JP2009008639A - 液体クロマトグラフ用濁り検出器 - Google Patents

Abstract

【課題】測定対象物の成分量に対し検出感度特性が一次関数になり、かつ成分の種類に依存せず均一な検出感度が得られる検出器であって、分取が可能であると共に、廃液はすべて回収可能な液体クロマトグラフ用濁り検出器を提供する。
【解決手段】分離カラムから排出する移動相の液流に水を主成分とした高極性液体を混入し、移動相に溶解している測定対象物の各成分を沈殿として析出させるための高極性液体混合手段５ａと、前記高極性液体混合手段の下流にあって、沈殿により生じる濁りを検出する濁り検出手段５ｂを含む。
【選択図】図１

Description

本発明は液体クロマトグラフに用いることができる液体クロマトグラフ用濁り検出器に関する。

従来より、様々な測定対象物の分離分析を行うために、液体クロマトグラフが広く利用されてきた。液体クロマトグラフの基本的な構成は、有機溶媒などの移動相を一定の流速で送液するための送液ポンプ、移動相の液流に測定対象物溶液を導入するためのサンプルインジェクター、前記サンプルインジェクターの下流に接続され、シリカゲルなどの固定相を保持した分離カラム、前記分離カラムから順次排出される測定対象物の各成分を検出するための検出器にて構成されている。

前記検出器には、紫外線吸収、可視光吸収、蛍光、化学発光、屈折率、電気化学反応、電導度、蒸発光散乱など種々の原理が導入され、測定対象物の物理化学的性質により最も適した検出器が選択され利用されてきた。しかしながら、脂質分析の分野においては、多くの選択肢があるにもかかわらず、完全に適合する検出器は存在しないため、種々の制約を受けながらＵＶ検出器（紫外線吸収検出器）、ＲＩ検出器（示差屈折検出器）ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出器）が主に使用されてきた。

ＵＶ検出器の場合には、不飽和脂肪酸にある二重結合の非特異的な紫外線吸収（１９５〜２１０ｎｍ）の波長域で検出されるが、吸収強度が脂質の濃度または質量に依存していないので、定量分析には向いていない。また使用できる溶媒も限定され、アセトンなど脂質分離には最適な溶媒も前記波長では使用することができない。ＩＲ検出器の場合には、脂質の質量に依存して検出されるので、定量分析が可能であるが、屈折率の変化を検出することから、環境温度の変化や移動相の僅かな流速変動に対して敏感であるため取扱が難しい。さらに検出感度が非常に悪く、一成分あたりｍｇオーダーの分析となる。

ＥＬＳＤは、近年になり脂質分析などに主に利用されるようになってきた。ＥＬＳＤは、分離カラムから排出される測定対象物の成分を含む移動相を適当なガス（窒素ガス、エアなど）を用いて噴霧することで、揮発性の高い移動相は蒸発され、揮発性が無い測定対象物の成分は、微粒子となり前記ガスの気流と共に検出部へ送られる。検出部にある光源から発せられた光は、前記気流に照射され、前記測定対象物成分由来の微粒子が通過すると散乱光を生じるので、その散乱光を受光素子で検出する。ＥＬＳＤは、測定対象物成分の質量に依存して検出されるので、定量分析が可能であり、揮発性があり蒸発する溶媒であれば移動相として使用できる。また環境温度や移動相の流速に対して影響を受け難いなどの利点があり、ＵＶ検出器やＩＲ検出器に取って代わろうとしている。

以上のようにＥＬＳＤは利点の多い検出器であるが、検出器の特性は、測定対象物の成分量に対する検出値の関係は一次関数とならず、Ｙ＝ＡＸ＾Ｂで表されるべき乗関数となる。さらに成分の種類により前記Ｂの値は１．２〜１．６のような値を示し、検出感度が成分により大きく異なる。したがって定量分析を行う際には成分ごとに検量線を求める必要がある。検量線はべき乗関数的に曲がるため、最低５ポイントの値を求める必要があることから、非常に煩雑な実験操作が必要となる。このため定量分析は可能ではあるが、定量分析向きの検出器とは言い難い。また脂質分析に於いては、通常測定対象物は多様な成分を含んでおり、成分の分子構造を決定するために検出器より排出された移動相を分取して、マススペクトルやガスクロマトグラフィー用の検体として用いることが行われる。ＥＬＳＤの場合、分離カラムから排出された移動相は、ガスにより噴霧された後、気流となって検出部を通過し排気されるため分取することが困難である。

