JP2000088804A

JP2000088804A - 分取装置

Info

Publication number: JP2000088804A
Application number: JP10254846A
Authority: JP
Inventors: Hiroko Matsunaga; 浩子松永; Senshu Uematsu; 千宗植松; Kazunobu Okano; 和宣岡野
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 1998-09-09
Publication date: 2000-03-31

Abstract

(57)【要約】【課題】ゲルから目的とする部位を切り出し分取する
分取装置を提供する。【解決手段】電気泳動で展開された試料を含むアガロ
ースゲルを、Ｘ−Ｙステージ２にゲルストッパー３、４
を用いて設置する。蛍光体で標識された試料は、光源
６、二次元カメラ７により検出され、電気泳動パターン
は画像データとしてモニタ８に表示される。画像データ
を参照して切り出す部分を選択し、切り出し部９、１０
を用いて、選択された部分をゲルから自動的にカットす
る。【効果】目的とする部位を正確に切り出し分取でき
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、
又は蛋白等の目的とする試料を含む部分のゲルを分取す
る分取装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】ゲノムプロジェクトの進行に伴い、さま
ざまな遺伝子の機能解析が活発に進んでいる。その中で
も目的遺伝子の分取技術は今後必須の技術であり、操作
の簡便性、感度の向上が望まれている。

【０００３】従来、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は蛋白等の分離
には、ゲル電気泳動法が用いられている。ゲルから目的
の試料を抽出精製する際には、ゲルをレーザ等でスキャ
ンし、蛍光体等で標識された試料を検出した後に、得ら
れた画像を参照してゲルを切り出して試料の分取を行な
っている。アガロースゲルの場合は、ゲルを直接スキャ
ンすることが可能である。一方、ポリアクリルアミドゲ
ルの場合、ゲル厚が１ｍｍ以下と非常に薄く、表面に凹
凸ができやすい。このため螢光検出用のレーザをゲルに
照射した時、散乱しやすい。散乱を防止し検出の感度を
上げるために、ポリアクリルアミドゲルを２枚のガラス
板に挟みフラットな状態に保って泳動及びレーザスキャ
ンを行なう。ポリアクリルアミドゲルをスキャンした
後、ゲルの画像データをプリントアウトして、画像デー
タを参照しながら試料を含むゲルの切り出しを行なった
り、又はＵＶ照射下で試料部分を直接可視化して、ゲル
の切り出し操作を行なっていた。しかし、プリントアウ
トされた画像データを参照する操作の場合、ゲルと画像
データとの位置合せが非常に困難で、正確な切り出し操
作は難しかった。また、ＵＶ照射下の操作の場合、切り
出し部位の特定は容易なものの、ＵＶ照射により試料が
分散することも希ではない。以上の様な背景から、ゲル
から試料を含む部分の分取を目的とした装置が開発され
ている。

【０００４】独自の泳動トレイを用いて試料を電気泳動
して試料の解析抽出を自動に行ない、板状ゲルより切り
出し分取を行なう装置（第１の従来技術）、キャピラリ
ーゲル電気泳動法を用いた分取装置（第２の従来技術）
が知られている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】第１の従来技術では、
装置独自のトレイを用いなければならず、自由度が低
い。ポリアクリルアミドゲルを用いた場合、ゲルをガラ
ス板で挟み込んで電気泳動及び検出しないので、感度
が、１ｎｇ／ｂａｎｄと、著しく低下するという問題が
ある。即ち、ポリアクリルアミドゲルをガラス板で挟み
込んで電気泳動及び検出を行なう場合の感度２０ｐｇ／
ｂａｎｄに比べ、２桁近く感度が悪い。

【０００６】第２の従来技術では、キャピラリー中に導
入される試料の絶対量が少なく、また多量の溶液で希釈
されたサンプルしか回収できず、微量試料の分画には不
向きであるという問題がある。以上のように従来市販さ
れている装置はいずれも操作性、感度面に問題がある。
また、ゲルから目的とする部位のみを、正確に分取する
ための有効な従来手法はない。

