JP2009036808A

JP2009036808A - 観察装置

Info

Publication number: JP2009036808A
Application number: JP2007198645A
Authority: JP
Inventors: Hirobumi Shiono; 博文塩野
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2007-07-31
Filing date: 2007-07-31
Publication date: 2009-02-19

Abstract

【課題】添加物に起因する画像の変化を抑え、自動観察において適切な画像の取得を可能とすることを目的とする。
【解決手段】培養容器で培養される試料を観察する観察装置であって、照明光学系を備え、前記試料を照明する照明部と、前記照明部により照明された前記試料の像を撮像して画像を取得する画像取得部と、前記試料の培養に用いる培地のｐＨ値を測定するｐＨ測定部と、前記ｐＨ値と前記培地に含まれる添加物の光吸収特性とに応じて、前記照明部の光量と前記画像取得部による撮像時の露光時間との少なくとも一方を含む条件を決定する条件決定部と、前記条件決定部により決定された前記条件に応じて、前記照明部と前記画像取得部との少なくとも一方を制御する制御部とを備えたことを特徴とする観察装置。
【選択図】図１

Description

本発明は、培養容器で培養される試料を観察する観察装置に関する。

従来から、培養容器で培養される試料を観察する観察装置として、位相差顕微鏡などが知られている（例えば、特許文献１参照）。このような観察装置により観察される試料には、各種の微生物や細胞等がある。
特開平１１−８４２６０号公報

ところで、上述した微生物や細胞などの試料の培養においては、培地にｐＨ指示薬などの添加物を添加することが多い。ｐＨ指示薬などの添加物には、特徴的な光吸収特性を有するものがある。そのため、添加物に起因して、観察される試料の明るさや見え方が変化してしまう場合がある。人間による目視観察の場合には、明るさやコントラストなどを人間が適宜調整することにより、このような変化に対応することが可能である。しかし、カメラなどの撮像装置を用いた自動観察の場合には、取得される画像の明るさやコントラストが変化してしまうという問題がある。

本発明の観察装置は、ｐＨ指示薬などの添加物に起因する画像の変化を抑え、自動観察において適切な画像の取得を可能とすることを目的とする。

本発明の観察装置は、培養容器で培養される試料を観察する観察装置であって、照明光学系を備え、前記試料を照明する照明部と、前記照明部により照明された前記試料の像を撮像して画像を取得する画像取得部と、前記試料の培養に用いる培地のｐＨ値を測定するｐＨ測定部と、前記ｐＨ値と前記培地に含まれる添加物の光吸収特性とに応じて、前記照明部の光量と前記画像取得部による撮像時の露光時間との少なくとも一方を含む条件を決定する条件決定部と、前記条件決定部により決定された前記条件に応じて、前記照明部と前記画像取得部との少なくとも一方を制御する制御部とを備えたことを特徴とする。

なお、好ましくは、前記条件決定部は、前記培地のｐＨ値に加えて、前記培地中の前記添加物の濃度と前記照明光学系の光軸方向における前記培地の厚さとの少なくとも一方に応じて、前記条件を決定しても良い。

本発明の観察装置によれば、ｐＨ指示薬などの添加物に起因する画像の変化を抑え、自動観察において適切な画像の取得を可能とすることができる。

以下、図面を用いて本発明の実施形態について説明する。なお、本実施形態では、本発明の観察装置の一例として、位相差顕微鏡を用いて説明する。

図１は、本発明の実施形態における顕微鏡の構成を示すブロック図である。図１に示すように、顕微鏡１は、顕微鏡本体２、照明部３、コンピュータ４から構成される。

顕微鏡本体２は、ｐＨ測定器７、観察対象の試料を静置するステージ８、対物レンズ部９、位相板１０、画像取得部１１、対物レンズ部９からの光束を画像取得部１１に導くミラー１２を備える。また、顕微鏡本体２は、照明部３と相互に接続可能なコネクタＩ／Ｆ部１３、コンピュータ４と相互に接続可能な外部Ｉ／Ｆ部１４、焦点調節を行う焦点調節部１５、各部を制御する顕微鏡制御部１６を備える。顕微鏡制御部１６は、画像取得部１１、コネクタＩ／Ｆ部１３、外部Ｉ／Ｆ部１４、焦点調節部１５と相互に接続されるとともに、ステージ８を制御する。

観察対象である培養容器は、ステージ８上に静置される。培養容器には様々な種類があるが、ここでは外径が円形であるディッシュ５を例に挙げて説明する。ディッシュ５の内部は培地６で満たされており、その培地６の中で細胞や微生物などの試料が培養されている。ｐＨ測定器７は、ディッシュ５内部の培地６に接触する位置に配置され、培地６のｐＨ値を測定して顕微鏡制御部１６に出力する。ｐＨ測定器７は、例えば、ガラス電極や半導体センサを用いたｐＨメーターなどである。

