JP2008543791A - Ｐｓｐ９４診断薬およびアッセイ - Google Patents

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Abstract

血清中において、PSP94は遊離形態として生じるか、または担体タンパク質と結合する。その結合形態におけるPSP94を、前立腺癌患者の血液中で定量化し、これらの測定値は、前立腺癌の評価または予後としての有用性を示した。PSP94の遊離形態を検出するための診断アッセイ、方法、およびキット、ならびにPSP94の遊離形態に結合できる抗体などの試薬も本明細書に開示されている。

Description

本発明は、PSP94の遊離形態を検出するための診断アッセイ、方法およびキット、ならびにPSP94の遊離形態に結合できる抗体などの試薬に関する。
オスの哺乳動物に独占して見られる前立腺は、精液および血液ならびに幾つかの調節性ペプチドの幾つかの成分を産生する。前立腺は、間質細胞および上皮細胞を含み、後者群は、円柱分泌細胞および基底非分泌細胞からなる群である。これら基底細胞ならびに間質細胞の増殖により、1つの一般的疾患である良性前立腺肥厚(BPH)を引き起こす。別の一般的な前立腺疾患は、前立腺腺癌(CaP)であり、これは、最も一般的な致死的状態生理学的前立腺腺癌であり、前立腺の末梢領域の上皮細胞の悪性変換を含む。前立腺腺癌および良性前立腺肥厚は、加齢ヒト男性集団において高発生率を有する2つの一般的な前立腺疾患である。
55才超の男性の4人に約1人は、何らかの形態または別の形態の前立腺疾患を患っている。前立腺癌は、高齢男性において癌関連死亡の第二の最も一般的な死亡であり、米国において毎年185,000の症例が診断され、約39,000人の死亡が報告されている。
種々の前立腺疾患の病因の理解を得るために実施された、正常、良性および癌性前立腺により合成され、分泌された種々の物質の試験により、これらある一定の物質は、前立腺疾患の診断において免疫組織学的腫瘍マーカーとして使用できることが明らかである。正常な前立腺により分泌される3種の主要タンパク質またはポリペプチドは: (1)前立腺酸性ホスファターゼ(PAP); (2)前立腺特異性抗原(PSA); および(3)前立腺インヒビンペプチド(PIP)、ヒト精液血漿インヒビン(HSPI)またはβ-マイクロセミノタンパク質(β-MSP)としても知られている94のアミノ酸の前立腺分泌タンパク質(PSP94)であり、以後PSP94と称される。
PSP94は、単純な非グリコシル化システインに富むタンパク質であり、前立腺特異性抗原(PSA)および前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)と共にヒト精液に見られる3つの主要タンパク質のうちの1つを構成する。PSP94は、10.7kDaの分子量を有し、このタンパク質の完全アミノ酸配列は、既に決定されている。PSP94に関するcDNAおよび遺伝子は、クローン化され、特性化されている(Ulvsbackら、Biochem. Biophys. Res. Comm.、164: 1310頁、1989年; Greenら、Biochem. Biophys. Res. Comm.、167: 1184頁、1990年)。免疫化学およびインサイチュハイブリダイゼーション技法により、PSP94は、主として前立腺上皮細胞に配置されていることが示されている。しかしながら、それは、種々の分泌上皮細胞にも存在する(Weiberら、Am. J. Pathol.、137: 593頁、1990年)。PSP94は、前立腺腺癌細胞系、LNCapに発現されることが示されている(Yangら、J. Urol. 160: 2240頁、1998年)。なおその上、腫瘍細胞増殖に対する外因性PSP94の阻害効果は、インビボおよびインビトロ双方で見られており(Gardeら、Prostate、22: 225頁、1993年; Lokeshwarら、Cancer Res.、53: 4855頁、1993年)、PSP94は、腫瘍細胞における同源受容体との相互作用を介して前立腺癌増殖に対する負の調節剤であり得ることが示唆された。
天然のPSP94は、ホルモン不応性前立腺癌(および可能性として他の前立腺適応症)の治療において治療効果があることが示されている。例えば、前立腺癌内にPSP94の発現は、腫瘍グレードとして減少させ、攻撃力が増加することが知られている。腫瘍PSP94の発現は特に高グレード腫瘍における抗アンドロゲン治療の際に刺激される。参照として本明細書に組み込まれている米国特許第5,428,011号(Sheth A.R.ら、1995-06-27に発行)は、前立腺、胃腸管および乳房腫瘍の増殖のインビトロおよびインビボ阻害に使用される天然PSP94を含む製薬製剤を記載している。これらの製薬製剤は、天然PSP94単独または、例えば、マイトマイシン、イダルビシン、シスプラチン、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、アドリアマイシンおよびダウノマイシンなどの抗癌剤との混合物を含む。さらに組換えヒトPSP94(rhu PSP94)およびPCK3145などのポリペプチド類縁体の治療効果は、カナダ国特許出願第2,359,650号(参照として本明細書に組み込まれている)に記載されている。
mRNAのレベルの免疫組織学的試験および研究により、前立腺は、PSP94の主要源であることを示している。PSP94は、成体オスラットにおいてインビトロおよびインビボ双方で循環濾胞刺激ホルモン(FSH)のフィードバック制御に関与し、該ホルモンの分泌を抑制するために作用する。下垂体ならびに前立腺の双方が、PSP94の受容体部位により供給されることから、PSP94は、該双方に作用する。PSP94は、ラットの下垂体からのFSHの生合成および放出を抑制し、ならびに前立腺によるFSH様ペプチドの合成/分泌に影響を及ぼす可能性があることが立証されている。これらの知見により、インビボでの腫瘍増殖に対するPSP94の効果は、血清FSHレベルの減少に起因し得ることを示唆している。
最近、BPHまたはCaPを有する患者の血清中PSP94濃度は、正常人よりも有意に高いことが示された。正常男性に見られたPSP94の最高血清濃度は、約40ng/mlであり、一方、BPHまたはCaPを有する男性において、PSP94の血清中濃度は、400ng/mlまで観察された。
血清において、PSP94は、本性が未知の担体タンパク質に関連する遊離(非結合)形態または結合形態として生じる。結合形態(状態)のPSP94は、前立腺癌患者の血中において測定され、これらの測定値により、予後評価としての有用性が解析されている(Bauman, G.S.ら、The Prostate J. 2: 94〜101頁、2000年; Xuan, J.W.の米国特許第6,107,103号; Wu, D.ら、J. Cell. Biochem. 76: 71〜83頁、1999年)。PSP94の遊離形態および結合形態の測定は、遊離形態単独の測定よりも前立腺癌の幾つかの領域において大きな臨床関連性を有し易いことが示唆された。さらに、PSP94の双方の形態の測定は、放射線療法後の前立腺癌における無再発性間隔の正確な予測を可能にすることが立証された。しかしながら、米国特許第6,107,103号に記載されたものなど、PSP94に関する現在のアッセイは、タンパク質の結合および遊離形態を分離する精製ステップに依存し、したがって、有用かつ効率的な商品アッセイに必要な簡便性に欠いている。
米国特許第5,428,011号(Sheth A.R.ら、1995-06-27に発行) カナダ国特許出願第2,359,650号 米国特許第6,107,103号 米国特許第6,107,103号 米国特許第6,156,515号 米国特許第4,196,265号 Ulvsbackら、Biochem. Biophys. Res. Comm.、164: 1310頁、1989年 Greenら、Biochem. Biophys. Res. Comm.、167: 1184頁、1990年 Weiberら、Am. J. Pathol.、137: 593頁、1990年 Yangら、J. Urol. 160: 2240頁、1998年 Gardeら、Prostate、22: 225頁、1993年 Lpkeshwarら、Cancer Res.、53: 4855頁、1993年 Bauman, G.S.ら、The Prostate J. 2: 94〜101頁、2000年 Wu, D.ら、J. Cell. Biochem. 76: 71〜83頁、1999年 J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons(1984) J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) T. A. Brown (編集者)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、1巻および2巻、IRL Press (1991) D. M. GloverおよびB. D. Hmes (編集者)、DNA Cloning: A Practical Approach、1〜4巻、IRL Press (1995年および1996年) F. M. Ausubelら (編集者)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988年、現在までの全ての最新版を含む) Todaro GJおよびGreen H.、J. Cell Biol. 17: 299〜313頁、1963年 Puck TTら、J. Exp. Med. 108: 945〜956頁、1958年 Buckholz, R. G.およびGleeson, M. A. G.、Biotechnology、9: 1067〜1072頁、1991年 Cregg, J. M.ら、Biotechnology、11: 905〜910頁、1993年 Sreekrishna, K.ら、J. Basic Microbiol.、28: 265〜278頁、1988年 Wegner, G. H.、FEMS Microbiology Reviews、87: 279〜284頁、1990年 Protein-structure and molecular properties、第2版、T. E. Creighton、W. H. Freeman and Company、ニューヨーク、1993年 Smith,T. F.およびWaterman M. S. (1981)Ad. Appl. Math.、2: 482〜489頁 Needleman, S. B.およびWunsch, C. D. (1970)J. Mol. Biol.、48: 443〜453頁 Antibodies: A Laboratory Manual.、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年 Goding、65〜66頁、1986年 Campbell、75〜83頁、1984年 Baijal Guptaら、Prot. Exp. and Purification 8: 483〜488頁、1996年 Galfr. G.およびMilstein C、Meth. Enzymol. 73: 3〜46、1981年 Antibodies: A Laboratory Manual、編集者HarlowおよびLane、Cold Spring Harbor Laboratory
PSP94(PSP94の遊離または結合形態ならびに全PSP94)のレベルを評価する(定量化する)方法を本明細書に記載される。本発明は、PSP94またはPSP94結合タンパク質に対する特異性および改善された診断および予後アッセイ、ハイブリドーマ、キットおよびその試薬に関する。
さらに、PSP94を結合する担体タンパク質が、本出願に記載され、同定され、特性化される。
PSP94と結合する能力により、PSP94結合タンパク質および関連する抗体は、PSP94の生物活性に対する影響を与えることができ、したがって、(PSP94関連)疾患の診断および予後マーカーとして本明細書に使用できる。
より特に、本発明は、PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる(単離)抗体に関する。例えば、本発明の(単離)抗体は、PSP94/ PSP94結合タンパク質複合体に結合できなくPSP94(配列番号1)の遊離形態に結合できる。
本発明によれば、該抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系またはその抗原結合断片により産生される抗体であり得る。また、本発明によれば、該抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系またはその抗原結合断片により産生される抗体であり得る。
またより特に、本発明は、PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。本発明に使用できるハイブリドーマ細胞系の例としては、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系または特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系を挙げることができる。
本発明はまた、PSP94結合タンパク質として本明細書に同定されたポリペプチド類(配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9)、精製法、核酸ならびにアミノ酸配列および疾患の診断および予後(例えば、前立腺癌またはPSP94および/または濾胞刺激ホルモン(FSH)の異常または高レベルおよび/またはPSP94結合タンパク質の異常または高レベル)におけるこれらの配列の使用に関する。
第一の態様において、本発明は、(例えば、単離)ポリヌクレオチド(例えば、PSP94結合タンパク質をコードする)を提供し、これは、
a) 配列番号1に記載されたポリヌクレオチド、
b) 配列番号6に記載されたポリヌクレオチド、
c) 配列番号6の1392に対して配列1を有するポリヌクレオチド、
d) 配列番号6の1653に対して配列1を有するポリヌクレオチド、
e) 配列番号1に記載されたポリヌクレオチドの少なくとも10塩基の連続部分に対する配列が同一の長さにおいて10塩基と2005(または2004)塩基との間のサイズのポリヌクレオチド、および
f) 配列番号6に記載されたポリヌクレオチドの少なくとも10塩基の連続部分に対する配列が同一の長さにおいて10塩基と1876(または1875)塩基との間のサイズのポリヌクレオチド、
からなる群から選択されるメンバーを含むことができる。
好ましくは、該ポリヌクレオチドは、配列番号1に記載されたポリヌクレオチドまたは配列番号6に記載されたポリヌクレオチドまたは配列番号6の1392に対して配列1を有するポリヌクレオチドまたは配列番号6の1653に対して配列1を有するポリヌクレオチドであり得る。本発明のヌクレオチドは、特にコード化タンパク質がPSP94に結合する能力に基づいて選択できる。配列番号1は、配列番号6の類縁体を考慮できることが本明細書において理解することができる。
第二の態様において、本発明は、例えば、以下のようなポリペプチドおよびポリペプチド類縁体を提供する、すなわち、
配列番号2に記載されたポリペプチド、
配列番号3に記載されたポリペプチド、
配列番号7に記載されたポリペプチド、
配列番号8に記載されたポリペプチド、
配列番号9に記載されたポリペプチド、
配列番号2の同じサイズの連続部分と同一の長さで10と505との間のアミノ酸サイズのポリペプチド、
配列番号3の同じサイズの連続部分と同一の長さで10と592との間のアミノ酸サイズのポリペプチド、
配列番号7の同じサイズの連続部分と同一の長さで10と624との間のアミノ酸サイズのポリペプチド、
配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8または配列番号9に記載されたアミノ酸配列と同一のそのアミノ酸配列の少なくとも90%を有するポリペプチド類縁体、
配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8または配列番号9に記載されたアミノ酸配列と同一のそのアミノ酸配列の少なくとも70%を有するポリペプチド類縁体、
配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8または配列番号9に記載されたアミノ酸配列と同一のそのアミノ酸配列の少なくとも50%を有するポリペプチド類縁体、
- 配列番号2の10と505との間の連続アミノ酸長のポリペプチド、
- 配列番号3の10と592との間の連続アミノ酸長のポリペプチド、
- 配列番号7の10と624との間の連続アミノ酸長のポリペプチドまたは、
アミノ酸配列と同一のそのアミノ酸配列の少なくとも90%を有するポリペプチド類縁体、
- 配列番号2の10と505との間の連続アミノ酸長のポリペプチド、
- 配列番号3の10と592との間の連続アミノ酸長のポリペプチド、
- 配列番号7の10と624との間の連続アミノ酸長のポリペプチドまたは、
アミノ酸配列と同一のそのアミノ酸配列の少なくとも70%を有するポリペプチド類縁体、
- 配列番号2の10と505との間の連続アミノ酸長のポリペプチド、
- 配列番号3の10と592との間の連続アミノ酸長のポリペプチド、
- 配列番号7の10と624との間の連続アミノ酸長のポリペプチドまたは、
アミノ酸配列と同一のそのアミノ酸配列の少なくとも50%を有するポリペプチド類縁体。
本発明によれば、好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号2に記載されたポリペプチド、配列番号3に記載されたポリペプチド、配列番号7に記載されたポリペプチド、配列番号8に記載されたポリペプチドまたは配列番号9に記載されたポリペプチドであり得る。本発明のポリペプチドは、PSP94に結合するその能力に基づいて特に選択できる。配列番号2および配列番号3は、配列番号7の類縁体を考慮できることが本明細書において理解することができる。配列番号8および配列番号9もまた、配列番号7の類縁体を考慮できる。
さらなる態様において、本発明は、例えば、本明細書に定義されたポリヌクレオチドを含むベクターなど、免疫化組成物を提供する。7つのアミノ酸のポリペプチド(21の塩基対ポリヌクレオチド配列によりコード化された)が、抗原提供時に主要組織適合性複合体(MHC)としばしば結合することから、所望の配列長が少なくとも21の塩基のポリヌクレオチドを有することが時には好ましい。該ベクターは、例えば、配列番号1に記載されたポリヌクレオチド、配列番号6に記載されたポリヌクレオチド、配列番号6の配列1から1392を有するポリヌクレオチド、配列番号6の配列1から1653を有するポリヌクレオチド、配列番号1に記載されたポリヌクレオチドの同じサイズの連続部分と配列長が同一の21塩基と2005塩基との間のサイズのポリヌクレオチドまたは配列番号6に記載されたポリヌクレオチドの同じサイズの連続部分と配列長が同一の21塩基と1876塩基との間のサイズのポリヌクレオチドからなる群から選択されたポリヌクレオチド、および希釈剤または緩衝液を含むことができる。該ベクターは、ポリヌクレオチドからコード化されたポリペプチドを発現でき得ることが本明細書において理解できる。該ベクターは、線状または環状であり得、ポリヌクレオチド自体に加えて最少配列(例えば、ゲノム、プロモーター、CpG配列に統合するための配列)を含有し得る。本発明のポリヌクレオチドの投与(さらなるいずれの配列のない、すなわち、ベクターのない)は、所望の免疫応答を開始させるために時には十分であり得る。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に定義されたポリペプチド(配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9)、ポリペプチド類縁体、変異体、断片またはそれらの組合せおよび希釈剤または緩衝液を含む免疫化組成物に関する。本明細書に記載された免疫化組成物の任意のものの組合せによる免疫化もまた、本発明により包含されている。
該免疫化組成物は、アジュバントをさらに含むことができる。さらなる実施形態において、該免疫化組成物もまた、PSP94(天然および/または組換え)、PSP94変異体、PSP94の断片、PSP94をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、PSP94変異体をコードするポリヌクレオチド、PSP94断片をコードするポリヌクレオチドおよびそれらの組合せを含むことができる。また、該ベクターは、ポリヌクレオチドからコード化されたポリペプチドを発現でき得る。天然PSP94、組換えPSP94(例えば、rHu PSP94)、PSP94変異体、類縁体および断片に関して、カナダ国特許出願第2,359,650号またはWO 02/33090の下で公表された国際特許出願を参照されたい。
さらなる態様において、本発明は、ポリペプチド(例えば、PSP94、PSP94結合タンパク質および/またはPSP94/PSP94結合タンパク質複合体)に対する抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)を生成する(生成するための)方法に関するものであり、該方法は、本明細書に定義された免疫化組成物(ポリペプチド、ポリペプチド類縁体、ポリヌクレオチドおよびそれらの組合せなどを含む)を哺乳動物に投与することを含む。
本発明によれば、本法を用いて免疫化できる哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ラット、ブタ、および機能的な免疫系を有する他の哺乳動物が挙げられる。「機能的な免疫系を有する哺乳動物」は、抗原(例えば、体液性免疫応答および/または抗原に対する細胞免疫応答を有する)により免疫化された場合、抗体(免疫グロブリン)を産生できる哺乳動物として本明細書において理解することができる。
本発明のさらなる態様は、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系およびその抗原結合断片により産生されたモノクローナル抗体、特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系およびその抗原結合断片により産生されたモノクローナル抗体、特許寄託番号PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系およびPTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の任意のポリヌクレオチド、例えば、配列番号1、配列番号6、アンチセンス、断片、変異体、mRNAなどにより組込まれた(変換された、形質導入された、形質移入されたなど)細胞に関する。
なおさらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドの少なくとも1つ、例えば、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、変異体、断片、類縁体またはそれらの組合せを組込んでいる、および/または発現する(単離)細胞に関する。
別の態様において、本発明は、PSP94の異常(例えば、高い、上昇)レベル、またはPSP94-結合タンパク質の異常(例えば、高い、上昇)レベルに関連した状態の診断または予後、(または治療)において、本明細書に定義されたポリヌクレオチド(配列番号1、配列番号6、断片、アンチセンス、類縁体、mRNA)の使用を含む。
さらに別の態様において、本発明は、PSP94の異常(例えば、高い、上昇)レベル、またはPSP94-結合タンパク質の異常(例えば、高い、上昇)レベルに関連した状態の診断または予後、(または治療)において、本明細書に定義されたポリペプチド(例えば、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、類縁体、変異体、断片)の使用を提供する。
本発明によれば、本明細書に定義されたポリヌクレオチドまたは本明細書に定義されたポリペプチドは、例えば、前立腺癌、胃癌、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、上皮分泌の他の癌および良性前立腺肥大(BPH)またはFSHの上昇レベルを特徴とする疾患などの状態の診断、または予後に使用できる。
別の態様において、本発明は、本明細書に定義されたポリペプチド、例えば、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9(なおその上、変異体、類縁体およびそれらの断片)またはそれらの組合せからなる群から選択される試料中のポリペプチドの量を測定する方法に関する。本発明によれば、該方法は、該サンプルと、ポリペプチドを認識できる分子(抗体またはポリペプチド)とを接触させることを含むことができる。本明細書で企図された方法は、ブロット膜、プレート、マトリックスに固定化されるか、または固定化されない(溶液中の)ポリペプチド類に適用できる。
ポリペプチドのレベルを評価する定量アッセイを開発するために、好ましい分子は、所望のポリペプチドに対する十分な親和性と特異性を有し得ることが本明細書において理解すべきである。親和性および特異性は、例えば、対象のポリペプチドに対する競合アッセイなどにより無関係なポリペプチドへの分子の結合を比較することにより決定できる。
本発明の一実施形態において、上記の方法に用いられた分子は、例えば、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体および特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体を含むことができる。本発明の別の実施形態において、該分子は、例えば、PSP94およびその類縁体であり得る。
本明細書に考慮されている配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9からなる群から選択されたポリペプチド量を測定する方法は、例えば、以下のステップ:
a) 本発明のポリペプチドの少なくとも1つを含む試料を好適な支持体(例えば、ELISAプレート、マトリックス、SDS-PAGE、ウェスタンブロット膜)に固定化された抗体と接触させること、
b) 標識またはマーカーを含む検出試薬をステップa)に加えること; ならびに
c) 標識またはマーカーから生じるシグナルを検出することをさらに含むことができる。
好適な検出試薬は、例えば、本発明のポリペプチド(類)に対する親和性を有する抗体またはポリペプチドを含むことができ、好ましくは、該検出試薬は、抗体とは異なった結合部位を有することができる。本明細書に記載されるように、検出試薬は、標識(またはマーカー)に直接結合(接合)できるか、または標識またはマーカーを担持する(と接合された)第二の分子により認識できる。
ステップa)に使用できる抗体の例は、特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)である。その場合、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)は、ステップc)における検出試薬として使用することができる。
表10に掲げられた抗体(クローンとして確認)など、PSP94結合タンパク質(配列番号2、配列番号3など)に結合できるいずれの抗体も、本明細書に記載された方法(例えば、(クローン)2B10、1B11、9B6、P8C2、B3D1、26B10、1A6)に使用できる。本法を実施するために2つの抗体が必要とされる場合、異なるエピトープに結合する抗体を選択することが好ましいと言える。
ステップa)に使用できる抗体の別の例は、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)である。その場合、特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)は、ステップc)における検出試薬として使用できる。
さらなる態様において、本発明は、PSP94に結合されない(すなわち、遊離(非結合))配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9(変異体、類縁体、断片)またはそれらの組合せからなる群から選択される試料中のポリペプチド量を測定する方法に関するものであり、該方法は;
a) PSP94により形成される複合体および無複合体試料を生じる配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9(変異体、類縁体、断片)からなる群から選択されるポリペプチドのいずれをも試料から除去すること; ならびに
b) 無複合体試料と、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9(変異体、類縁体、断片)およびそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドのいずれをも認識できる抗体とを接触させることを含む。
本発明の一実施形態において、ステップb)に用いられる抗体は、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体および特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体からなる群から選択できる。
上記に考慮されたPSP94に結合しない本発明のポリペプチド量を測定する方法は、例えば、以下のステップ;
(a) PSP94により形成される複合体および無複合体を生じる配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9からなる群から選択されるポリペプチドのいずれをも試料から除去すること、
(b) 好適な支持体(ELISAプレート、マトリックス、SDS-PAGE、ウェスタンブロット膜)に抗体を固定化(コーティング、吸着)させること、
(c) 無複合体試料を添加すること、
(d) 標識またはマーカーを含む検出試薬を添加すること; ならびに
(e) 標識またはマーカーから生じるシグナルを検出することを含む。
該複合体の除去は、例えば、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体を用いることにより実施できる。
ステップb)に使用できる好適な抗体は、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)および特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)からなる群から選択される抗体である。
さらなる態様において、本発明は、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、変異体、断片、類縁体および/またはそれらの組合せの(試料中)の量(定量、濃度)(遊離、結合、および/または全量)を評価するために、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(2D3)、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(P1E8)、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)、および特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)からなる群から選択される抗体(モノクローナル)の使用を含む。
別の態様において、本発明は、(試料中の)PSP94の量、またはPSP94もしくはPSP94結合タンパク質の異常なまたは上昇レベルと関連する状態の診断を評価するために、配列番号2に示されたポリペプチド、配列番号3に示されたポリペプチド、配列番号7に示されたポリペプチド、配列番号8に示されたポリペプチド、配列番号9に示されたポリペプチド、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(2D3)、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(P1E8)、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)、特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)、および特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体からなる群から選択される分子の使用を含む。
別の態様において、本発明は、第一の部分および第二の部分を含む抗体接合体に関するものであり、第一の部分は、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(2D3)、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(P1E8)、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)、特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)からなる群から選択され、第二の部分は、薬剤、固体支持体、レポーター分子、レポーター分子を担持する基、キレート化剤、アシル化剤、架橋剤、および標的基からなる群から選択され、第二の部分または第二の部分の接合は、第一の部分の生物活性(例えば、親和性、安定性)を妨害しない。
さらなる態様において、本発明は、第一部分および第二部分を含むことができる抗体接合体に関するものであり、該第一の部分は、PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体であり得、該第二部分は、例えば、薬剤、固体支持体、レポーター分子、レポーター分子を担持する基、キレート化剤、アシル化剤、架橋剤、および標的基からなる群から選択できる。
本発明によれば、固体支持体は、例えば、炭水化物、リポソーム、脂質、コロイド状金、ミクロ粒子、ミクロカプセル、ミクロ乳濁液、および固体マトリックスからなる群から選択できる。
また、本発明によれば、該レポーター分子は、例えば、蛍光体、発色団、染料、酵素、放射性分子および結合/リガンド複合体の分子からなる群から選択できる。
さらに本発明によれば、該薬剤は、毒素、薬物およびプロドラッグからなる群から選択できる。
より特に、本発明によれば、第一の部分は、例えば、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体、または特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体であり得る。
本発明の一実施形態において、該固体支持体の例は、例えば、炭水化物、リポソーム、脂質、コロイド状金、ミクロ粒子、ミクロカプセル、ミクロ乳濁液、およびアフィニティーカラムのマトリックスを含むことができる。
さらなる実施形態において、レポーター分子は、蛍光体(例えば、ローダミン、フルオレセイン、および緑色蛍光タンパク質)、発色団、染料、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)、放射性分子および結合/リガンド(例えば、ビオチン/アビジン(ストレプトアビジン))複合体の分子からなる群から選択できる。
よりさらなる実施形態において、該薬剤は、毒素(例えば、細菌毒素)、薬物(例えば、抗癌剤)およびプロドラッグからなる群から選択できる。
さらなる態様において、本発明は、(試料中の)PSP94の量またはPSP94を認識(結合)できる分子を有する容器を含むPSP94(またはPSP94結合タンパク質)の異常(例えば、高い、上昇)レベルと関連する状態の診断の評価に使用のためのキットを含む。該キットは、別々の構成成分で提供(販売)できることが本明細書において理解することができる。
本発明の一実施形態において、キットに含むことができるPSP94を認識できる分子は、(以下の1つ以上の)特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(2D3)、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(P1E8)、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)、特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)、本発明の抗体接合体(類)、および配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9からなる群から選択されるポリペプチドからなる群から選択される分子(例えば、含む)であり得る。
本発明の別の実施形態において、該キットは、配列番号2に示されたポリペプチド、配列番号3に示されたポリペプチド、配列番号7に示されたポリペプチド、配列番号8に示されたポリペプチド、変異体、断片、類縁体およびそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドを認識(結合)できる抗体を有する容器をさらにをさらに含むことができる。特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)および特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)が、本発明により考慮されている。
該キットは、別々の構成成分で提供できることを本明細書において理解することができる。該キットにより提供される抗体は、プレートまたは膜もしくは固体マトリックスの他のタイプなどの種々の形態で、または抗体の濃縮形態あるいは好適な作業希釈液を含有するバイアルであり得る。
より特に、本発明は、PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体(第一の抗体)を含むキットに関する。
本発明によれば、該キットは、PSP94の量またはPSP94の異常または上昇レベルと関連する状態の診断の評価に使用できる。該キットは、PSP94を認識できる分子を有する容器を含み得る。
本発明によれば、該キットに用いられる抗体は、例えば、レポーター分子と接合できる。該レポーター分子は、例えば、ペルオキシダーゼ(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)などの酵素であり得る。
また本発明によれば、該キットは、PSP94(例えば、実質的に純粋形態で)の知られた(所定)量を含有する対照試料をさらに含むことができる。本発明のキットに使用できる好適な(第一の)抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体を含む。
さらに本発明によれば、該キットはまた、PSP94の異なるエピトープに結合できるか、あるいはPSP94に結合するポリクローナル抗体を含むことができる第二の抗体を含むことができる。第二の抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体であり得る。
あるいは、本発明に使用できる別の好適な(第一)抗体は、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体を含む。本発明によれば、該キットは、PSP94の異なるエピトープに結合できる第二の抗体をさらに含むことができるか、あるいは、該キットは、PSP94に結合できるポリクローナル抗体をさらに含むことができる。
該キットの抗体の1つが、固体マトリックス(例えば、プレート、膜など)に結合できることを本明細書において理解することができる。所望ならば、固体マトリックスの任意の非特異的結合部位はまた、(ウシ血清アルブミン、ミルクタンパク質などを用いて)遮断できる。
より特に本発明は、PSP94に結合する第一および第二の抗体を含むことができるキットに関する。本発明によれば、第一または第二の抗体の少なくとも1つは、PSP94の遊離形態(のみ)に結合できる。また本発明によれば、第一および第二の抗体は、PSP94の異なるエピトープに結合できる。
本発明によれば、該キットは、PSP94(例えば、実質的に純粋形態で)の知られた(所定)量を含有できる対照試料をさらに含むことができる。
本発明によれば、第一の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体および特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体からなる群から選択できる。第二の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体および特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体からなる群から選択できる。
本発明によれば、第一の抗体は、ポリクローナル抗体であり得、第二の抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体および特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体からなる群から選択できる。
本発明によれば、第一の抗体は、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生でき、第二の抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体および特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体からなる群から選択できる。
本発明によれば、第二の抗体は、レポーター分子と接合できる。また本発明によれば、該レポーター分子は、例えば、ペルオキシダーゼ(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ)などの酵素であり得る。
別の態様において、本発明は:
a) 細胞によるポリペプチドの発現を提供する条件下で宿主細胞を培養すること; および
b) 1つ以上の精製ステップによりポリペプチドを回収することを含む、本明細書に定義されたポリペプチド(PSP94-結合タンパク質、例えば、配列番号2に示されたポリペプチド、配列番号3に示されたポリペプチド、配列番号7に示されたポリペプチド、配列番号8に示されたポリペプチド、配列番号9に示されたポリペプチド)を調製する方法を提供する。
さらに別の態様において、本発明は:
a) ポリペプチドを含有する1つ以上の生体試料を採取すること; および
b) 1つ以上の精製ステップによりポリペプチドを回収することを含む、本明細書に定義されたポリペプチド(PSP94-結合タンパク質、例えば、配列番号2に示されたポリペプチド、配列番号3に示されたポリペプチド、配列番号7に示されたポリペプチド、配列番号8に示されたポリペプチド、配列番号9に示されたポリペプチドおよびそれらの組合せ)を調製する方法を提供する。
単独または組み合わせた精製ステップは、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどからなる群から選択できることを本明細書において理解することができる。
本発明の別の実施形態において、精製ステップは:
a) 硫酸アンモニウムを生体試料に加えること、
b) イオン交換クロマトグラフィーを実施すること、
c) PSP94接合アフィニティーマトリックスを用いてアフィニティークロマトグラフィーを実施すること、
d) ゲルろ過クロマトグラフィーを実施すること、および
e) 実質的に純粋なPSP94結合タンパク質を含有するフラクションを回収することを含むことができる。
さらなる態様において、本発明はまた:
a) PSP94結合タンパク質の沈殿を供するような様式で、硫酸アンモニウムを試料(例えば、ヒト男性血清)に加えること、
b) ステップa)の混合物を遠心分離して沈殿タンパク質を回収すること、
c) 沈殿タンパク質を再懸濁すること、
d) イオン交換クロマトグラフィーを実施してPSP94結合タンパク質を含有するタンパク質のフラクションを回収すること、
e) PSP94接合アフィニティーマトリックスを用いてアフィニティークロマトグラフィーを実施してPSP94結合タンパク質を含有するタンパク質のフラクションを回収すること、
f) ゲルろ過クロマトグラフィーを実施してPSP94結合タンパク質を含有するタンパク質のフラクションを回収すること; および
g) 実質的に純粋なPSP94結合タンパク質(例えば、配列番号2に定義されたポリペプチド、配列番号3に定義されたポリペプチド、配列番号7に定義されたポリペプチド、配列番号8に定義されたポリペプチド、配列番号9に定義されたポリペプチドおよびそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチド)を含有するフラクションを回収することを含む試料からPSP94結合タンパク質精製のための方法を含む。
