゴヌクレオチド、ならびにそれらの改変体が挙げられ
る。本発明において使用され得るオリゴヌクレオチドとしては、生分解に対して感受性が
低くなるように改変されたオリゴヌクレオチド（例えば、ホスホジエステル部分の酸素を
硫黄で置き換える（Ｓ−オリゴ）際に利用可能なチオホスホジエステル結合を含むオリゴ
ヌクレオチド、ならびにホスホジエステル部分を、電荷を保有しないメチルホスフェート
基で置換する際に利用可能なオリゴヌクレオチドが挙げられる。

本発明において使用するためのデコイを生成するための技術に関して、従来の化学合成
法または生化学合成法が、使用され得る。例えば、核酸がデコイとして使用されるべき場
合、遺伝子操作において一般的に使用される核酸合成のための方法が、使用され得る。例
えば、目的のデコイオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機において直接合成され得る。ま
たは、各々予め合成された核酸もしくはそのフラグメントが、ＰＣＲによってか、または
クローニングベクターなどを使用して、増幅され得る。さらに、望ましい核酸は、制限酵
素などを用いる切断、および／またはＤＮＡリガーゼなどによる連結のような手順によっ
て、得られ得る。細胞中でより安定であるデコイヌクレオチドを得るために、本核酸の塩
基部分、糖部分、および／またはリン酸部分は、アルキル化、アシル化、さもなければ化
学改変され得る。本発明に従って活性成分としてデコイを含む薬学的組成物は、その活性
成分が罹患部位中の細胞または標的組織の細胞によって取り込まれ得る限り、形態を限定
されない。従って、本デコイは、単独でかまたは一般的な薬学的キャリアと混合してかの
いずれかで、経口投与、非経口投与、局所投与、または外部投与され得る。

本薬学的組成物は、溶液、懸濁物、シロップ剤、リポソーム、ローションなどのような
、液体投与形態でか、または錠剤、顆粒、散剤、およびカプセル剤などのような固体投与
形態で、提供され得る。必要な場合は、薬学的組成物は、種々のビヒクル、賦形剤、安定
化剤、滑沢剤、および／または他の従来の薬学的添加剤（例えば、ラクトース、クエン酸
、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、石膏、スクロース、コーンスター
チ、滑石、ゼラチン、寒天、ペクチン、落花生油、オリーブ油、カカオバター、エチレン
グリコールなど）を補充され得る。

特に核酸またはその改変産物がデコイとして使用される場合、好ましい投与形態として
は、遺伝子治療において一般的に使用される投与形態（例えば、リポソーム（センダイウ
イルスを使用する膜融合リポソーム、およびエンドサイトーシスを利用するリポソーム）
、カチオン性脂質を含む調製物（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈ Ｏｒｉｅｎｔａｌ））、またはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター
などを使用するビロソームが、挙げられる。特に好ましいのは、膜融合リポソームである
。

このようなリポソーム調製物の構造は、大きな単層リポソーム（ＬＵＶ）、多層リポソ
ーム（ＭＬＶ）、小さな単層リポソーム（ＳＵＶ）のいずれかであり得る。小胞のおよそ
のサイズは、ＬＵＶについて２００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲、ＭＬＶについて４００ｎ
ｍ〜３５００ｎｍの範囲、そしてＳＵＶについて２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲であり得るが
、センダイウイルスを使用する膜融合リポソーム調製物の場合、例えば、直径２００ｎｍ
〜１０００ｎｍの小胞系を含むＭＬＶが、好ましくは使用される。

本デコイが小胞中で首尾良く捕捉され得る限り、リポソーム生成のための技術に関して
、制限は存在しない。従って、そのようなリポソームは、従来の技術（例えば、２〜３例
挙げると、逆相エバポレーション法（Ｓｚｏｋａ，Ｆ．ら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ．６０１ ５５９（１９８０））、注入法（Ｄｅａｍｅｒ，Ｄ．
Ｗ．；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３０８ ２５０（１９７８））、
および界面活性剤法（Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．ら：Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ，ｖｏｌ．４５５ ３２２（１９７６）））によって製造され得る。

リポソームを形成するために使用され得る脂質としては、リン脂質、コレステロール、
およびその融合体、ならびに窒素含有脂質が挙げられるが、リン脂質が、一般的には好ま
しい。使用され得るリン脂質としては、天然に存在するリン脂質（例えば、ホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシ
トール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルディオリピン、スフ
ィンゴミエリン、卵黄レシチン、ダイズレシチン、リソレシチンなど）、従来の方法によ
って水素添加された対応するリン脂質、ならびに合成リン脂質（例えば、ジセチルホスフ
ェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、オレオステアロイルホスファチジルコ
リン、オレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、オレオステアロイルホスフ
ァチジルセリンなど）が、挙げられる。

上記脂質（特に、リン脂質）は、個別にかまたは適切な組合せで、使用され得る。正に
荷電した基（例えば、エタノールアミンまたはコリン）を含む脂質を使用することによっ
て、電気的に負のデコイヌクレオチドの結合が、増強され得る。主要なリン脂質に加えて
、種々の化合物（例えば、リポソーム添加剤として公知である、コレステロールおよびそ
の誘導体、ステアリルアミン、トコフェロールなど）が、リポソームの製造において添加
され得る。

生じるリポソームに、膜融合プロモーター（例えば、センダイウイルス、不活化センダ
イウイルス、センダイウイルスから精製した膜融合促進タンパク質、ポリエチレングリコ
ールなど）が、罹患部位または標的組織の細胞による細胞内取り込みを補助するために添
加され得る。

薬学的リポソームの生成のための代表的な手順が、ここに、詳細に記載される。上記の
リポソーム形成物質、ならびにコレステロールなどが、有機溶媒（例えば、テトラヒドロ
フラン、クロロホルム、エタノールなど）中に溶解される。適切な容器において、その溶
媒は減圧下で蒸発されて、その容器の内壁にリポソーム形成物質のフィルムが残る。その
後、本デコイを含む緩衝液が添加され、そしてその混合物が攪拌される。上記膜融合プロ
モーターの必要に応じて添加した後、そのリポソームは単離される。そのようにして本デ
コイが捕捉されたリポソームが、適切な媒体中に懸濁されるか、またはその凍結乾燥体が
、治療において使用するために適切な媒体中に再分散される。上記膜融合プロモーターは
、リポソームを単離した後と使用の前との間の期間に添加され得る。

本デコイを活性成分として含む薬学的組成物のデコイ含有量に関して、そのデコイが転
写因子関連疾患を制御するために有効な量で含まれる限り、制限はない。従って、このデ
コイ含有量は、制御されるべき疾患、標的部位、投与形態、および投与スケジュールに従
って、自由に選択され得る。

上記の様式で提供されるような本デコイを活性成分として含む薬学的組成物は、疾患の
型および含まれるデコイの種類に従って、種々の方法によって投与され得る。虚血性疾患
、炎症疾患、自己免疫疾患、癌の転移または浸潤、ならびに悪液質を例として採ると、本
組成物は、脈管内に注入され得るか、罹患領域に直接適用され得るか、病巣中に注射され
得るか、または罹患領域中の局所的血管中へと投与され得る。さらなる具体例として、Ｐ
ＴＣＡが器官梗塞の処置のために実施される場合、本薬学的組成物が、手術と同時にか、
手術前および手術後に、局所的血管中に投与され得る。器官移植のために、移植片物質は
、本発明の組成物で前もって処理され得る。さらに、変形性関節症またはリウマチの処置
において、本組成物は、関節中に直接注射され得る。

本デコイの投与量は、患者の年齢および他の要因、疾患の型、使用されるデコイの種類
などを参照して選択されるが、脈管内投与、筋肉内投与、または関節内投与のためには、
例えば、単位用量１０ｎｍｏｌ〜１０，０００ｎｍｏｌが、一般的には１日１回から２〜
３回投与され得る。

以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるものではない。

（実施例１：インビトロでの脈管平滑筋細胞の増殖およびインビボでの新生内膜形成に
対する、新規なＡＰ−１デコイオリゴヌクレオチドの阻害効果）
（材料および方法）
（動物）
２８０ｇ〜３２０ｇの体重である９週齢〜１０週齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ
ラット（Ｈｙｏｃｈａｎｇ，Ｔａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を、使用した。すべての手順は、
研究施設における動物研究に関する指針に従った。

（細胞培養）
ヒトＶＳＭＣを、Ａｈｎら、２００１（上記）に記載される通りに採集し、ラット大動
脈平滑筋細胞を、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２５０ｇ）の胸
大動脈から採集した。ＶＳＭＣを、２０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含むＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓ
ｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で培養した。ＶＳＭＣの純度を、平滑筋特異的α−アクチン
モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いる陽性染色
によって特徴付けた。

（ＣＤＯＤＮの構築）
本発明において使用したダンベル型およびＡＰ−１結合部位から誘導したホスホロチオ
エート二本鎖ＯＤＮおよびミスマッチＯＤＮの配列は、以下の通りである：
ＣＤＯＤＮ（コンセンサス配列に下線を付している）、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣ
ＴＣＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＡＧＴＣＡＴ−３’（配列番号３）
；
ホスホロチオエート線状ＡＰ−１デコイＯＤＮ（ＰＳＯＤＮ）、５’−ＡＧＣＴＴＧＴ
ＧＡＣＴＣＡＧＡＡＧＣＴ−３’（配列番号４）；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ（Ｍ
ＯＤＮ）、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＣＡＣＧＴＣＴＴ
ＣＴＧＡＧＡＴＴＴ−３’（配列番号５）。

ステムの５’末端は、ＢａｍＨＩの制限部位として、６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡ
ＴＣＣ−３’を有する。２つのオリゴ分子を、両方の５’末端の相補的な６塩基配列によ
って結合した。温度を８０℃から２５℃へと下げながら、ＯＤＮを２時間アニールさせた
。１単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、１６℃で２４時間インキュベートして、共有
結合したダンベルデコイＯＤＮ分子（ＣＤＯＤＮ）を生成した。このＣＤＯＤＮは、２つ
のループと１つのステムとからなり、この１つのステムは、２つのＡＰ−１コンセンサス
配列を直列に含む（図１Ａ）。

