JP2009042031A - 電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 必要とする核酸試料を全て回収することができ、他の核酸試料の混入を防ぐことができる電気泳動装置を提供する。
【解決手段】 生体高分子を電気泳動により移動させるための支持体が配置される電気泳動槽１０と、支持体中を電気泳動させた後の生体高分子を切り出すため、支持体に対して相対的に移動されて、指定された位置の生体高分子を支持体とともに、矩形形状の断面で切り出してその内部に留置する切り出し器具２０と、切り出し器具２０を着脱自在に取り付ける前記切り出し手段６２と、を備え、電気泳動が行われる支持体の平面に対して垂直なＺ軸の回りに、切り出し器具２０を回転させ、切り出し器具２０と支持体との相対的な位置を微調整する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生体高分子、とりわけ核酸を分析するための電気泳動装置に関するものであり、より詳細には、電気泳動装置により核酸を分子量毎に分離し、電気泳動の支持体より核酸の切り出し及び回収する技術に関する。

従来、電気泳動装置を用い、生体高分子とりわけ核酸の分子量に基づいた分離、解析を行う技術は、簡便かつ安価であると共に分析精度も高いため、広範囲に利用されている。以下、核酸の電気泳動に関して述べる。

従来の電気泳動装置は、緩衝液の入れられた電気泳動槽の両端に電圧を印加する電極を配置し、さらにこの電気泳動槽内に、核酸試料が移動する支持体を設置して構成されている。この電気泳動の支持体としては、アガロースあるいはポリアクリルアミドなどのゲル状物質が使用されている。また装置の形態としては、直方体形状の支持体の取り扱いを容易にするため、電気泳動が行われる平面が水平になるように支持体を設置する水平方式の電気泳動装置が汎用されている。

電気泳動の動作は、支持体の一端に形成した溝に核酸試料を滴下し、支持体の両端に電圧を印加させ、支持体中の核酸試料を電気的に移動させる。この時に支持体の網目構造により核酸試料の移動が制約を受け、分子量が大きい程、移動度が遅くなることにより、核酸の分子量に基づいた分離が可能となる。

さらにこのようにして分離した核酸を支持体より核酸画分毎に切り出し、ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎとＧｉｌｌｅｓｐｉｅの方法（非特許文献１）あるいはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法（非特許文献２）などの適当な方法で核酸を抽出回収することにより、核酸試料からの不純物質の分離除去、ベクターへの組み込み、配列マッピングなどへ利用されている。

なお、この核酸分画を抽出回収する方法としては、電気泳動装置を利用する方法以外にも高速液体クロマトグラフィーに代表されるカラムクロマトグラフィーを利用する方法などがあるが、核酸の分離精度に対する装置の簡便性、融通性、装置価格、維持費用などを勘案した場合、電気泳動装置による方法は極めて高効率であるため、専ら核酸画分の抽出回収には電気泳動による方法が利用されている。

次に電気泳動により分離した核酸の検出方法については、臭化エチジウム等の核酸結合性蛍光試薬を電気泳動前に予め支持体中に混合しておくか、あるいは電気泳動後、支持体をこれらの溶液中に浸漬し、支持体中に浸潤させておおくことで、支持体中の核酸試料とこの蛍光試薬を結合させた後、蛍光試薬を紫外線により励起し、蛍光発色させて、支持体中の分離した核酸試料を可視化させる（この紫外線を照射する装置はトランスイルミネーターと呼ばれている）。

この紫外線照射により可視化した核酸試料の結果は、従来、フィルム式カメラを利用した画像撮影によりデータを取得していたが、近年の電子デバイスの進歩と共に電荷結合素子（ＣＣＤ）式カメラを採用した画像撮影装置により、画像をデジタル化することが可能となる。ＣＣＤ式のものはフィルム式に比べ、撮影の簡便性、データの保存性およびコンピュータ等のデジタルデバイスとの親和性が高く、電気泳動の短時間化と共に一連の電気泳動手技の作業効率向上に貢献している。

さらに近年、電気泳動装置と画像撮影装置を一体化させて、電気泳動のリアルタイムモニタリングが提案されており、電気泳動による最適な核酸分離分析及び画像の取得を可能にしている。

