JPH09503064A - 液体中の物質を検出する新規な方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 液体中の物質の濃度を測定する方法において、液クロマトグラフィーまたは細管電気泳動により物質がまず分離され、そして引続いて、液体流の屈折率を一つより多くの波長でモニターすることにより物質が検出され、また検出工程が屈折率の波長に伴う変動の定量的評価からなり、そしてこの定量的評価は、波長に関する屈折率の差、微分または微係数の計算、あるいは積分、主成分分析、PLS（部分最小二乗法）、因子分析またはカーブフィッティングを包含する。

Description

【発明の詳細な説明】 液体中の物質を検出する新規な方法 本発明は液クロマトグラフィー分離または細管電気泳動分離において一つまた はそれ以上の物質を屈折率測定により検出（refracto-metric detection）する ことに関する。 細管電気泳動および液クロマトグラフィーは性能が非常に高い十分に確立した 新式の分離方法である。液クロマトグラフィーおよび毛細管電気泳動のための理 想的な検出器は、例えば（ｉ）濃度を測定するので小形化が可能であり、（ii） 十分に低い濃度検出限界（＜１μＭ）を示し、（iii）カップリングまたは特殊 検出セルでのゾーン拡大を避けるためにカラム上での応用が可能であり、（iv） 検出の時定数のために分解能が低下しないように、迅速であり、また（ｖ）簡単 で、堅牢でまた安価であるべきである。 上述した分離方法に関係して現在最も普及している技術は、紫外線または可視 光線の吸収である。しかしながら、吸光度は吸収物質の濃度にでなくむしろ光線 の径路にある吸収物質の量に比例するので、吸光度による方法は小形化するのに 不適当となる。この結果、この技術の場合、小形化された装置の感度が劣悪であ ることが認められる。 別な一つの技術は蛍光測定である。この技術でも濃度よりむしろ量が測定され るので、この技術は小形化に不向きであろう。しかし、蛍光法はその質量感度が 極めて高いので小形化は実際には可能である。他方、計器は複雑でそして高価で あり、またこの方法は迷光、バックグラウンド蛍光、消光および化学的な基質中 で変異のような阻害的な現象に対して敏感でもある。 検出のための第三の別法は屈折率測定である。この技術は一層広汎に応用可能 であり、また目的とする物質が蛍光を吸収もせず発出もしない場合にも採用でき る。しかしながら、屈折率の測定は多くの阻害的な現象、例えば温度および圧力 の変動によって影響をうけるので、現在利用可能な屈折率測定検出器の感度およ び信号対ノイズ比は満足なものでない。このことは、細管電気泳動および液クロ マトグラフィーでの屈折率測定の魅力を低下させる。屈折率測定が汎用的な（選 択的ではなく）技術である点は、様々な応用において利点でありあるいは不利な 点であろう。屈折率測定の一つの利点は、液体の屈折率が溶解された物質の濃度 によるということである。従ってこの技術によって確かに小形化が可能であり、 そして細い分離カラムまたは毛細管にもこの技術が応用できよう。さらに、屈折 率測定は迅速性のある技術であり、また屈折率測定器は一般に簡単で、堅牢でま た安価な測定器である。 屈折率測定の感度および選択性に関して上記した欠点は、屈折率が単一の波長 において測定される慣用的な屈折率測定にかかわっている。屈折率測定技術を改 善し、そして一つより多い波長で屈折率を同時に測定することによって上記の欠 点を克服するためにいくつかの提案がなされてきた。 US，A，4 704 029において、A．van Heuvelenは血液の屈折率を測定すること により、血中のグルコース濃度を直接に（先行する何らかの分離段階なしに）測 定するための方法を記載している。この発明の一つの態様においては、グルコー スの異常分散領域での最大および最小屈折率に対応する二つの波長において屈折 率が同時に測定されそしてこれら二つの波長での屈折率の差がグルコースの濃度 の尺度として採用された。これの利点は測定がグルコースに対して特異的になさ れたことであった。 Anal．Chem．（1988年）の60号、2609ページにG．Gauglitz，J．Krause-Bonte ，H．SchlemmerおよびA．