（ＣＤＯＤＮの安定性）
ＣＤＯＤＮの安定性を試験するために、各々１μｇの非連結ホスホジエステルＯＤＮ、
ＰＳＯＤＮ、およびＣＤＯＤＮを、ヒト血清、ウシ胎仔血清、仔ウシ胎仔血清、エキソヌ
クレアーゼＩＩＩ、またはＳ１ヌクレアーゼとともにインキュベートした。すべての血清
は、ＤＮａｓｅ活性を保存するために、熱不活化をせずに使用した。各血清を、ＯＤＮに
１００μｌの反応容器中５０％まで添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。１６
０単位／μｇのエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をＯ
ＤＮに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。１０単位／μｇ ＯＤＮのＳ１ヌク
レアーゼをＯＤＮに添加し、２５℃で３０分間インキュベートした。その後、ＯＤＮをフ
ェノールおよびクロロホルムで抽出し、１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で試験した
。

（ＶＳＭＣの増殖に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
ＶＳＭＣを、９６ウェル組織培養プレート上に播種した。３０％コンフルエンスにて、
ＶＳＭＣを、規定した無血清培地中で２４時間インキュベーションすることによって、休
止状態にした。その後、１００ｎｍｏｌ／ＬデコイＯＤＮを含むリポフェクチンを、これ
らのウェルに添加した。これらの細胞を、３７℃で５時間インキュベートした。２〜３日
間後、細胞増殖の指標を、ＷＳＴ細胞計数キット（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）
の使用によって決定した。

（細胞遊走アッセイ）
ＶＳＭＣ遊走を、改変型Ｂｏｙｄｅｎチャンバ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使
用して評価した。コントロール培地中に懸濁したＶＳＭＣ（２×１０^５細胞／ウェル）を
、上部チャンバに添加し、試験サンプルを、下部チャンバ中に配置した。３７℃で２４時
間のインキュベーション後、細胞を固定し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色
した。そのフィルターの下部表面上の無作為に選択した４つの高倍率（×４００）視野か
らの平均細胞数を、計数した。

（電気泳動移動度アッセイ（ＥＭＳＡ））
核抽出物を、Ａｈｎ ＪＤら（上記）に記載される通りに、ＶＳＭＣから調製した。簡
単に述べると、ＤＮＡプローブ（例えば、ＡＰ−１およびミスマッチデコイＯＤＮ）を、
プライマーとして標識した。タンパク質−ＤＮＡ結合反応を、容量２０μｌにて室温で２
０分間実施した。この反応混合物は、６μｇの核抽出物、１００μｇ／ｍｌのポリｄＩ：
ｄＣ、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣ
ｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／ｌ Ｍ
ｇＣｌ_２、４％グリセロールおよび６０，０００ｃｐｍの^３２Ｐ標識プライマーＤＮＡを
含んだ。インキュベーション後、これらのサンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤ
ＴＡ緩衝液中にある４％ネイティブポリアクリルアミドゲル上にローディングし、１５０
Ｖにて２時間泳動した。そのゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーによって可視化した
。競合研究のために、実験条件は同一であった。但し、適切な競合ＯＤＮを、核抽出物の
添加前に反応混合物に５０倍モル過剰〜１００倍モル過剰で添加した。

（ルシフェラーゼアッセイ）
ＡＰ−１ルシフェラーゼ構築物ｐＡＰ１（ＰＭＡ）−ＴＡ−Ｌｕｃを、Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈから購入した。サイクリンＡプロモータールシフェラーゼ構築物を、Ｍａｓａｏ Ｙｏ
ｓｈｉｚｕｍｉ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｋｙｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔ
ｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により親切にも提供された（Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ Ｍら、Ｊ Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９７；２７２：２２２５９〜２２２６４を参照のこと）。このル
シフェラーゼ発現を分析するために、その細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２００μｌの１×
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い
て溶解した。５０μｌの各溶解物を、ルシフェラーゼ活性について試験した。

（ノーザンブロット分析）
ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロッティングによって測定し
た。ノーザンブロット分析のために、１０μｇの全ＲＮＡを、１％ホルムアルデヒド−ア
ガロースゲルに適用し、ナイロン膜に移した。このナイロン膜を、６５℃のＥｘｐｒｅｓ
ｓ Ｈｙｂ^ＴＭ溶液中で、放射標識ＰＣＮＡ ｃＤＮＡプローブまたはサイクリンＡ ｃ
ＤＮＡプローブ（Ｙｏｕｎｇ−Ｃｈａｅ Ｃｈａｎｇ博士、Ｄａｎｋｏｏｋ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｋｏｒｅａによって寄贈された）を用いて
ハイブリダイズし、製造業者の指示に従って洗浄した。この膜をＸ線フィルムに露光し、
そしてそのｍＲＮＡ発現を、濃度測定分析を用いて定量した。

（日本赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを、Ａｈｎ ＪＤら、２００１（上記）に記載される通りに
調製した。簡単に述べると、コレステロール、ジオレオイル−ホスファチジルエタノール
アミン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、およびホスファチジルセリンを、
モル比５０：１３．３：１３．３：１３．３：１０で混合した。この脂質混合物を、クロ
ロホルム除去によって、フラスコの側面に堆積させた。乾燥した脂質を、ＯＤＮを含む２
００μｌの平衡塩溶液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ，５．４ｍｍｏｌ／ｌ
ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中で水和した。リポソーム
を、振盪および濾過によって調製した。精製ＨＶＪ（Ｚ染色）を、使用直前に３分間のＵ
Ｖ照射によって不活化した。このリポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中にあるＨ
ＶＪとともに混合した。その混合物を４℃で５分間インキュベートし、その後、穏やかに
振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。遊離したＨＶＪを、ショ糖密度勾配
遠心分離によって、ＨＶＪ−リポソームから除去した。そのショ糖勾配の最上層を、使用
のために収集した。

（バルーン損傷およびインビボ遺伝子移入）
２ Ｆｒｅｎｃｈ Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを使用して、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗ
ｌｅｙラット（２８０ｇ〜３２０ｇ）中に脈管損傷を誘導した。これらのラットを、ペン
トバルビタールで麻酔し、左総頸動脈を外科的に露出させた。外頸動脈を介して、この総
頸動脈中にカテーテルを導入した。外頸動脈中に動脈切開を介してバルーンカテーテルを
３回通過および膨張させることによって、この総頸動脈の脈管損傷を誘導した。損傷した
部分を、一時的結紮によって一過的に分離させた。バルーン損傷後、ＣＤＯＤＮ、ＭＯＤ
Ｎ、ＦＩＴＣ標識ＰＳＯＤＮのいずれかを含むＨＶＪ−リポソームまたはＨＶＪ−リポソ
ーム単独を２０μｌ、室温にて１０分間管腔中でインキュベートした。１０分間のインキ
ュベーションの後、注入カニューレを取り出した。トランスフェクションの後、その総頸
動脈への血流を、結紮糸の解放によって回復し、その後、その創傷を閉鎖した。有害な神
経学的効果も脈管への効果も、この手順を行ったどの動物においても観察されなかった。

（組織学的分析）
トランスフェクション後２週間目に、ラットを屠殺し、そして脈管を、４％パラホルム
アルデヒドで灌流固定した。新生内膜のサイズを、サンプルの正体を知らない個人による
形態計測によって、定量した。内膜面積および中膜面積を、デジタル処理システム（モデ
ルＩＮＴＵＯＳ ６×８、Ｗａｃｏｍ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＷＡ，ＵＳＡ）において測
定した。ＦＩＴＣ標識ＡＰ−１デコイＯＤＮトランスフェクションの場合、脈管を、トラ
ンスフェクション後３日目に採集し、そして４％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。
切片を、蛍光顕微鏡によって試験した。免疫組織化学のために、切片を、ウサギ抗増殖細
胞核抗原抗体（１：２００希釈、ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにインキュベートし、そして標準的様式で免
疫組織化学のために処理した。

（統計学的分析）
結果を、平均値±標準誤差平均として表す。その後のＤｕｎｃａｎ検定を用いる分散分
析を使用して、多重比較における差の有意性を決定した。Ｐ＜０．０５を、統計学的に有
意であると見なした。すべての実験は、少なくとも３回実行した。

（結果）
（安定性が増強したダンベル型ＡＰ−１デコイの構築）
種々のデコイＯＤＮの安定性を調査するために、本発明者らは、まず、ヌクレアーゼに
対する分子の安定性を試験した。ＣＤＯＤＮは、エキソヌクレアーゼＩＩＩに対して安定
であったが、ＰＳＯＤＮおよびアニールしたデコイＯＤＮの両方は、エキソヌクレアーゼ
ＩＩＩと２時間インキュベートした後に、完全に分解された（図１Ｂ）。本発明者らはさ
らに、Ｓ１ヌクレアーゼを使用して、ＣＤＯＤＮの分子特徴を試験した。Ｓ１ヌクレアー
ゼは、ＤＮＡ分子における一本鎖領域を消化する。ダンベルデコイ（７２塩基）およびＰ
ＳＯＤＮ（３８塩基）の両方のステム領域は、Ｓ１ヌクレアーゼから保護されることが見
出されたが、アニール型デコイＯＤＮのステム領域は、保護されなかった（図１Ｂ）。

ＰＳＯＤＮおよびアニールしたデコイＯＤＮの両方は、非不活化ヒト血清、ウシ胎仔血
清および仔ウシ胎仔血清の存在下での２４時間のインキュベーションの後、有意に加水分
解された。しかし、ＣＤＯＤＮは、これらの種々の血清との２４時間のインキュベーショ
ンの後に、大部分がインタクトなままであった。このことは、ＰＳＯＤＮおよびアニール
型デコイＯＤＮと比較した場合に、かなり改善された安定性を示す（図１Ｂ）。