電気泳動により分離した核酸の支持体からの抽出回収については、従来、鋭利な刃物を利用して支持体より目的の核酸画分を切り出し、上述した適当な方法により核酸を抽出回収していたが、近年、機械的に支持体より核酸分画を切り出す装置および抽出回収装置（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３参照）が提案され、従来のマニュアル操作によるものに比べ、作業効率を大幅に向上している。
特開平９−１５２０６号公報 特開２０００−８８８０４号公報 特開平７−１３２０７９号公報 ヴォーゲルステイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ．Ｂ．），ギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ．Ｄ．）、「 米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」、７６巻、６１５−６１９頁、１９７９年 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（モレキュラークローニング）第２版、６．２２−６．３５頁、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｊ．），フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ．Ｅ．Ｆ．），マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｔ．）編、コールドスプリングハーバー研究所出版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）刊、１９８９年

しかしながら、上記従来の電気泳動装置、特に、電気泳動後の支持体から核酸画分の切り出しを作業者によるマニュアル操作で行う装置の場合、作業者は専ら鋭利なナイフを利用して切り出すため、紫外線を直視しながら操作する必要がある。このとき、紫外線の暴露から作業者を保護する保護具を着用するが、通常、紫外線ランプには、紫外光以外にも紫色可視光を混合させているため、高光量の紫色可視光を直視しなければならず、作業者に重篤な眼性疲労を誘引する原因となっている。また、作業中は紫外線を照射し続ける必要があるため、核酸分子の部分断絶、核酸分子に存在する塩基であるチミン同士の重合（チミンダイマー）形成を回避できない。このため、支持体からの核酸の抽出回収に不適であるという課題を有していた。

また、支持体からの核酸画分の切り出しから、回収までの一連の作業を自動化した上記従来の電気泳動装置では、切り出し器具を自動的にチャッキングした後、切り出し器具の開口部を支持体に押し当て、切り出し器具内に支持体を保持することで抽出回収を行う。

しかしながら切り出し器具をチャッキングするとき、切り出し器具が装置に対して正規の位置に取り付けられず、若干の位置ずれが生じてしまったならば、切り出し器具の開口と必要とする画分との位置関係がずれてしまい、画分の全てを回収することができず、支持体に必要な画分が残留する。また、必要とする画分と他の画分が近接していた場合、これらの他の画分が混入するという課題を有していた。

本発明は、上記従来の課題を解決するもので、電気泳動後の支持体から核酸画分を抽出回収する際に、画分に対する切り出し器具の取り付け位置を最適に調整できるようにした電気泳動装置を提供することを目的とする。

上記従来の課題を解決するために、本発明の電気泳動装置は、生体高分子を電気泳動により移動させるための支持体が配置される電気泳動槽と、前記支持体中を電気泳動させた後の生体高分子を切り出すため、前記支持体に対して相対的に移動されて、指定された位置の生体高分子を前記支持体とともに、矩形形状の断面で切り出してその内部に留置する切り出し器具と、前記切り出し器具を着脱自在に取り付ける前記切り出し手段と、を備え、電気泳動が行われる前記支持体の平面に対して垂直な軸の回りに、前記切り出し器具または支持体を回転させ、切り出し器具と支持体との相対的な位置を微調整することを特徴とするものである。

本発明の電気泳動装置によれば、切り出し器具のチャッキング時に正規の取り付け位置からずれてしまったとしても、切り出すべき支持体の画分との位置関係を微調整できるため、必要とする核酸試料を全て回収することができ、他の核酸試料の混入を防ぐことができる。

以下に、本発明の電気泳動装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、本発明の一実施の形態における電気泳動装置の概略構成を示した図である。この装置は、Ｙ軸方向に駆動可能なテーブル機構４０と、Ｘ軸方向に駆動可能なキャリッジ機構６０とを備えている。テーブル機構４０の上部には、電気泳動槽１０及び切り出し器具ホルダー３０が設置される。これら電気泳動槽１０と切り出し器具ホルダーとは、テーブル機構４０と一体となりＹ軸方向に移動される。

電気泳動槽１０の両端には白金線等の電極１０５，１０６（図３参照）を備えており、電気泳動槽１０に設置された電気泳動用ゲル１０１（支持体の例として用いた）に対し、電極に電圧を印加することにより、電気泳動を実施する。切り出し器具ホルダー３０には、複数の切り出し器具２０が収容される。