Mattesは液クロマトグラフィーに関し、いくつかの波 長で屈折率を同時に測定する方法を述べている。これの考え方は、異常分散の領 域内で測定し、そして分析される物質の同定が可能となるであろう屈折率のスペ クトル的な情報を得ることであった。 国際特許出願PCT／SE92／00558においては、検知表面に対する化学的相互作用 を表面層の屈折率の変化として測定することに基礎をおくあるタイプの表面プラ ズモン共鳴（SPR）のおよび関連するアッセイの感度を増大する手段として異常 分散の測定がやはりA．Hanningにより記載されている。上記の変化は、屈折率を 増大する化学種の検知表面への結合またはこれからの離脱にかかわりがあるある いはそれらに影響を与える検体によって惹起される。一層特定的にいうと、特定 のアッセイにおいて使用する屈折率増大用の化学種、望ましくは染料または発色 団分子の最大吸光率に測定波長を合致させることにより、そして特に測定波長が 、吸光率の波長に関する負の微係数の最大値にほとんど相当するようにすること により、感度が増大される。これは、特定の測定器のまたは応用での測定波長に 適合するように屈折率増大用の化学種を測定することあるいは特定の屈折率増大 化学種に適合するように測定波長を選定することのいずれかにより達せられよう 。 国際特許出願PCT／SE94／00045においてA．Hanningは、液クロマトグラフィー 分離または細管電気泳動分離において全体の屈折率を 測定することにより検体を決定する方法であって、上記の測定波長または少くと も一つの測定波長での屈折率が高い化学種によって検体が標識されることを特徴 とする方法について記載している。さらに国際特許出願PCT／SE94／00762におい てA．Hanningは、液クロマトグラフィー分離または細管電気泳動分離において、 移動相中の化学種の検体による置換を屈折率の変化によって測定することにより 検体を決定する方法であって、置換される化学種が上記の測定波長または少くと も一つの測定波長で高い屈折率を有することを特徴とする方法について記載して いる。 本発明によると、一つより多い波長において屈折率を同時に測定するという基 本的原理がさらに改善されそして一層ひろく応用されうることが現在見出されて いる。 均質なすべての光学的物質（つまり、この場合は液体溶液）については、吸収 スペクトルと屈折率スペクトルとの間に普遍的で明瞭な関係がある。その最も一 般的な場合、この関係はKramers-Kronigの光分散の式（例えば、フィラデルフィ アのSaundersにより1976刊行のN.W．Ashcroft、N.D．Merminの「Solid state ph ysics」の付録を参照）により記述される。吸収ピーク（共鳴波長）の近傍での 屈折率の変化は、吸光率の波長に関する負の微係数（negative derivative）に より簡単にそして概略的に近似できる。屈折率は吸光率の波長に関するその微係 数の最大値の近傍で（つまり共鳴波長より僅に大きい波長において）最大値を示 し、また吸光率の波長に関するその微係数の最小値の近傍で（つまり共鳴波長よ り僅に小さい波長において）最小値を示す。波長に伴う屈折率の変化は分散と称 される。屈折率が最小および最大である区間の波長領域は異常分 散領域と称される。分散は正常領域と異常領域とにおいてそれぞれ符号を異にす る。吸収と屈折率との局所的近似としての簡単な関係はニューヨークのWileyに よって1983年に刊行のC.F．BohrenおよびD.R．Huffmanの「Absorption and scat tering of light by small particles」中に記載されている。この局所的近似を 出発点として、最大値と最小値の間の屈折率の差は吸光係数の最大値に比例する 。液体中に溶解した物質の場合このことは、最大値と最小値との間の屈折率の差 （または吸収ピークの近傍で任意に選んだ二つの波長の間での屈折率の差）は、 溶解した物質の吸光率とその濃度との積に比例することを意味する。このことは 下記の例によって実験的にも示される。すなわち、 △ｎ ∝ ａ＊ｃ （１） であり、△ｎは屈折率の差、ａは吸光率、そしてｃは濃度である。この表現は定 量的な吸収分光学に関する下記の周知のLambert-Beerの法則と同様に普遍的に妥 当する。 