【０００７】本発明の目的は、現在、広く使用されてい
る泳動形態をそのまま使用でき、ゲルと電気泳動パター
ンの画像との煩雑な位置合せ操作の自動化が可能であ
り、マニュアル操作でもより精度良く分取できる装置を
提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の分取装置では、
蛍光体等で標識された試料を板状ゲルを用いて泳動分離
した後、板状ゲルをレーザ照射して蛍光体からの螢光を
検出して電気泳動パターンを検出解析し、電気泳動パタ
ーンの画像データを使用して分取部分をモニタ上で選択
し決定する。決定された部位を、分取装置の分取機構に
取り付けられた針状カッターでゲル上に切り込みを入れ
て、ゲルを分取回収する。

【０００９】更に、分取回収後のゲルの分取回収部分の
周辺を再度レーザ照射し、ゲルの分取回収（切り出し回
収）が正確に行われたことを確認する。この際、再度レ
ーザ照射を行なう部位も、最初にレーザ照射を行なった
時の画像データを参照してモニタ上で決定する。

【００１０】また、ゲル回収時、及び再度のレーザ照射
時にゲル板が検出機構上で最初の設置位置からずれてし
まうのを防ぐため、検出機構部のゲル設置部分にはゲル
板が移動しないように、一度移動させても再度当初の位
置に設置できるような、ゲルストッパーを用意する。ポ
リアクリルアミドゲル使用の場合、試料の検出時は、感
度向上のためゲルの両面をガラス板で覆っておくが、切
り出し分取の際には上部ガラス板をはずす必要がある。
このためガラス板上でゲルがずれる可能性がある。ずれ
を補正するために、突起を持つ形状のスペーサーを用い
てゲルを作製する。スペーサーの突起部をゲルの位置マ
ーカーとして用いてゲルの分取を行ない、分取後は再度
上部ガラス板をゲルにかぶせレーザ照射を行なう。

【００１１】また、分取時の上部ガラス板を取り外すこ
となくゲルの切り出しを行なうため、ガラス板ではなく
針状カッターで切断可能で検出面をフラットに保てるよ
うな、ポリエチレンフィルム、又は透明塩化ビニールシ
ートのような材質のフィルムを用いゲルを作製し、上部
覆いを外すことなく本発明の装置を用いてゲルの特定部
位を切断することも可能である。

【００１２】更に、ゲル泳動パターンがより複雑でマニ
ュアルで切り出しを行ないたい場合、画像データを映し
出したモニタ上にゲルを直に重ね合せ、透明なゲルとモ
ニタ上の画像データを重複させて、分取装置に用いられ
る針状カッターを用いて、マニュアル操作でゲルを切り
出すことも可能である。この場合、アクリルアミドゲル
を室温中にさらす時間が自動で切り出すのに比べ長くな
り、ゲルの乾燥による縮みが生じる可能性がある。この
為、モニタ上に映し出される画像は実際のゲルに合せて
自在にサイズを変更できる。

【００１３】以上のように本発明では、ゲルから特定部
位を正確に感度良く分取することができ、従来技術の問
題点を解決できる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、実施例を図を参照して詳細
に説明する。

【００１５】（第１の実施例）ＰＣＲ反応により増幅さ
れた約７００ｂｐのＰＣＲ産物の精製（プライマーの除
去及び副産物の除去）を目的とし、ゲルからＰＣＲ産物
を含む部分の切り出しを行なう例について述べる。

【００１６】＜アガローズゲルを用いた切り出し＞ＰＣ
Ｒ反応により増幅された約７００ｂｐのＰＣＲ産物の反
応後の反応液を、エタノール沈殿法により濃縮精製操作
を行なった後、予め調製済みの２％アガロースゲルを用
いて電気泳動を行なった。電気泳動後、本発明の分取装
置によりゲルの切り出しを行なった。