対物レンズ部９は、対物レンズ、対物レンズ駆動部、中間変倍部などを備える。なお、複数の対物レンズを備え、それらを切り替えて使用可能な構成であっても良い。また、位相板１０の断面図を１０Ａに示す。また、画像取得部１１は、撮像素子１１Ａ、Ａ／Ｄ変換などの画像処理を行う画像処理部などを備える。

照明部３は、照明光源部２１、リング絞り２２、照明光源部２１を制御する照明部制御部２３、単色光フィルタ２４を備える。照明光源部２１は、ＬＥＤなどの光源、集光レンズ、絞り、ミラーなどを備える。照明部制御部２３は、上述したコネクタＩ／Ｆ部１３を介して、顕微鏡制御部１６と接続され、顕微鏡制御部１６の指示にしたがって照明光源部２１を制御する。リング絞り２２の断面図を２２Ａに示す。

単色光フィルタ２４は、照明光源部２１からの照明光のうち、緑色光を透過させる一方、緑色以外の光の透過を制限するフィルタであり、図１に示すように、照明光源部２１とリング絞り２２との間に配置される。

コンピュータ４は、コンピュータ制御部３１、表示部３２、操作部３３、記録部３４、テーブル記憶部３５を備え、操作部３３を介して顕微鏡１の動作に関わるユーザ指示を受け付けるとともに、顕微鏡本体２から取得した画像や記録部３４に記録した画像を表示部３２に表示する。また、コンピュータ制御部３１は、不図示のメモリに各部を制御するためのプログラムを予め記録する。そして、コンピュータ制御部３１は、外部Ｉ／Ｆ部１４を介して顕微鏡制御部１６と接続され、画像取得部１１により取得された画像を顕微鏡制御部１６から取得するとともに、顕微鏡制御部１６を制御する。記録部３４は、コンピュータ制御部３１の制御に基づいて画像を記録する。テーブル記憶部３５は、後述する照明光源部２１の光量に関するテーブルを予め記録する。

顕微鏡１の観察においては、ステージ８に静置されたディッシュ５に対して、照明光源部２１により照明光を照射する。照明光は、リング絞り２２によって絞られ、単色光フィルタ２４を透過してステージ８上のディッシュ５内の試料を照明する。そして、試料を透過した光束（直接光と回折光とを含む）は、対物レンズ部９を透過して位相板１０に到達する。そして、位相板１０を経た光束は、ミラー１２により画像取得部１１に導かれる。画像取得部１１は、撮像素子１１Ａにより試料の透過像を撮像して画像を取得する。画像取得部１１により取得される画像は、位相差により明暗のコントラストを有する画像である。

顕微鏡制御部１６は、ステージ８を上下方向に移動することにより、焦点調節の対象となる面を変更するとともに、焦点調節部１５を介して対物レンズ部９の一部を対物レンズの光軸方向に移動して、焦点調節を行う。なお、焦点調節は、公知技術と同様に行われるため、説明を省略する。

ところで、細胞や微生物などの試料の培養においては、培地６にｐＨ指示薬を添加することが多い。しかし、ｐＨ指示薬などの添加物には、培地６のｐＨ変化に応じた特徴的な光吸収特性を有するものがある。そのため、添加物に起因して、観察される試料の明るさや見え方が変化してしまう場合がある。そこで、以下、観察される試料の明るさを一定にするために、照明光源部２１の光量を制御する例を説明する。

本実施形態では、添加物の一例として、ｐＨ指示薬であるフェノールレッドを例に挙げて説明する。ユーザはフェノールレッドで染色された培地６の色から細胞や微生物の数などを判定し、必要に応じて培地６の交換や継代を行う。すなわち、ｐＨ指示薬は、培地６の交換や継代などの目安として利用するために培地６に添加される。

次に、フェノールレッドの光吸収特性について説明する。図２は、フェノールレッドの光吸収特性を示す図である。図２に示すように、フェノールレッドは５００〜６００ｎｍ付近に特徴的な吸収帯がある。この吸収帯は、培地６のｐＨ値の変化、光軸方向の培地６の厚さ（以下、「培地６の光路長」と称する）、および培地６中のフェノールレッドの濃度変化に応じて変化することが知られている。なお、培地６の光路長および培地６中のフェノールレッドの濃度変化は、培地６の濃度に関するファクターである。