Ａ＝ａ＊ｂ＊ｃ （２） ここでＡは吸光度、またｂは物質を透過する光線の径路長である。これらの二つ の表現は似ているが、重要な一つの差は、Lambert-Beerの法則にはｂという因子 が含まれていることであり、このことは吸光度が径路長の減少につれて低下し、 また系を小形化するときに吸光度の測定感度が悪化することを意味する。屈折率 の差を記述する表現には因子ｂは含まれず、従って小形化に際して屈折率の測定 感度が悪化しない。 要約すると、１）吸収スペクトルまたは屈折率スペクトルを測定するとき、原 則として同一の情報（Knamers-Kronigの式により与え られるような）が与えられる。２）吸光度および屈折率の差はともに濃度に対し て直線的に相関する（上記の式（１）および（２）により表わされるように）。 ３）吸光度の検出の感度は小形化に際して悪化するが、屈折率の検出の感度は悪 化しない（上記の式（１）および（２）により表わされるように）。 本発明はその最も広汎な局面において、液体クロマトグラフィーまたは細管電 気泳動によって物質がまず分離され、引続いて一つより多くの波長において液体 流の屈折率をモニターすることにより検出され、そして検出の工程は波長に伴う 屈折率の変化の定量的な評価からなることを特徴とする、液体中の物質の濃度を 測定する方法を提供する。 この方法は検体のタイプに何らの制限も加えないが、測定波長に近接して、高 い吸光率を有する検体に対して最大の感度が得られる。この方法は赤外線、可視 光線または紫外線の波長領域において用いうるが、検体が高い吸光率を有する領 域の近傍に測定波長が選ばれるならば、最高の感度が得られる。この方法は、分 離に利用されるクロマトグラフィー分離または電気泳動分離の方式に何らの制限 も加えない。分離方式には、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー 、イオンクロマトグラフィー、イオン対クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマト グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、毛細管帯域電気泳動、毛細管 イオン電気泳動、ミセル動電毛細管クロマトグラフィー（MECC）、等速電気泳動 、毛細管ゲル電気泳動および等電点電気泳動が含まれるが、これらには限定され ない。本発明の目的のために考えうる他の分離方式は技術上熟達する者にとって は明らかであろう。この方法は測定に使用する屈折計の 型式に何ら制約を加えない。屈折計の型式には、偏向屈折計、干渉計、フレネル 屈折計、表面プラズモン共鳴屈折計、および光学導波管屈折計が含まれるが、こ れらに限定されない。本発明の目的のために考えうる他の屈折計は技術上熟達す る者にとって明らかであろう。 US，A，4 704 029（前記参照）中にvan Heuvelenによって記載された方法と比 較するとき、本発明の概念はいくつかの本質的な技術上の差異を示す。まず第１ にVan Heuvelenは、同定されたあるいは同定されていない他のいくつかの物質の 混合物中のただ一つの物質の濃度を、二つの波長での屈折率の差を単に測定する ことによって決定することは事実上不可能であることを理解していない。このた だ一つの物質にとって特定的な二つの波長を見出す機会はほとんど無視でき、ま た他の物質が同定されていないならば一層そうである。例えば血液中のグルコー スを測定すべき場合、いくつかの他の分子、例えば別な種類の糖および炭水化物 がグルコースと同じ領域で吸収を行なうであろうから、測定が妨害される。本発 明概念にあっては、この問題は屈折率測定を化学的分離段階、つまり液クロマト グラフィーまたは細管電気泳動と組合わせることによって解決される。このよう にして異なる物質はすべてまず分離され、次いで一つずつ検出されるので、未知 の物質の複雑な混合物例えば血液を分析することが可能になる。第二にvan Heuv elenは特定の一つの物質を測定するために特定的な二つの波長を利用するので、 波長はこの物質に対して特定的である。複雑な混合物中の異なるいくつかの物質 の濃度を測定するために、それぞれの物質について二つの特定的な波長を知らね ばならないであろうが、これは実際的にも理論的にもともに 不可能である。