（ＡＰ−１標的部位を有するダンベルデコイＯＤＮへのＡＰ−１の特異的結合）
ＣＤＯＤＮが、配列特異的様式で、デコイとして十分に強くＡＰ−１と相互作用するこ
とを実証するために、インビトロ競合アッセイを行った。非標識化ＡＰ−１デコイＯＤＮ
の増加は、タンパク質によって形成された複合体に対応する遅延バンドの強度を減少させ
た（図２Ａ）。１０００倍モル過剰の非標識化ＰＳＯＤＮは、競合物質として、標識化プ
ローブへのＡＰ−１結合に対してほぼ完全に競合した。ＣＤＯＤＮを、競合物質としてＰ
ＳＯＤＮの代わりに用いた場合、１００倍モル過剰の非標識化ＣＤＯＤＮ競合物質は、標
識化プローブへのＡＰ−１結合に対して完全に競合した。次いで、本発明者らは、ＣＤＯ
ＤＮおよびＰＳＯＤＮを高濃度のグルコースおよび血清刺激条件下で細胞中にトランスフ
ェクトして、ＣＤＯＤＮがＡＰ−１のＤＮＡ結合活性を特異的に阻害するか否かを調べた
。予想通り、高濃度のグルコースでの処理により、低濃度のグルコースと比較して、ＡＰ
−１結合活性が有意に増大した（図２Ｂ、ｐ＜０．００１）。同様に、血清もまた、用量
依存的にＡＰ−１のＤＮＡ結合活性を増大させた（ｐ＜０．００１）。ＰＳＯＤＮおよび
ＣＤＯＤＮの両方のトランスフェクションは、高濃度のグルコースまたは血清によって誘
導されたＡＰ−１ＤＮＡ結合活性を有意に低減した（ｐ＜０．０１）が、ＣＤＯＤＮは、
ＡＰ−１結合活性のより高い阻害を示した（ｐ＜０．００１）。

（平滑筋細胞における遺伝子発現に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果）
本発明者らは、プロモーター領域にＡＰ−１結合部位を含むレポーター遺伝子構築物を
用いて、プロモーター活性に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を研究した。高濃度グル
コースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーションにおけるＡＰ−１
結合部位の役割を調べるために、一連の種々の長さのヒトサイクリンＡ５’フランキング
配列を含むルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドを、高濃度のグルコースで処理し
た平滑筋細胞中にトランスフェクトした。これらのプラスミド中の２つのプラスミド（ｐ
ＣＡ−２６６／＋２０５ｍｔおよびｐＣＡ−１３３／−２０５ｍｔ）のみが、有意に低下
したルシフェラーゼ活性を示し（図３Ａ、ｐＣＡ−２６６／＋２０５またはｐＣＡ−１３
３／＋２０５と比較して、ｐ＜０．００１）、そしてこれらのレポーター遺伝子構築物は
、サイクリンＡプロモーター由来のＡＰ−１タンパク質を担う、ＡＴＦ部位を変異させる
。これらのデータは、平滑筋細胞において、ＡＰ−１デコイＯＤＮが、高濃度のグルコー
スによって誘導されるサイクリンＡのプロモーター活性をダウンレギュレートし得たこと
を示す。

次いで、本発明者らは、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐＡＰ１（ＰＭＡ）−Ｔ
Ａ−ＬｕｃおよびＡＰ−１結合部位を含むサイクリンＡプロモータールシフェラーゼ構築
物（ｐＣＡ−２６６／＋２０５）の高濃度グルコースおよび血清誘導性活性に対するＡＰ
−１デコイＯＤＮの効果を比較した。予想通り、ルシフェラーゼレポーターのＰＳＯＤＮ
およびＣＤＯＤＮとの同時トランスフェクションは、高濃度グルコース刺激性および血清
刺激性ルシフェラーゼ遺伝子発現を顕著に低減した（図３ＢおよびＣ、ｐ＜０．０１）。
しかし、ＣＤＯＤＮは、ＰＳＯＤＮよりも有効であった（ＰＳＯＤＮと比較して、ｐ＜０
．０１）。従って、本発明者らは、インビトロの細胞周期−調節遺伝子の内因性の発現に
対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を調べた。この目的のために、ＰＣＮＡおよびサイク
リンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロット法によって測定した。サイクリンＡおよびＰＣ
ＮＡの両方は、Ｇ１期からＳ期への細胞周期進行に必要である。図３Ｄに示すように、ヒ
トＶＳＭＣおよびラット大動脈平滑筋細胞の両方において、高濃度グルコースおよび血清
の両方が、ＰＣＮＡおよびサイクリンＡ ｍＲＮＡの発現を刺激した。ミスマッチのＯＤ
Ｎではなく、ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランスフェクションにより、これらの遺伝子の高
濃度グルコースおよび血清誘導性の発現の低減が引き起こされた。さらに、このような刺
激条件において、これらの遺伝子発現に対するＣＤＯＤＮの阻害効果は、ＰＳＯＤＮより
も強かった。

（インビトロにおける平滑筋細胞の増殖および遊走の阻害に対するＡＰ−１デコイＯＤ
Ｎの効果）
高濃度グルコースおよび血清刺激性の初代培養ヒトＶＳＭＣおよびラットＶＳＭＣの増
殖を、コントロールと比較した（図４Ａおよび４Ｂ）。ＡＰ−１デコイＯＤＮのトランス
フェクションにより、高濃度グルコースまたは血清によって刺激される細胞と比較して、
細胞増殖の有意な阻害が引き起こされた（ｐ＜０．０５）。注目すべきは、ＣＤＯＤＮが
、細胞増殖をほぼ完全に阻害することである（ｐ＜０．０１）。同様に、ＶＳＭＣの遊走
は、高濃度グルコースおよび高濃度血清の両方によって、コントロールと比較して増大し
（図４Ｃおよび４Ｄ、ｐ＜０．０５）、そして、この高濃度グルコースおよび高濃度血清
の両方によって刺激された遊走は、ＡＰ−１デコイＯＤＮでの処理によって有意に低減さ
れ（ｐ＜０．０１）、一方、ＣＤＯＤＮは、遊走に対して最も強力な阻害効果を示した（
ｐ＜０．００１）。

（ラットバルーン損傷頸動脈における新内膜形成に対するＣＤＯＤＮの効果）
本発明者らは、蛍光（ＦＩＴＣ）−標識化ＡＰ−１デコイＯＤＮを用いたＨＶＪ−リポ
ソーム法のラット頸動脈中へのトランスフェクション効率を試験した。ＨＶＪ−リポソー
ム法によるＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのトランスフェクションにより、強い蛍光を生じ（図
５ＡおよびＢ）、動脈の全層において容易に検出された。従って、本発明者らは、ラット
頸動脈中にＡＰ−１デコイＯＤＮをトランスフェクトするために、ＨＶＪ−リポソーム法
を選択した。

ＨＶＪ−リポソーム法を用いて、ラット頚動脈バルーン損傷モデルにおける新内膜形成
に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を検査した。図５に示すように、ミスマッチのＯＤ
Ｎとトランスフェクトした脈管は、未処理の脈管と同様に、トランスフェクションの２週
間後に新内膜形成を示した。対照的に、ＰＳＯＤＮおよびＣＤＯＤＮの単回投与は、新内
膜形成の有意な低下を引き起こした（ｐ＜０．００１）。インビトロのデータと一致して
、新内膜形成に対するＣＤＯＤＮの阻害効果は、ＰＳＯＤＮよりも強力であった（ｐ＜０
．０００１）。

次いで、本発明者らは、損傷頚動脈における新内膜形成の阻害に対するＡＰ−１デコイ
ＯＤＮの前処理および後処理の効果を比較した。図６に示すように、バルーン損傷前のラ
ット頸動脈中へのＡＰ−１デコイＯＤＮでの前処理は、新内膜形成の阻害において、後処
理よりも有効であった（バルーン損傷脈管と比較して、ｐ＜０．０００１、ＣＤＯＤＮの
後処理と比較して、ｐ＜０．０１）
（インビボにおけるＡＰ−１ ＤＮＡ結合活性および遺伝子発現に対するＡＰ−１デコ
イＯＤＮの効果）
ＡＰ−１デコイＯＤＮが、インビボにおけるＡＰ−１ ＤＮＡ結合活性を効果的にブロ
ックしたことを確認するために、本発明者らは、損傷動脈由来の細胞を用いて、ゲル移動
性シフトアッセイを行った。図７Ａに示すように、ＡＰ−１ ＤＮＡ結合活性は、損傷後
３０分で増大し、損傷後３時間で最大になった。この活性化は、ＣＤＯＤＮでの処理によ
って阻害された。デコイＯＤＮでの前処理は、後処理よりもより効果的にＡＰ−１活性を
低減させた。

細胞増殖に対するＡＰ−１デコイＯＤＮの阻害効果は、ＰＣＮＡ染色（正常な状態およ
び疾患状態の両方における増殖マーカーとして広く用いられる）によって確認された。図
７Ｂに示すように、非損傷動脈におけるＰＣＮＡ染色はなかった。損傷の２週間後、ＰＣ
ＮＡ染色陽性の細胞における顕著な増大が、新内膜領域および再増殖した内皮細胞中に検
出された。対照的に、ＡＰ−１デコイＯＤＮで処理された脈管において、ＰＣＮＡ染色陽
性の細胞はさらに少なかった。

（実施例２：新規Ｅ２Ｆデコイオリゴデオキシヌクレオチドの効果）
（材料および方法）
（動物）
体重２８０〜３２０ｇの９〜１０週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラ
ットを用いた。全ての手順は、研究施設における動物研究に関する指針に従った。

（細胞培養）
ヒトＶＳＭＣを、心臓移植ドナーの胸大動脈から単離した。この組織の収集は、機関の
倫理委員会によって承認された。ラットＶＳＭＣを、成体雄性ＳＤラットの胸大動脈から
回収した。ＶＳＭＣを、２０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂ
ｃｏ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）中で培養した。ＶＳＭＣの純
度を、平滑筋特異的なα−アクチンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いるポジティブ染色によって特徴付けた。

１００ｍｍディッシュ中で８０〜９０％のコンフルエンスに達した後、ヒトＶＳＭＣを
、無血清培地中で２４時間血清飢餓させ、そしてコントロール正常グルコース培地（５．
５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコースを含むＤＭＥＭ）または馴化培地（１０％血清および２
２ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコースを含むＤＭＥＭ）のいずれかに供した。次いで、細胞を
、以下に記載されるような核タンパク質抽出またはＲＮＡ抽出で処理した。