キャリッジ機構６０は、画像撮影手段６１と電気泳動槽１０の電気泳動用ゲル１０１の設置面に対して垂直なＺ軸方向に駆動可能な切り出し手段６２を一体として有し、テーブル機構４０の直上に位置する。鏡面１０８（図３参照）は、画像撮影手段６１により、切り出し手段６２を撮影できる位置に設置される。

ここで、切り出し器具２０の切り出し手段６２への脱着方法について説明する。図２は、電気泳動装置のキャリッジ機構６０の斜視図である。切り出し手段６２の先端にはチャッキング部６３があり、切り出し器具２０の上端に開口する接続部２１内に嵌合することにより、切り出し手段６２に把持される。切り出し手段６２はモータ６４によりＺ軸方向に駆動する。

切り出し作業は、下端が開口した切り出し器具２０を電気泳動用ゲル１０１に押しつけることで、電気泳動によって分離された核酸試料を電気泳動用ゲル１０１と共に切り出す。また、切り出し器具２０を切り出し手段６２から取り外す方法は、切り出し手段６２をＺ軸方向にさらに上昇させるようにモータ６４を駆動させる。これにより、ストッパー６５に切り出し器具２０の接続部２１が押し当てられ、チャッキング部６３から切り出し器具２０は取り外される。この操作を切り出し器具ホルダー３０の開口上で行うことにより、切り出し器具２０の回収が行われる。切り出し器具２０はＺ軸回りに回転機構６６により回転することができ、その取り付け位置を微調整することができる。

以上のように構成された電気泳動装置について、以下その動作及び作用を説明する。図３は、本発明の電気泳動装置のテーブル機構４０の斜視図である。

まず、電気泳動槽１０内に支持体として電気泳動用ゲル１０１を設置する。電気泳動用ゲル１０１の一端に設けた注入口１０２に核酸試料を注入した後、ゲルの両端に設置された１対の電極１０５，１０６間に規定の電圧を印加する。電圧を印加することで負に帯電している核酸試料は陰極から陽極方向に向かって移動を開始する。ゲル内部は微細な網目状となっており、ゲル内部を移動する核酸試料はその分子量の大きさによって移動する速度が異なるため、一定時間の電圧を加えたゲル内部では、分子量に基づいて、ゲルの注入口とほぼ同じ長さを長辺とした矩形形状が並んで分布した状態に分離される。この矩形形状の短辺は、注入した核酸試料中の、ある分子量を中心に分布している核酸試料の分布幅となる。このとき核酸試料に紫外線を照射すると、核酸試料に予め混合しておいた臭化エチジウムなどの核酸結合性蛍光試薬が蛍光発色する。この蛍光を画像撮影手段６１にて撮影することで核酸試料が分子量に基づいて矩形形状に分離している電気泳動パターンの画像を得ることが出来る。なお、ここでは電気泳動パターンを得るために、電気泳動を実施する一例を示したが、予め電気泳動を実施したゲルを電気泳動槽１０に設置しても、紫外線を照射し撮影することで、電気泳動パターンを得ることができる。

撮影を実施した核酸試料を更に後の分析にて使用する際には、ゲルの切り出しによる核酸試料の抽出が必要となる。本発明による電気泳動装置においては、撮影された電気泳動パターン画像を元に、目的とする核酸試料が含まれる核酸画分を判断するようになる。その方法として、画像処理による自動検出、もしくは、ＣＲＴや液晶モニタといった表示手段に表示された電気泳動パターンの画像を元に、作業者が手動で切り出しを行う位置を、マウスやキーボートによる座標入力といった入力手段により入力するといった方法が提供される。

切り出し作業は、キャリッジ機構６０が切り出し器具ホルダー３０に予め収納された切り出し器具２０の直上まで移動し、チャッキング部６３により切り出し器具２０を把持する。このとき、回転機構６６により切り出し器具２０の取り付け位置を調整する。次に、テーブル機構４０とキャリッジ機構６０を駆動して、指定された場所に切り出し器具２０が位置するように切り出し手段６２を移動させる。この位置において、切り出し手段６２を作動させ、把持している切り出し器具２０をゲルに押し付け、ゲルの切り出しを行う。切り出し器具２０内部に切り出されたゲルが留まった状態となった後、切り出し器具ホルダー３０の直上の位置に切り出し器具２０を移動させ、内部にゲルを留置した状態の切り出し器具２０を切り出し手段６２から外して、切り出し器具ホルダー３０に切り出し器具２０を回収させる。さらに別の部分のゲルを切り出す場合には、再度、切り出し器具ホルダー３０に収納されている、別の切り出し器具２０を把持させ、同様の切り出し動作を繰り返し行うようにする。