本発明の一実施形態において、ステップa)におけるPSP94結合タンパク質の沈殿は、硫酸アンモニウムを加えることによって最終濃度が47%まで達成できる。
本発明の第二の実施形態において、ステップd)のイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックスを使用することによって実施できる。
さらなるその態様において本発明は、PSP94結合タンパク質(例えば、配列番号2に定義されたポリペプチド、配列番号3に定義されたポリペプチド、配列番号7に定義されたポリペプチド、配列番号8に定義されたポリペプチド、配列番号9に定義されたポリペプチドおよびそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチド)のための精製方法を含む(図8に要約)。血清からのPSP94結合タンパク質の精製は、例えば、以下のステップを含むことができる:
a) 硫酸アンモニウムをヒト(男性)血清試料に加えて最終濃度が32%の硫酸アンモニウムを供すること、
b) 前記ステップの溶液を遠心分離して、非特異的ヒト血清タンパク質を含有するタンパク質のペレットフラクションおよびPSP94結合タンパク質を含有するタンパク質の上澄液フラクションを回収すること、
c) PSP94結合タンパク質を含有するタンパク質の上澄液フラクションを回収し、硫酸アンモニウムの濃度を47%の最終濃度に調整して、PSP94結合タンパク質を含有する沈殿タンパク質の溶液を提供すること、
d) 混合物を遠心分離してPSP94結合タンパク質を含有する沈殿タンパク質を回収すること、
e) 水性媒体(例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水、10mM MES、10mM MOPS、10mM Bicine: (適用される場合)これらの溶液は、例えば、4.7と9.0との間、好ましくは、5.7と8.0との間、より好ましくは、5.7と6.7との間を含むpHであり得るが、好ましい水性媒体は、6.5のpHで10mM MESである)にPSP94結合タンパク質を含有する沈殿タンパク質を再懸濁すること
f) イオン交換(アニオン交換)クロマトグラフィーマトリックス(樹脂、ゲル)を含有するイオン交換(アニオン交換)クロマトグラフィーカラムにPSP94結合タンパク質を含有するタンパク質の水性溶液を装填(接触、充填)すること、
g) 塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウムからなる群から選択される塩溶液を添加して、好ましくは、例えば、100mMから1000mMまでの範囲のモル濃度で、イオン交換クロマトグラフィーカラムからPSP94結合タンパク質を含有するタンパク質を回収(溶出、脱着)すること、
h) PSP94結合タンパク質を含有するタンパク質のフラクション(ピーク)を回収すること、
i) PSP94結合タンパク質に結合されたPSP94接合親和性マトリックスを生成するために、PSP94接合親和性マトリックスと回収フラクションとを接触(充填、通過)させること、
j) 溶出剤(遊離PSP94、尿素、酢酸ナトリウムまたはCAPS: 好ましくは、遊離PSP94)を、PSP94結合タンパク質に結合されたPSP94接合親和性マトリックスに加えてPSP94結合タンパク質を回収(溶出、脱着)すること、
k) PSP94結合タンパク質を含有するフラクションを回収すること、
l) ゲルろ過クロマトグラフィーマトリックスを含有するゲルろ過クロマトグラフィーカラムにPSP94結合タンパク質を装填して不純物からPSP94結合タンパク質を分離すること; および
m)(実質的に)純粋なPSP94結合タンパク質を含有するフラクションを回収すること。
本明細書に記載された幾つかの精製ステップは、必要とされる精製レベルに依って、または1つ以上の残りのステップの最適化に依って不必要になり得ることがまた理解し得る。
さらなる態様において、本発明は、上記に定義された精製法から得られた生成物に関する。
本発明によれば、本明細書に言及された試料(例えば、生体試料)は、血液、血漿、血清、尿、精液、細胞培養培地、細胞溶解液などを含むことができる。この試料は、ヒト(例えば、男性)試料であることが好ましい。
別の態様において、本発明は、PSP94が別のポリペプチド(別の分子)に結合される場合でも利用できるPSP94エピトープ(すなわち、曝露エピトープ)を認識できる抗体、およびその抗原結合断片に関する。このようなポリペプチドは、例えば、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9、変異体、断片、類縁体およびそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドであり得る。このような抗体を産生するハイブリドーマ細胞系もまた、本発明により考慮されている。このような抗体の例は、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(P1E8)であるか、または遊離および結合形態のPSP94を認識できるポリクローナル抗体である。
曝露エピトープの同定は、遊離および結合形態のPSP94に対する特異性に関して抗体のパネルを試験することによって実施できる。両形態と反応(認識)する抗体により、候補抗体を提示することができる。平行して、部分トリプシン消化は、PSP94/PSP94結合タンパク質複合体に対して実施できる。次に複合形態で利用できるPSP94エピトープ(例えば、線状エピトープ)は、アミノ酸配列分析により同定できる。このまたはこれらの(利用できる)エピトープ(類)に結合できる抗体を生成することができる。好ましくは、分子または複合体が、その固有(天然)状態(例えば、未変性、天然または3D形態)である場合、曝露エピトープ類は、抗体にアクセスできる分子(例えば、PSP94、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9およびそれらの複合体)のエピトープとして本明細書において理解することができる。
さらなる態様において、本発明は、試料からPSP94を除去する方法を提供し、該方法は
a) 該試料とPSP94に結合できる分子(該分子は、マトリックスまたは固体支持体に直接的または間接的に結合できる)とを接触させること; および
b) PSP94のない試料を回復させることを含む。
試料(生体試料)からPSP94の除去、例えば、PSP94の上昇レベルを有する個体の血清から過剰のPSP94を除去すること(すなわち、PSP94枯渇の血清)、および枯渇血清を個体(例えば、必要な患者)へ補強することは有用になり得る。他の場合、他の血清構成要素の測定を最適化するために試料からPSP94を除去することは有用であり得る。PSP94の除去は、PSP94と、いずれの配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9、PSP94抗体およびそれらの組合せとの間の親和性に基づく。
上述の分子は、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体および特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体からなる群から選択できる。
よりさらなる態様において、本発明は、試料から、PSP94と、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9およびそれらの組合せ(例えば、PSP94/配列番号2および/またはPSP94/配列番号3および/またはPSP94/配列番号7など)に定義されたポリペプチドのいずれのものとによって形成された複合体を除去する方法を提供し、該方法は:
a) 該試料と複合体の利用できる(曝露)エピトープを認識できる抗体(該抗体は、マトリックスまたは固体支持体に直接的または間接的に結合できる)とを接触させること; および
b) 該複合体のない試料を回復させることを含む。
本発明の一実施形態において、ステップb)に使用される抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体および特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体を含むことができる。特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体を使用することが好ましい。
本発明の他の態様は、特許寄託(例えば、登録)番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体、特許寄託(例えば、登録)番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体ならびに特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体およびその抗原結合断片を包含する。
また、本明細書に記載された抗体を産生するハイブリドーマ細胞系は、本発明により包含される。これらは、特許寄託(例えば、登録)番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系、特許寄託(例えば、登録)番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系ならびに特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系を含む。
別の態様において、本発明は、試料中のPSP94の全量を測定する方法を提供し、PSP94が、別のポリペプチド(例えば、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9、変異体、断片および類縁体)に結合される場合でも、該方法は、該試料とPSP94を認識できる抗体との接触を含むことができる。本発明の態様は、1つ以上のステップを実施するか、またはしないという事実とは無関係に、このステップを含む任意の方法を包含する。
一実施形態において、試料中のPSP94の全量の測定に使用できる抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体であるか、またはPSP94の遊離および結合形態を認識できるポリクローナル抗体であり得る。
上記に考慮された試料中のPSP94の全量(遊離(非結合)および結合)を測定する方法は、以下のステップを含むことができる:
a) PSP94抗体を好適な支持体(ELISAプレート、マトリックス、SDS-PAGE、ウェスタンブロット膜)に固定化(コーティング、吸着)すること。該抗体は、PSP94結合タンパク質(配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9など)に結合される場合でも、PSP94を認識できる可能性がある。
b) PSP94を含む試料を添加すること、
c) 標識またはマーカーを含むPSP94検出試薬を添加すること; および
d) 標識またはマーカーから生じるシグナルを検出すること。
本発明のステップc)に使用できる好適な検出試薬の例としては、PSP94に対する親和性を有する抗体およびポリペプチドが挙げられる。しかしながら、該検出試薬は、PSP94 抗体およびPSP94結合タンパク質とは異なる結合部位を有し得ることが好ましい。検出試薬は、標識(またはマーカー)に直接結合できるか(例えば、本発明の抗体接合体)、あるいは標識またはマーカーを担持する(それらと接合された)第二の分子により認識できる。
ステップa)に使用できるPSP94抗体の例は、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体(P1E8)である。その場合、検出試薬は、例えば、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体(2D3)(例えば、抗体-接合体)または任意の他の好適なPSP94抗体であり得る。
遊離および結合形態のPSP94を認識できるポリクローナル抗体(1つまたは複数のポリクローナル抗体)は、本明細書に記載された任意のモノクローナル抗体と組み合わせてステップa)またはc)のいずれかに好適であり得ることが本明細書において理解することができる。例えば、全PSP94を、ポリクローナル抗体(遊離および結合形態のPSP94を認識できる抗体)により捕捉でき、検出は、P1E8などの別の抗体により(直接的または間接的に)実施できる(および逆もまた同様)。
さらに、全PSP94を、例えば、ポリクローナル抗体またはP1E8抗体(ハイブリドーマ細胞系PTA-4241により産生された)などのその遊離および結合形態(例えば、本明細書に記載されたPSP94結合タンパク質に結合)のPSP94を認識できる抗体により捕捉でき、捕捉タンパク質(複合体)の検出は、2つ以上の抗体の組合せにより実施できる。すなわち、1つは、遊離PSP94(例えば、ハイブリドーマ細胞系PTA-4240により産生された2D3)を検出でき、1つまたは複数の抗体は、PSP94結合タンパク質(例えば、ハイブリドーマ細胞系PTA-4243により産生された17G9; および/またはハイブリドーマ細胞系PTA-4242により産生された3F4)を検出できる。
さらに別の態様において、本発明は、試料中の遊離PSP94量を測定するために改善された方法を提供し、該方法は、該試料とPSP94(例えば、その遊離形態で)を認識できる抗体とを接触させることを含む。
さらに特に、本発明は、試料中の遊離PSP94量を測定する方法に関するものであり、該方法は、該試料とPSP94(PSP94の遊離形態)を認識できる抗体とを接触させることを含むことができる。
またさらに特に、本発明は、試料中の遊離形態のPSP94を検出または測定する方法に関するものであり、該方法は、例えば、
- 試料と本発明の抗体(例えば、PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体)とを接触させること; および
- 抗体または標識を担持する第二の分子により供される標識からのシグナルを検出することを含むことができる。
本発明によれば、本発明の方法で使用される好適な抗体は、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体、その抗原結合断片、または特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体およびその抗原結合断片を含む。
本発明によれば、試料に対して得られたシグナルは、所定量のPSP94を含有する対照試料に対して得られたシグナルと比較できる。
本発明はまた、試料中の遊離形態のPSP94を検出または測定する方法に関するものであり、該方法は:
- 試料とPSP94に結合できる第一の抗体とを接触させること;
- 試料とPSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる第二の抗体とを接触させること; および
- 第二の抗体に結合された標識から、または標識を担持する第三の抗体により供される標識からのシグナルを検出することを含むことができる。
本発明によれば、第一および第二の抗体は、異なるPSP94エピトープに結合できる。
本発明によれば、第一の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体および特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体からなる群から選択できる。
本発明によれば、第一の抗体は、ポリクローナル抗体であり得、第二の抗体は、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体であり得る。
また、本発明によれば、第一の抗体は、ポリクローナル抗体であり得、第二の抗体は、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体であり得る。
さらに本発明によれば、試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、精液、細胞培養培地および細胞溶解液からなる群から選択できる。
さらなる態様において、試料中の遊離形態のPSP94を検出または測定する方法に関するものであり、該方法は:
- 試料とPSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合でき得る第一の抗体とを接触させること;
- 試料とPSP94に結合できる第二の抗体とを接触させること; および
- 第二の抗体に結合された標識から、または標識を担持する第三の抗体により供される標識からのシグナルを検出することを含むことができる。
さらに本発明によれば、第一および第二の抗体は、異なるPSP94エピトープに結合できる。
本発明によれば、第一の抗体は、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体であり得ると共に、第二の抗体は、ポリクローナル抗体、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体および特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体からなる群から選択できる。
また、本発明によれば、第一の抗体は、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体であり得ると共に、第二の抗体は、ポリクローナル抗体、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体および特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生された抗体からなる群から選択できる。
さらなる態様において、本発明は、試料中の遊離の形態のPSP94を検出または測定する方法に関するものであり、該方法は、PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体接合体と試料とを接触することを含み得る。該抗体接合体は、第一部分と第二部分を含むことができる。第一部分は、PSP94が遊離形態である場合に利用でき得るPSP94のエピトープに結合できる抗体であり得ると共に、第二部分は、レポーター分子およびレポーター分子を担持する基からなる群から選択できる。
よりさらなる態様において、本発明は、試料中の遊離のPSP94を測定する方法に関するものであり、該方法は、第一の抗体および第二の抗体と試料とを接触させることを含むことができる。第一の抗体および第二の抗体の各々は、PSP94の異なるエピトープに結合できる。本発明によれば、第一の抗体および第二の抗体の少なくとも1つは、その遊離形態のみでPSP94に結合できる。
本発明の一実施形態において、好適な抗体としては、例えば、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体および特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体を挙げることができる。しかしながら、他の好適な抗体は12C3抗体など、本発明により包含される(表10)。
本明細書に記載されたPSP94に結合する抗体のいずれも、免疫組織化学、ウェスタンブロットなど、他のタイプのアッセイにおいてPSP94を検出するために使用できる。例えば、PSP94発現細胞を含む組織切片(例えば、前立腺からの)は、本発明の抗PSP94抗体のうちの1つと接触でき、PSP94の存在は、抗PSP94抗体により担持された標識からのシグナルを検出することにより評価される。PSP94の存在はまた、例えば、抗PSP94抗体に結合できる第二の抗体により担持された標識からシグナルを検出することにより評価できる。好適な第二の抗体の例は、モノクローナル抗体(例えば、1A6、2D3、12C3、P1E8など)または抗PSP94ポリクローナル抗体に関する抗マウスIgG(例えば、抗マウスIgG1K)、抗ウサギ抗体(例えば、抗ウサギIgG)である。本明細書に記載された抗PSP94抗体は、ヒトPSP94を認識できることを本明細書において理解することができる。
免疫検出アッセイ(遊離PSP94を測定するサンドイッチELISAアッセイ)は、PSP94を含有する試料と接触するELISAプレートのウェル上にコーティングされたPSP94を認識できる抗体により実施できる。PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる第二の抗体を加えることができ、検出を実施することができる。第二の抗体は、レポーター分子を担持できる。このタイプのアッセイにおいて、2種の抗体が使用される; (第一の抗体および第二の抗体)の各々は、PSP94の異なるエピトープに結合できる。第一および第二の抗体は、この結果に影響を及ぼすことなく相互交換できることを理解されたい。第一および第二の抗体の1つは、その遊離形態(例えば、本明細書に記載されたPSP94結合タンパク質に結合された形態ではない)のみでPSP94に結合できる抗体であり得る。
例えば、第一の抗体は、PSP94の全ての形態(結合および遊離のポリクローナル抗体)に結合できる抗体であり得ると共に、第二の抗体は、PSP94の遊離形態のみに結合できる抗体(すなわち、PSP94が遊離形態のみの場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体、すなわち、該抗体は、PSP94が結合される場合にマスクされるPSP94のエピトープ(例えば、本明細書に記載されたPSP94結合タンパク質)に結合できる)であり得る。したがって、PSP94の形態の全ては、第一の抗体により捕捉され、このタイプのアッセイにおいて、PSP94の遊離形態のみが第二の抗体により検出できる。
あるいは、第一の抗体は、本明細書に記載されたPSP94の遊離形態のみに結合できる抗体(1A6)であり得ると共に、第二の抗体は、PSP94の全て(あらゆる)形態(結合および非結合)に結合できる抗体であり得る。第一の抗体は、PSP94の遊離形態のみを捕捉し、結合形態は保持されないので、第二の抗体は、PSP94の遊離形態のみを検出できる。
あるいはまた、第一の抗体は、本明細書に記載されたPSP94の遊離形態のみに結合する抗体(1A6)であり得ると共に、第二の抗体はまた、PSP94の遊離形態(のみ)に結合する抗体であり得る。第一および第二の抗体は、PSP94の種々のエピトープに結合できる。