（ダンベル型デコイＯＤＮの構築）
本発明において使用される、Ｅ２Ｆ結合部位に対するダンベル型およびホスホロチオエ
ート二重鎖ＯＤＮならびに変異型ＯＤＮの配列は、以下の通りである：ＣＤ−Ｅ２Ｆ（注
記；コンセンサス配列に下線を付す）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＣＧＣＴＡＴＴ
ＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号６）；ホスホロチオエー
トＥ２Ｆデコイ（ＰＳ−Ｅ２Ｆ）、５’−ＡＴｓＴＴＡＡＧＴＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＴＴ
ＣＴＣＡｓＡｓ−３’（配列番号７）；変異型Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−Ｅ２Ｆ）、５’−ＧＧ
ＡＴＣＣＧＴＴＴＣＧＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＣＧＡＡＡＣ−３
’（配列番号８）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ステムループ構造を形成すると予測された。ステム
は、各オリゴの両端の相補的な配列によって形成される。ステムの５’末端は、ＢａｍＨ
Ｉの酵素部位として６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。２つのオリ
ゴ分子を、両方の５’末端の相補的な６塩基の配列によって連結した。温度を８０℃から
２５℃に低下させながら、ＯＤＮを２時間アニーリングさせた。１単位のＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを添加し、そして１６℃で２４時間インキュベートして、共有結合したダンベル型
デコイ分子を生成した。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、２つのループおよび２つのＥ２Ｆコンセンサス
配列を含む１つのステムからなる（図８Ａ）。

（ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性）
ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性を試験するために、各々１μｇのＰＳ−Ｅ２Ｆ、非連結ホスホジ
エステルオリゴおよびＣＤ−Ｅ２Ｆを、ヒト血清、ＦＢＳ、エキソヌクレアーゼＩＩＩま
たはＳ１ヌクレアーゼのいずれかと共にインキュベートした。ＤＮａｓｅ活性を維持する
ために、全ての血清を熱不活化せずに使用した。各血清を１００μｌの反応容積中５０％
までオリゴに添加し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり
１６０単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をオリ
ゴに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１０単位の
Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｔａｋａｒａ）をオリゴに添加し、そして２５℃で３０分間インキュ
ベートした。次いで、これらのオリゴをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、そして
１５％変性ポリアクリルアミドゲルで試験した。

（インビトロ遺伝子移入）
細胞に、新鮮な培養培地を供給し、その一日後に、デコイを添加し、そして各試験の前
にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ
ｉｎ^ＴＭ（モル比；ＤＮＡ：脂質＝１：３）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と合わせて、１００
ｎＭのデコイＯＤＮでトランスフェクションした。デコイＯＤＮ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ
の混合物を、製造業者の指示に従って細胞に滴下した。これらの細胞を３７℃で５時間イ
ンキュベートした。次いで、新鮮な培地を１０％ ＦＢＳに交換した後、これらの細胞を
ＣＯ_２インキュベータ中でインキュベートした。

（ＶＳＭＣ増殖に対するデコイＯＤＮの効果）
ＶＳＭＣを、９６ウェルの組織培養プレートに播種した。３０％コンフルエンスで、Ｖ
ＳＭＣを、規定された無血清培地中で２４時間インキュベートすることによって静止状態
にした。次いで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ：デコイＯＤＮ（１００ｎＭのＯＤＮを含む）を
ウェルに添加した。これらの細胞を３７℃で５時間インキュベートした。２〜３日後、細
胞増殖の指標を、ＷＳＴ細胞計数キット（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用し
て決定した。

（電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
核抽出物を、Ａｈｎ ＪＤら、２００１（前出）に記載されるようにＶＳＭＣから調製
した。簡潔には、Ｅ２Ｆおよび変異型ＯＤＮに対するプローブのようなＤＮＡプローブを
、［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、プライマーと
して標識した。末端標識後、^３２Ｐ標識したＯＤＮをＮＡＰ−５カラムを用いて精製した
。タンパク質−ＤＮＡ結合反応を、２０μｌの容量で室温にて２０分間実施した。この反
応混合物は、６μｇの核抽出物、１００μｇ／ｍｌのポリｄＩ：ｄＣ、１０ｍｍｏｌ／ｌ
Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ
ＥＤＴＡ、０．５ｍｍｏｌ／ｌ ＤＴＴ、１ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ_２、４％グリセロ
ールおよび６０，０００ｃｐｍ ^３２Ｐ標識プライマーＤＮＡを含んだ。インキュベーシ
ョン後、サンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液中で４％非変性ポリア
クリルアミドゲルに充填し、そして１５０Ｖで２時間泳動した。ゲルを乾燥させ、そして
オートラジオグラフィーによって可視化した。競合実験について、実験条件は、適切な競
合ＯＤＮを、反応混合物に対して５０倍〜１００倍モル過剰で添加し、その後各抽出物を
添加したこと以外、同一であった。

（ノーザンブロット分析）
ＰＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現を、ノーザンブロットによって測定した。１
０μｇの総ＲＮＡを、１％ホルムアルデヒド−アガロースゲルにアプライし、そしてナイ
ロンメンブレンに移した。このナイロンメンブレンをＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ^ＴＭ溶液中
で６５℃で２時間、放射性標識したＰＣＮＡ ｃＤＮＡプローブまたはサイクリンＡ ｃ
ＤＮＡプローブ（Ｄｒ Ｙｏｕｎｇ−Ｃｈａｅ Ｃｈａｎｇ，Ｄａｎｋｏｏｋ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｋｏｒｅａにより贈与）とハイブリダイ
ズさせ、そして製造業者の指示に従って洗浄した。このメンブレンを、２４〜４８時間Ｘ
線に曝露し、そしてｍＲＮＡ発現を、濃度測定分析によって定量した。充填の差異を、１
８ｓ ｒＲＮＡ ｃＤＮＡプローブを用いて正規化した。

（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−リポソームを、Ａｈｎ ＪＤら、２００１（前出）に記載されるように調製し
た。簡潔には、コレステロール、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン、ホスフ
ァチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルセリンを、５０：１３．３：
１３．３：１３．３：１０のモル比で混合した。この脂質混合物を、クロロホルムの除去
によってフラスコ側面に堆積させた。乾燥脂質を、ＯＤＮを含む、２００μｌの平衡塩溶
液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１０ｍｍｏ
ｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中に水和した。リポソームを、攪拌および濾過
によって調整した。精製ＨＶＪ（Ｚ株）を、使用直前に３分間のＵＶ照射によって不活化
した。リポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中でＨＶＪと混合した。この混合物を
４℃で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間穏やかに攪拌した。遊離のＨ
ＶＪを、スクロース密度勾配遠心分離によってＨＶＪリポソームから除去した。スクロー
ス勾配の上層を、使用するために収集した。

（バルーン損傷およびインビボの遺伝子移入）
２つのＦｒｅｎｃｈ Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを使用して、雄性ＳＤラットの血管損
傷を誘導した。これらのラットを、ペントバルビタールで麻酔し、そして左総頚動脈を外
科的に露出させた。カニューレを、外部総頚動脈を介して総頚動脈中に導入した。インビ
ボの遺伝子移入を、挿入したバルーンカテーテルを３回膨脹させることによって、総頚動
脈の血管損傷を誘導した後に、実施した。損傷したセグメントを、一時的結紮によって一
過的に隔離した。バルーン損傷後、ＣＤＥ２Ｆ、Ｍ−Ｅ２Ｆ、ＦＩＴＣ−標識化ＰＳ−Ｅ
２ＦまたはＨＶＪ−リポソームのみのいずれかを含む、２０μｌのＨＶＪ−リポソーム複
合体を、室温にて管腔内で１０分間インキュベートした。１０分間のインキュベーション
後、注入カニューレを除去した。トランスフェクション後、総頚動脈への血流を、結紮の
解放によって回復させ、次いで、創傷を閉じた。有害な神経学的効果も血管の効果も、こ
の手順を受けた全ての動物で観察されなかった。

（ルシフェラーゼアッセイ）
Ｅ２Ｆルシフェラーゼ構築物は、Ｄｒ．Ｙｏｕｎｇｃｈａｅ Ｊａｎｇ（Ｄａｎｋｏｏ
ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｕｎａｎ，Ｋｏｒｅａ）の厚意により提供された。ルシ
フェラーゼ発現を分析するために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして２００μｌの１×
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で溶解
させた。５０μｌの各溶解物を、ルシフェラーゼ活性について試験した。

（組織学的分析）
トランスフェクションの２週間後、ラットを屠殺し、そして血管を４％パラホルムアル
デヒドで灌流固定した。新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）サイズを、サンプルの正体につい
て盲目の個体による形態測定によって定量した。内部領域および中間領域を、デジタル化
システム（モデルＩＮＴＵＯＳ ６ｘ８，Ｗａｃｏｍ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＷＡ，ＵＳ
Ａ）で測定した。ＦＩＴＣ標識Ｅ２ＦデコイＯＤＮトランスフェクションの場合、血管を
、トランスフェクション後の３日目に回収し、そして４％パラホルムアルデヒドで灌流固
定した。切片を、蛍光顕微鏡によって試験した。免疫組織化学について、切片を、ウサギ
抗増殖細胞核抗原抗体（１：２００希釈、ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，
ＣＡ，ＵＳＡ）と共にインキュベートし、そして標準的な様式で免疫組織化学のために処
理した。

（統計的分析）
結果を、平均値±ＳＥＭとして示す。引き続くＤｕｎｃａｎ試験を用いた分散の分析を
使用して、複数の比較における差異の有意差を決定した。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意
とみなした。全ての実験を少なくとも３回実施した。