ＥＬＳＤの使用環境は、移動相の溶媒を噴霧するためのガス供給源、例えば、窒素ボンベやエアコンプレッサーが必要であり、さらに移動相の溶媒を噴霧し蒸発させた排気ガスを室外へ放出するための排気装置が必要となるため、他の検出器に比べより限定された使用環境となる。また有機溶媒を含んだ排気ガスを排気するため、環境へ負荷をかけるという点において芳しくない。

本発明者は、脂質が水に溶解しないこと、脂質の分離に用いられる移動相の溶媒が、アセトニトリル、アセトン、メタノール、水、リン酸、酢酸、リン酸塩など水に対する溶解度が高い溶媒が多用されているという点に着目し、分離カラムから分離排出される測定対象物の成分を含む移動相液流に、水を主成分とした高極性液体を混合し、移動相の極性を極端に高くすることで、測定対象物の成分のみが沈殿析出し濁りを生じさせることができ、その濁りを検出することにより、測定対象物の成分量が求められるであろうと推測した。そして推測に基づいた実験を行ったところ、想定以上に良好な結果が得られ本発明を完成させるに至った。

前記のように、脂質の液体クロマトグラフィー分析に於いては、ＥＬＳＤが多用されている。しかしＥＬＳＤは、測定対象物の成分量と検出値との間には一次関係が成り立たず、その検量線はべき乗関数的に曲り、かつ測定対象物成分ごとに感度が異なるため定量性が劣っていた。また、測定対象物を含む移動相はガスにより噴霧気化され、検出部から気流として排出されるため、測定対象物の成分を分取することができなかった。さらに、ガス供給源や排気ガスを室外へ逃がすための排気装置などが必要で、使用環境が限られている上、有機溶媒を含む排気ガスを環境に排出するという欠点があった。従来技術の前記欠点をすべて解消し、定量性に優れ、分取が可能で、使用環境を選ばない全く新しい原理の液体クロマトグラフ用検出器を提供することにある。

以上の課題を解決するために、分離カラムから排出する移動相の液流に、水を主成分とした高極性液体を混入し、移動相に溶解している測定対象物の各成分を沈殿として析出させるための高極性液体混合手段と、前記高極性液体混合手段の下流にあって、沈殿により生じる濁りを検出する濁り検出手段を具備した液体クロマトグラフ用濁り検出器により解決することができる。

本発明によれば、測定対象物の成分量と液体クロマトグラフ用濁り検出器から得られる検出値を一次関数で与えることができ、成分が異なっても均一の感度が得られることから理想的な定量分析が可能となる。また検出器から排出される移動相は、測定対象物の成分を含む液体であるため分取が可能となる。本発明の検出器は、特別な設備を必要としないため、使用環境は限定されることはない。また、検出器からは液体が排出され、廃液容器内にすべて回収することができることから、環境に対し負荷をかけることはない。

以下、本発明を詳細に説明する。図１は、本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器を実施するための一態様を模式的に示す説明図であり、図２は本発明の濁り検出器に配置される濁り検出手段の一態様を模式的に示す説明図である。図５は、濁り検出手段の別の態様を模式的に示す説明図である。図２に示す濁り検出手段の態様は、透過光量の変化を検出する態様であり、図５に示す態様は、散乱光量の変化を検出する場合の態様である。

図１に示す態様では、移動相ボトル１から送液ポンプ２によって吸引された移動相は、分離カラム４へ向かって一定流速で送液される。送液ポンプ２と分離カラム４の間には、測定対象物溶液を注入するためのサンプルインジェクター３が配置されている。サンプルインジェクター３で注入された測定対象物は、分離カラム４を通過することにより各成分に分離され、分離カラム４より順次排出される。分離カラム４の下流には濁り検出器５が接続されており、濁り検出器５にて各成分が検出され記録器９にてクロマトグラムとして記録される。一方、濁り検出器５を通過した移動相は、廃液として廃液ボトル８に回収される。廃液ボトル８の代わりにフラクションコレクターを接続することにより、各成分を分取することも可能である。濁り検出器５は、高極性液体混合手段５ａと濁り検出手段５ｂから構成されており、高極性液体混合手段５ａには高極性液体供給ポンプ６が接続され、高極性液体ボトル７より高極性液体が一定流速にて供給され、高極性液体混合手段５ａにて移動相の流れと合流して混合される。高極性液体混合手段を通過することで移動相は極性が高くなっており、低極性である脂質などの成分が存在すると、沈殿となり析出し、濁りのある流体となって濁り検出手段５ｂへ送られ濁りとして検出される。ここで高極性液体供給ポンプ６は濁り検出器５の外側に配置されているが、濁り検出器５の構成要素として、同一筐体ないに収めることも可能である。