第二の抗体は、酵素の基質が添加される場合、比色反応を生じる酵素、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼを担持できる。幾つかの場合において、特異的抗体(第一または第二の抗体)の接合体の代わりに検出試薬として第三の抗体を使用することが有用となり得る。第三の抗体が検出試薬として使用される場合、この第三の抗体は、それ自体レポーター分子(または他)を担持できる。この第三の抗体は、第二の抗体を認識することができる(第二の抗体のイソタイプおよび化学種を認識できる)。
さらなる態様において、本発明は、試料中の遊離の(非結合PSP94)PSP94(および/またはPSP94断片およびその類縁体)の量を測定するために改善された方法を提供し、該方法は、PSP94/PSP94結合タンパク質複合体と、PSP94、PSP94断片およびその類縁体を認識できる抗体との接触を含む。例えば、該改善された方法は、試料中の遊離PSP94の量を測定するためのものであり;
a) PSP94と、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9およびそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドのいずれかとで形成された複合体を除去して、複合体のない試料を生成すること; および
b) 複合体のない試料とPSP94を認識できる抗体とを接触させることを含むことができる。
本明細書に考慮された試料中の遊離の(非結合PSP94)PSP94の量を測定するために改善された方法は、例えば、以下のステップもまた含むことができる;
a) PSP94と、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8および配列番号9、変異体、断片、類縁体およびそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドのいずれかとで形成された複合体を除去して、複合体のない試料を生成すること(例えば、本明細書に記載された方法を用いて)、
b) PSP94抗体を好適な基質(ELISAプレート、マトリックス、SDS-PAGE、ウェスタンブロット膜)に固定化(コーティング、吸着)すること、
c) 遊離(非結合)PSP94を含む複合体のない試料を添加すること、
d) 標識またはマーカーを含む(PSP94)検出試薬を添加すること; および
e) 標識またはマーカーから生じるシグナルを検出すること。
本発明に使用できる好適な検出試薬の例は、抗体、ポリペプチドまたはPSP94に対する親和性を有する他の分子からなる群から選択される試薬である。該検出試薬は、PSP94 抗体とは異なる結合部位を有し得ると共に、検出試薬は、標識(またはマーカー)に直接結合できるか、あるいは標識またはマーカーを担持する(それらと接合された)第二の分子により認識できる。
ステップb)に使用されたPSP94抗体の例は、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(2D3)である。その場合、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(P1E8)(例えば、接合された)は、検出試薬として(本明細書に記載されたように直接的または間接的に)使用できる。
ステップb)に使用できるPSP94抗体の別の例は、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(P1E8)である。その場合、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(2D3)(例えば、接合された)は、検出試薬として(本明細書に記載されたように直接的または間接的に)使用できる。
さらなる態様において、本発明は、試料中のPSP94(結合および非結合(遊離))の全量を測定する方法に関するものであり、該方法は、PSP94が別のポリペプチド(例えば、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9)に結合される場合でもPSP94に結合できる第一および第二の抗体の使用を含むことができる。第一および第二の抗体は、異なるPSP94エピトープに結合することが好ましいと言える。
よりさらなる態様において、本発明はまた、試料中の全PSP94を測定する方法に関するものであり、該方法は、第一および第二の抗体を使用することを含み、PSP94がポリペプチドに結合される場合でも、第一の抗体はPSP94に結合でき、第二の抗体は、PSP94に結合でき、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9からなる群から選択されるポリペプチドのいずれのものも、PSP94とポリペプチドとにより形成された複合体から置き換えることができる。
本発明の実施形態において、第一の抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体、または任意の他の好適な抗体であり得る。第二の抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産出されたモノクローナル抗体であり得る。
さらなる態様において、本発明は、試料中のPSP94レベル(量、濃度)を測定する方法に関するものであり、該方法は、その遊離および結合形態(例えば、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9など)におけるPSP94を認識できる抗体と該試料とを接触させることを含む。
本発明の一実施形態において、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体が使用できる。
本明細書に記載された方法(例えば、全PSP94、遊離PSP94、遊離または全PSP94結合タンパク質および算出比率を測定する)が、臨床試料(血清、血液、血漿など)に適用される場合、それらは、PSP94の異常または上昇レベルに関連する状態(例えば、前立腺癌(例えば、放射線療法後の前立腺癌における自由間隔での再発予測))に関して対象をスクリーニングするため、例えば、前立腺癌と診断された対象の予後を評価するために有用となり得る。例えば、対照の対象に比して、前立腺癌を有する個体において全PSP94のレベル(または遊離PSP94/全PSP94の比率、または全PSP94結合タンパク質)が高いほど、予後が不良であるか、または前立腺癌を有する(再発発生)の機会が高くなることを見ることができる。さらに、全PSP94の上昇レベル(または本明細書に記載された他のパラメーター)が対象に見られる場合、その対象における前立腺癌が予測(示唆)できる。したがって、前立腺癌(PSP94 またはPSP94結合タンパク質の異常または上昇レベルと関連するいずれの他の状態)に関する対象をスクリーニングするための診断法および予知診断法はまた、本発明により包含されている。
所望または必要ならば、本発明の方法はまた、試料: 例えば、PSP94の上昇レベルと関連する状態または他の状態を有する個体からの血液試料を採取するステップおよび上記の方法ならびにアッセイを実施するステップを含むことができる。
本発明の方法は、分子(抗体、ポリペプチド; 例えば、分子に結合された標識由来)により、または標識を担持する第二の分子(抗体または結合/リガンド系)により供される(担持される)標識からのシグナルの検出をさらに含むことができる。
本発明の方法はまた、試料に関して得られたシグナル(結果)と、対象のポリペプチドの知られた量を含有する対照試料に関して得られたシグナル(結果)とを比較する(検出する)ことを含むことができる。
さらなる態様において、本発明は、PSP94の上昇レベルに関連する状態の治療のためにPSP94抗体の使用に関する。PSP94抗体を投与することを含むこのような状態患者を治療する方法もまた、本明細書に包含されていることを理解することができる。
よりさらなる態様において、本発明は、PSP94の上昇レベルに関連する状態の治療用医薬品の製造におけるPSP94抗体の使用に関する。
PSP94抗体は、例えば、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体または特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体であり得る。
試料は、一定分量の血液、血清、血漿、生体液として本明細書に理解することができるか、または、例えば、ELISAプレートのウェル、膜、ゲル、マトリックスなどに結合されたタンパク質(他の構成要素を含有するか、または含有しない)であり得る。
よりさらなる態様において、本発明は、試料中のPSP94(遊離および/または結合および/または全部)、PSP94変異体およびそれらの類縁体の量を評価するために、配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9に示されたポリペプチド、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(2D3)、特許寄託番号: PTA-4241の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(P1E8)、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)、特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)からなる群から選択される分子の使用に関する。
本発明によれば、本明細書に記載された方法および使用に関して企図される状態は、例えば、前立腺癌、胃癌、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、上皮分泌細胞の他の癌および良性前立腺肥厚(BPH)を含むことができる。
他の抗体は、本明細書に記載された方法に使用できる(好適である)ことを本明細書において理解することができる。例えば、表10に掲げたPSP94結合タンパク質に特異的な抗体は互換性であり、本発明により包含されている(それらのハイブリドーマ細胞系を含んでいる)。例えば、特許寄託番号: PTA-4242の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(3F4)は、モノクローナル抗体2B10、9B6、1B11などと互換でき、特許寄託番号: PTA-4243の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたモノクローナル抗体(17G9)は、モノクローナル抗体P8C2、1B11、26B10、9B6などと互換できる。種々の他の状態は可能である。しかしながら、2種の抗体が、本法を実施するために必要である場合、種々のエピトープに結合する抗体を選択することが好ましい。
また、本明細書に開示された任意の(モノクローナル)抗体の抗原結合断片(例えば、抗原結合部位)などの抗体断片は、本発明により包含されていることを本明細書において理解することができる。
一般的分子生物学および定義
他に指定されない限り、本発明に利用される組換えDNA技法は、当業者に知られている標準的な手法である。本明細書に記載された溶液、試薬および緩衝液は、当業界に知られた試薬と方法を用いて調製できる。技法、溶液および試薬の例は、J. Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、T. A. Brown (編集者)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach、1巻および2巻、IRL Press (1991)、D. M. GloverおよびB. D. Hames (編集者)、DNA Cloning: A Practical Approach、1〜4巻、IRL Press (1995年および1996年)、およびF. M. Ausubelら(編集者)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988年、現在までの全ての最新版を含む)などの情報源の文献に説明されており、参照として本明細書に組み込まれている。
「ポリヌクレオチド」とは一般に、未修飾RNAまたはDNA、あるいは修飾RNAまたはDNAであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのことである。「ポリヌクレオチド類」としては、限定はしないが、一本鎖および二本鎖DNA、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖および二本鎖RNA、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖あるいは、より典型的には、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、「ポリヌクレオチド」とは、RNAまたはDNAあるいはRNAおよびDNAの双方を含む三本鎖領域のことである。用語ポリヌクレオチドとしてはまた、1つ以上の修飾塩基を含有するDNA類ならびにRNA類および安定性または他の理由のために修飾された主鎖を有するDNA類またはRNA類が挙げられる。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの異常塩基が挙げられる。種々の修飾は、DNAおよびRNAに対してなされ; したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に自然界に見られるポリヌクレオチド類の化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウィルスおよび細胞のDNAおよびRNA特性の化学形態を包含する。「ポリヌクレオチド」としては、限定はしないが、線状および末端閉鎖分子が挙げられる。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチド類を包含する。
したがって、本発明によれば、ポリヌクレオチドは、例えば、ポリリボヌクレオチド、ポリデオキシヌクレオチド、修飾ポリリボヌクレオチド、修飾ポリデオキシヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド(例えば、アンチセンス)またはそれらの組合せであり得る。
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合(すなわち、ペプチドアイソスター)により互いに結合された2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質のことである。「ポリペプチド」とは、通常、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短鎖、および一般にタンパク質と称される長鎖双方のことである。上記のとおり、ポリペプチド類は、20の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有することができる。
本明細書に使用される用語「変異体」は、それぞれ参照のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、必須の性質を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、ヌクレオチド配列において別の参照ポリヌクレオチドとは異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドのアミノ酸配列を変えてもよいし、変えなくてもよい。ヌクレオチドの変化により、本明細書に記載された参照配列によりコード化されたポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、削除、融合および切断をもたらし得る。ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列において別の参照ポリペプチドとは異なる。一般に、参照ポリペプチドの配列および変異体は、全体として密接に類似しており、多くの領域が同一になるように違いは限定される。したがって、変異体および参照ポリペプチドは、1つ以上の置換、付加、削除、またはそれらの任意の組合せによりアミノ酸が異なる。置換または挿入アミノ酸残基は、遺伝子コードによりコード化されたものであってもなくてもよい。変異体ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、対立形質変異体など自然に発生してもよく、または自然に発生することが知られていない変異体であってもよい。ポリヌクレオチド類およびポリペプチド類の非天然変異体は、変異誘発技法または直接合成によって作製できる。本明細書に用いられる「変異体」は、(活性な)変異体、類縁体、同族体、キメラ、断片およびそれらの部分を包含する。しかしながら、本明細書に用いられる「変異体」は、元のポリペプチドの生物活性の一部を保持できる。
本明細書に用いられる「製薬組成物」とは、好適な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび/または担体と一緒に薬剤の治療的有効量を意味する。本明細書に用いられる「治療的有効量」とは、所与の状態および投与計画のために治療効果を与えるその量のことである。このような組成物は、液体または凍結乾燥あるいは乾燥製剤であり、種々の緩衝内容物(例えば、トリス-HCl、酢酸塩、リン酸塩)の希釈剤、pHおよびイオン強度、表面に対する吸収を防ぐためにアルブミンまたはゼラチンなどの添加物、界面活性剤(例えば、ツイーン20、ツイーン80、プルロニックF68、胆汁酸塩類)、可溶化剤(例えば、グリセロール、ポリエチレングリセロール)、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム)、保存剤(例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン)、増量剤または等張化調節剤(例えば、乳糖、マンニトール)、ポリエチレングリコールなどのポリマー類のタンパク質への共有結合、金属イオンとの複合化、またはポリアクチン酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の微粒子製剤内または上へ、あるいはリポソーム、ミクロ乳濁液、ミセル、単層または多層媒体、赤血球細胞形骸、またはスフェロプラスト上への取り込みを含む。このような組成物は、物理状態、溶解性、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼすであろう。制御または持続性放出組成物は、親油性デポー剤(例えば、脂肪酸類、ワックス類、油類)中の製剤を含む。ポリマー(例えば、ポロキサマー類またはポロキサミン類)によりコーティングされた微粒子組成物は、本発明によっても理解される。本発明の組成物の他の実施形態は、非経口、経肺、経鼻および経口経路など、種々の投与経路用に保護コーティング、プロテアーゼ阻害剤または透過増強剤の微粒子形態を組み入れる。一実施形態において、該製薬組成物は、非経口的、経癌的(Paracancerally)、経粘膜的、経皮的、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭部内および腫瘍内に投与される。
本明細書に用いられる「免疫組成物」または「免疫原性組成物」とは、このような組成物を服用する宿主において免疫応答を促進できる組成物のことである。「免疫組成物」としては、例えば、抗体が捜し出されるポリペプチド(またはポリペプチドをコードできるDNAまたはRNA)などの化合物が挙げられる。通常、ポリペプチドは、緩衝剤、希釈剤または製薬的に許容できる担体中で希釈される。「免疫組成物」は、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムなどのアジュバントを含むことができる。
さらに、本明細書に用いられる「製薬的に許容できる担体」または「製薬用担体」としては、当業界に知られており、限定はしないが、0.01〜0.1M、好ましくは、0.05Mリン酸緩衝液または0.8%生理食塩水が挙げられる。さらに、このような製薬的に許容できる担体は、水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類である。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体など、水、アルコール性/水溶液、乳濁液または懸濁液が挙げられる。非経口用媒体としては、塩化ナトリウム液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは不揮発性油が挙げられる。静脈内用媒体としては、液体および栄養補充液、リンゲルデキストロースに基づくものなどの電解質補充液などが挙げられる。保存剤および、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、照合剤、不活性ガスなどの他の添加物もまた存在することができる。
本明細書に用いられる「PSP94結合タンパク質」は、通常、可逆性様式でPSP94に結合(すなわち、会合)できるタンパク質(配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9など)に関する。
本明細書に用いられる用語「遊離PSP94」は、別のポリペプチドとは(例えば、PSP94結合タンパク質とは)会合されないPSP94タンパク質に関する。用語「遊離PSP94」は、PSP94が非結合形態(状態)にあることを意味する。
本明細書に用いられる用語「抗体」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Fc、F(ab)2、F(ab)2'およびFabなどを含む抗体断片のことである。「ポリクローナル抗体」とは、抗原に対し動物を免疫化することにより生じ、抗原の複数エピトープにしばしば特異的である抗体を言及するために用いられる用語であることを理解することができる。
本明細書に用いられる用語「抗原結合断片」は、対象の抗原を認識(結合)できる抗体断片(抗原結合ドメイン)に関する。「抗原結合断片」は、分子生物学的方法を用いて抗体をコードする遺伝子(例えば、可変領域をコードする遺伝子)から単離できる。単離遺伝子は、例えば、一本鎖抗体を創製するために操作できる。抗体の「抗原結合断片」は、抗原に対する抗体の特異的結合を担うことが知られている。