（結果）
（ＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性）
新たに合成したＣＤ−Ｅ２Ｆの安定性を調査するために、本発明者らは、ヌクレアーゼ
の存在下での分子の安定性を最初に試験した（図８Ｂ）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、予測どおり、
エキソヌクレアーゼＩＩＩに耐性であり、そしてゲル電気泳動において主要なバンドとし
て観察された。ＣＤ−Ｅ２Ｆと対照的に、ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールしたデコイの両方
が、エキソヌクレアーゼＩＩＩとの２時間のインキュベーション後に、完全に分解された
。ＣＤ−Ｅ２Ｆのステムループ構造を確認するために、本発明者らは、Ｓ１ヌクレアーゼ
を使用して、ＣＤ−Ｅ２Ｆの分子特徴をさらに試験した。デコイを、ＤＮＡ分子中の一本
鎖領域を消化するＳ１ヌクレアーゼと共にインキュベートした。ＣＤ−Ｅ２Ｆ（７４塩基
）およびＰＳ−Ｅ２Ｆ（５０塩基）の両方のステム領域は、Ｓ１ヌクレアーゼから保護さ
れるが、アニールした型のデコイのステム領域は保護されないことが見出された（図８Ｂ
）。

エキソヌクレアーゼ活性は、細胞質および血清におけるヌクレアーゼ活性のほとんどを
構成することが報告されている。従って、本発明者らは、熱不活化していない血清とのイ
ンキュベーションによって、デコイの安定性を試験した。デコイを、５０％の非不活化ヒ
ト血清、ＦＢＳまたはウシ血清で２４時間処理した。ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールした型
のデコイの両方が、各血清の存在下での２４時間のインキュベーション後に、有意に加水
分解された。しかし、ＣＤ−Ｅ２Ｆは、これらの異なる血清との２４時間のインキュベー
ション後にほぼインタクトなままであり、ＰＳ−Ｅ２Ｆおよびアニールした型のデコイの
両方と比較して、改善された安定性を示した（図８Ｂ）。

（Ｅ２Ｆの、Ｅ２Ｆ標的部位を有するＣＤ−Ｅ２Ｆに対する特異的結合）
ＣＤ−Ｅ２Ｆの配列特異性を試験するために、インビトロ競合アッセイを実施した。非
標識Ｅ２Ｆデコイの増大は、Ｅ２Ｆタンパク質によって形成される複合体に対応する、遅
延したバンドの強度を減少させた（図９Ａ）。競合物としての非標識ＰＳ−Ｅ２Ｆの１０
００倍モル過剰は、Ｅ２Ｆ結合において、標識プローブに対して完全に競合した。他方で
、ＣＤ−Ｅ２ＦをＰＳ−Ｅ２Ｆの代わりに競合物として使用した場合、１００倍モル過剰
の非標識ＣＤ−Ｅ２Ｆ競合物のみが、標識プローブに対するＥ２Ｆ結合について完全に競
合するのに必要であった。次に、本発明者らは、デコイがＥ２ＦのＤＮＡ結合活性を特異
的に阻害し得るか否かを調べるために、細胞にデコイをトランスフェクトした。予測され
るように、高濃度のグルコースおよび血清を含む馴化培地における培養は、コントロール
培地中での培養と比較して、Ｅ２Ｆ結合活性が有意に増大していた（図９Ｂ、ｐ＜０．０
１）。ＰＳ−Ｅ２ＦおよびＣＤ−Ｅ２Ｆのトランスフェクションは、高濃度のグルコース
および血清によって誘導されるＥ２Ｆ ＤＮＡ結合活性を有意に減弱させた（ｐ＜０．０
１）。しかし、高濃度のグルコースおよび血清によって誘導されるＥ２Ｆ ＤＮＡ結合活
性の増大は、ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較して、ＣＤ−Ｅ２Ｆによって強力に阻害された（ｐ＜０
．０５）。

（平滑筋細胞におけるサイクリンプロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの効果）
本発明者らは、プロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの効果を調査するために、レポ
ーター遺伝子構築物を使用した。この構築物は、プロモーター領域中にＥ２Ｆ結合部位を
含む。高濃度のグルコースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーショ
ンに対するＥ２Ｆ結合部位の役割を調査するために、本発明者らは、種々の長さのヒトサ
イクリンＡの５’隣接配列を含む、一連のルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドを
、高濃度のグルコースで処理した平滑筋細胞中にトランスフェクトした。これらのプラス
ミド中で、２つのプラスミド（ｐＣＡ−１３３／＋２０５およびｐＣＡ−１３３／−２）
だけが、有意に減少したルシフェラーゼ活性を示し（図１０Ａ）、そしてｐＣＡ−１３３
／−２構築物（本発明者らが、サイクリンＡプロモーターから２つのＥ２Ｆ結合部位を欠
失させた）の活性は、最低だった。これらのデータは、Ｅ２Ｆ部位が、ＶＳＭＣにおける
高濃度のグルコースによるサイクリンＡプロモーター活性のアップレギュレーションを媒
介することを示す。次に、本発明者らは、レポーター遺伝子プラスミドｐＣＡ−２６６／
＋２０５および［Ｅ２Ｆ］Ｘ４−Ｌｕｃ（これは、プロモーター領域中に４つのＥ２Ｆ結
合部位を含む）のプロモーター活性に対するＥ２Ｆデコイの阻害効果を調査した。予想さ
れるように、Ｅ２Ｆデコイの共トランスフェクションは、高濃度のグルコースおよび血清
によってアップレギュレートされたルシフェラーゼ遺伝子発現を顕著に減弱させた（図１
０ＢおよびＣ、ｐ＜０．０１）。また、ＣＤ−Ｅ２Ｆは、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも有効であり
（ｐ＜０．０５）そしてＭ−Ｅ２Ｆは、ルシフェラーゼ活性の増大を無効にした。

（ＶＳＭＣにおける細胞周期調節遺伝子の発現に対するＥ２Ｆデコイの効果）
本発明者らは、内因性の細胞周期調節遺伝子の発現に対するＥ２Ｆデコイの効果を評価
した。図１１に示されるように、高濃度のグルコースおよび血清は、ヒトＶＳＭＣおよび
ラットＡＳＭＣの両方において、サイクリンＡ遺伝子およびＰＣＮＡ遺伝子の発現を刺激
した（ｐ＜０．０１）。Ｍ−Ｅ２ＦではなくＥ２Ｆデコイのトランスフェクションは、Ｐ
ＣＮＡおよびサイクリンＡの遺伝子発現の減弱を生じた（ｐ＜０．０１）。１８Ｓ ｒＲ
ＮＡ発現は、Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションによって影響されなかった。これらの
遺伝子の発現に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果は、これらの刺激条件下で、ＰＳ−Ｅ２Ｆ
よりも強力であった（ｐ＜０．０５）。

（インビトロのＶＳＭＣ増殖の阻害に対するＥ２Ｆデコイの効果）
バルーン損傷に対する血管の共通の特徴は、ＶＳＭＣの増殖であるので、Ｅ２Ｆデコイ
を、平滑筋細胞の増殖を阻害するその能力について試験した。高濃度のグルコースおよび
血清での処理は、ＷＳＴ細胞計数キットによって評価されるように、コントロールと比較
して、培養初代ヒトＶＳＭＣおよびラットＶＳＭＣの増殖を刺激した（図１２ＡおよびＢ
）。Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションは、高濃度のグルコースまたは血清で刺激され
た細胞と比較して、細胞増殖の有意な阻害を生じた（ｐ＜０．０１）。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、
ほぼ完全に細胞増殖を阻害した（ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５）。

（バルーン損傷したラット頚動脈に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの効果）
本発明者らは、ＨＶＪ−リポソーム法を使用して、ラット頚動脈へのＥ２Ｆデコイのト
ランスフェクションの効率を試験した。ＨＶＪ−リポソーム法を使用する、ＦＩＴＣ標識
Ｅ２Ｆデコイのトランスフェクションは、動脈の全ての層において容易に検出される強い
蛍光を生じた（図１３Ｂ）。従って、本発明者らは、実験の残りについて、ラット頚動脈
へＥ２Ｆデコイをトランスフェクションするために、ＨＶＪ−リポソーム法を使用した。

本発明者らは、ラット頚動脈バルーン損傷モデルにおいてＥ２Ｆデコイを使用して、イ
ンビボ抗原ストラテジーの効果を試験した。図１３に示されるように、Ｍ−Ｅ２Ｆでトラ
ンスフェクトした血管は、トランスフェクション後２週間目で、未処理の血管と類似の新
内膜形成を示した。対照的に、ＰＳ−Ｅ２ＦおよびＣＤ−Ｅ２Ｆの単一の投与は、新内膜
形成の有意な減少を生じた（ｐ＜０．００１）。インビトロのデータと一致して、新内膜
形成に対するＣＤ−Ｅ２Ｆの阻害効果は、ＰＳ−Ｅ２Ｆよりも強力であった（ｐ＜０．０
５）。デコイ処理は、中間領域を変更しなかった。新内膜形成における減少は、トランス
フェクトされた領域に限定された。

ＰＣＮＡの遺伝子は、Ｅ２Ｆ依存性であることが示され、そして元々、その出現が細胞
の増殖状態と相関する核タンパク質として定義された。従って、本発明者らは、ＰＣＮＡ
発現に対するバルーン損傷の効果と、Ｅ２Ｆデコイでの処理がＰＣＮＡ発現を阻害するか
どうかとを試験した。図１４に示されるように、非損傷のコントロール動脈においては、
ＰＣＮＡ染色は存在しなかった。損傷の２週間後、新内膜領域のＰＣＮＡポジティブ細胞
および再増殖する内皮細胞の顕著な増大が存在した。対照的に、Ｅ２Ｆデコイ処理した血
管のＰＣＮＡポジティブ細胞の数は、未処理の血管よりもかなり低かった。