【００１７】図１は、本発明の第１の実施例の分取装置
の構成を説明する図である。アガロースゲル１は検出用
Ｘ−Ｙステージ２上に設置され、アガロースゲル１のス
キャン（機械走査）中、及びゲルの切り出し中の位置ず
れを防止するため、ゲルストッパー３、及び４により固
定されている。また、本装置のＸ−Ｙステージ２は、ス
テージコントローラ５により縦横に自由に動かすことが
可能である。ゲル中の試料は光源６により励起され、検
出光は２次元カメラ７により検出される。検出された光
パターンをディジタル信号化したデータは、データ処理
部である解析用コンピュータ１３に送られ画像データと
して加工され、ディスプレイ８上に画像データとして表
示される。

【００１８】ゲル切り出しには切り出し部９を用い、切
り出し部９の先端には針状の形状を持つディスポーザブ
ルカッター１０が設置されている。切り出し部は切り出
し機コントローラ１１によりコントロールされる。更
に、切り出し機コントローラ１１、及びステージコント
ローラ５は、コントロールユニット１２につながれてお
り、実際の制御操作は解析用コンピュータ１３を用いて
行なう。即ち、解析用コンピュータ１３で制御されるコ
ントロールユニット１２の制御により、（１）ステージ
コントローラ５は、Ｘ−Ｙステージ２の移動方向（Ｘ、
Ｙ方向）と移動距離とを制御し、（２）切り出し機コン
トローラ１１は、ゲル切り出しには切り出し部９の上
下、及び左右の移動を制御することにより、画像データ
で選択された目的とするゲル部分を自動的に切り出すこ
とができる。

【００１９】また、試料の発光パターン光は非常に微弱
であるため、検出部、及び切り出し部（図１の参照番号
１６で囲まれた部分）は、周囲からの光が入り込まない
ように、箱部１５の内部に収納されカバー部１４により
暗室が構成されている。

【００２０】図２は、本発明の第１の実施例に於いてア
ガロースゲルの切り出し操作過程を説明する図である。
図２に於いて、２１はアガロースゲル、２２、２３はＤ
ＮＡサイズマーカー、２４はＰＣＲ産物、２５、２６は
ＰＣＲの副産物、２７はＰＣＲ反応の際の未反応プライ
マーを示している。即ち、ＰＣＲ反応後の反応液は、約
７００ｂｐのＰＣＲ産物２４、ＰＣＲの副産物２５、２
６、未反応プライマー２７の混合液で構成されている。

【００２１】続いてゲルからＰＣＲ産物２４のみを含む
部分の分取を行なう。即ち、モニタ上に表示された画像
データ２８より切り出し部分２９をマウスで選択する。
この選択された部分のアガロースゲルが、図１に示す
９、及び１０に示される切り出し部により自動的にカッ
トされる。カット後、カバー部１４を開けゲルのカット
された部分２９をピンセット等を用いて回収する。

【００２２】その後、ゲルのレーザ照射を再度を行な
う。これにより得られる結果は、図２に示す画像データ
３１になる。画像データ３１によれば、目的とするメイ
ンの産物のみを含む部分３２が、確実に切り出されてい
ることが確認できる。

【００２３】（第２の実施例）選択プライマーを用いて
ＰＣＲ増幅された２種の組織Ａ、及びＢの遺伝子群よ
り、組織Ｂに特異的な遺伝子のみ含む部分を、ポリアク
リルアミドゲルより切り出し精製を行なう例について述
べる。

【００２４】＜ポリアクリルアミドゲルを用いた切り出
し＞ＰＣＲ反応後の反応液をエタノール沈殿法により濃
縮精製操作を行なった後、予め調製済みの５％Ｔ、５％
Ｃポリアクリルアミドゲル（７Ｍ尿素入り）を用いて電
気泳動を行なう。

【００２５】図３は、本発明の第２の実施例に於いてポ
リアクリルアミドゲルの作製手順を説明する斜視図であ
る。泳動の際にはゲルのスキャン（機械走査）時に位置
合せ用に使用するための突起を持つ形状のスペーサーを
用いてゲルを作製する。