本明細書に用いられる「PSP94」または「PSP」は、自然および組換えPSP94に関する。
遺伝子(cDNA)クローニングおよびタンパク質発現
同定かつ単離された遺伝子(すなわち、ポリヌクレオチド)は、適切なクローニングまたは発現ベクター(すなわち、発現系)に挿入できる。当業界に知られている多数のベクター宿主系を使用できる。可能なベクターとしては、限定はしないが、プラスミドまたは修飾ウィルス(例えば、バクテリオファージ、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、レトロウィルス)が挙げられるが、ベクター系は、使用される宿主細胞と適合性でなければならない。クローニングベクターの例としては、限定はしないが、大腸菌(E. coli)、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、またはpBR322誘導体またはpUCプラスミド誘導体(例えば、pGEXベクター、pmal-c、pFLAGなど)などのプラスミドが挙げられる。発現ベクターの例としては以下に検討される。クローニングまたは発現ベクターへの挿入は、例えば、相補的付着端を有するクローニングベクターにDNA断片を結合することによって達成できる。しかしながら、DNAを断片化するために用いられる相補的制限部位が、クローニングベクターに存在しない場合、DNA分子の末端は、酵素的に修飾できる。あるいは、任意の所望の部位は、DNA端上にヌクレオチド配列(リンカー)を結合させることによって産生でき; これらの結合リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成されたオリゴヌクレオチド類を含むことができる。組換え分子は、形質変換、トランスフェクション、リポフェクション、感染、電気穿孔などを介して宿主細胞に導入できる。クローン化遺伝子を、クローン化細胞、例えば、大腸菌において拡大するシャトルベクタープラスミド上に含むことができ、所望ならば、適切な発現細胞系へのその後の挿入に対する精製を促進できる。例えば、1種以上の生物において複製できるベクターであるシャトルベクターは、大腸菌プラスミドからの配列と酵母2.mu.プラスミドからの配列とを結合させることによって大腸菌および酵母双方における複製のために調製できる。
本発明のポリヌクレオチド(例えば、遺伝子、cDNA、RNA)が、適切なベクターに挿入される場合、それは、例えば、その単離のために外来宿主細胞(細菌、酵母、昆虫、動物細胞または植物細胞など)、または遺伝子療法治療または細胞媒介ワクチン接種(例えば、樹状細胞を用いて)の目的のために個体からの(単離)細胞においてタンパク質を発現する方法として使用できることが本明細書において理解することができる。例えば、細胞は、哺乳動物から単離でき、同じ個体または適合性個体に再注入される前に本発明のポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子、RNA、アンチセンス)によりエキソビボで処理(例えば、曝露、トランスフェクト、リポフェクト、感染、衝撃(高速度微量注入))できる。ポリヌクレオチドのインビボ送達は、上記のもの以外の他の方法により実施できる。例えば、注入される場合のリポソーム製剤は、ポリヌクレオチドのインビボ送達を媒介するために好適であり得る。
組換えポリペプチド(タンパク質)を提供するために、任意の多種多様の発現系を使用できる。使用される正確な宿主細胞は、本発明にとって重大な意味をもたない。本発明のポリペプチドは、原核生物宿主(例えば、大腸菌または枯草菌(B. subtilis))または真核生物宿主(酵母、例えば、ピチアパストリス(Pichia Pastoris)のサッカロミセス属; 哺乳動物細胞、例えば、サルCOS細胞、マウス3T3細胞(Todaro GJおよびGreen H.、J. Cell Biol. 17: 299〜313頁、1963年)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)(例えば、Puck TTら、J. Exp. Med. 108: 945〜956頁、1958年)、BHK、ヒト腎293細胞(例えば、ATCC: CRL-1573)、またはヒトHeLa細胞(例えば、ATCC: CCL-2); または昆虫細胞)において産生できる。
ピチアパストリス(P. Pastoris)などの酵母細胞発現系において、本発明のポリペプチド類をコードするDNA配列は、pPIC9ベクター(Invitrogen)などの好適な発現ベクターにクローン化できる。本発明のポリペプチド類の全てまたは一部をP. Pastoris宿主細胞にコードするDNA配列を含有するベクターの導入の際に、組換え事象は、例えば、AOX1座に生じることができる。このような組換え事象により、AOX1遺伝子プロモーターの依存下で本発明のポリペプチドのDNA配列を配置することができる。本発明のポリペプチド類をコードする遺伝子(すなわち、DNA配列)の成功した挿入により、宿主細胞の増殖培地に添加されたメタノールにより調節され、および/または誘導されるこのようなポリペプチドの発現をもたらすことができる(参考文献に関して、Buckholz, R. G.およびGleeson, M. A. G.、Biotechnology、9: 1067〜1072頁、1991年; Cregg, J. M.ら、Biotechnology、11: 905〜910頁、1993年; Sreekrishna, K.ら、J. Basic Microbiol.、28: 265〜278頁、1988年; Wegner, G. H.、FEMS Microbiology Reviews、87: 279〜284頁、1990年を参照されたい)。
哺乳動物の宿主細胞において、多くのウィルスベース発現系を利用できる。例えば、アデノウィルスは、本発明のポリペプチド類に対する発現ベクターとして使用される事象において、核酸配列は、アデノウィルスの転写/翻訳対照複合体(例えば、後期プロモーターおよび三者構成リーダー配列)に結合できる。このキメラ遺伝子は、例えば、インビトロまたはインビボ組換えによりアデノウィルスゲノムに挿入できる。ウィルスゲノム(例えば、領域E1またはE3)の非必須領域への挿入により、生存し、感染宿主において本発明のポリペプチド類を発現できる組換えウィルスをもたらすことができる。
本発明のタンパク質およびポリペプチド類はまた、植物細胞により産生できる。カリフラワーモザイクウィルスおよびタバコモザイクウィルスなどの発現ベクターならびにプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)は、植物細胞におけるポリペプチド類の発現に使用できる。このような細胞は、広範囲の供給源(例えば、the American Type Culture Collection、ロックランド、メリーランド州)から入手できる。もちろん、形質変換またはトランスフェクションの方法ならびに発現媒体の選択は、選択された宿主細胞に従って選択できる。
スポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞において増殖するオウトグラファカリフォルニア核多汗症ウィルス(AcNPV)などの昆虫細胞発現系において、AcNPVは、外来遺伝子を発現するベクターとして使用できる。例えば、本発明のポリペプチド類をコードするDNA配列は、ウィルスの非必須領域(例えば、ポリヘドリン遺伝子)にクローン化でき、AcNPVプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)の制御下に置くことができる。本発明のポリペプチド類をコードする遺伝子(例えば、DNA配列)の成功した挿入により、ポリヘドリン遺伝子の不活化および非閉塞性組換えウィルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコード化されたタンパク質様コートを欠くウィルス)の産生をもたらすことができる。該挿入遺伝子が発現されるスポドプテラフルギペルダ(spodoptera frugiperda)細胞を感染させるために、これらの組換えウィルスを使用できる。
さらに、宿主細胞は、挿入配列の発現を変調させるか、または特異的な所望の様式で遺伝子産物を修飾または処理する能力に関して選択できる。タンパク質産物のこのような修飾(例えば、グリコシル化)および処理(例えば、開裂)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後処理と修飾に関する特性および特異的機序を有する。もちろん、細胞系または宿主系は、発現された外来タンパク質の所望の修飾と処理とを確保するために選択できる。最後に、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、およびリン酸化の適切な処理に関する細胞仕組みを有する真核宿主細胞を使用できる。このような哺乳動物の宿主細胞は、例えば、限定はしないが、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、および3T3を含む。
あるいは、本発明のポリペプチド類は、安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞系により産生できる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに好適な多くのベクターは、公的に入手でき; このような細胞系を構築する方法もまた、公的に入手できる。一例において、rHuPSP94タンパク質をコードするcDNAは、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子を含む発現ベクターにクローン化され得る。宿主細胞染色体へのプラスミドの組込み、したがって、本発明のポリペプチドのDNA配列は、細胞培養培地中のメトトレキサートを含むことによって選択できる。この選択は、大部分の細胞型において達成できる。
特異的な開始シグナルはまた、上記の好適な発現媒体中で挿入されたDNA配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含むことができる。例えば、本発明のポリペプチド類をコードする遺伝子またはcDNAが、それら自体の開始コドンおよび隣接配列を有することが考えられない事象において、さらなる翻訳対照シグナルを必要と言える。例えば、恐らくATG開始コドンを含む外因性翻訳対照シグナルが必要となり得る。所望のポリペプチドの適切な翻訳を確保するために、該開始コドンは、ポリペプチド配列のリーディングフレームによる相内に存在しなければならないことが当業界に知られている。外因性翻訳対照シグナルおよび開始コドンは、天然および合成双方を含む種々の起源からであり得る。該発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターの包含により増強できる。転写、転写シグナルは、所望の発現パターンおよびレベル(例えば、特定のインデューサーを必要であり得るシグナル、規定の細胞型または特定の時間枠で発現を可能にするシグナル)を提供するために特異的に操作できる。しかしながら、これらのシグナルは、所望の宿主細胞においてポリペプチドの発現を可能にするプロモーターをしばしば含有する発現ベクターにより提供され得る。
ポリペプチド修飾(変異体、変種、類縁体、同族体、キメラおよび一部/断片)
多くの修飾によって認識できるように、ポリペプチド類または断片の生物活性に有害に影響を及ぼすことなく、本発明のポリペプチド類および断片に作製できる。本発明のポリペプチド類は、例えば、翻訳後の処理などの天然処理、または当業界に知られている化学修飾技法により修飾されたアミノ酸配列を含有するものを含む。ポリペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ端またはカルボキシ端など、ポリペプチド内のいずれかに修飾は生じ得る。同じタイプの修飾は、所与のポリペプチドの幾つかの部位で同じかまたは程度を変えて存在し得ることを認識するであろう。ポリペプチド類は、ユビキチン結合の結果、分枝状であっても、またそれらは、分枝の有る無しで環式であってもよい。環式、分枝状および分枝状環式ポリペプチド類は、翻訳後の天然の処理から生じることができるか、または合成法により作製できる。修飾は、例えば、限定はしないが、アセチル化、アシル化、フラビンに対する共有結合、ヘム部分に対する共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、架橋共有結合の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、フェニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化およびユビキチン結合などのタンパク質への転移RNA媒介アミノ酸付加を含む(参考文献に関して、Protein-structure and molecular properties、第2版、T. E. Creighton、W. H. Freeman and Company、ニューヨーク、1993年を参照)。
他のタイプのポリペプチド修飾は、例えば、アミノ酸挿入(すなわち、付加)、削除および置換(すなわち、置き換え)、ポリペプチド配列における保存的または非保存的修飾(例えば、D-アミノ酸、脱アミノ酸)を含むことができ、このような変化は、ポリペプチドの総合的な生物活性を実質的に変えない。本発明のポリペプチド類は、例えば、生物活性変異体、変種、断片、キメラ、および類縁体を含み; 断片は、1つ以上のアミノ酸の切断を有するアミノ酸配列を包含し、切断は、アミノ末端(N末端)、カルボキシ末端(C末端)から、またはタンパク質の内部から生じ得る。本発明のポリペプチド類縁体は、1つ以上のアミノ酸の挿入または置換を含む。変種、変異体、断片、キメラおよび類縁体は、本発明のポリペプチド類の生物学的特性を有することができる。
ポリペプチド類が合成的に作製される場合、DNAにより自然にコード化されないアミノ酸による置換が作製できることもさらに注目すべきである。例えば、代替残基は、nが2〜6である式NH2(CH2)nCOOHのオメガアミノ酸を含む。これらは、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、およびノルロイシンである中性非極性アミノ酸類である。フェニルグリシンを、Trp、TyrまたはPheの代わりに用いることができ; シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは中性非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンは、ヒドロキシプロリンで置換されて、コンフォメーション付与特性を保持できる。
変異体または変種は、置換変異誘発により生成され、本発明のポリペプチド類の生物活性を保持できることが当業界に知られている。これらの変種は、タンパク質分子の少なくとも1つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されている。例えば、置換変異誘発に関して対象の1つの部位は、制限はしないが、活性部位、または免疫部位として確認された部位を含むことができる。対象の他の部位は、例えば、種々の種から得られた特定の残基が同一であるものであり得る。これらの位置は生体活性にとって重要であり得る。「保存置換」として確認された置換の例は、表1に示している。このような置換は、望ましくない変化をもたらす場合、表1またはアミノ酸クラスに関してさらに本明細書に記載された「代表的な置換」と呼ばれる他のタイプの置換が導入され、産物がスクリーンされる。
置換の例は、保存的であるもの(すなわち、残基が同じ一般的タイプの別のものにより置換される)であり得る。理解されるように、天然アミノ酸は、酸性、塩基性、中性および極性、または中性かつ非極性として細分類できる。さらに、コード化されたアミノ酸のうちの3つは芳香族である。本発明の決定されたポリペプチドとは異なるコード化ポリペプチドは、置換されるアミノ酸基と同じ基に由来するアミノ酸に関する置換コドンを含有することで用いることができる。したがって、幾つかの場合、塩基性アミノ酸であるリシン(Lys)、アルギニン(Arg)およびヒスチジン(His)は互換でき; 酸性アミノ酸のアスパラギン酸(ASp)およびグルタミン酸(Glu)は互換でき; 中性極性アミノ酸であるセリン(Ser)、トレオニン(Thr)、システイン(Cys)、グルタミン(Gln)、およびアスパラギン(Asn)は互換でき; 非極性脂肪族アミノ酸であるグリシン(Gly)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、イソロイシン(Ile)、およびロイシン(Leu)が互換できるが、サイズのためGlyとAlaとは、より密接に関連しており、Val、IleとLeuとは、互いにより密接に関連しており、芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン(Phe)、トリプトファン(Trp)およびチロシン(Tyr)は互換できる。
Figure 2008543791
幾つかの場合において、アミノ酸置換、挿入、または削除によりポリペプチドの生物活性を修飾することは興味深いことと言える。例えば、ポリペプチドの修飾により、ポリペプチドの生物活性の増大をもたらすことができ、その毒性を変調でき、生物学的利用能または安定性の変化をもたらすことができ、またはその免疫活性または免疫本性を変調できる。機能または免疫本性の実質的な変更は、(a)例えば、シートまたはらせん状コンフォメーションとして、置換領域においてポリペプチド主鎖の構造、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、または(c)側鎖の嵩、を維持する上でそれらの効果が有意に異なる置換基を選択することにより達成される。天然残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のグループに分類される:
(1) 疎水性: ノルロイシン、メチオニン(Met)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)
(2) 中性親水性: システイン(Cys)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)
(3) 酸性: アスパラギン酸(ASp)、グルタミン酸(Glu)
(4) 塩基性: アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)
(5) 鎖配向性に影響を及ぼす残基: グリシン(Gly)、プロリン(Pro); および
(6) 芳香族: トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、フェニルアラニン(Phe)。
非保存的置換は、別にこれらのクラスの1つのメンバーの交換を必要とするであろう。
変異体ポリペプチド類は、削除(例えば、切断)、挿入(例えば、付加)、またはアミノ酸残基の置換である1つ以上の変異を有する。変異体は、天然(すなわち、天然源から精製または単離)または合成(例えば、コード化DNAに対して部位特異的変異誘発を実施することにより、または化学合成などの他の合成法により作製)であり得る。したがって、本発明のポリペプチド類は、天然または組換え(すなわち、組換えDNA技法から調製)のいずれかであり得ることは明白である。
当業者に知られた方法(例えば、Smith,T. F.およびWaterman M. S. (1981) Ad. Appl. Math.、2: 482〜489頁、またはNeedleman, S. B.およびWunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol.、48: 443〜453頁により記載された方法)により決定された、本発明のこれらのポリペプチド類に対して少なくとも50%同一のタンパク質、本発明のタンパク質に対して少なくとも70%または80%、より好ましくは少なくとも90%同一性であるタンパク質が本発明に含まれる。これは、少なくとも5つ、好ましくは少なくとも20の連続アミノ酸の領域にわたるであろう。
アミノ酸配列変種は、DNAへの適切なヌクレオチド変化を導入することにより、または所望のポリペプチドのインビトロ合成により調製できる。このような変種としては、例えば、削除、挿入、またはアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる。削除、挿入および置換の組合せにより、最終タンパク質産物が所望の特徴を有するという条件で最終構築物に到達させることができる。アミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変えること、膜固着特性を変えること、挿入、削除により細胞内位置を変えること、または他に固有のタンパク質の膜貫通配列に影響を及ぼすこと、またはタンパク質分解開裂に対する感受性を変更することなど、翻訳後の処理を変えることができる。
タンパク質の精製
本発明の幾つかの態様は、ポリペプチドの精製、特定の実施形態において、実質的な精製に関するものである。本明細書に用いられる用語「精製ポリペプチド」とは、他の成分から単離可能な組成物を称することが意図されており、該ポリペプチドは、その天然獲得状態に比して(すなわち、この場合、前立腺細胞抽出物内の純度に比して)任意の程度に精製される。したがって、精製ポリペプチドとはまた、天然に生じ得る環境から遊離のポリペプチドのことである。
一般に、「精製」とは、種々の他の成分を除去するために分別化に供されて、組成物が、その生物活性の発現を実質的に保持するポリペプチド組成物のことである。用語「実質的に精製」が用いられる場合、これは、組成物中約50%以上のポリペプチドを構成しているなど、組成物の主要成分または一部をポリペプチドが形成する組成物のことである。
ポリペプチド精製の使用に好適な種々の技法は、当業者によく知られている。これらには、例えば、硫酸アンモニウムによる沈殿、PEG、抗体など、または熱変性、次いで遠心分離; イオン交換、ゲルろ過(すなわち、ゲルろ過クロマトグラフィー)、逆相、ヒドロキシルアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップ; 等電点電気泳動; ゲル電気泳動; およびこのような技法ならびに他の技法の組合せが挙げられる。これらの技法は、単独かまたは組み合わせて使用できる。一般に当業界に知られているように、種々の精製ステップを実施する順序は変更できるか、またはあるステップは削除でき、さらに実質的に精製されたポリペプチドの調製に好適な方法をもたらすと考えられる。