（実施例３：新規ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドの効果）
（ダンベル型デコイＯＤＮの構築）
本発明において使用された、ＮＦκＢ結合部位に対するダンベル型およびホスホロチオ
エート二本鎖ＯＤＮの配列ならびに変異型ＯＤＮは、以下の通りである：ＣＤ−ＮＦ（注
記：コンセンサス配列に下線を付す）、５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＴＴ
ＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＧＣＧＡＡＡＣ−３’（配列番号１５）；ホスホロチオエ
ートＮＦκＢデコイ（ＰＳ−ＮＦ）、５’−ＡＴｓＴＴＡＡＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＴ
ＴＣＴＣＡｓＡｓ−３’（配列番号１６）：変異型Ｅ２Ｆデコイ（Ｍ−ＮＦ）、５’−Ｇ
ＧＡＴＣＣＧＧＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＣＧＡＡＡＣ−
３’（配列番号１７）。ＣＤ−ＮＦは、ステムループ構造を形成することが予測された。
ステムは、各オリゴの両端における相補的配列によって形成される。ステムの５’末端は
、ＢａｍＨＩの酵素部位として６塩基の一本鎖配列５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’を有する。
２つのオリゴ分子を、両方の５’末端で、相補的な６塩基の配列によって連結した。温度
を８０℃から２５℃に低下させながら、ＯＤＮを２時間アニーリングさせた。１単位のＴ
４ ＤＮＡリガーゼを添加し、そして１６℃で２４時間インキュベートして、共有結合し
たダンベル型デコイ分子を生成した。ＣＤ−ＮＦは、２つのループおよび２つのＮＦκＢ
コンセンサス配列を含む１つのステムからなる。

（ＮＦ−κＢデコイ（デコイオリゴヌクレオチド）の合成）
ＤＮＡ合成機で、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドおよびスクランブルデコイオリ
ゴヌクレオチド（ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドと同じ塩基組成であるがランダム
化された配列を有するオリゴヌクレオチド）（これらのヌクレオチド配列は、以下に示さ
れる）を、それぞれ、Ｓ−オリゴヌクレオチドから合成した。これらのヌクレオチドを８
０℃で３０分間加熱し、次いで２時間かけて室温まで冷却させて、二本鎖ＤＮＡを提供し
た。

ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチド
ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣ（配列番号９）
ＧＧＡＡＣＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧ（配列番号１８）
スクランブルデコイオリゴヌクレオチド
ＴＴＧＣＣＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＴＡＧＣＣ（配列番号１９）
ＡＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＴＣＧＧ（配列番号２０）。

（ＣＤ−ＮＦの安定性）
ＣＤ−ＮＦの安定性を試験するために、各々１μｇのＰＳ−ＮＦ、非連結ホスホジエス
テルオリゴおよびＣＤ−ＮＦを、ヒト血清、ＦＢＳ、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＳ
１ヌクレアーゼのいずれかと共にインキュベートした。ＤＮａｓｅ活性を維持するために
、全ての血清を熱不活化せずに使用した。各血清を１００μｌの反応容積中５０％までオ
リゴに添加し、そして３７℃で２４時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１６０
単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）をオリゴに添
加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。オリゴ１μｇ当たり１０単位のＳ１ヌ
クレアーゼ（Ｔａｋａｒａ）をオリゴに添加し、そして２５℃で３０分間インキュベート
した。次いで、これらのオリゴをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、そして１５％
変性ポリアクリルアミドゲルで試験した。

（インビトロ遺伝子移入）
細胞に、新鮮な培養培地を供給し、その一日後に、デコイを添加し、そして各実験の前
にＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄した。細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ
ｉｎ^ＴＭ（モル比；ＤＮＡ：脂質＝１：３）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）と合わせて、５μＭ
のデコイＯＤＮでトランスフェクションした。デコイＯＤＮ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの混
合物を、製造業者の指示に従って細胞に滴下した。これらの細胞を３７℃で５時間インキ
ュベートした。次いで、１０％ ＦＢＳを含む新鮮な培地に交換した後、これらの細胞を
ＣＯ_２インキュベータ中でインキュベートした。

（ＣＤ−ＮＦのセンダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソームの調製）
ＨＶＪ−リポソームを、Ａｈｎ ＪＤら、２００１（前出）に記載されるように調製し
た。簡潔には、コレステロール、ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン、ホスフ
ァチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルセリンを、５０：１３．３：
１３．３：１３．３：１０のモル比で混合した。この脂質混合物を、クロロホルムの除去
によってフラスコの側面に堆積させた。乾燥脂質を、ＯＤＮを含む、２００μｌの平衡塩
溶液（ＢＳＳ；１３７ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、５．４ｍｍｏｌ／ｌ ＫＣｌ、１０ｍｍ
ｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）中に水和した。リポソームを、攪拌および濾
過によって調整した。精製ＨＶＪ（Ｚ株）を、使用直前に３分間のＵＶ照射によって不活
化した。リポソーム懸濁物を、総容量２ｍｌのＢＳＳ中でＨＶＪと混合した。この混合物
を４℃で５分間インキュベートし、次いで、３７℃で３０分間穏やかに攪拌した。遊離の
ＨＶＪを、スクロース密度勾配遠心分離によってＨＶＪリポソームから除去した。スクロ
ース勾配の上層を、使用するために収集した。

（正常なＮＦ−κＢデコイのリポソーム調製物の生成）
１：４．８：２の重量比（合計１０ｍｇ）で提供されたホスファチジルセリン、ホスフ
ァチジルコリンおよびコレステロールを、テトラヒドロフラン中に溶解させた。ロータリ
ーエバポレータを使用して、テトラヒドロフランを脂質溶液から除去して、この脂質をフ
ラスコ壁に接着したフィルムの形態にした。これに、実施例１において調製したＮＦ−κ
Ｂデコイオリゴヌクレオチド（０．７ｍｇ）を含む約２００ｍｌの生理食塩水（ＢＳＳ；
１３９ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６
）を添加し、そしてこの混合物を通常の条件下で攪拌し、超音波処理して、ＮＦ−κＢデ
コイオリゴヌクレオチドを含むリポソーム懸濁物を提供した。このリポソーム小胞の懸濁
物（０．５ｍｌ、脂質含量１０ｍｇ）を、使用の３分前に、ＵＶ照射（１１０ｅｒｇ／ｍ
ｍ^２／秒）に曝露した精製センダイウイルス（Ｚ株１００００血球凝集単位）と混合し、
そしてこの混合物を、ＢＳＳで４ｍｌにした。この混合物を４℃で５分間維持し、次いで
、３７℃で３０分間の穏やかな攪拌に供した。リポソームに結合しなかったセンダイウイ
ルスをスクロース密度勾配遠心によって除去した後、最上層を分離し、そしてその濃度を
ＢＳＳで調節して、捕捉された場合に８μＭのＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオチドを含
むリポソーム調製物を提供した。リポソーム調製物を、ＮＦ−κＢデコイオリゴヌクレオ
チドの代わりに、実施例１のスクランブルデコイオリゴヌクレオチドを使用して同様に生
成した。

（再灌流モデル実験）
（（１）方法）
９〜１０週齢のＳＤラットをペントバルビタールナトリウムで麻酔した後、カニューレ
を、気道に隣接する左頚動脈中に挿入し、そして心臓の大動脈弁の近傍（冠状動脈の口の
近く）に留置した。さらに、気管にカニューレ挿入し、そして動物を、気管カニューレを
人工呼吸器に接続することによって、支持的呼吸においた。その後、左肋間切開を行い、
ラット心臓の左下行前動脈を結紮して、虚血状態を生じた。３０分後、結紮縫合を切断し
て、再灌流を開始した。その直後、１．５ｍｌ／ラットの、上記のように調製した、リポ
ソームに捕捉されたＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦ、Ｍ−ＮＦ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチド
またはスクランブルデコイヌクレオチドを、冠状動脈の口の近くに留置されたカニューレ
を介して、投与した。胸部を閉じた後、気管もまた縫合し、そして動物を生存させた。２
４時間後、このラットを再麻酔し、そして心臓を摘出し、そして生理食塩水で洗浄した。
ラット心臓の心室を、６枚の切片にスライスし、これを、塩化テトラゾリウム（ＴＴＣ）
で染色した。６枚の切片をそれぞれ撮影し、そして画像分析に供した。梗塞領域を、以下
の式によって計算した。
梗塞率（％）＝６枚の切片の梗塞面積の合計／６枚の切片の合計×１００
統計的分析を、多重比較（ＡＮＯＶＡ）によって行った。

（（２）結果）
未処置コントロール群、Ｍ−ＮＦおよびスクランブルデコイ処置群において、心筋梗塞
は、ほぼ等しい程度で見出された。ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイヌク
レオチドを与えられた群において、梗塞は、未処置コントロール群、Ｍ−ＮＦおよびスク
ランブルデコイ処置群から、有意な程度まで抑制される。これらのポジティブ群において
、ＣＤ−ＮＦを与えられた群は、正常なデコイまたはＰＳ−ＮＦよりも、有意により高い
抑制を示す。

類似の阻害効果は、リポソームが梗塞の誘導直前に投与される場合に見出された。

（癌転移の阻害）
（（１）方法）
７週齢のＣ５７ＢＬ／６株の雌性マウスに、１×１０^４のマウス小網細胞肉腫Ｍ５０７
６細胞を静脈内投与し、そして２４時間後、各々０．２ｍｌ（６ｎｍｏｌｅ）の、リポソ
ームに捕捉された、上記と同じ様式で調製された、上記で調製したＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−Ｎ
Ｆ、Ｍ−ＮＦ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチドまたはスクランブルデコイヌクレオチドを
静脈内投与した。コントロール群は、同じ様式で０．２ｍｌの生理食塩水を受けた。Ｍ５
０７６の静脈内注射後１４日目に、動物を剖検し、そして肝臓表面上の腫瘍小節の数を、
立体顕微鏡下で計数した。各群は、１０匹のマウスからなった。統計的分析のために、Ｋ
ｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験およびＤｕｎｎｅｔｔ多重比較を使用した。

（（２）結果）
ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイ処置した群は、Ｍ−ＮＦで処置した群
またはコントロール群よりも腫瘍サイズの抑制における有意な効果を示した。これらのポ
ジティブ群の中で、ＣＤ−ＮＦを受けた群は、正常デコイまたはＰＳ−ＮＦよりも、腫瘍
サイズにおける有意に大きい抑制を示す。