液クロマトグラフィーおよび細管電気泳動に関する本発明概念に あっては、二つまたはそれ以上の固定した波長が使用され、従って波長は任意の 単一な物質に対して特定的でない。溶出する物質はすべて検出されようが、感度 は変化する（いくつかの物質は零に近い感度を示しさえするだろう）。第三にva n Heuvelenの方法は異常分散領域に明確に限定される。van Heuvelenの方法は、 分散が正常領域と異常領域とにおいてそれぞれ異なる符号をもつ事実を基礎にお く。 本発明概念は異常領域に限定されずまた分散の符号に対して何らかの要請をし ない。モニターされるのは符号が正であれまたは負であれ分散の大きさであり、 従って本発明の方法は正常領域と同様に異常領域にも適用できる。 G．Gauglitzらによって提案される方法（前記参照）と比較して、本発明の概 念は著しく改善された方法をなしている。Gauglitzはいくつかの異なる波長にお いて屈折率の絶対値を同時に測定するが、彼は定量を行うために分散（広い意味 で、波長に関する屈折率の差、微分または微係数のように、波長に関する屈折率 の変化をいう）を全く利用しないかあるいは利用の可能性について言及さえしな い。定量を行うために分散を用いることはたとえ暗黙のうちにせよGauglitzには わかっていないことは明らかである。逆に彼は温度変化、圧力変化および機械的 な不安定さが屈折率の絶対値に影響することを明確に指摘するが、もし屈折率の 絶対値の代りに分散をモニターするならば、これらのノイズ源のすべてが大巾に 相殺されるだろうことを理解していない。さらにGauglitzは、彼の提案する方法 に関する「現在の最新技術」を、屈折率が時間に対してプロットさ れているクロマトグラムと明確に規定しているので、この場合にも彼は定量を行 うために分散つまり波長に関する屈折率の変化を用いない。 国際特許出願PCT／SE92／00558（前記参照）と比較し、本方法は表面の相互作 用の検出に関係せずまた屈折率を増大する化学種も何ら使用しない。国際特許出 願PCT／SE94／00045（前記参照）と比較し、本方法は検体の標識化を利用しない 。国際特許出願PCT／SE94／000762（前記参照）と比較し、本方法は検体によっ て置換される物質の検出を利用しない。 本発明の方法においては、波長に関する屈折率の変化は液体中の検体の濃度に 関係づけられる。本方法の最も簡単な態様においては、異なる二つの波長で屈折 率がモニターされ、そして測定した屈折率の差が液体中の検体の濃度に関係づけ られる。屈折率の差は前記した式（１）に記述するように濃度に対して直線的に 相関される。別な態様においては、離散している二つより多くの波長においてあ るいは連続する波長区間にわたって、屈折率が連続的にモニターされる。やはり 定量化は、二つの値の間での単純な差の算出として行なわれ、あるいは定量化の 手続きは、得られた屈折率スペクトルの微分、微係数算出、または積分からなっ てよく、あるいはこの定量化手続きが、例えば主成分分析（PCA）、部分最小二 乗法（PLS）および因子分析のようなスペクトルの定量的評価のための多変数技 術を含めて通例の任意の技術を含んでよい。異なる物質の分離が不十分な（つま り溶出ピークが重なり合う）場合、あるいは基線が安定でない（例えば基線が傾 きあるいは変動する）場合、例えばカーブフィッティングまたは上記したような 多変数技術を用いることにより分解 能が向上するであろう。 本方法の別な局面においては、検体の構造を決定しあるいは検体を同定するた めに、波長に関する屈折率の変化についての情報を用いることができる。この局 面での一つの態様においては、二つの波長において屈折率が測定されそして分散 の符号および大きさが定性分析のために用いられる。これは単一の波長での測定 に似ており、これもまた構造に関して限定された情報を与える。別な一つの態様 においては、別個な二つより多くの波長においてあるいは連続する波長区間にわ たって屈折率が連続的にモニターされる。この場合には検体の構造を決定しある いは検体を同定するためにスペクトル情報を用いることができる。この場合にお ける定性的解析のために、スペクトルの評価のための十分に確立された多くの方 法、例えば微分、微係数算出、積分、PCA、PLS、因子分析、カーブフィッティン グまたは収集された屈折率値とのまたは参照スペクトルとの比較が用いられてよ い。 