【００２６】図３に示すように、４１、４２のような形
状を持つスペーサーを使用する。作製されたゲルには、
位置合せ時に使用されるスペーサー４１、４２による切
れ込み４０が入いる。ゲルは、スペーサー４１、４２で
上側ガラス板４３、及び下側ガラス板４４を区切った空
間に位置する。ゲルはガラス板を両面に張った状態で、
図１に示すＸ−Ｙステージ２上に設置する。

【００２７】図４は、本発明の第２の実施例に於いてポ
リアクリルアミドゲルを分取装置のＸ−Ｙステージに設
置した状態、即ち、ガラス板を、ゲルストッパー３、４
により装置に固定した様子を示す平面図である。

【００２８】切り出し時、又は再度のゲルのスキャン
（機械走査）時のゲルのずれを防ぐため、スペーサー４
１、４２によるゲルへの切り込み部４０と、ゲルストッ
パー３、４上に設置されているマーカー４５の位置合せ
を行なう。ゲル板をＸ−Ｙステージに設置した後、レー
ザ照射を行ない電気泳動パターンの検出を行ない画像デ
ータ５１を得る（以下、図５で説明する）を得る。

【００２９】図５は、本発明の第２の実施例に於いてポ
リアクリルアミドゲルの切り出し操作過程を説明する図
である。図５に於いて、５２のレーンはサイズマーカ
ー、５３のレーンは組織Ａの遺伝子群、５４、５５のレ
ーンは組織Ｂの遺伝子群を、それぞれ表わす。このパタ
ーン中の組織Ｂに特異的に現れるバンド（遺伝子）５６
の分取を行なう。即ち、モニタ上に表示された画像デー
タ５１で切り出しを行なう部分５７をマウスで選択す
る。続いてポリアクリルアミドゲルを挟むガラス板の上
側ガラス板４３のみをはずし、再度、Ｘ−Ｙステージに
設置する。

【００３０】この時、最初にスキャン（機械走査）を行
なった際、位置合せされるゲルストッパー上の位置マー
カー４５と、ゲルのスペーサーによる切り込み部４０を
正確に合せる。このようにして設置されたゲル中から、
選択された部分を、第１の実施例と同様にして、切り出
し部を用いて自動的にカットする。カット後、カバー部
１４を開けゲルの切り出された部分５７をピンセットを
用いて回収する。その後、上側ガラス板４３を再度ゲル
にかぶせ、ゲルストッパー上の位置マーカー４５と、ゲ
ルのスペーサー４１、４２による切り込み部４０を正確
に合せてゲル板をＸ−Ｙステージに設置する。

【００３１】続いて、設置されたゲル板の、切り出しを
行なった部分５７を含む５８の部分を画像データ上で選
択し、ゲルのレーザ照射を再度を行なう。これにより得
られる結果は、図５に示す画像データ５９になる。画像
データ５９によれば、目的とする産物のみを含む部分６
０が、確実に切り出し抽出されていることが確認でき
る。

【００３２】また、上側ガラス板４３を樹脂性のフィル
ム等を用いてゲルを作製し、上側ガラス板に代わる上側
カバーをかぶせたまま、カバーもゲルと一緒にカットし
ても良い。更に、ゲル作製時には、上側ガラス板は従来
と同様にガラス板をを用い、電気泳動前にカット可能な
カバーと交換しても良い。