（悪液質の阻害）
（（１）方法）
７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用して、マウス結腸癌系統Ｃｏｌｏｎ ２６の２
ｍｍ立方の腫瘍塊を、皮下移植した。移植後７日目に開始して、０．２ｍｌ（６ｎｍｏｌ
ｅ）のリポソームに捕捉された、上記のように調製したＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦ、Ｍ−Ｎ
Ｆ、ＮＦ−κＢデコイヌクレオチドまたはスクランブルデコイヌクレオチドを、この腫瘍
塊に投与し、そして体重および腫瘍重量を連続的に決定した。動物を１３日目に剖検し、
そして精巣上体脂肪および腓腹筋を単離し、そして計量した。さらに、残りの器官および
腫瘍を全て除いた死体の湿重量を決定した。腫瘍重量を、以下の式によって、各腫瘍塊の
大きい方の直径および小さい方の直径から計算した。
腫瘍重量（ｍｇ）＝大きい方の直径×小さい方の直径^２／２
各群は、１０匹のマウスからなった。統計的分析を、一方向のレイアウトのＡＮＯＶＡ
およびＤｕｎｎｅｔｔ多重比較によって行った。

（（２）結果）
腫瘍保有群において、腫瘍の増殖は、体重、精巣上体脂肪重量、腓腹筋重量および死体
湿重量の有意な増加を生じた。ＣＤ−ＮＦ、ＰＳ−ＮＦおよびＮＦ−κＢデコイ群におい
て、改善が得られる。この改善は、ＰＳ−ＮＦ群またはＮＦ−κＢ群よりも、ＣＤ−ＮＦ
群において有意に高い。しかし、Ｍ−ＮＦ群およびスクランブルデコイ群においては改善
は見出されない。Ｍ−ＮＦ群またはスクランブルデコイ群においては、腫瘍重量に対する
明確な効果は存在しない。

本発明の上記の実施形態の記載は、例示および説明の目的のために提供されている。こ
れらは、網羅的であることも、開示された明確な形態に本発明を限定することも意図せず
、そして上記教示に鑑みて多くの改変およびバリエーションが明らかに可能である。これ
らの実施形態は、本発明の原理およびその実際の適用を最良に説明し、それによって、当
業者が、意図された特定の使用に適切である種々の実施形態で、そして種々の改変を共な
って、本発明を最良に利用することができるようにするために、選択し、記載した。本発
明の範囲は、本明細書に添付される特許請求の範囲によって規定されることが意図される
。本明細書中に引用される全ての参考文献は、本明細書中で参考として援用される。

本発明は、２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴヌク
レオチド（ＣＤＯＤＮ）を提供し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ド
メインと結合し得るヌクレオチド配列を含む。本発明はさらに、このＣＤＯＤＮを含む薬
学的組成物を提供する。この薬学的組成物は、このような転写因子に関する疾患または傷
害を処置および／または予防するために使用され得る。本発明はまた、このような転写因
子に関する疾患または傷害を処置および／または予防するための方法を提供し、この方法
は、治療有効量の、２つのループ構造および１つのステム構造を備えるＣＤＯＤＮを被験
体に投与する工程を包含し、ここで、このステム構造は、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン
と結合し得るヌクレオチド配列を含む。

さらに、本発明は、転写因子ＡＰ−１のトランス活性化能力を阻害することによる、血
管形成術後の再狭窄の処置のための方法および組成物を提供する。これらの組成物および
方法は、血管障害の処置において有用である。

本発明はまた、転写因子ＡＰ−１およびＥ２Ｆに対する新規の環状ダンベルオリゴヌク
レオチドデコイ（ＣＤＯＤＮ）を提供し、これは、ＡＰ−１およびＥ２Ｆ関連の傷害の処
置およびこれらの転写因子の細胞での役割を解明する際に有用である。

図１は、ＡＰ−１デコイＯＤＮの構造および分子安定性を示す。［Ａ］ＡＰ−１デコイＯＤＮの構造。ＣＤＯＤＮは、２つの共有結合した同一のステム−ループ分子から作製される。従って、ＣＤＯＤＮは、そのステム領域にＡＰ−１に対する２つの結合部位を有する。［Ｂ］エキソヌクレアーゼＩＩＩ（左パネル）、Ｓ１ヌクレアーゼ（左パネル）、または血清（右パネル）の存在下でのデコイＯＤＮの安定性試験。ＥｘｏＩＩＩ；エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理したデコイＯＤＮ、Ｓ１；Ｓ１ヌクレアーゼで処理したデコイＯＤＮ、ＣＳ；仔ウシ血清、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｌ；連結前のＣＤＯＤＮのアニールした形態。 図２は、ＡＰ−１のＤＮＡ結合活性におけるＣＤＯＤＮの効果を示す。［Ａ］競合アッセイ。種々の濃度の未標識オリゴヌクレオチドの存在下で、標識化プローブとＡＰ−１タンパク質との間でＡＰ−１複合体を形成させた。［Ｂ］ＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣからのゲルシフトアッセイの代表例。この実験を５回繰り返した。ＮＧ；標準のグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、ＨＧ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。ＥＭＳＡ結果の定量化を５回の独立の実験の平均値±ＳＥＭとして表した。^＊ＮＧと比較してｐ＜０．００１、^†ＨＧと比較してｐ＜０．０１、^§ＮＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、^¶ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１。 図３は平滑筋細胞における遺伝子発現に対するＣＤＯＤＮの効果を示す。［Ａ］細胞を、平滑筋にて高濃度グルコース条件下で、デコイＯＤＮとサイクリンＡプロモーターの連続欠失体または変異体とを同時トランスフェクトした。^＊ｐＣＡ−２６６／＋２０５と比較してｐ＜０．００１_、 ^†ｐＣＡ−１３３／＋２０５と比較してｐ＜０．００１。［Ｂ］および［Ｃ］細胞を、デコイＯＤＮ、とプラスミドＡＰ１（ＰＭＡ）−ＴＡ−Ｌｕｃ（Ｂ）またはｐＣＡ−２６６／＋２０５（Ｃ）とを同時トランスフェクトした。デコイＯＤＮの活性は、ルシフェラーゼ活性をダウンレギュレートする能力に反映する。値は、β−ガタクトシダーゼ活性による正規化後の６回の独立した実験の平均値±ＳＥＭである。^＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、^†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、^‡ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、［Ｄ］代表的なノーザンブロット解析。サイクリンＡ（上のパネル）およびＰＣＮＡ（下のパネル）の遺伝子発現をＲＡＳＭＣ（左パネル）またはＨＶＳＭＣ（右パネル）のノーザンブロッティングによって測定した。Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。 図４は、ＨＶＳＭＣ（Ａ）およびＲＡＳＭＣ（Ｂ）における細胞増殖の阻害に対するＣＤＯＤＮの効果を示す。増殖活性は、６回の測定値の平均値±ＳＥＭである。ＨＶＳＭＣ（Ｃ）およびＲＡＳＭＣ（Ｄ）における細胞遊走に対するＣＤＯＤＮの効果。フィルターの低い方の表面上で、４つのランダムに選択した強拡（×４００）場での平均細胞数を計数した。各実験を三連で行い、４回の独立した実験を行った。遊走活性は平均値±ＳＥＭである。Ｎ；正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ：１００ｎｍｏｌ／ｌのＡＰ−１デコイＯＤＮでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳＯＤＮ、Ｄ；ＣＤＯＤＮ、Ｍ；ミスマッチＡＰ−１デコイＯＤＮ。^＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、^†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０５、^‡ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１。 図５は、ラット頚動脈のバルーン損傷後の新内膜形成についてのＡＰ−１デコイＯＤＮの効果を示す。（Ａ）＋（Ｂ）左総頚動脈の蛍光顕微鏡法：ＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのみで処理した（Ａ）か、またはＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを有するＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮで処理した（Ｂ）：（Ｃ）〜（Ｇ）コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ｃ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｄ）、（Ｅ）〜（Ｇ）ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法を用いてＭＯＤＮ（Ｅ）、ＰＳＯＤＮで（Ｆ）、およびＣＤＯＤＮで（Ｇ）で処理したバルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面。（Ｈ）ＡＰ−１デコイＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比。棒は、試験した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の新内膜／中膜比を表す。値は、平均値±ＳＥＭである。^＊バルーン損傷した動脈と比較してｐ＜０．０１、^†ＰＳＯＤＮ処理した動脈と比較してｐ＜０．０５。 図６は、損傷した頚動脈における新内膜形成の阻害へのＣＤＯＤＮ処理時点の効果を示す。（Ａ）〜（Ｅ）コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ａ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｂ）、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法を使用してＭＯＤＮの前処理をした左総頚動脈の横断面（Ｃ）、ＣＤＯＤＮの前処理をした左総頚動脈の横断面（Ｄ）、およびＣＤＯＤＮの後処理をした左総頚動脈の横断面（Ｅ）。（Ｆ）ＡＰ−１デコイＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比。棒は、研究した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の新内膜／中膜比を表す。値は、平均値±ＳＥＭ。^＊バルーン損傷動脈と比較してｐ＜０．００５、^†ＣＤＯＤＮで前処理した動脈と比較してｐ＜０．０１、^‡ＣＤＯＤＮで後処理した動脈と比較してｐ＜０．０１。 図７Ａは、動脈抽出物におけるＡＰ−１結合活性の分析を示す。損傷後に示された時点での頚動脈からの細胞の核抽出物を用いてゲル移動度シフトアッセイを行った（ｎ＝１０）。バルーン損傷の前（ＣＤＯＤＮ前処理した）または後（ＣＤＯＤＮ後処理した）に、２０μｌのＣＤＯＤＮを含むＨＶＪ−リポソーム複合体を室温にて管腔内で１０分間インキュベートした。図７Ｂは、バルーン損傷後のラット頚動脈におけるＰＣＮＡ発現を示す。コントロール血管のＰＣＮＡ染色（１）、バルーン損傷した血管のＰＣＮＡ染色（２）、ＭＯＤＮで前処理した動脈のＰＣＮＡ染色（３）、ＣＤＯＤＮで前処理した動脈のＰＣＮＡ染色（４）およびＣＤＯＤＮで後処理した動脈のＰＣＮＡ染色（５）。ＰＣＮＡ陽性細胞は、茶色がかった黒に見える。全ての図は、４００×の拡大率である。 図８は、Ｅ２Ｆデコイの構造および分子安定性を示す。［Ａ］ＣＤ−Ｅ２Ｆ分子を形成するために共有結合された２つの同一のステム−ループから構成されるＥ２Ｆデコイの構造。ＣＤ−Ｅ２Ｆは、そのステム領域上のＥ２Ｆに対する２つの結合部位からなる。［Ｂ］エキソヌクレアーゼＩＩＩ（左パネル）、Ｓ１ヌクレアーゼ（左パネル）または血清（右パネル）の存在下でのデコイの安定性。略語：ＥｘｏＩＩＩ；エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理したデコイ、Ｓ１：Ｓ１ヌクレアーゼで処理したデコイ、ＣＳ；仔ウシ血清、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、およびＬ；連結前のＣＤ−Ｅ２Ｆのアニールした形態。 図９は、Ｅ２ＦのＤＮＡ結合活性についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。［Ａ］種々の濃度の未標識のＯＤＮの存在下での標識化プローブとＥ２Ｆタンパク質との間に形成されるＥ２Ｆ複合体の量。［Ｂ］ゲルシフトアッセイの代表例をＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣについて示す。この実験を６回繰り返した。略語：ＮＧ；正常のグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）、ＨＧ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、およびＭ：Ｍ−Ｅ２Ｆ。ＥＭＳＡの結果を５回の別の実験の平均値±ＳＥＭとして表す。統計的有意差を以下のように決定した：^＊ＮＧと比較してｐ＜０．００１、^†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、^‡ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。 図１０は、平滑筋細胞における細胞周期関連遺伝子のプロモーター活性についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。（Ａ）ＶＳＭＣを、高濃度グルコース条件下で、デコイと、サイクリンＡプロモーターの連続欠失体または変異体構築物とを同時トランスフェクトした。統計的有意差を以下のように決定した：^＊ｐＣＡ−２６６／＋２０５と比較してｐ＜０．０１、^†ｐＣＡ−１３３／＋２０５と比較してｐ＜０．０１。ＶＳＭＣを、デコイと、プラスミドｐＣＡ−２６６／＋２０５（Ｂ）または［Ｅ２Ｆ］×４−Ｌｕｃ（Ｃ）とを同時トランスフェクトした。デコイの活性は、ルシフェラーゼ活性をダウンレギュレートする能力に反映される。値をβ−ガラクトシダーゼ活性の正規化後の５回の別の実験の平均値±ＳＥＭで表す。統計的有意差を以下のように決定した：^＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、^†ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．００１、^‡ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。略語：Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦのデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ：ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。 図１１は、ＶＳＭＣにおける遺伝子発現についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。（Ａ）代表的なノーザンブロット解析。ＲＡＳＭＣ（ＢおよびＤ）またはＨＶＳＭＣ（ＣおよびＥ）におけるサイクリンＡ（ＢおよびＣ）およびＰＣＮＡ（ＤおよびＥ）の遺伝子発現を、濃度測定分析を用いて定量化した。略語：Ｎ；正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ；高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。値は、５回の別の実験の平均値±ＳＥＭを表す。統計的有意差を以下のように決定した：^＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、^＃ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、^＃＃ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。 図１２は、ＨＶＳＭＣ（Ａ）およびＲＡＳＭＣ（Ｂ）における細胞増殖の阻害についてのＣＤ−Ｅ２Ｆの効果を示す。増殖活性は６つの測定値の平均値±ＳＥＭである。デコイを平滑筋細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２〜３日後、ＷＳＴ細胞計数キットを使用して細胞増殖の指数を決定した。統計的有意差を以下のように決定した：^＊ＮＧと比較してｐ＜０．０１、^＃ＨＧ＋１０％血清と比較してｐ＜０．０１、および^＃＃ＰＳ−Ｅ２Ｆと比較してｐ＜０．０５。略語：Ｎ：正常なグルコース（５．５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、Ｈ：高濃度グルコース（２５ｍｍｏｌ／ｌ Ｄ−グルコース）と共に培養したＶＳＭＣ、デコイＯＤＮ；１００ｎｍｏｌ／ｌのＥ２ＦデコイでトランスフェクトしたＶＳＭＣ、Ｐ；ＰＳ−Ｅ２Ｆ、Ｄ；ＣＤ−Ｅ２Ｆ、Ｍ；Ｍ−Ｅ２Ｆ。 ラット頚動脈におけるバルーン損傷後に生じる新内膜形成についてのＥ２Ｆデコイの効果。図は、ＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮのみ（Ａ）か、またはＨＶＪ−リポソームを有するＦＩＴＣ−標識化ＯＤＮ（Ｂ）で処理した左総頚動脈の蛍光顕微鏡法を図示する。コントロールラットの左総頚動脈の横断面（Ｃ）、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｄ）、ＨＶＪ−リポソーム法を使用してＰＳ−Ｅ２Ｆを伴う、バルーン損傷の１４日後の左総頚動脈の横断面（Ｅ）、ＨＶＪ−リポソーム法およびＣＤ−Ｅ２Ｆを伴う左総頚動脈の横断面（Ｆ）、またはＨＶＪ−リポソーム法およびＭ−Ｅ２Ｆを伴う左総頚動脈の横断面（Ｇ）を示す。Ｅ２Ｆデコイを含むＨＶＪ−リポソームでトランスフェクトした群における左頚動脈の内膜領域／中膜領域の平均比を示す（Ｈ）。棒は、試験した動物の各群（ｎ＝１０）からのバルーン損傷後の総頚動脈の、新内膜／中膜の比を表す。値は、平均値±ＳＥＭで表し、以下のように統計的有意差を決定した：^＊バルーン損傷した動脈と比較してｐ＜０．０１、^＃ＰＳ−Ｅ２Ｆ処理した動脈と比較してｐ＜０．０５。元の倍率の１００×（ＡおよびＢ）および２５×（Ｃ〜Ｇ）。スケールバーは、２００μｍを表す。 図１４は、バルーン損傷後のラット頚動脈におけるＰＣＮＡ発現を示す。コントロール血管（Ａ）、バルーン損傷した血管（Ｂ）、Ｍ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｃ）、ＰＳ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｄ）およびＣＤ−Ｅ２Ｆで処理した動脈（Ｅ）のＰＣＮＡ染色。ＰＣＮＡ陽性細胞は、茶色がかった黒に見える。全ての図は、２００×の拡大率である。スケールバーは、５０μｍを表す。