図３に培地６の光路長と培地６中のフェノールレッドの濃度とを固定し、培地６のｐＨ値を変化させた場合の光吸収特性を示す。図３に示すように、ｐＨ値がｐＨ７．０、ｐＨ７．４、ｐＨ７．８、ｐＨ８．２と高くなると、光吸収特性の変化が大きくなることが分かる。そのため、培養中に培地６の光路長と培地６中のフェノールレッドの濃度とが変化せず、培地６のｐＨ値が変化した場合には、ｐＨ値が高い培地６ほど５００ｎｍ〜６００ｎｍ付近の光がフェノールレッドに吸収されて、撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量が少なくなる。したがって、培地６のｐＨ値によって撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量が変化するため、取得される画像の明るさが一定にならず、ユーザが試料を観察しづらい場合や、取得した画像を比較しづらい場合がある。

図４に培地６のｐＨ値と培地６中のフェノールレッドの濃度とを固定し、培地６の光路長を変化させた場合の光吸収特性を示す。図４に示すように、培地６の光路長が５ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍと長くなると、光吸収特性の変化が大きくなることが分かる。そのため、培養中に培地６のｐＨ値と培地６中のフェノールレッドの濃度とが変化せず、培地６の光路長が変化した場合（培地６の量が変化した場合）には、培地６の光路長が長い培地ほど５００ｎｍ〜６００ｎｍ付近の光がフェノールレッドに吸収されて、撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量が少なくなる。したがって、培地６の光路長によって撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量が変化するため、取得される画像の明るさが一定にならず、上記の図３の例と同様に、ユーザにとって好ましくない場合がある。

なお、培地６のｐＨ値と培地６の光路長とを固定し、培地６中のフェノールレッドの濃度を変化させた場合にも、濃度が高くなるほど光吸収特性の変化が大きくなる。

ここで、照明光源部２１から照射された光が撮像素子１１Ａに到達するまでの流れを考える。撮像素子１１Ａに入射する入射光Ｉ_in(λ)は、以下の式１で表される。

Ｉ_in(λ)＝Ｉ_o(λ)×τ₁(λ)×Ａ・・・（式１）
ただし、式１において、Ｉ_o(λ)は照明光源部２１の光量を示し、τ₁(λ)は培地（培地に添加されたフェノールレッド）の影響を示し、式１のＡは、以下の式２で表される試料の周囲媒体による光吸収特性を示す。

Ａ＝α(λ)×Ｌ×Ｃ・・・（式２）
ただし、式２において、α(λ)は吸光係数を示し、Ｌは培地６の光路長を示し、Ｃは培地６中のフェノールレッドの濃度を示す。

以上説明したように、培地６のｐＨ値と、培地６の光路長と、培地６中のフェノールレッドの濃度とのうち、少なくとも一つが培養中に変化した場合には、撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量が変化する。そのため、上述した通りユーザにとって好ましくない場合がある。したがって、撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量が一定になることが好ましい。また、式１において、培地の影響τ₁(λ)と試料の周囲媒体による光吸収特性Ａとは、試料の培養状態によって変化する。したがって、培地６のｐＨ値が変化しても、培地６の光路長が変化しても、培地６中のフェノールレッドの濃度が変化しても、撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量Ｉ_in(λ)が一定になるような照明光の光量Ｉ_o(λ)が照明光源部２１から出力されることが好ましい。

そこで、本実施形態では、培地６のｐＨ値と照明光源部２１の光量とを対応づけたテーブルをテーブル記憶部３５に予め記録する。図５にテーブル記憶部３５に記録されるテーブルの一例を示す。図５は、培地６の光路長ごとに培地６のｐＨ値と照明光源部２１の光量とを対応づけたテーブルである。なお、ｐＨ値ごとの照明光源部２１の光量Ｉ_o(λ)は、上述した式１に基づいて、撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量Ｉ_in(λ)が一定になるように予め算出される。

図６のフローチャートは、コンピュータ制御部３１の撮像時の動作を示す。

ステップＳ１において、コンピュータ制御部３１は、ユーザから操作部３３を介して培養容器の種類の指定を受け付ける。なお、培養容器の種類ごとに培地６の光路長が対応づけられたテーブルがテーブル記憶部３５に予め記録されている。そして、コンピュータ制御部３１は、このテーブルからユーザが指定した培養容器に対応する培地６の光路長を読み出す。ここでは、前述したように培養容器の一例として、ディッシュ５を例に挙げて説明する。

ステップＳ２において、コンピュータ制御部３１は、ユーザから操作部３３を介して撮像開始の指示が行われたか否かを判定する。開始の指示が行われた場合（ＹＥＳ）には、Ｓ３に移行する。一方、開始の指示がない場合（ＮＯ）には、コンピュータ制御部３１は、開始の指示が行われるまで待機する。