硫酸アンモニウム沈殿によるタンパク質を精製する能力は、高塩濃度でタンパク質の溶解度が低下するという事実に基づく。しかしながら、タンパク質の溶解度は、それらの性質に依って異なる様式で影響を受ける。
ゲルろ過クロマトグラフィーまたはゲルろ過は、それらのサイズに基づいて分子を分離する。ゲル(すなわち、マトリックス、樹脂)媒体は、特定の分布のポアを含有するビーズからなり得る。分離は、異なるサイズの分子がマトリックス内のポアに含まれるか、またはポアから除外される場合に生じ得る。小型の分子は、ポア内に拡散でき、それらのカラム内の流れは遅くなるが、一方、大型の分子は、ポアに入らず、カラムの空隙容量で溶出される。その結果、分子はカラムを通過し、分子量の減少順序で溶出され、それらはサイズに基づいて分離される。
タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィーにより正味電荷に基づいて分離できる。例えば、タンパク質がpH7で正味の陽電荷を有する場合、通常、陰電荷基を含有するビーズ(すなわち、マトリックス)に結合(吸着)するであろう。例えば、陽電荷タンパク質は、陰電荷カルボキシメチル-セルロースまたはカルボキシメチル-アガロースマトリックス上で分離できる。溶出後、低密度の正味陽電荷を有するタンパク質は、カラムから最初に出現する傾向があり、次いでより高密度電荷を有するものが出現する。陰電荷タンパク質は、陽電荷ジエチルアミノエチル-セルロース(DEAE-セルロース)またはDEAE-アガロースマトリックス上のクロマトグラフィーにより分離できる。イオン交換マトリックスに結合された電荷タンパク質は、溶出緩衝液として塩化ナトリウムまたは別の塩溶液の濃度を増加させることによって溶出(放出、解離)できる。イオンは、マトリックスに結合するためのタンパク質上の電荷基と競合する。
本発明の特定のポリペプチド(すなわち、PSP94-結合タンパク質(配列番号2、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9))が溶出されるまで、塩溶液を、連続様式(すなわち、特定のモル濃度(例えば、100mM塩化ナトリウム)の溶液を加えることによって、次いで1つ以上の異なるモル濃度溶液(例えば、200mM、次いで300mMの溶液、次いで400mMの溶液、次いで500mMの溶液、次いで1000mMの溶液)の添加により)でマトリックスに添加できる。さらに、塩類溶液は、連続勾配として添加できる。例えば、高モル濃度(例えば、1000mM)の塩溶液は、イオン交換クロマトグラフィーカラムに入る前に低モル濃度(例えば、100mM)の第二の溶液を徐々に添加できる。カラムに入る塩溶液は、100mMから1000mMまでゆっくりと増加するモル濃度を有する。
アフィニティークロマトグラフィーは、化合物に対するポリペプチドの特異性(親和性)が知られているか、または疑いのある場合に使用できる。例えば、最初のステップとしてこのような化合物(例えば、PSP94)は、カラム(例えば、シアノーゲンブロミド活性化セファロースマトリックス)に共有結合され、所望のポリペプチド(例えば、PSP94結合タンパク質)を含有する混合物(溶液)を、マトリックスに添加できる。マトリックスを洗浄後、未結合タンパク質を除去するために、溶解形態の高濃度の化合物(例えば、PSP94)を添加することによってマトリックスから所望のポリペプチドを溶出できる。抗体は、結合するタンパク質を精製するためにしばしば用いられる化合物の例である。
望ましくない(すなわち、非特異的)タンパク質の結合(非特異的結合)を最少にするために、クロマトグラフィーマトリックス(すなわち、樹脂)(例えば、イオン交換マトリックス、ゲルろ過マトリックス、アフィニティーマトリックス)の平衡および実質的な洗浄が好ましいことは当業界に知られている。
抗体およびハイブリドーマ
本発明の他の態様は、抗体およびハイブリドーマ細胞系に関する。抗体の調製および特性化は、当業界によく知られており(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual.、Cold Spring Harbor Laboratory、1988年を参照、参照として本明細書に組み込まれている)、米国特許第6,156,515号に検討されており、参照としてその全体内容が本明細書に組み込まれている。
例えば、ポリクローナル抗体の調製は、動物を免疫原性(免疫)組成物により免疫化し、その免疫化動物から抗血清を採取することにより得ることができる。広範囲の動物種を、抗血清産生のために使用することができる。抗-抗血清の産生のために使用される動物は、典型的にはウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。
例えば、免疫原(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)およびウシ血清アルブミン(BSA))を担体に結合させることにより、またはアジュバントを、本明細書に記載された免疫組成物に組み入れることにより宿主免疫系をしばしば増強させることが必要である。
抗体の産生は、免疫化後、種々の時点で免疫化動物の血液をサンプリングすることによりモニターできる。抗体(類)の十分な力価を提供するために、時には、追加のブーストが必要となり得る。
所望の抗体は、例えば、別の抗体または固体マトリックスに結合されたペプチドを用いてアフィニティークロマトグラフィーなど、知られた方法により精製できる。
モノクローナル抗体(mAbs)は、参照としてその全体内容が本明細書に組み込まれている、米国特許第4,196,265号に例示されたものなど、知られた技法の使用により容易に調製できる。マウス(例えば、BALB/cマウス)およびラットは、免疫化のために通常使用される動物である。免疫化後、Bリンパ球(B細胞)を、mAb産生プロトコルに使用のために選択される。しばしば、動物パネルを免疫化しなければならず、最高の抗体力価を有する動物が選択される。次に、免疫化動物からの抗体産生Bリンパ球を、継代骨髄腫細胞の細胞(例えば、ポリエチレングリコールを用いて)と融合する。多くの骨髄腫細胞のいずれも、当業者に知られているように(Goding、65〜66頁、1986年; Campbell、75〜83頁、1984年)使用できる。例えば、免疫化動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/JU、MPC-11、MPC-11-X45-GTG 1.7およびS194/5XXO BuIを使用でき; ラットに関しては、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび4B210を使用でき; U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6は、ヒト細胞融合に関連して全てに有用である。
融合ハイブリッドは、融合細胞と親細胞(すなわち、骨髄腫細胞およびB細胞)との間の分化を可能にする選択的培地中で増殖する。選択的培地は、通常、ヌクレオチドのデノボ合成を遮断する試剤(例えば、アミノプテリン、メトトレキサート、アザセリン)を含有する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地は、ヌクレオチド源としてヒポキサンチンおよびチミジンにより補足される(HAT培地)。アザセリンが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンにより補足される。ヌクレオチドサルベージ経路を操作できる細胞だけが、HAT培地において生存できる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)において欠陥があるので、それらは生存できない。B細胞はこの経路で操作できるが、培養時の寿命が限定されており、一般に約2週間以内に死滅する。したがって、選択培地で生存できる細胞は、骨髄腫細胞とB細胞とから形成されたハイブリッドだけである。
ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中、単一クローン希釈により細胞を培養し、次いで所望の反応性に関して個々のクローン上澄液を試験することにより実施される。次に選択ハイブリドーマを連続希釈し、個々の抗体産生細胞系内でクローン化され、次いでクローンは、mAbを提供するために無限に増殖できる。
モノクローナル抗体(類)の断片は、本発明により包含される。これらは、ペプシンまたはパパインなどの酵素による消化および/または化学的還元によるジスルフィド結合の開裂を含む方法により得ることができる。あるいは、本発明により包含されたモノクローナル抗体の断片は、自動ペプチドシンセサイザーを用いて合成できるか、または好適な細胞(細胞系)内でこのような断片(例えば、一本鎖抗体)を産生するために操作されたクローン化遺伝子セグメントから産生できる。
抗体接合体もまた、本発明により包含される。これらは、抗体と、レポーター分子、蛍光体、発色団または染料(例えば、ローダミン、フルオレセイン、および緑色蛍光タンパク質)と、または単独に作用させるか、あるいは生化学反応(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびベータ-ガラクトシダーゼなどの酵素)後に検出可能なシグナルを生じさせる任意の他の試薬または標識とを結合させることにより生成できる。ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)などの分子もまた抗体に結合できる。DTPAは、放射性同位元素(例えば、インジウムの同位体111(111In))などの重金属イオンにも結合できるキレート化剤として作用し得る。これらの接合体は、免疫アッセイまたは画像法の検出手段として使用できる。あるいは、毒素などの治療剤を有する接合体は、本発明のモノクローナル抗体から調製でき、これらは、癌細胞を標的にし、破壊を促進するために使用できる。
前立腺癌に関連するタンパク質に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体が、幾つかのタイプの適用において有用性があることは当業者により認識されるであろう。これらは、前立腺癌の個体の検出、診断または予後の評価に使用するための診断キットの製造を含むことができる。
抗原検出
抗原検出に関して、分析される生体試料は、組織、細胞溶解液、尿、血液、血清、血漿などに対象の抗原を含有する疑いのある任意の試料であり得る。
生体試料と抗原検出(検出する)試薬(タンパク質、ペプチドまたは抗体)との接触とは、一般に該組成物を試料に単に加えることであり、抗体にとって十分な長さの時間この混合物をインキュベートして抗原との免疫複合体を形成することである。試料(すなわち、組織切片、ELISAプレート、ドットブロットまたはウェスタンブロット)の洗浄は、一般にいずれの非特異性結合抗体種を除去するために必要である。次いでこの抗原抗体複合体(免疫複合体)を、特定の試薬を用いて検出する。
例えば、抗原検出試薬が、抗体(特異的抗体)である場合、この抗体は、複合体の検出を可能にするため、マーカー(蛍光体、発色団、染料、酵素、放射性同位元素など)により(直接)標識できる。他の場合、当業界に知られている、二次抗体またはビオチン/アビジン(ストレプトアビジン)(結合/リガンド複合体)配列などの二次的結合リガンドを使用することは有利であり得る。再び、二次抗体は、上記のマーカーにより、またはビオチン/アビジン(すなわち、アビジンペルオキシダーゼ)あるいは免疫複合体の検出を可能にするビオチン/ストレプトアビジン(すなわち、レポーター分子(例えば、ペルオキシダーゼ)により結合されたストレプトアビジン)の配列により標識できる。このような標識の使用に関する米国特許としては、米国特許第3,817,837号; 米国特許第3,850,752号; 米国特許第3,939,350号; 米国特許第3,996,345号; 米国特許第4,277,437号; 米国特許第4,275,149号および米国特許第4,366,241号が挙げられ、各々は、参照として本明細書に組み込まれている。通常、二次抗体は、規定されたイソタイプおよび例えば、抗マウスIgGなどの種の特定の抗体(一次抗体)に特異的な抗体である。
一方、抗原検出試薬もまた、複合体(すなわち、ポリペプチド-ポリペプチド複合体または抗体-ポリペプチド複合体)を形成する抗体または別のポリペプチドに対する親和性を有するポリペプチドであり得る。その場合、ポリペプチド自体は、直接検出を可能にする上記のマーカーを用いて標識できる。再び、該複合体は、二次(標識)抗体またはポリペプチドを加えることによって間接的に標識できる。
酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロット法などの免疫検出法は、前立腺癌などの状態の診断において有用性がある。しかしながら、これらの方法はまた、ハイブリドーマなどの切片における抗原または抗体試料の力価測定など、非臨床試料に対して適用される。
ELISA
本明細書に記載の方法、アッセイ、キット、抗体および試薬は、例えば、前立腺癌の診断/予後における有用性を見出すことができる。
本発明の試薬を用いて実施できる免疫アッセイとしては、当業界に知られている、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および放射性免疫アッセイ(RIA)が挙げられる。組織切片を用いる免疫組織化学検出もまた、特に有用である。しかしながら、検出はこのような技法に限定されないことは容易に認識され、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、FACS解析法などもまた使用できる。
ELISAアッセイの例としては、以下のものが挙げられる: ポリペプチドに結合する抗体(例えば、PSP94に対する抗体)は、ポリスチレン製マイクロタイタープレート(ELISAプレート)のウェルなど、タンパク質親和性を示す選択表面(すなわち、好適な基質)上に固定化される。次いで、ポリペプチドを含有する疑いのある試料を、プレートのウェルに加える。結合後、非特異的結合免疫複合体を除去するために洗浄し、結合抗原を検出できる。検出は、検出可能な標識に結合される標的ポリペプチドに特異的な第二の抗体の添加により達成できる。このタイプのELISAは、単純な「サンドイッチELISA」である。検出はまた、第二の抗体の添加、次いで、検出可能な標識(マーカー)に結合する第三の抗体であって、第二の抗体に対して結合親和性を有する第三の抗体を添加することによって達成できる。
ELISAアッセイの別の例としては、以下のものが挙げられる; 対象のポリペプチドを含有する疑いのある試料を、好適な基質の表面上に固定化してから、本発明の抗体と接触させる。結合後、非特異的結合免疫複合体を除去するために洗浄し、結合抗原を検出する。免疫複合体は、本明細書に記載されたとおり、直接的または間接的に検出できる。
ELISAアッセイのさらなる例としては、以下のものがある; 再度、ポリペプチドを支持体に固定化するが、この場合、該アッセイには競合ステップを含む。このELISAにおいて、知られた量の対象ポリペプチドは、プレートに吸着される。次に未知試料中のポリペプチドの量は、固定化ポリペプチドを含有するウェルによるインキュベーション前またはインキュベーション中の特定の抗体と試料とを混合することにより決定される。検出試薬(例えば、抗体)を添加して、固定化ポリペプチドに結合できる抗体を定量化する。試料中のポリペプチドの存在により、ウェルに含まれたポリペプチド(固定化ポリペプチド)に結合するために利用できる抗体量を減少させるように作用し、したがってシグナルを減少させる。
シグナルと未知の試料中のポリペプチドの量(濃度)との間の相互関係を得るために、対照試料をアッセイ中に含ませることができる。例えば、ポリペプチド(通常、実質的に純粋形態で)の既知(所定)量を、未知試料と同時に測定(検出)できる。次いで、未知試料に関して得られたシグナルを、対照に関して得られたシグナルと比較する。シグナル強度(レベル)は、通常、試料中のポリペプチド(ポリペプチドに結合の抗体)量に比例する。しかしながら、定量アッセイを生じさせるために必要な対照ポリペプチド量および抗体量は、最初に評価するために必要である。
抗原(ポリペプチド)または抗体によりプレートをコーティングするのに、一般に、抗原または抗体の溶液によりプレートのウェルを、一晩または指定された時間でインキュベートする。次に、プレートのウェルを洗浄して、不完全に吸着された物質を除去する。次いで、残りの利用できるウェル表面を、試験抗血清に関して抗原的に中性である非特異的タンパク質により「コーティング」する。これらには、ウシ血清アルブミン(BSA)、カゼインおよびミルク粉末の溶液が挙げられる。このコーティングは、固定化表面上の非特異的吸着部位の遮断を可能にするので、表面上の抗血清の非特異的結合により生じるバックグラウンドを減少させる。
免疫複合体(抗原/抗体)形成を可能にし得る条件は、BSA、ウシガンマグロブリン(BGG)およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)/ツイーンなどの溶液により抗原および抗体を希釈することを含む。これら添加された試剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少を補助する傾向がある。
好適な条件は、インキュベーションが効果的な結合を可能にするのに十分な温度および時間であることを含む。インキュベーションステップは、典型的に約1時間から2時間、4時間まで、好ましくは、温度は20℃から27℃までの程度であり、または一晩、約4℃などであってもよい。
免疫複合体の検出は、酵素に結合する試薬により実施されることが多い。検出は、通常、酵素基質の添加を必要とする。例えば、適切な基質を与えた場合のホスファターゼ(例えば、アルカリホスファターゼ)、ペルオキシダーゼなどの酵素は、発生する色(放射性、蛍光など)の強度(程度)を測定することによって定量化できる反応を生じる。該反応は、通常、広範囲の濃度に亘って直線的であり、可視スペクトルの分光光度計を用いて定量化できる。
キット
本発明はまた、上記の免疫検出法による使用のための免疫検出キットおよび試薬に関する。本発明のポリペプチドは、抗体を検出するために使用でき、対応する抗体は、ポリペプチドを検出するために使用できるので、このような成分のいずれか、または双方ともキットに提供できる。したがって、好適な容器手段で、免疫検出キットは、ポリペプチド(PSP94、またはPSP94-結合タンパク質)、またはポリペプチドおよび/または免疫検出試薬に結合する第一の抗体を含むことができる。キットはまた、選択された抗体またはポリペプチドが、既に結合されていてもよい好適なマトリックスを含むことができる。好適なマトリックスとしては、ELISAプレートが挙げられる。キットにより提供されたプレートは、選択された抗体またはポリペプチドにより既にコーティングされていてもよい。コーティングされたELISAプレートはまた、非特異的結合を防止するために本明細書に記載された試薬を用いて遮断することができる。検出試薬もまた提供でき、例えば、標識またはマーカーおよび/または酵素基質を担持できる二次抗体またはリガンドを含むことができる。キットは、対照に使用できる抗体またはポリペプチド(通常、力価または濃度が知られている)をさらに含むことができる。試薬は、例えば、凍結乾燥または(規定された濃度の)液体形態で提供でき、好適な容器中で提供される(試薬の安定性、安全性などを確保した)。
「範囲」、「物質の群」または特定の特性(例えば、温度、濃度、時間など)が記述される場合、本発明は、部分範囲または部分群の各々ならびにいずれの特定のメンバーおよびそれらの中のいずれかの組合せに関するものであり、明白に本明細書に組込まれていることを、本明細書において理解することができる。したがって、任意の指定された範囲または群は、個々に範囲または群の各々全てのメンバーならびに本明細書に包含された各々ならびにいずれの可能な部分範囲または部分群に関係して; および同様にその中の任意の部分範囲または部分群に関する速記方法として理解することができる。したがって、例えば、
- 1分以上の時間は、各々およびいずれの個々の時間、並びに例えば、1分、3分から15分、1分から20時間、1時間から3時間、16時間、3時間から20時間などの1分超の部分範囲を本明細書に具体的に組込まれているものとして理解することができる反応時間に関して;
- および同様に濃度、温度などの他のパラメーターに関して。
非PSP94結合タンパク質(またはこのようなポリペプチドをコードするDNA)は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドから除外されることもまた本明細書において理解することができる。
Figure 2008543791
本出願に記載された刊行物、特許および特許出願の各々の内容は、参照によって本明細書に組み込まれている。
PSP94は、PSP94結合タンパク質の単離、同定および精製において、おとりとして使用された。その目的のために、標識PSP94は、種々の精製ステップに供された血清フラクション中のPSP94結合タンパク質の存在を検出するために使用された。さらに、PSP94は、PSP94結合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製に使用された。下記の実施例は、PSP94結合タンパク質の精製、同定および有用性を例示する。
PSP94はまた、抗体の産生、抗PSP94抗体の単離、同定および精製のために使用された。
PSP94の単離、PSP94の放射性標識およびPSP94結合タンパク質の動態学的解析
ヒト精漿からのPSP94の単離および精製
PSP94は、Baijal Guptaら(Prot. Exp. and Purification 8: 483〜488頁、1996年)に記載されたとおりに調製するか、あるいはPSPを単離し、(実質的に)以下の通り精製した。
この手法は、4℃で実施された。精液試料(生体回収)を4℃で4〜6時間解凍した。試料を一緒にプールし、容量を測定した。試料をSDS-Page分析のために維持した。試料を5000×gで遠心分離(4℃)を10分間することにより精液を清浄にした。