時間的変動に基づく様々なノイズ源が、何らかの影響を及ぼすことのないよう に、異なる波長での異なる屈折率測定は同時にあるいは極めて迅速に逐次的に行 なわねばならない。二つの波長で測定を行う場合、異なる二つの検出体を照射す る（下記の例のような）、あるいは急速に回転するフィルターと組合わされた一 つの検出体を照射する、二つの発光波長を有する一つの光源、あるいは点滅を交 互に急速に継続する波長の異なる二つのレーザーを例えば利用できる。広い波長 範囲にわたって測定する場合、例えば、いくつかの輝線を有するまたは広い発光 スペクトルを有するランプをモノクロメーター（異なる波長がすべて試料に通過 させられるので時にはポリ クロメータと称される）およびダイオードアレイまたはCCD検出体と組合わせて 利用することができる。測定を同時にまたは迅速に逐次的に行うために他に考え られる技術的な解決方法は、技術上熟達する者には明らかであろう。 一般の屈折率測定による検出については、屈折率の絶対値を実際に測定する必 要はない。重要なことは時間を追って変化をモニターすることであり、従って屈 折率または、例えば偏向角、光度または位相角のように屈折率と関連するなにか の特性を測定すれば十分である。 本発明概念は慣用的な単一波長の屈折率測定と比較して多くの利点を有する。 屈折率の絶対値を測定する代りに、屈折率の波長に関する変化を一定の時間に測 定する（スナップショットをとる）ことにより、例えば温度および圧力の変動、 および機械的変動のような前述したノイズ源の影響が減少し、信号対ノイズ比が 増加しまた感度が改善することになろう。いくつかの波長での測定により、分析 のために用いうるスペクトル的な情報が得られる。慣用的な屈折率測定の利点つ まり小形化の可能性、迅速性、単純さ、堅牢性および低価格はすべて依然として 確保される。慣用的な単一波長屈折率測定は、複数波長での測定のために設計さ れた屈折計によって実施できる。従って単一波長でのそして複数波長での測定が 、ただ一つの検出セル内で同時に実施できる。 ずっと前に述べた液クロマトグラフィーまたは細管電気泳動のための理想的な 検出器に関する基準に、本発明の概念を利用する屈折計が合致することは容易に 理解されよう。 次に、本発明の方法を以下の限定的でない実施例において例示す るが、添付の図面も参照されたい。 図１は本実施例で使用する実験手段の略解図である。 図２は本実施例で使用する液体を取扱う系を示す略解図である。 図３は本実施例で使用する染料、HITCに関する屈折率スペクトルを示す図であ る。 図４はHITCの濃度に対するレーザーの光点の距離のプロットである。 実施例示差屈折計 図１に図式的に示すように実験用の示差屈折計を構成した。この計器はそれぞ れ１、および２の二つのレーザー、プリズム形状の流 カメラ６からなった。 レーザー１および２は光を平行にする光学素子を有するダイオード型のもので あった。レーザー１は660nm（一層詳細には658.5nm）の波長を有し（Melles-Gri ot）、そして電圧装置（Mascot Electronics Type 719）により駆動された。別 なレーザー２は780nmの波長を有し（Spindler & Hoyer）そして第二の電圧装置 であるDiode Laser DL 25 Control Unit（Spindler & Hoyer）によって駆動され た。二つのレーザー１および２は鋼板７上に互いに直角に取付けた。 二つのレーザー光線が交叉する点に、黒くした真鍮の管（図示せず、内径は20 ミリ）を鋼板７に固定した。真鍮の管はスリットを有し、その内部に約700nmで カットオフをする短波長通過フィルター８（Melles-Griot）を、光線の方向に対 して45°の角度をなすように取付けた。このフィルターはレーザー１の660nmの 光線を透過さ せるが、レーザー２の780nmの光線は反射し、その結果、二つの光線を同時に存 在させるという効果を生む。直径１ミリの開口は出口スリットの役をした。 次に、流れキュベット３、つまり液クロマトグラフィー屈折率検出器（スウェ ーデンのUppsalaのPharmacia LKB Biotechnology AB）のための市販の二重プリ ズムセルキュベット（斜辺が互いに向い合っている、容積が８μｌの1.5×７ミ リの二つの45°プリズムセルからなる）を、真鍮の管の出口スリットと連結する ように真鍮管の外側にねじ込んだ。