ステップＳ３において、コンピュータ制御部３１は、外部Ｉ／Ｆ部１４を介して顕微鏡制御部１６を制御し、ｐＨ測定器７に培地６のｐＨ値を測定する指示を行う。ｐＨ測定器７は、培地６のｐＨ値を測定し、顕微鏡制御部１６に出力する。顕微鏡制御部１６は、外部Ｉ／Ｆ部１４を介してコンピュータ制御部３１に培地６のｐＨ値を出力する。

ステップＳ４において、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ１で読み出した培地６の光路長と、ステップＳ３で測定した培地６のｐＨ値とに応じて、上記の照明光源部２１の光量に関するテーブルから照明光源部２１の光量を読み出す。

ステップＳ５において、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ４で読み出した光量に応じて、外部Ｉ／Ｆ部１４を介して照明部制御部２３を制御し、照明光源部２１の光量を制御するとともに、顕微鏡制御部１６を制御し、画像取得部１１を駆動させて画像を取得する。

ステップＳ６において、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ５で取得した画像とともに、タグ情報として、画像取得日時、ステップＳ４で読み出した照明光源部２１の光量、ステップＳ３で測定した培地６のｐＨ値などを記録部３４に記録する。

図７は、記録部３４に記録した複数の画像とタグ情報とをあわせて表示部３２に表示した例を示す図である。図７に示すように、複数の画像を並べて表示した場合に、それぞれの画像を取得した際の培養条件（培地６のｐＨ値など）が異なっても、画像の明るさは一定であるため、ユーザは画像を比較しやすい。

なお、上記の実施形態では、培地６の光路長ごとに培地６のｐＨ値と照明光源部２１の光量とを対応づけたテーブルをテーブル記憶部３５に予め記録したが、照明光源部２１の光量を決定する要素はこれらに限らない。例えば、フェノールレッドの濃度をファクターとして追加して、培地６の光路長と培地６中のフェノールレッドの濃度との組み合わせごとに、培地６のｐＨ値と照明光源部２１の光量とを対応づけたテーブルを用意しても良い。すなわち、図５の例では、４種類の光路長に加えて４種類のフェノールレッドの濃度がある場合には、合計で１６個のテーブルを用意しても良い。

さらに、培地６のｐＨ値と、培地６の光路長と、培地６中のフェノールレッドの濃度との３つの要素のうち、いずれか任意の要素の組み合わせと照明光源部２１の光量とを対応づけたテーブルを用意しても良い。

なお、上記の実施形態では、照明光源部２１の光量を制御する例を示したが、画像取得部１１による撮像時の露光時間を制御しても良い。例えば、コンピュータ制御部３１は、培地６のｐＨ値と培地６の濃度に関するファクターとを画像取得部１１による撮像時の露光時間に対応づけたテーブルを予めテーブル記憶部３５に記録する。そして、コンピュータ制御部３１は、このテーブルに基づいて、露光時間を決定する。次に、コンピュータ制御部３１は、前記決定した露光時間に応じて、外部Ｉ／Ｆ部１４を介して顕微鏡制御部１６を制御し、画像取得部１１による撮像時の露光時間を制御する。このように、画像取得部１１による撮像時の露光時間を制御しても、上記の実施形態と同様に、撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量を一定にすることができる。

以上説明したように、本実施形態の観察装置によれば、添加物に起因する画像の変化を抑え、自動観察において適切な画像の取得を可能とすることができる。また、本実施形態によれば、撮像素子に入射する入射光の光量を一定にするので、明るさの変化の少ない画像を生成することができる。

なお、本実施形態では、ｐＨ測定器７を顕微鏡本体２の構成要件としたが、ｐＨ測定器７を備えない顕微鏡本体２にも本発明を同様に適用することができる。この場合、ステップＳ１において、コンピュータ制御部３１は、ユーザから予め測定した培地６のｐＨ値を受け付ければ良い。

また、図６のフローチャートでは、ユーザの撮像開始指示に応じて画像を取得する例を示したが、画像を取得する流れはこれに限らない。例えば、ステップＳ１で、コンピュータ制御部３１は、ユーザから培養容器の種類の指定に加えて、観察間隔（１２時間，２４時間など）の指定を受け付け、この観察間隔が経過する毎にステップＳ３からステップＳ６までの動作を繰り返す構成としても良い。

また、上記の実施形態において、照明光源部２１の光量と画像取得部１１による撮像時の露光時間とのうち、いずれか一方を試料に応じて選択的に制御する構成としても良い。例えば、動きのある試料を観察する場合には、露光時間を制御することなく、光量を制御する構成としても良い。