精漿を7容量の冷エタノールを(撹拌なし)添加して一晩沈殿させた。翌日、試料を3000gで10分間遠心分離し(4℃)、冷エタノールで2回洗浄し、洗浄液の間で遠心分離した。次いで、ペレットをエンドトキシンの無いH2Oで元の容量に再懸濁した。試料を、凍結乾燥するために該容量よりも約4倍大きな容量の冷容器に移した。凍結乾燥前に、試料を、ドライアイス/メタノールのスラリー中-45℃でエルレンマイヤーに入れることによって凍結し、精漿が完全に凍結されまで渦巻かせ、次いで凍結乾燥した。この粉末は安定であることが判明し、窒素で満たされた密閉容器中で-80℃で維持した。
この混合物は、エンドトキシンの無い水の1容量(精漿の元の容量に関して)および2容量の氷冷の緩衝液A(50mMのPBS pH7.5、2.5mMのEDTA pH8.0、1.5mMのPMSF)を加えることによって再構成し、PMSFを新たに加え、混合して均質にした。
再構成された精漿のpHを0.1Mの酢酸を用いて6.0に調整し、生じた溶液(pH6.0)の容量を測定した。
固体硫酸アンモニウムを加えて、ゆっくりと一定の撹拌をすることによって0〜30%(176g/L)の濃度を形成した。この溶液を冷却しながら1.5時間撹拌した。
翌日使用のために製造元の取扱い説明書に従って、カチオン交換カラムの平衡を、pH6.3の10mMのリン酸ナトリウム緩衝液により開始した。溶液を適切な遠心分離管に移し、冷却遠心分離器中、12,000×gで60分遠心分離した。
上澄液を保存し、新鮮な冷却容器に移した。試料をSDS-Page分析用に維持した。ペレットを記録用に維持した。
上澄液容量を、目盛り付シリンダーで測定した。硫酸アンモニウムを、上澄液にゆっくりと加えて、30〜70%(273g/L)の最終濃度を得た。この混合物を1.5時間撹拌した。
この溶液を遠心分離管に移し、冷却遠心分離器中、12,000×gで60分遠心分離した。
ペレットを保存し、上澄液を取っておいた。ペレットを、各管から冷ガラスDounce Tissueグラインダーにすくい取った。ペレットを、可能性として(出発物質の約1ml/2ml)少容量の緩衝液B(pH8.0の2.5mM EDTA、pH6.3の10mMのリン酸ナトリウム)に溶解した。
透析用1,000 MWCO透析チューブ(Biolynk(Spectrum): 132103)を調製し、再懸濁ペレットを、該チューブに加えてからクリップで密封した。透析中の容量を増加させるために、1容量の空のスペースを残した。約15リットルの緩衝液の容器を用いて、透析を緩衝液Bに対して一晩実施した。翌日pHが、緩衝液Bと類似するか、または同じであることを確認した。
物質を透析チューブから取り出し、氷上で維持した。この物質を280nmでのUV吸収により試験した。試料をSDS-Page分析のために維持した。全タンパク質濃度は、1.0のA280(280nmでの吸収)は1mg/mlのタンパク質に等しいことを想定して算出された。
200mlのMacro-prep High S Supportカラム(BioRad: 156-0030、BioRadカラム: 737-5031)を、引き続く精製ステップに用いた。このカラムは、約1600mgのタンパク質の能力を有する。それゆえ必要ならば、試料を、カラム能力を超えさせないように確保するために複数操作に分けることができる。
試料を装填する前に、カラムをpH6.3の10mMリン酸緩衝液により平衡にした。
透析された硫酸アンモニウム沈殿試料をカラム上に装填した。10〜13mlのフラクションを採取し、4℃に置いた。
全試料容量がカラムを通過したら、さらに平衡緩衝液(10mMリン酸緩衝液、pH6.3)を加えた。A280が0.1以下になるまでフラクションを採取した。幾つかのフラクションは、PSP94溶出の限界を判定するためにSDS-Pageで分析した。PSP94を含有するフラクションをプールし、他の全てのフラクション(O.D.>0.1)を-80℃に維持する。プールされたフラクションの容量を測定し、A280を読み取った。再度、全タンパク質濃度を、1.0のA280(280nmでの吸収)は1mg/mlのタンパク質に等しいことを想定して算出された。
プールされたフラクションの試料を、SDS-Page分析用に維持した。試料を凍結しても、アニオン交換によりさらに精製してもよい。
30mMのTris-HCl pH8.8によるアニオン交換カラムの平衡は、製造元の取扱い説明書に従って開始した。
カチオンカラムから採取された物質をプールし、2M Tris-HCl、pH8.8を用いてpH8.8に調整した。最終Tris濃度は、50mM以下であった。タンパク質濃度は、0.8mg/ml以上で維持された。
60mlのMacro-prep High Q Supportカラム(BioRad: 156-0040、BioRadカラム: 737-5031)を、引き続く精製ステップに用いた。このカラムは、約480mgのタンパク質の能力を有する。それゆえ必要ならば、試料を、カラム能力を超えさせないように確保するために複数操作に分けることができる。
試料を装填する前に、カラムをpH8.8の30mM Tris-HCl緩衝液により(製造元の取扱い説明書に従って)平衡にした。
試料をカラム上に装填し、10〜13mlのフラクションを採取し、4℃に置いた。
全試料容量がカラムを通過したら、A280がベースラインに戻るまで50mM Tris-HCl pH8.8(洗浄緩衝液)を加えた。A280がベースラインに到達するまで250mM Tris-HCl pH8.8によるステップごとの溶出を実施した。A280がベースラインに到達するまで300mM Tris-HCl pH8.8による最終溶出を実施した。ピークが見られなくなったら、ピークが見られるまで350mM Tris-HCl pH8.8および400mMにより溶出を継続した。純粋なPSP94タンパク質を含有しないフラクションは凍結した。
純粋なPSP94タンパク質を含有したフラクションをプールし、製造元の取扱い説明書(VWR: 29300-714)に従って、1,000 MWCO膜(分子量切断)を用いて容量が約10mlになるまでAmicon濃縮器により濃縮した。透析を500〜1000倍容量の10mM PBS(pH7.4)に対して18時間実施した。
Dextoxi-gelカラムの再生とパッキングは、製造元の取扱い説明書(Biolynx: 20339)に従って実施した。2本のカラムのうちの1本の再生マトリックスは、濃縮PSP94と共に50mlチューブのうちの15mlに加え、ロッキングプラットホーム上、室温で1時間インキュベートした。
インキュベーション後、物質を他のパックカラム上にゆっくりと移した。全ての物質は、氷上で自然流下により採取した。物質の全てが、カラムを通過したら、細胞培養グレードのPBS(エンドトキシンのない、Wisent(Multicell): 21 031CV)を加え、A280が25よりも低くなるまで物質を採取した。
光学濃度を測定し、タンパク濃縮物を上記に示されたとおり算出した。PSP94(タンパク質)濃度は、1mg/ml超であり、物質を濃縮する必要はなかった。しかしながら、タンパク質濃度がより低かった場合、少なくとも1mg/mlになるように1,000 MWCO遠心分離濃縮器を用い、フィルターを、細胞培養グレードPBSによりリンスしてPSP(PSP94)を完全に除去した。
物質を、0.22μmシリンジフィルター(例えば、Millex: SLGP033RS)を用いてろ過により滅菌した。分割量を、ラバーシールを備えた低温チューブ内で作製して蒸発を防止し、-80℃で凍結した。幾つかの分割量を、特性化用に維持した。
PSP94の純度、濃度および「活性」を評価するために、複数の分析を実施した。例えば、クーマシーおよび銀染色(例えば、MES緩衝液(Invitrogen NPO342BOX、NP0002)との12%ポリアクリルアミドゲルを用いて)を用いるSDS-Page、例えば、P1E8抗体、エンドトキシンレベル(Charles River)を用いるウェスタンブロット、PSP結合タンパク質に対する結合能力を測定するELISA、アミノ酸配列決定、質量分析およびRP-HPLC。PSP94の精製結果は、表Aに示される。
Figure 2008543791
標識PSP94の調製
125I-PSP94標識化、ヒト男性血清タンパク質に対する125I-PSP94結合アッセイを最適化するための実験、ならびに遊離(すなわち、非結合)および複合化(すなわち、結合、会合)125I-PSP94を分離する手段の開発に着手した。PSP94(この場合; 125I-PSP94)に結合するヒト男性血清タンパク質(類)は、遊離PSP94(遊離 125I-PSP94)よりも高分子量の複合体形成を生じる。
PSP94のヨード化を以下のとおり実施した。15マイクロリットルの100mMの重炭酸ナトリウム(pH8.0)中、Baijal Guptaら(Prot. Exp. and Purification 8: 483〜488頁、1996年)に記載されたとおりに調製された20マイクログラムの固有のヒトPSP94を、製造元の取扱い説明書(NEN Radiochemicals)に従って0℃で1ミリキュリーのモノヨード化Bolton-Hunter試薬を用いて標識化した。この反応は、2時間後、100マイクロリットルの100mMグリシンの添加により終了した。遊離のヨウ素は、製造元の取扱い説明書(BIORAD)に従ってPD10の使い捨てゲルろ過カラムによりPSP94に組込まれたヨウ素から分離された。典型的には、PSP94タンパク質に組込まれたヨウ素の割合は約60%であり、PSP94の1マイクログラム当り約30マイクロキュリーの比放射能を得た。
125I-PSP94に対するヒト男性血清タンパク質の結合アッセイの最適化は、最適化インキュベーション時間、温度、および分離条件を特定するために実施した。平衡(例えば、インキュベーション時間を延長する結合においてさらに有意な増加がない)は、37℃でかなりのインキュベーション時間後にアプローチし、それゆえ16時間のインキュベーション時間を選択した。高分子量を有する複合化形態(すなわち、結合形態)のPSP94(または複合化125I-PSP94)および低分子量を有する遊離PSP94(または遊離125I-PSP94)の分離は、1×20cmカラム内にパックされたSephadex G100樹脂(Amersham Pharmacia Biotech社)を用いるゲルろ過クロマトグラフィーにより達成された。モレキュラーシーブクロマトグラフィーは、本手法時により高温において複合体の解離が有意に示されたので、4℃で実施された。
上記の最適化結果に基づいて、PSP94結合血清成分(すなわち、PSP94結合タンパク質)の放射性リガンド結合分析を実施した。このアッセイは、500マイクロリットルの全容量で実施された。この試験試料は、リン酸緩衝生理食塩水-ゼラチン(PBS-ゼラチン: 10mMリン酸ナトリウム、140mM NaCl、0.1%ゼラチン(Fisher Scientific、タイプA)、pH7.5、抗菌剤として8mMアジ化ナトリウムを含む)中、過剰の遊離競合物(10マイクログラムの遊離PSP94(非標識化))の有る無しでPSP94結合タンパク質(ニート血清、または精製試験からのフラクション)50ngの放射性標識PSP94を含んだ。これらは、37℃で16時間インキュベートした。この時間で、この平衡混合物を氷上に置き、成分は、PBSゼラチンにより平衡化された1×20cmセファデックスG100カラムを用いて4℃でモレキュラーシーブクロマトグラフィーによりそれらの分子量に従って分離した。試料をカラム中で操作した後、3mlを廃棄し、0.5mlの20フラクションを採取した。30mlの単一フラクションもまた、操作の終了時に採取した。
採取されたフラクションにおいて放射活性(1分当りのカウント(cpm)で発現された)を、LKBラックガンマカウンターを用いて測定し、高分子量ピーク(一般にフラクション4〜14内に含んだ)および低分子量ピーク(残りの0.5mlフラクションおよび単一の30mlフラクション)における全放射活性を算出した。典型的な溶出プロフィールを図1に示す。
図1は、ヨードの同位体元素125(125I)(すなわち、125I-PSP94)で放射性標識されたPSP94に結合された(特異的な結合)ヒト男性血清からのタンパク質のゲルろ過クロマトグラフィー結果を示す。125I-PSP94のヒト男性血清タンパク質への結合は、各フラクションにおいて1分当りのカウント(cpm)で発現される放射活性により判定される。非特異的結合は、250μlのヒト男性血清と50ngの125I-PSP94と一緒のインキュベーション混合物において10ngの遊離PSP94を含むことによって判定される。遊離(すなわち、非結合)-PSP94および複合(すなわち、結合)-PSP94を含有するフラクションの位置は、グラフに示している。遊離PSP94(125I-PSP94)の大部分を、フラクション20より後に溶出した。典型的に、250マイクロリットルのヒト血清に加えられた全放射活性PSP94の約33%が、PSP94結合タンパク質複合体の一部として早期フラクションに溶出し、非複合化のままの放射活性PSP94の約67%は、後期フラクションに溶出した。競合対照において、インキュベーション混合物中の非標識PSP94の10マイクログラムの包含により、放射活性PSP94の約3%だけが、高分子量複合体の一部として早期フラクションに溶出し、PSP94結合タンパク質に対するPSP94の特異性を確認した。
この方法論を用いて、放射性標識および競合PSP94の濃度を変えることによって、また、一定(250μl)のヒト男性血清の量を維持することによって、平衡結合データの動態学的解析を実施することは可能であった。PSP94は、PSP94結合タンパク質の分子量の約五分の一であることを想定して、これは、各ミリリットルの血清は、約1マイクログラムのPSP94結合タンパク質を有することを示唆するであろう。血清の全タンパク質含量は、1ミリリットル当り約80ミリグラムであることから、PSP94結合タンパク質: 血清中の全タンパク質比率は、約1:80,000である。
放射性リガンド結合解析からのさらなる情報は、PSP94結合タンパク質は、ヒト女性血清、ヒト処女女性血清、ウシ胎児血清、およびプールされたマウス血清に存在することを示した。
硫酸アンモニウム沈殿
実施例1で得られた動態学的結果から、PSP94結合タンパク質が、ヒト血清中の豊富さに乏しかったことが示された。
さらなる特性化および同定用のPSP94結合タンパク質を単離するために、最初の精製ステップを、硫酸アンモニウム沈殿により実施した。PSP94結合タンパク質を沈殿させるのに必要な硫酸アンモニウムの適切な濃度を確立するために、小スケール硫酸アンモニウム沈殿試験を実施した。沈殿物中のPSP94結合タンパク質の存在は、実施例1に検討された放射性リガンド結合分析によりPSP94に対する溶解および透析後に測定された。これらの試験により、32〜47%の硫酸アンモニウムフラクションは、図2に示すように大多数量のPSP94結合物質を含むことが判定された。
硫酸アンモニウム沈殿を、大スケールでルーチンに実施した。手短に言うと、1リットルの男性凍結血清(Bioreclamation社、ニューヨーク)を解凍し、1リットルの冷10mMリン酸ナトリウム、140mM NaCl、pH7.5(リン酸緩衝生理食塩水; PBS)に加え、一定撹拌下で、これに370gの硫酸アンモニウム(BDH ACS試薬グレード)をゆっくりと加えて硫酸アンモニウム濃度を32%までにした。塩の溶解後、この混合物(すなわち、硫酸アンモニウムを含有する男性血清)を、20分間撹拌してから、5,000×gで15分間遠心分離した。ペレットを廃棄し、PSP94結合タンパク質を含有するタンパク質の上澄液フラクションを採取した。さらに硫酸アンモニウム(188g)を、一定撹拌下で上澄液フラクションにゆっくりと加えて、全硫酸アンモニウム濃度を47%にまでにした。20分後、この混合物を、5,000×gで回転し、上澄液を廃棄し、ペレットを、全部で500mlの10mM MES((2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸)水和物)、100mM NaCl、pH6.5に溶解した。このペレットを、16リットルの10mM MES、100mM NaCl、pH6.5を有する6〜8,000分子量切断透析用チューブを用いて4℃で16時間透析し、次いでさらに16リットルの同じ緩衝液を用いてさらに7時間別の透析ステップを行った。生成物内のタンパク質濃度は、280nmでの紫外線(UV)吸光度を用いて測定し、この調製物を、4gのタンパク質分割量(一般に約150ml)で-20℃で保存した。典型的な硫酸アンモニウム沈殿アッセイは、図2に示している。
イオン交換クロマトグラフィーアッセイ
イオン交換クロマトグラフィー(IEX)は、ネット電荷に基づいて分子を分離する。負電荷および正電荷官能基を、カチオンまたはアニオン交換体を生じる固体支持体マトリックスに共有結合させる。電荷分子が、反対電荷の交換体に適用されると吸着され、一方、中性イオンまたは同じ電荷のイオンは、カラムの溶媒容積で溶出される。電荷分子の結合は可逆性であり、吸着された分子は、通常、塩またはpH勾配で溶出される。
PSP94結合タンパク質の予めの特性知識なしで、pH値の範囲でPSP94結合タンパク質を吸収するためにアニオンおよびカチオン交換マトリックスの能力を、一連のイオン交換アッセイにおいて判定した。分割量の硫酸アンモニウム沈殿血清を、製造元の取扱い説明書に従って適切な緩衝液により平衡化したBiorad DG 10カラムを用いて表3に示された緩衝液に交換した。700マイクロリットルの分割量を、500マイクロリットルのイオン交換マトリックス(製造元の推奨に従って調製された)と共にインキュベートした。緩やかに撹拌しながら室温で90分間のインキュベーション後、混合物を1000×gで5分間回転させて上澄液からマトリックスを分離した。PSP94結合タンパク質がマトリックスに結合(吸着)されると、遠心分離後それに結合されたままであり、該タンパク質は上澄液に存在しないであろう。上澄液を、0.3容量の250mMのTRIS pH7.5で直ちに中和し、この溶液の250マイクロリットルを、本明細書に記載された(実施例1)125I-PSP94結合アッセイにおいて評価した。試験条件およびこれらのアッセイ結果は、表3に示している。
Figure 2008543791
これらのイオン交換クロマトグラフィーアッセイからの主要な知見により、極端なpH(8超、および6以下)に対するPSP94結合タンパク質の一時的な曝露は、PSP94に結合するPSP94結合タンパク質の能力を減少させることを示しており、PSP94結合タンパク質はpHに鋭敏であることを示唆している。カチオンマトリックスに対するPSP94結合タンパク質の吸着は、pH4.7では見られなかった。カチオンマトリックスに対する幾つかの吸着は、pH5.7で見られ、最大吸着は、pH6.7で見られた。これらの結果により、約pH5の等電点を示唆できる。
アニオン交換クロマトグラフィーアッセイは、5の等電点と一致したpH5.7と9.0との間のマトリックスに対してPSP94結合タンパク質の良好な吸着を示した。良好な吸着が中性(非変性)pH値で達成できることから、好ましい精製方法は、アニオンマトリックスを使用しなければならないであろうことは明白であった。それゆえ、アニオン交換マトリックス、およびpH6.5での10mM MESが、pH溶出よりもむしろ塩濃度溶出を用いるさらなる作業に関して選択された。
アニオン交換マトリックスからのPSP94結合タンパク質の溶出条件の最適化は、種々の塩化ナトリウム濃度を用いて実施された。
Macro Prep High Qを含有するカラム(1×15cm)を、10mM MES、100mM NaCl、pH6.5を含有する緩衝液により平衡化し、1分当り0.5mlで操作した。同じ緩衝液に平衡化した7ミリリットルの32〜47%の硫酸アンモニウムカット(すなわち、表4の出発物質)を、カラムに適用し、種々の緩衝液をPSP94結合タンパク質を溶出させるために適用した。溶出液はUVレコーダーによりモニターした。フラクションを採取し、緩衝液を、10kDaの分子量切断によるCentriPrep濃縮器(Amicon)を用いてPBSに交換した。これらの試料を、実施例1に記載された125I-PSP94結合アッセイで試験した。表4は、使用された種々の条件および本実験で得られた結果を要約している。星印(*)は、何らかの損失が緩衝液交換時に経験したことを示している。タンパク質濃度は、1OD単位が1mgのタンパク質に等しい280nm(A280)における吸光度から算出された。
Figure 2008543791
これらのデータから、300mM NaClを含有する緩衝液が有効であり、好ましくは、アニオン交換マトリックスからのPSP94結合タンパク質を溶出するために使用されたであろうことは明白である。これらの結果を用いて、スケールアップイオン交換プロトコルは、下記のとおり、5cm×12cmアニオン交換マトリックスへの4gの硫酸アンモニウム沈殿血清抽出物の適用を可能にするために開発された。
PSP94結合タンパク質の大スケールアニオン交換クロマトグラフィー精製
アニオン交換カラム(5cm直径×12cm長、Macro-Prep Hi Q、Biorad)を調製し、製造元のガイドラインに従って10mM MES、100mM NaCl、pH6.5で平衡化し、室温で1分当り約3mlの流速で操作した。硫酸アンモニウム沈殿血清の分割量(実施例2から; 約150mlの溶液中4gの全タンパク質)をカラムに適用し、次いで約250mlの10mM MES、100mM NaCl、pH6.5で洗浄した(図3)。溶出は、400mlの10mM MES、200mM NaCl、pH6.5緩衝液で実施し、次いで10mM MES、300mM NaClにより溶出した。300mM溶出フラクションを採取した(図3)。溶出タンパク質のプロフィールは、チャートレコーダー上で280nmのUV吸光度によりモニターされた。典型的なプロフィールを図3に示す。図3は、硫酸アンモニウムにより精製されたタンパク質(約4グラム)で装填されたMacroPrep High Qアニオン交換カラムを用いて、アニオン交換クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。タンパク質を、塩化ナトリウム濃度をステップごとに増加させて溶出した。A点とB点との間に位置するピークは、PSP94結合タンパク質を含有するタンパク質フラクションを表す。タンパク質を280nmで測定された吸光度により検出する。
カラムを、10mM MES、1M NaCl、pH6.5(300ml)で再生でき、次いで500mlの10mM MES、100mM NaCl、pH6.5で平衡化した。アジ化ナトリウムを、24時間超でカラムの保存のために0.05%(w/v)のこの緩衝液に加えた。