Claims (21)

1. ２つのループ構造および１つのステム構造を備える環状ダンベルオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＤＯＤＮ）であって、該ステム構造が、転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、ＣＤＯＤＮであって、該転写因子がＡＰ−１であり、該ヌクレオチド配列がＴＧＡＣＴＣＡであるか、または該転写因子がＥ２Ｆであり、該ヌクレオチド配列がＴＴＴＣＧＣＧＣである、ＣＤＯＤＮ。
2. 酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有する、請求項１に記載のＣＤＯＤＮ。
3. いかなる化学改変されたヌクレオチドも含まない、請求項１または２に記載のＣＤＯＤＮ。
4. 前記ステム構造が、２つ以上の転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載のＣＤＯＤＮ。
5. 前記相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号３の配列である、請求項２に記載のＣＤＯＤＮ。
6. 前記相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号２１（GAATTCATGACTCAGAAGACGAAAACGTCTTCTGAGTCAT）である、請求項２に記載のＣＤＯＤＮ。
7. 前記相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号６の配列である、請求項２に記載のＣＤＯＤＮ。
8. 被験体において、転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、治療有効量の２つのループ構造および１つの該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含むステム構造を備えたＣＤＯＤＮ、ならびに薬学的受容可能キャリアを含有する、薬学的組成物であって、該転写因子がＡＰ−１であり、該ヌクレオチド配列がＴＧＡＣＴＣＡであるか、または該転写因子がＥ２Ｆであり、該ヌクレオチド配列がＴＴＴＣＧＣＧＣである、薬学的組成物。
9. 前記薬学的受容可能キャリアが、ＨＶＪ−リポソーム組成物である、請求項８に記載の薬学的組成物。
10. 前記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、請求項８または９に記載の薬学的組成物。
11. 前記ＣＤＯＤＮは、請求項２〜４のいずれかに記載の特徴をさらに有する、請求項８〜１０のいずれかに記載の薬学的組成物。
12. 前記ＣＤＯＤＮが酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有し、該相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号３の配列である、請求項８に記載の薬学的組成物。
13. 前記ＣＤＯＤＮが酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有し、該相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号２１（GAATTCATGACTCAGAAGACGAAAACGTCTTCTGAGTCAT）である、請求項８に記載の薬学的組成物。
14. 前記ＣＤＯＤＮが酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有し、該相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号６の配列である、請求項８に記載の薬学的組成物。
15. 被験体において転写因子に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬品の製造における、治療有効量の２つのループ構造および１つのステム構造を備えたＣＤＯＤＮの使用であって、ここで、該ステム構造は、該転写因子のＤＮＡ結合ドメインに結合し得るヌクレオチド配列を含む、使用であって、該転写因子がＡＰ−１であり、該ヌクレオチド配列がＴＧＡＣＴＣＡであるか、または該転写因子がＥ２Ｆであり、該ヌクレオチド配列がＴＴＴＣＧＣＧＣである、使用。
16. 前記医薬品が、ＨＶＪ−リポソーム組成物の形態である、請求項１５に記載の使用。
17. 前記疾患または障害が、炎症性腸疾患を含む、請求項１５または１６に記載の使用。
18. 前記ＣＤＯＤＮは、請求項２〜４のいずれかに記載の特徴をさらに有する、請求項１５〜１７のいずれかに記載の使用。
19. 前記ＣＤＯＤＮが酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有し、該相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号３の配列である、請求項１５に記載の使用。
20. 前記ＣＤＯＤＮが酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有し、該相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号２１（GAATTCATGACTCAGAAGACGAAAACGTCTTCTGAGTCAT）である、請求項１５に記載の使用。
21. 前記ＣＤＯＤＮが酵素的連結によって共有結合する２つの相同なステムループ構造を有し、該相同なステムループ構造のそれぞれの配列が、配列番号６の配列である、請求項１５に記載の使用。

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