【００３３】（第３の実施例）第３の実施例では、実施
例２と同様の手法で得られた画像データを元に、マニュ
アルで切り出し操作を行なう例について述べる。

【００３４】図６は、本発明の第３の実施例に於いてポ
リアクリルアミドゲルのマニュアルでの切り出し操作を
説明する斜視図である。第２の実施例と同様の方法で得
られた画像データは、切り出し用のモニタ７１に映し出
される。この画像データは、解析用コンピュータ１３に
より制御されている。続いて、ゲルを挟み込む２枚のガ
ラス板のうち上部ガラス板をはがし、ゲルと等倍に映し
出されたモニタ７１の画像データに、ゲルが乗ったガラ
ス板７２を重ねあわせる。モニターは画面がフラットで
あり、撥水処理が施されているため、ゲルを直接載せる
ことができる。また、モニタの支持台７５に対するモニ
タの画面の角度を変えて、モニタの角度を自由に変更で
きるので、ゲルを切り出しやすい作業のしやすい角度に
設置できる。ゲルのスペーサー７３による切り込み部
と、画像データの切り込み部７４を正確に合せる。ゲル
は無色透明なので、モニタ上に映し出された画像データ
はゲルから透けて確認することが可能である。この様に
して重ね合わされたゲルから、ゲル下に映し出されてい
る画像データを元に、目的とするバンド（遺伝子）の切
り出し回収を、マニュアルで容易に正確に行なうことが
できる。

【００３５】以下、本発明のＤＮＡ断片試料の分取装置
の特徴を整理する。本発明の分取装置は、螢光標識され
た試料が電気泳動により展開された板状のゲルに光を照
射する光照射手段と、光の照射により螢光標識から発す
る螢光を検出し、試料の電気泳動パターンの画像データ
を表示するモニタと、モニタ上で選択された板状のゲル
の目的とする部分を切断する手段とを具備し、板状のゲ
ルの試料が泳動する方向に平行な両側部に、複数の切り
込み部分が形成されていることに特徴があり、更に、
（１）突起を持つ形状のスペーサーを用いて板状のゲル
が作製される際に、複数の切り込み部が形成されるこ
と、（２）切断する手段は、先端が針状の鋭い形状を持
つ取り替え可能なカッターを具備するすること、切断す
る手段は、板状のゲルを覆うカバーを切断すること、
（３）目的とする部分が切断され分取された後の板状の
ゲルに光を照射して、試料の電気泳動パターンの画像デ
ータをモニタに表示すること、等に特徴がある。

【００３６】また、本発明の分取装置は、螢光標識され
た試料が電気泳動により展開された板状のゲルに光を照
射する光照射手段と、光の照射により螢光標識から発す
る螢光を検出し、試料の電気泳動パターンの画像データ
を表示するモニタとを具備し、板状のゲルの試料が泳動
する方向に平行な両側部に、複数の切り込み部分が形成
されており、モニタに表示された画像データに板状のゲ
ルを複数の切り込み部分を用いて重ね合せ、画像データ
を参照しながら、板状のゲルの目的とする部分を切断し
て分取することに特徴があり、更に、（１）モニタは、
撥水処理が施されたフラットな画面を有し、（２）モニ
タの角度が変更可能であり、（３）目的とする部分が切
断され分取された後の板状のゲルに光を照射して、試料
の電気泳動パターンの画像データをモニタに表示するこ
と、等に特徴がある。

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、ゲルから特定部位を正
確に良く切り出すことができ、近接する分離バンドから
のコンタミネーションを低く押さえることができる。ま
た、ゲルのバンドの位置とモニタのバンドの位置を実際
に重複させて切り出すので、回収の信頼性が高いだけで
なく、作業者に与えるストレスを軽減でき、簡単に分離
分取が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の第１の実施例の分取装置の構成を説明
する図。