図４は、切り出し器具２０の詳細図を示す。切り出し器具２０はチャッキング部６３にて把持される接続部２１と、切り出し手段６２をＺ軸方向に駆動させることで電気泳動によって分離された核酸画分を電気泳動用ゲル１０１の一部と共に切り出すための下端に開口を有する切り出し部２２と、切り出したゲルを保持する直方体形状の支持体収納部２３を有している。

切り出し手段６２により、切り出し器具２０を電気泳動用ゲル１０１に押し付けるよう操作すると、切り出されたゲルは支持体収納部２３に収納される。このとき、切り出しの対象となる核酸画分は矩形形状であり、必要な画分と他の画分が近接している場合があるため、切り出し部２２は切り出しの対象となる画分と同形状が望ましいが、漏れなく確実に必要とする画分を抽出回収するためには、対象となる画分よりやや大きい矩形形状とする必要がある。

なお、切り出し器具２０の切り出し手段６２に対する取り付け位置が依存しない、切り出し部２２の形状が円形のものを使用することが考えられるが、必要な画分と他の画分が近接している場合には、他の画分の混入が発生しやすく、装置として実施することのできる抽出回収作業の限界を制限することとなる。従って、切り出し部２２は必要最小限となる矩形形状であることが望ましい。

図５は、切り出し器具２０による電気泳動パターンに対する抽出回収動作を詳細に説明するものである。図５（ａ）に示すように、切り出し部２２が必要な画分１０３を包含した状態で抽出回収作業を行うと、確実に必要とする画分を得ることができる。しかしながら、必要な画分１０３に対して切り出し部２２がＺ軸回りに回転し、正規の取り付け位置からずれて取り付けられていると、図５（ｂ）に示すように、画分１０３の一部が電気泳動用ゲル１０１に残留することとなる。もしくは、図５（ｃ）に示すように、近接している不必要な他の画分１０７と共に抽出回収を行うこととなり、核酸試料の混入が発生する。

そこで、切り出し手段６２に調整機構として図２で説明した回転機構６６を備え、電気泳動用ゲル１０１の電気泳動パターンと切り出し器具２０の切り出し部２２が最適となるように調整する。図５（ｂ）及び図５（ｃ）のような状態を解消するために、切り出し器具２０を回転させ、画分１０３を完全に包含するよう調整する回転機構６６を切り出し手段６２に備えるようにする。なお、上記では切り出し器具２０を回転調整する例を示したが、テーブル機構４０もしくは電気泳動槽１０を回転させるようにしても同様の効果が得られる。

ここで、調整機構の調整量を算出する手法として、画像撮影手段６１により切り出し部２２を撮影し、ここで得られた画像情報と、電気泳動パターンにより、調整量を算出するようにする。このとき、切り出し部２２を撮影する方法として、鏡面１０８の直上に切り出し器具２０を移動させ、鏡面１０８に映った切り出し部２２を撮影する方法や、別の画像撮影手段を用意し、その画像撮影装置によって切り出し部２２を撮影する方法が考えられる。切り出し器具２０の調整は、切り出し部２２を撮影することにより得られた画像から、矩形状である切り出し部２２の開口部の長辺と、画分１０３の長辺が平行となるようにすることで行われる。

以上のように、本実施の形態においては、切り出し器具の切り出し部の画像撮影を実施し、必要とする核酸画分を包含できるようその取り付け位置を微調整することにより、貴重な検体の支持体への残留及び、他の核酸試料の混入を防ぐことができる。