本発明における高極性液体は、水または水を主成分とする水溶液であれば特に限定されたものではなく、水、界面活性剤などの機能性有機物を水に溶解させた水溶液、メタノールなどの有機溶媒入り水溶液、酸性水溶液、アルカリ性水溶液および金属塩入り水溶液などを用いることができる。また必要に応じて、色素、蛍光剤または水溶性ポリマーなどを添加することもできる。

本発明における濁り検出器５の高極性液体混合手段５ａは、移動相と高極性液体が十分に混和できるものであれば特に限定されるものではない。最も簡単な手段としては、ユニオンティーのような三方継ぎ手を用いればよい。ただしこの場合には、混合効率が悪いため、適当な長さのミキシングコイルを下流に接続することが望ましい。好ましくは、低容量のダイナミックミキサーまたはスタティックミキサーを使用する。また溶解度を一定にコントロールするために、高極性液体混合手段５ａは恒温に保たれることが望ましい。

本発明における濁り検出器５の濁り検出手段５ｂは、高感度に濁りが検出できればその原理は特に限定されるものではなく、透過光、散乱光、表面散乱光、および散乱光と透過光の同時検出などを用いることができる。図２は、透過光を検出する場合の一態様であり、光源１０から放射された光は集光レンズ１２にて集められフローセル１３に照射される。フローセル１３を透過した光は、受光レンズ１４に集められ受光素子１６で透過光が検出され、演算増幅器１７で増幅され矢印Ｃに電気信号として出力される。図３は、フローセルを用いない落下水流型であり、矢印Ａから導入された移動相は、ノズル１９から流れ落ちリザーバー２０に受けられる。光源２１から放射された光は、レンズ２２を通り移動相の落下水流に当てられる。移動相に濁りがあれば濁りの粒子により散乱光の矢印Ｄが生じ、その散乱光を受光素子２４で検出する。図３では、９０°側方散乱光を検出しているが、検出角度は特に限定されたものではなく、光源の種類などに応じて前方散乱、後方散乱、或いは積分球により全散乱光を検出してもよい。光源２１から放射された光は、最終的に光トラップ２３により完全にトラップされ、迷光の発生を防止している。図３の態様は、フローセルを用いない落下水流型であるが、フローセルを用いても同様に実施することができる。この落下水流型の最大の利点は、測定対象物のフローセルへの付着を考慮しなくても良い点である。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

本実施例では、図１に示す本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器の一態様を、濁り検出手段は図２に示す透過光検出を用い、逆相クロマトグラフィーによりトリグリセリドの分子種分析を行った。図１における高極性液体７は０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を使用し、高極性液体供給ポンプ６は、ダブルプランジャーポンプを使用した。尚、界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用する理由は、測定対象物がフローセル１３に付着するのを防止するためである。５ａの高極性液体混合手段は、ユニオンティーを用いその下流に１ｍのミキシングコイルを接続した。図２の光源１０には４００ｎｍの分光された単色光を用い、フローセル１３は光路長１ｃｍの石英セルを使用した。受光素子１６はフォトダイオードを用い、演算増幅器１７にて透過度の逆数の対数としてＣから記録器へ出力した。

分離カラムは内径４．６ｍｍ長さ１５０ｍｍのＯＤＳカラムを用い、移動相にはアセトニトリル：アセトン＝３：７（容量比）を用い０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速に設定した。高極性液体の流速は１．５ｍＬ／ｍｉｍに設定した。測定対象物として、市販のトリグリセリドであるトリラウリン、トリミリスチン、トリオレインをそれぞれ２ｍｇ／ｍＬの濃度の混合液になるようアセトンで調製し、それを原液として希釈列溶液を調製した。このように調製した溶液を２０μＬ注入しクロマトグラムを得た。得られたクロマトグラムのピークの積分値（μＶ・ｓｅｃ）を求め、その結果より検量線の近似式を求めた。

結果を図４および図５に示した。図４に示すようにベースラインは非常に安定しており、ピーク１（トリラウリン）、ピーク２（トリミリスチン）およびピーク３（トリオレイン）ともに同程度の大きさのピークが得られた。図５は、トリラウリン（Ｌａｕ）、トリミリスチン（Ｍｙｒ）およびトリオレイン（Ｏｌｅ）の検量線である。従来のＥＬＳＤは、分子種の違いによりその検出感度は大きく異なることが知られているが、本発明の濁り検出器は、前記３種類の分子種の検量線がほぼ同一曲線となり、分子種の違いによる検出感度の差がなく、均一の感度が得られることが判った。このことは、クロマトグラム上のピークの大きさと、測定対象物に含まれる成分量が視覚的にも一致することになり、検出器特性としては理想的である。さらに驚くことには、図５に示した各分子種の検量線の近似式は、いずれもＹ＝ＡＸ＾２に限りなく近似していることが判明した。