また、上記の実施形態では、培地６の光路長ごとに培地６のｐＨ値と照明光源部２１の光量とを対応づけたテーブルをテーブル記憶部３５に予め記録したが、照明光源部２１の光量の算出方法はこれに限らない。例えば、照明光源部２１の光量を算出するための式（Ｉ_o(λ)＝Ｉ_in(λ)／（τ₁(λ)×Ａ））をコンピュータ制御部３１に予め記録する。そして、コンピュータ制御部３１は、ステップＳ４でこの式を用いて照明光源部２１の光量を算出しても良い。

また、本実施形態では、照明光として緑色単色光を用いたが、他の照明光にも同様に適用することができる。

また、本実施形態では、添加物として、ｐＨ指示薬であるフェノールレッドを例に挙げて説明したが、他のｐＨ指示薬にも本発明を同様に適用することができる。また、ｐＨ指示薬以外の添加物についても同様である。例えば、培地６に添加される添加物である血清や各種試薬などについても本発明を同様に適用することができる。何れの場合も、培地６のｐＨ変化に伴う光吸収特性の変化を有する添加物であれば、その特性と培地６のｐＨ値とに応じて撮像素子１１Ａに入射する入射光の光量を一定にするように、照明光源部２１の光量と画像取得部１１による撮像時の露光時間との少なくとも一方を制御すれば良い。

さらに、本実施形態では、培地６のｐＨ値の変化に伴う光吸収特性の変化を有する添加物を例に挙げて説明したが、培地６の光路長の変化に伴う光吸収特性の変化を有する添加物にも、本発明を同様に適用することができる。この場合、培地６の光路長の変化を検出し、検出した光路長に応じて照明光源部２１の光量と画像取得部１１による撮像時の露光時間との少なくとも一方を制御すれば良い。また、濃度の変化に伴う光吸収特性の変化を有する添加物にも、本発明を同様に適用することができる。この場合、添加物の濃度の変化を検出し、検出した濃度に応じて照明光源部２１の光量と画像取得部１１による撮像時の露光時間との少なくとも一方を制御すれば良い。

また、上述した通り、他の添加物にも本発明を同様に適用することができるため、添加物の種類ごとに、照明光源部２１の光量に関するテーブルや画像取得部１１による撮像時の露光時間に関するテーブルをテーブル記憶部３５に予め記録しても良い。この場合、ステップＳ１で、コンピュータ制御部３１は、ユーザから培養容器の種類の指定に加えて、添加物の種類の指定を受け付ければ良い。

また、本実施形態では、本発明の検査装置の一例として位相差顕微鏡を例に挙げて説明したが、その他の顕微鏡や観察装置にも本発明を同様に適用することができる。

本実施形態の顕微鏡の構成を示すブロック図である。フェノールレッドの光吸収特性を示す図である。培地６の光路長と培地６中のフェノールレッドの濃度とを固定し、培地６のｐＨ値を変化させた場合の光吸収特性を示す図である。培地６のｐＨ値と培地６中のフェノールレッドの濃度とを固定し、培地６の光路長を変化させた場合の光吸収特性を示す図である。照明光源部２１の光量に関するテーブルの一例を示す図である。コンピュータ制御部３１の動作を示すフローチャートである。記録部３４に記録した複数の画像とタグ情報とをあわせて表示部３２に表示した例を示す図である。

符号の説明

１…顕微鏡，２…顕微鏡本体，３…照明部，６…培地，７…ｐＨ測定器，１１…画像取得部，１６…顕微鏡制御部，２１…照明光源部，２３…照明部制御部，３１…コンピュータ制御部

Claims

培養容器で培養される試料を観察する観察装置であって、
照明光学系を備え、前記試料を照明する照明部と、
前記照明部により照明された前記試料の像を撮像して画像を取得する画像取得部と、
前記試料の培養に用いる培地のｐＨ値を測定するｐＨ測定部と、
前記ｐＨ値と前記培地に含まれる添加物の光吸収特性とに応じて、前記照明部の光量と前記画像取得部による撮像時の露光時間との少なくとも一方を含む条件を決定する条件決定部と、
前記条件決定部により決定された前記条件に応じて、前記照明部と前記画像取得部との少なくとも一方を制御する制御部と
を備えたことを特徴とする観察装置。
請求項１に記載の観察装置において、
前記条件決定部は、前記培地のｐＨ値に加えて、前記培地中の前記添加物の濃度と前記照明光学系の光軸方向における前記培地の厚さとの少なくとも一方に応じて、前記条件を決定する
ことを特徴とする観察装置。