キュベット３の二つのプリズムセルの一つだ けを用いて、以下に述べる液を取扱う簡単な系に管（図示せず）によって連結し た（他のセルは空のままであった）。 鋼板７をアルミニウム板９の一方の端にスクリューボルト10により回転するよ うに取付けた。Panasonic Power Supply WV-CD52によって駆動されるCCDカメラ ４（Panasonic WV-CD50）をアルミニウム板９の他の端に、プリズムキュベット ３から約0.8ｍの距離において（以下に述べる一連の試験ごとに少し変わる）、 マイクロメータのねじで垂直方向に調節可能なように取付けた。迷光を遮蔽する ためにCCDカメラを覆うように、黒い鋼の曲ったフードを置いた。 CCDカメラの画像をテレビ画面５（Electrohome、10インチ）に投影し、透明な 方眼パターン（１ミリ方眼紙を1.4倍に拡大してオーバーヘッドフィルムにコピ ーしたもの）をテレビ画面にテープで取り付けた。透明な方眼パターンは、パタ ーン上の方眼を数えることによりテレビ画面５上での距離を測定するために使用 した。約0.5ｍ した。CCDカメラ４からテレビ画面への拡大率は約30倍であった。 二つのレーザー光線のそれぞれのくっきりした対称的な光画像（１〜1.5ミリ の光点）がＴＶ画像上で重なって得られるように、レーザー１および２は横方向 および垂直方向にそして真鍮管は横方向に調節した。一般的な方策としては、低 いレーザー強度、画面上での高いコントラストおよび¹/₄秒の露出時間を採用し た。次いで肉眼ではっきりした画像が得られるまで輝度を調整し、そして最後に 、鮮明な画像が写真上に得られるまでダイアフラムを調整した。 光点の位置はテレビ画面５の写真を撮影し、次いで光点の左端と右端の位置を 決定するように顕微鏡内でチェックをかぞえた。各光点の中心は左端と右端の中 央であると仮定した。液を取扱う系 使用した液を取扱う系を図２に示す。この系は蠕動型のポンプ（スウェーデン のUppsalaのPharmacia LKB Biotechnology ABのP1）からなった。ポンプ11は一 方で管13を経由して試料貯槽12に、また他方では管15を経由して手動の回転弁14 に連結した。管16により弁14をドレインにつないだ。図１に関して述べた流れキ ュベット３に0.4mmのカニューレ17を経由して弁14を管16で連結した。管19によ りキュベット３をキュベットドレインにつないだ。手動弁14により液体をドレイ ンまたはキュベット３にポンプで送入できた。 以下に述べる測定に際しては、キュベットを経由して液体を約23μｌ／分にて ポンプ送入した。液体を変更する時には弁をドレイン向けとし、ポンプの配管13 および15をパージするために流量を10倍に増大した。次に再び流量を減少し、弁 をキュベットへの位置に設定しそして液をキュベットを通じて少くとも15分間ポ ンプ送入し （カノューレ１７の死容積のため）てから測定を行った。染料溶液の調製 純水1000ml中に21gのクエン酸（Ｍ＆Ｂ p.a.）と23gのNaCl（Merck p.a.）と を溶解してクエン酸塩緩衝液（pH３、クエン酸塩 ら3.00に調整するように４ＭのNaOH（p.a.）を添加し、そして混合物を0.22μｍ のフィルターを通して濾過した。次に500mlのクエン酸塩緩衝液を分光写真術的 にみて純粋な500mlのエタノールと混合しそして超音波により２〜３分間均質化 した。 次に14mgのHITC沃化物（Sigma HO 387、純度94％、M_w 537g／モル；米国、ミ ズウリ州St，LouisのSigma Chemical Co.）を上記に調製したクエン酸塩／エタ ノール緩衝液の50mlと混合することにより、染料HITC（1,1′,3,3,3′,3′−ヘ キサメチルインドトリカルボシアニン）の500μＭの原料溶液を調製した。超音 波により２〜３分間均質化した後、0.45μｍのフィルターを通して混合物を濾過 した。 種々な容積のHITC原料溶液をクエン酸塩／エタノール緩衝液で25mlとなるよう に希釈して、７つの異なるHITCの濃度への一連の希釈を行った。 