【図２】本発明の第１の実施例に於いてアガロースゲル
の切り出し操作過程を説明する図。

【図３】本発明の第２の実施例に於いてポリアクリルア
ミドゲルの作製手順を説明する斜視図。

【図４】本発明の第２の実施例に於いてポリアクリルア
ミドゲルを分取装置のＸ−Ｙステージに設置した状態を
示す平面図。

【図５】本発明の第２の実施例に於いてポリアクリルア
ミドゲルの切り出し操作過程を説明する図。

【図６】本発明の第３の実施例に於いてポリアクリルア
ミドゲルのマニュアルでの切り出し操作を説明する斜視
図。

【符号の説明】

１…アガロースゲル、２…Ｘ−Ｙステージ、３、４…ゲ
ルストッパー、５…ステージコントローラ、６…光源、
７…二次元カメラ、８…ディスプレイ、９…切り出し
部、１０…針状の形状を持つディスポーザブルカッタ
ー、１１…切り出し機コントローラ、１２…コントロー
ルユニット、１３…解析用コンピュータ、１４…カバー
部、１５…箱部、１６…検出部、及び切り出し部、２１
…アガロースゲル、２２、２３…ＤＮＡサイズマーカ
ー、２４…ＰＣＲ産物、２５、２６…ＰＣＲの副産物、
２７…未反応プライマー、２９…切り出し部分、３０…
再スキャン選択部分、３１…画像データ、３２…切り出
し部分、４０…ゲルへの切り込み部、４１、４２…スペ
ーサー、４３…上側ガラス板、４４…下側ガラス板、４
５…ゲルストッパー上位置マーカー、５１…画像デー
タ、５２…サイズマーカー、５３…組織Ａの遺伝子群、
５４、５５…組織Ｂの遺伝子群、５６…組織Ｂに特異的
に現れるバンド、５７…切り出しを行なう部分、５８…
再度レーザ照射を行なう部分、５９…画像データ、６０
…切り出しされた部分、７１…モニタ、７２…ポリアク
リルアミドゲルが乗った下側ガラス板、７３…スペーサ
ー、７４…スペーサーによるゲルへの切り込み部、７５
…モニタの支持台。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】螢光標識された試料が電気泳動により展開
された板状のゲルに光を照射する光照射手段と、前記光
の照射により前記螢光標識から発する螢光を検出し、前
記試料の電気泳動パターンの画像データを表示するモニ
タと、該モニタ上で選択された前記板状のゲルの目的と
する部分を切断する手段とを具備し、前記板状のゲルの
前記試料が泳動する方向に平行な両側部に、複数の切り
込み部分が形成されていることを特徴とする分取装置。
【請求項２】請求項１に記載の分取装置に於いて、突起
を持つ形状のスペーサーを用いて前記板状のゲルが作製
される際に、前記複数の切り込み部が形成されることを
特徴とする分取装置。
【請求項３】請求項１に記載の分取装置に於いて、前記
切断する手段は、先端が針状の形状を持つカッターを具
備するすることを特徴とする分取装置。
【請求項４】請求項１に記載の分取装置に於いて、前記
切断する手段は、前記板状のゲルを覆うカバーを切断す
ることを特徴とする分取装置。
【請求項５】請求項１に記載の分取装置に於いて、前記
目的とする部分が切断され分取された後の前記板状のゲ
ルに前記光を照射して、前記試料の電気泳動パターンの
画像データを前記モニタに表示することを特徴とする分
取装置。
【請求項６】螢光標識された試料が電気泳動により展開
された板状のゲルに光を照射する光照射手段と、前記光
の照射により前記螢光標識から発する螢光を検出し、前
記試料の電気泳動パターンの画像データを表示するモニ
タとを具備し、前記板状のゲルの前記試料が泳動する方
向に平行な両側部に、複数の切り込み部分が形成されて
おり、前記モニタに表示された前記画像データに前記板
状のゲルを前記複数の切り込み部分を用いて重ね合せ、
前記画像データを参照しながら、前記板状のゲルの目的
とする部分を切断して分取することを特徴とする分取装
置。
【請求項７】請求項６に記載の分取装置に於いて、前記
モニタは、撥水処理が施されたフラットな画面を有する
ことを特徴とする分取装置。
【請求項８】請求項６に記載の分取装置に於いて、前記
モニタの角度が変更可能であることを特徴とする分取装
置。
【請求項９】請求項６に記載の分取装置に於いて、前記
目的とする部分が切断され分取された後の前記板状のゲ
ルに前記光を照射して、前記試料の電気泳動パターンの
画像データを前記モニタに表示することを特徴とする分
取装置。