実施例１の結果より、検量線がＹ＝ＡＸ＾２となることが判明したため、平方根演算増幅器の挿入実験を行った。すなわち検出器からの出力Ｙの平方根をとれば、測定対象物成分量Ｘに対し一次関数となるはずである。本実施例では、図１に示す本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器の一態様を、濁り検出手段は図２に示す透過光検出を用い、図２で示すように平方根演算増幅器１８を挿入した。それ以外の実施条件は実施例１と同様とし、トリラウリン、トリミリスチンおよびトリオレインの検量線を求めた。

図６にその結果を示した。図６で分かるようにトリラウリン（Ｌａｕ）、トリミリスチン（Ｍｙｒ）およびトリオレイン（Ｏｌｅ）の検量線は一次関数の直線で得られ、しかも原点を通過するほぼ同一の直線となった。したがって定量分析を行うときの検量線は１点の既知量にて検量線を作成する、所謂一点検量線法にて定量分析が行えることから非常に簡便となる。また検出感度が分子種に依存していないことから、分析により得られたクロマトグラムの各ピーク面積の比は、そのまま各測定対象物成分量の比となるため、測定対象物の純度を求める場合などは検量線を求める必要がなく、検出器としては最適な特性が得られた。

本実施例では、図１に示す本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器の一態様を、濁り検出手段は図３に示す側方散乱光検出を用い、代表的なリン脂質であるレシチンの順相クロマトグラフィーによるクラス分析を行った。図１における高極性液体７は１００％純水を使用し、高極性液体供給ポンプ６はダブルプランジャーポンプを使用した。５ａの高極性液体混合手段は、市販のスタティックミキサーを用いた。図３の光源２１には６５０ｎｍの半導体レーザーを、レンズ２１にはコリメーターレンズを用い平行光線を落下水流に照射した。受光素子２４は、光電子増倍管を用いて増幅器２５にて電圧値としてＣから記録器へ出力した。

分離カラムは内径４．６ｍｍ長さ１５０ｍｍの５μシリカカラムを用い、移動相にはアセトニトリル：メタノール：水＝５０：４５：６．５（容量比）を０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速に設定して使用した。高極性液体の流速は２ｍＬ／ｍｉｍに設定した。測定対象物として、大豆レシチン精製物のエタノール溶液を２０μＬ注入しクロマトグラムを得た。

結果のクロマトグラムを図７に示した。ピーク３が目的のレシチン由来のピークであり、順相クロマトグラフィーにおいても安定したベースラインが得られた。このように、落下水流型による散乱光検出においても良好なクロマトグラムを得ることができた。

本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器の一態様を模式的に示す説明図である。 本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器の濁り検出手段の一態様を模式的に示す説明図である。 本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器の濁り検出手段の別の態様を模式的に示す説明図である。 本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器で得られるトリグリセリドのクロマトグラムである。 本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器で得られるトリグリセリドの検量線である。 本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器で平方根演算増幅器を挿入した場合に得られるトリグリセリドの検量線である。 本発明の液体クロマトグラフ用濁り検出器の濁り検出手段の別の態様で得られるレシチンのクロマトグラムである。

符号の説明

１・・・移動相ボトル；２・・・送液ポンプ；３・・・サンプルインジェクター；４・・・分離カラム；５・・・濁り検出器；５ａ・・・高極性液体混合手段；５ｂ・・・濁り検出手段；６・・・高極性液体供給ポンプ；７・・・高極性液体ボトル；８・・・廃液ボトル；９・・・記録器；１０・・・光源；１１・・・スリット；１２・・・集光レンズ；１３・・・フローセル；１４・・・受光レンズ；１５・・・スリット；１６・・・受光素子；１７・・・演算増幅器；１８・・・平方根演算増幅器；１９・・・ノズル；２０・・・リザーバー；２１・・・光源；２２・・・レンズ；２３・・・光トラップ；２４・・・受光素子；２５・・・増幅器

Claims (1)

1. 有機溶媒などの移動相を一定の流速で送液するための送液ポンプ、移動相の液流に測定対象物溶液を導入するためのサンプルインジェクター、前記サンプルインジェクターの下流に接続され、シリカゲルなどの固定相を保持した分離カラム、前記分離カラムから順次排出される測定対象物の各成分を検出するための検出器を具備した液体クロマトグラフに於いて、分離カラムから排出する移動相の液流に水を主成分とした高極性液体を混入し、移動相に溶解している測定対象物の各成分を沈殿として析出させるための高極性液体混合手段と、前記高極性液体混合手段の下流にあって、沈殿により生じる濁りを検出する濁り検出手段を具備した液体クロマトグラフ用濁り検出器。

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