（実施の形態２）
図６は、本発明の他の実施の形態における電気泳動装置の切り出し作業の模式図を示す。ここでは前記した微調整の調整量を算出する手法と異なる手法を提供するものである。なお、主たる構成は実施例１において、図１から図４により示したものと同様であり、切り出し器具２０もしくはテーブル機構４０、電気泳動槽１０を回転させることにより、必要な画分の全てを回収し、他の画分の混入を防ぐようにする目的も同様である。そこで、必要となる画分の抽出回収作業を行う前に、予めダミーの作業として、ゲルの抽出回収作業をさせ、それにより電気泳動用ゲル１０１に空隙１０４を形成させる。この後に画像撮影手段６１にて撮影作業を行うことにより、その画像情報を基に調整量を算出することができる。切り出し器具２０の調整は、前述した切り出し部２２を撮影することにより得られた画像を用いる方法と同様に、形成した空隙１０４の長辺と、画分１０３の長辺が平行となるようにすることで行われる。このとき、予め行うゲルの抽出回収作業領域は、注入口１０２から電気泳動によって移動する核酸試料が移動しうる領域でないことが望ましい。この領域で作業を行うことで、切り出し器具２０に付着するゲルには核酸成分が含まれず、核酸成分の混入を防止することができる。

以上のように、本実施の形態においては、切り出し器具により予め切り出し作業を行い、それにより形成された空隙を基に、切り出し器具の取り付け位置を微調整することにより、貴重な検体の支持体への残留及び、他の核酸試料の混入を防ぐことができる。

本発明にかかる電気泳動装置は、ゲル電気泳動および電気移動パターンの撮影、電気泳動後の核酸試料の切り出し作業を自動的に一括して実施可能で作業者の安全と労力の低減を図り、かつ異なる核酸試料の混入を防止すると共に、必要とする核酸試料を余すことなく回収可能とする装置を提供でき、生体高分子の分析で一般的に利用される電気泳動に関連する技術分野で有用である。

本発明の一実施の形態における電気泳動装置の斜視図 同電気泳動装置のキャリッジ機構部の斜視図 同電気泳動装置のテーブル機構部の斜視図 同電気泳動装置の切り出し器具の斜視図 同電気泳動装置の切り出し作業を説明する図 本発明の他の実施の形態における電気泳動装置の切り出し作業を説明する図

符号の説明

１０ 電気泳動槽
２０ 切り出し器具
２１ 接続部
２２ 切り出し部
２３ 支持体収納部
３０ 切り出し器具ホルダー
４０ テーブル機構
６０ キャリッジ機構
６１ 画像撮影手段
６２ 切り出し手段
６３ チャッキング部
６４ モータ
６５ 停止器具
６６ 回転機構
１０１ 電気泳動用ゲル
１０２ 注入口
１０３ 画分
１０４ 空隙
１０５ 電極
１０６ 電極
１０７ 画分
１０８ 鏡面

Claims (6)

1. 生体高分子を電気泳動により移動させるための支持体が配置される電気泳動槽と、
   前記支持体中を電気泳動させた後の生体高分子を切り出すため、前記支持体に対して相対的に移動されて、指定された位置の生体高分子を前記支持体とともに、矩形形状の断面で切り出してその内部に留置する切り出し器具と、
   前記切り出し器具を着脱自在に取り付ける前記切り出し手段と、を備え、
   電気泳動が行われる前記支持体の平面に対して垂直な軸の回りに、前記切り出し器具または支持体を回転させ、切り出し器具と支持体との相対的な位置を微調整することを特徴とする電気泳動装置。
2. 前記微調整は、前記切り出し器具を保持する切り出し手段を回転させて行う構成としたことを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
3. 前記微調整は、前記支持体を配置した電気泳動槽を回転させて行う構成としたことを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
4. 支持体中を電気泳動させた後の生体高分子を撮影する画像撮影手段をさらに備え、
   前記画像撮影手段によって前記切り出し器具をも撮影するとともに、その撮影した画像に基づいて、前記微調整を行うことを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
5. 支持体中を電気泳動させた後の生体高分子を撮影する画像撮影手段をさらに備え、
   前記切り出し器具により切り出された支持体の空隙を、前記画像撮影手段により撮影し、その撮影された画像に基づいて、前記微調整を行うことを特徴とする請求項１に記載の電気泳動装置。
6. 前記支持体のうち、生体高分子を含まない位置に前記空隙を形成することを特徴とする請求項５に記載の電気泳動装置。

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