HITC（ml） HITC濃度（μＭ） 25 500 12.5 250 6.25 125 3.125 62.5 1.563 31.25 0.781 15.63 0 0 屈折率の測定 １mMのHITCに関する屈折率スペクトルを図３に示す（実線：理論的に計算され た曲線、×印：実験データ）。これから明らかなように、測定波長の780nm（レ ーザー２）は、屈折率のピーク領域の高波長側にあるのに対して、第２の測定波 長の660nmは屈折率が最小の平坦部にある。 前述した装置（図１および２）に関しては、液の充満されるキュベットセル（ 図３）の位置は、セルに50／50エタノール／水（純水と分光写真術的にみて純粋 なエタノール）を注射器により充満しそして二つのレーザー光線の中心がCCDカ メラ上で互いに重なるまで鋼板（７）を回転することにより調整した。キュベッ トとCCDカメラとの距離は73cmであった。 次に異なるHITC濃度について屈折率の測定を行なった。液体の取扱いは上記の 「液体取扱い系」の項で述べたように行った。光点の鮮明な画像を得るように、 染料の異なる濃度ごとに、テレビの輝度およびカメラの露出およびダイアフラム の設定を調整した。 染料の濃度ごとに２〜３分間の間隔で２枚の写真を撮った。レーザーの二つの 光点の間の距離は、方眼を数えることにより前述のように推定した。結果を図４ に示すが、これはHITC濃度の関数として光点の距離の平均値をミリメートル単位 で示す。この関係は直線的であり、その適合性は非常によく、決定係数（determ ination coefficient）は0.992である。直線の勾配つまりHITC濃度に関する感度 は3.１μｍ／μＭであり、角度単位では0.00024°／μＭであり、あるいは屈折 率単位（RIU）では2.0μRIU／μＭである。 上記に述べた実験は本発明の概念の実施可能性を明瞭に例証す る。 本発明は上記に特定的に述べた態様に限定されることは勿論ないばかりか、下 記の請求範囲に規定する一般的な発明概念から逸脱することなく多くの変更およ び変改が行なわれてよい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．液クロマトグラフィーまたは細管電気泳動により物質がまず分離され、そし て引続いて、液体流の屈折率を一つより多くの波長でモニターすることにより物 質が検出され、また検出工程が屈折率の波長に伴う変動の定量的評価からなり、 そしてこの定量的評価が波長に関する屈折率の差、微分または微係数の計算、あ るいは積分、主成分分析、PLS（部分最小二乗法）、因子分析またはカーブフィ ッティングを包含することを特徴とする、液体中の物質の濃度を測定する方法。 ２．測定が異なる二つの波長での屈折率の測定からなることを特徴とする請求項 １記載の方法。 ３．波長の少くとも一つが、測定される物質の吸光率が高い波長領域内にある、 あるいはこの領域の近傍にあることを特徴とする請求項２記載の方法。 ４．波長の少くとも一つが測定される物質の異常分散領域の外側にある請求項２ または３に記載の方法。 ５．測定が、二つより多くの離散している波長における、または連続する波長区 間内での屈折率の測定からなることを特徴とする請求項１記載の方法。 ６．離散している波長の少くとも一部、または波長区間の一部分が、測定される 物質の吸光率が高い領域内にある、またはこの領域の近傍にあることを特徴とす る請求項５記載の方法。 ７．離散している波長の少くとも一部または波長区間の少くとも一部分が、測定 される異常分散領域の外部にあることを特徴とする請求項５または６に記載の方 法。 ８．光学的測定が偏向屈折率測定、干渉測定、フレネル屈折率測定、表面プラズ モン共鳴屈折率測定または光学的導波路屈折率測定を基礎におく、請求項１から ７のいずれか１項に記載の方法。 ９．分離工程が、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオンク ロマトグラフィー、イオン対クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー 、アフィニティークロマトグラフィー、毛細管帯域電気泳動、毛細管イオン電気 泳動、ミセル動電毛細管クロマトグラフィー（MECC）、等速電気泳動、毛細管ゲ ル電気泳動または等電点電気泳動を基礎におくことを特徴とする、請求項１から ８のいずれか１項に記載の方法。