300mMのフラクション(約90ml)を採取し(マーカーAとBとの間、図3)、これは、大部分のPSP94結合活性を含有することが先に示された。「部分的に純粋なPSP94結合タンパク質」(PPBP)と同定されたこの調製は、製造元の取扱い説明書(Centriprep 10、Amicon)に従って遠心分離濃縮器で約20mlに濃縮し、PBSで60mlに希釈し、20mlに濃縮し、さらにPBSで60mlに希釈し、20mlに濃縮し、最終的にPBSで希釈して2.0のA280(一般に約150mlの最終容量)を有する溶液を得た。この溶液は、-20℃で保存した。20gのタンパク質の全適用(5サイクル)後、カラムを、1M NaOHを用いて消毒し、BIORADにより記載されたプロトコルを用いて10mM MES、100mM NaCl、pH6.5で再平衡化した。
硫酸アンモニウムの分画化(すなわち、沈殿)およびアニオン交換クロマトグラフィーにより、PSP94結合タンパク質の精製が、それぞれ約4倍および10倍の結果となった。ニート血清において、PSP94結合タンパク質の比率、すなわち、全タンパク質が、推定で1:80,000であることを示した。実施例2および実施例4に記載された2つのタンパク質精製ステップの効率は、実施例1に記載されたPSP94放射性リガンド結合アッセイを用いてモニターされた。双方のステップにおいて、大多数のPSP94結合物質は、単一フラクション内に限られた。この情報から、これら2つのステップを組み合わせると、PSP94結合物質の損失が殆どない(定量的)効率的な精製方法をもたらすことは明らかである。しかしながら、損失が少ないことを想定すると、実施例2および4で記載された2つのタンパク質精製ステップの組合せにより生じた部分的精製結合タンパク質(PPBP)は、約1質量部の結合タンパク質: 2000質量部の他のタンパク質を含有すべきである。
アフィニティークロマトグラフィーアッセイ
PSP94結合タンパク質精製のためのアフィニティーマトリックスの調製は、以下のとおり実施した。約0.5gのシアノーゲンブロミド活性化セファロースCL 4B(Sigma Chemical社)を1mM HClで膨潤させ、製造元の推奨に従って調製した。1mlのこのマトリックスに、100mM NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.0中、Baijal Guptaら(Prot. Exp. and Purification 8: 483〜488頁、1996年)に記載されたとおり精製した5mgのPSP94を含有する5mlの溶液を加え、この反応物を定期的撹拌しながら4℃でインキュベートした。時間間隔で、反応物を200×gで2分間回転し、上澄液の分割量の光学濃度(OD)単位で発現された280nm(A280)での吸光度を測定してマトリックスに対するPSP94の結合比を決定した。活性化セファロース(例えば、マトリックス)に対するPSP94の接合(すなわち、結合)経時を示す結果を、表5に要約する。
Figure 2008543791
PSP94の70〜80%が、マトリックスに結合されるまで(表5に示された調製で約60分後)、接合反応を継続した。この時間に、1mlの200mMグリシンを加えて、さらなるどの反応性基も遮断し、スラリーを、緩やかに撹拌しながら4℃で一晩インキュベートした。マトリックスは、製造元の推奨に従って洗浄し、PBSで希釈して1マイクロリットル当り1マイクログラムのPSP94に関する濃度を有するスラリーを得た。アジドナトリウム(NaN3)を、抗菌剤として0.05%で加えた。
上記の最適化アッセイ結果に基づいて、PSP94アフィニティーマトリックスを、シアノーゲンブロミド活性化セファロースにPSP94を接合させることによって調製した。該マトリックスは、パックマトリックスの1マイクロリットル当り4マイクログラムのPSP94を有し、1マイクロリットル当り1マイクログラムのPSP94を有する作業用スラリーを、0.05%のNaN3を含有するPBSでの希釈により調製した。PSP94アフィニティーマトリックス(PSP94に関して1マイクロリットル当り5マイクログラムの濃度で)を、部分的に純粋なPSP94結合タンパク質に加えた。0.1%(v/v)の濃度でツイーン20および0.05%(w/v)でのNaN3もまた混合物中に含ませてから、ロッキングテーブル上、34℃で18時間インキュベートした。平行対照実験において、遊離PSP94もまた、1ミリリットル当り50マイクログラムの濃度で加えた。この対照実験において遊離PSP94の添加によって、PSP94結合タンパク質の結合のためにマトリックスに接合されたPSP94と競合するであろう。これは、アフィニティーカラムに対するPSP94結合タンパク質の結合を逆転させ、したがってPSP94に特異的に結合するタンパク質の同定を可能にできる。アフィニティーマトリックスを、急速ろ過により上澄液から分離し、マトリックスを4℃のPBS中で広範に洗浄した。マトリックスを採取し、試料緩衝液(試料中の最終濃度: 5mM Tris pH6.8、2%(w/v)SDS、10%グリセロール(v/v)、8mMジチオトレイトール、0.001%ブロモフェノールブルー)を減少させるためにドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)の際に沸騰させて、結合タンパク質を解離させ、これらは、7.5% SDS-PAGEにより分割した。この実験結果を図4に示す。
図4は、PSP94-アフィニティークロマトグラフィー後に得られた試料で装填されたドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)結果を示す図である。ゲルを電場で操作し、Coomassie Brilliant Blueで染色した。レーン1は、分子量マーカー(Kaleidoscopeの前染色標品、Bio-Rad)を表す。レーン2は、PSP94接合アフィニティーマトリックスに結合されたタンパク質を表す。レーン3は、PSP94接合アフィニティーマトリックスに結合されたタンパク質を表し、過剰のPSP94とインキュベートした。少なくとも2つのタンパク質、AおよびCは、2つのレーン(レーン2および3)に存在のままであることに注目されたい。2本のバンド、BおよびDは、レーン3に存在するが、対照実験には存在しない(レーン2)。これらのバンド(BおよびD)は、恐らく特異的PSP94結合タンパク質である。
PSP94アフィニティーマトリックスからのPSP94結合タンパク質溶出の最適化
SDS-PAGE試料緩衝液(非還元性条件であってもなくてもよい)中の沸騰よりも少ない変性条件を用いてアフィニティーマトリックスからPSP94結合タンパク質を解離するために、条件範囲を評価した。試験された条件を表6に要約する。未変性の活性なPSP94結合タンパク質は、抗体生成およびさらなる実験ならびに開発のために必要である。部分的に純粋なPSP94結合タンパク質と(すなわち、結合タンパク質と)前インキュベートし、洗浄されたPSP94アフィニティーマトリックスの分割量を、表6に掲げた溶出(解離)条件で1時間インキュベートした。インキュベーション後、アフィニティーマトリックス遠心分離により溶出緩衝液から除去した。マトリックスを、PBS中で洗浄し、非還元性SDS-PAGE試料緩衝液(試料中の最終濃度: 5mM Tris pH6.8、2%(w/v)SDS、10%グリセロール(v/v)、0.001%ブロモフェノールブルー)中で沸騰させて、タンパク質を7.5% SDS-PAGE上で分析した。溶出後、タンパク質がマトリックスと会合したままである場合、その条件は、適切な解離にとって好適ではない。したがって、PSP94結合タンパク質が、図5に示されたSDS-PAGEに不在である場合、溶出(解離)条件は好適である。主要不純物バンドが、2本のPSP94-結合タンパク質バンド間ではなく、ゲルの上部に残っているので、非還元性条件は、優れた分離条件を提供することが判明した。試験条件および本実験結果は図5に示され、表6に要約されている。
Figure 2008543791
図5は、種々の溶出(解離)条件を用いて、PSP94接合アフィニティーマトリックスからのPSP94結合タンパク質の溶出後に得られた試料で装填されたSDS-PAGEを示す。インキュベーション後、種々の溶出緩衝液において、アフィニティーマトリックスを、遠心分離により溶出緩衝液から除去した。マトリックスをPBS中で洗浄し、非還元性SDS-PAGE試料緩衝液中で沸騰させた。SDS-PAGEを電場で操作し、Gelcode(登録商標)Blue Code Reagent(Pierce)で染色した。矢印は、高分子量結合タンパク質(HMW)の位置および低分子量結合タンパク質(LMW)の位置を表す。レーンAは、分子量マーカー(Kaleidoscopeの前染色標品、Bio-Rad)を表す。レーンBは、未処理試料を表す。レーンCは、PBS中、34℃で1時間インキュベートされた試料を表す。レーンDは、水中、34℃で1時間インキュベートされた試料を表す。レーンEは、1mlのPBS中、300μgのPSP94と共に34℃でインキュベートされた試料を表す。レーンFは、競合対照を表し、マトリックスは、レーンBからの試料と同じ方法でPPBPと共にインキュベートしたが、このインキュベーションにおいて、飽和過剰の遊離のPSP94が含まれた。レーンGは、2M尿素中でインキュベートされた試料を表す。レーンHは、8M尿素中でインキュベートされた試料を表す。レーンIは、pH2.7での100mMの酢酸ナトリウム中でインキュベートされた試料を表す。レーンJは、pH11.0での100mMの3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸(CAPS)中でインキュベートされた試料を表す。
上記の実験から、PSP94結合タンパク質とPSP94アフィニティーマトリックスとの相互作用は、種々の条件下で非常に安定であったことは明白である。8Mの尿素および極度のpHにより幾らかの解離が見られたが、これらの変性条件は、過剰の遊離リガンド(すなわち、PSP94)を用いて非変性競合解離よりも好ましくなかった。したがって、このアプローチは、活性なPSP94結合タンパク質を精製するために選択された。
データは、図5のHMWおよびLMWのバンドが、それぞれ図4のバンドBおよびDと同じであることを示している。
PSP94アフィニティークロマトグラフィーによるPSP94結合タンパク質の精製
0.1%(v/v)ツイーン-20および0.05%(w/v)NaN3を含有する部分的に純粋なPSP94結合タンパク質の100ミリリットルを、250マイクログラム(PSP94に関して)のアフィニティーマトリックスと、34℃で16時間インキュベートした。マトリックスは、使い捨てPoly-Prep Column(Bio Rad)を用いて急速ろ過により溶解性フラクションから分離した。カラム末端キャップに取付けられた10mlシリンジから空気圧を適用することによって、該液体をカラムを通過させた。該マトリックスを、同様に10mlの氷冷PBSにより3回洗浄し、該マトリックスを、マイクロピペットによりカラムのポリマーベッド支持体から採取した。該マトリックスを、2mgの遊離PSP94を含有する1 ミリリットルの10mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、pH7.5に再懸濁し、34℃で5時間、緩やかに撹拌しながらインキュベートした。次に該マトリックスを、遠心分離(1000×gで30秒間)により溶液から分離し、上澄液(溶出されたPSP94結合タンパク質および遊離PSP94を含有する)を、10mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、pH7.5で平衡化した1×20cmのセファデックスG100カラムを用いて室温でモレキュラーシーブクロマトグラフィーにより分析し、1分当り約0.7mlの流速で操作した。溶出液の280nmにおける吸光度を、チャートレコーダー上で記録した(図6)。PSP94結合タンパク質捕捉、溶出、および精製物の定量評価を、非還元性7.5% SDS-PAGEにより成した(図7)。
図6は、硫酸アンモニウム沈殿およびアニオン交換クロマトグラフィーにより精製された試料のアフィニティークロマトグラフィー(PSP94接合アフィニティーマトリックス(セファデックスG-100)を用いる)の結果を示す。PSP94結合タンパク質は、過剰のPSP94(遊離PSP94)を添加することによってカラムから溶出された。高分子量タンパク質を、4mlの全容量で(A点とB点との間)採取した。この溶液は、遠心分離濃縮器(AmiconからのCentricon-10)を用いてPBS(150mM NaCl)に交換された緩衝液であり、この溶液を1マイクロリットル当り約100ngに濃縮した。典型的な収量=100mlのPPBP出発物質から40マイクログラム。A点とB点との間に位置するピークは、PSP94結合タンパク質のフラクションを表す。タンパク質を検出し、280nmでの吸光度により定量化した。得られた結果は、遊離PSP94とPSP94結合タンパク質との間で適切な分離を示す。
非還元性条件下で実施されたSDS-PAGE(7.5%)の図である。レーンAは、分子量マーカー(Kaleidoscopeの前染色標品、Bio-Rad)を表す。レーンBは、硫酸アンモニウム沈殿およびアニオン交換クロマトグラフィーにより精製されたPSP94結合タンパク質とのインキュベーション後で、競合(すなわち、過剰)PSP94(すなわち、遊離PSP94)よる溶出前のPSP94アフィニティーマトリックスを表す。レーンCは、競合対照を表す。レーンDは、過剰のPSP94による溶出後のアフィニティーマトリックスを表す。レーンEは、最終溶出および濃縮された(実質的に)純粋なPSP94結合タンパク質を表す。得られた結果は、アフィニティークロマトグラフィーは、有意な様式でPSP94結合タンパク質(類)の純度を増加させることを示す。
PSP94結合タンパク質の精製工程は、図8に要約している。
PSP94結合タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列決定
SDS-PAGEゲルは、実施例5に記載されているとおり調製した。しかしながら、タンパク質は、調製物の配列決定のために製造元の推奨に従ってMini Trans-Blot輸送細胞(Bio-Rad)を用いて、配列決定グレードのPVDF膜(ProBlott膜、Applied Biosystem)に移した。この膜は、Coomassie Brilliant blueにより染色し、アミノ末端(すなわち、N末端)アミノ酸配列決定により分析した。アミノ末端アミノ酸配列決定は、図4に示されたバンドB、CおよびDに対して実施された。
Figure 2008543791
表7に見られるように、バンドBおよびDは、同じN末端アミノ酸配列を有するので、これらは恐らく、同じタンパク質の異なる形態であり、Bは可能性として何らかの形態の集合体(マルチミア)であり、あるいはBおよびDは、スプライスまたはプロセスされている。
PSP94結合タンパク質の遺伝子配列のクローニング
全RNAを、2×106ジャーカットクローンE6-1細胞(TIB 152、American Type Culture Collection、マナッサス、バージニア州)またはTri-reagent(Molecular Research Center社、シンシナチ、オハイオ州)を用いて健全血液ドナーの末梢血単核細胞から単離した。RNAをエタノール沈殿し、水に再懸濁させた。Thermoscript RT-PCR System(Life Technologies、ロックビレ、メリーランド州)を用いて、RNAをcDNAに逆転写させた。引き続き、このcDNAは、5'-プライマー(5'-ATGCACGGCTCCTGCAGTTTCCTGATGCTT-3')および3'-プライマー(5'-GCCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17-3')(Life Technologiesの3'Raceアダプタープライマー、Life Technologies)を用いるPlatinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Life Technologies)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅された。5'-プライマーDNA配列は、Gene Bankのデータベース(National Institute of Health、米国)G. B. 登録番号AA311654(EST182514ジャーカットT細胞VIヒトcDNA 5' mRNA配列)で公示されたPSP94結合タンパク質のアミノ酸配列および部分cDNA配列に基づいた。増幅されたDNAは、ゲルから切除され、Quiagen II DNA抽出キット(Quiagen、Mississauga、ON、カナダ国)を用いて濃縮されたアカロースゲル電気泳動により分析された。精製DNAは、pCR2.1プラスミド(Invitrogen、キャリスバッド、カリフォルニア州)に結合させ、大腸菌株TOP10(Invitrogen)を変換させるために使用された。アンピシリン耐性コロニーは、制限酵素分析およびDNA配列分析によるcDNA陽性挿入断片用にスクリーンされた。
PSP94結合タンパク質のDNA配列のGene Bankへのブラスチングにより、例えば、Gene Bank登録番号XM 094933(PRI 2002年2月6日)、BC022399(PRI 2002年2月4日)、NM153370(PRI 2003年4月7日)、BC035634(PRI 2002年9月23日)などの未知の有用性の幾つかのDNA配列を確認した。
PSP94結合タンパク質のメッセンジャーRNAの組織発現
ヒト組織のPSP94結合タンパク質のメッセンジャーRNA(mRNA)を単離し、サイズおよび相対的発現レベルを、ノーザンブロットにより決定した。製造元の推奨に従って、1レーン当り1または2マイクログラムのヒト組織ポリ-A RNAを含有する市販のノーザンブロット(Mutiple Tissue Northern(MTN(商標))Blot)、Clontech、パロアルト、カリフォルニア州)を、PSP94結合タンパク質cDNA配列346から745までに及んだ[32P]-標識PSP94結合タンパク質のcDNAプローブとハイブリダイズした。バンドの強度は、アルファイメージャー2000、モデル22595を用いて定量化した。バンドの相対強度を測定し、+から+++までの範囲の恣意的なスコアを得た。このスコアリングは、観測された最低検出可能な2.0kbのシグナルバンドに基づいた。
図9aおよび9bに示された定量化結果は、表8および9にそれぞれ要約する。手短に言うと、脳、心臓、骨格筋、大腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、前立腺、精巣、卵巣、および末梢血リンパ球(PBL)からのRNAは、PSP94結合タンパク質のRNA発現に関して分析された。
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遊離PSP94、結合PSP94およびPSP94結合タンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生成
抗体生成
本明細書に記載された免疫化スキームは、PSP94結合タンパク質、またはPSP94に対する抗体産生を促進させるために開発された。PSP94が結合形態(例えば、PSP94結合タンパク質に結合された)にある場合に曝露されるPSP94のエピトープに結合する抗体、PSP94が遊離形態(PSP94結合タンパク質のない)にある場合のみに利用できるPSP94のエピトープに結合する抗体、または遊離および結合双方の形態のPSP94を結合する抗体などの抗PSP94抗体。
モノクローナル抗体
TiterMax(商標)アジュバント中の(実質的に)純粋なPSP94結合タンパク質(すなわち、この製剤もまたPSP94を含有する)製剤を、4匹のBalb/cマウス(a、b、cおよびdと識別された)に対し15マイクログラムづつ皮下免疫化した。21日後、全てのマウスに第二のブーストを与え、さらに8日後、マウス血清を、上記のELISAスクリーニングアッセイにおいてPSP94およびPSP94結合タンパク質の双方に関する反応性について試験した。PSP94結合タンパク質の精製は、PSP94により全ての結合部位を飽和させることを含むので、実質的に純粋なPSP94結合タンパク質製剤により免疫化された動物の血清は、両抗原に関して陽性に試験される可能性もまた有した。
マウスaおよびbは、さらにアジュバントのない15μgのPSP94結合タンパク質により腹腔内ブーストされた。残りの2匹のマウス(cおよびd)を、さらにTiterMax(商標)アジュバント中、15μgの天然PSP94と共に15μgのPSP94結合タンパク質により皮下ブーストしてPSP94の曝露エピトープに対する抗体を得る可能性を増加させた。
さらに4日後、マウスaおよびbの脾臓を採取し、Bリンパ球を収集し、NSO骨髄細胞と融合させてハイブリドーマを生成した(Galfre. G.およびMilstein C、Meth. Enzymol. 73: 3〜46、1981年)。IscoveのMDM選択培地(20% FBS、HAT、1ml当り10ngのインターロイキン-6、および抗生物質)中、多数の脾細胞を、96ウェルプレートの各ウェル内で平板培養した。細胞から抗体が分泌されたので、細胞培養培地(すなわち、上澄液)は、産生された抗体の特性のために採取できる。37℃でインキュベーションの10日後、クローンを含有するウェルの上澄液を、ELISAスクリーニングアッセイ(以下参照)により評価した。PSP94またはPSP94結合タンパク質プレートの陽性認識(結合)を示す抗体およびPBSコーティングプレートに対して非特異的結合のない抗体を産生するクローンを、さらなる調査および特性化用に選択した。
所望の(陽性の)クローンを、6ウェルプレート内で平板培養した。上澄液を、特異的抗体の存在に関して再試験し、陽性が存続するこれらのクローンを、限定希釈により連続サイクルのクローニングを通過させた。このような様式のクローニングにより、産生されたハイブリドーマ細胞系が安定で純粋であることを確保した。典型的に、2つのサイクルのクローニングが、この目標を達成するために必要であった。生存度および抗体産生に関して試験される各バッチから1つのバイアルで、複数の凍結保存バイアルを調製した。クローン特性化の結果を表10に示す。
あるいは、抗PSP94抗体の生成のために、マウスを、TiterMax(商標)アジュバント中、PSP94製剤(実質的に純粋なPSP94)により免疫化する。ブースチングおよびハイブリドーマ手法は、上記のとおり実施する。
したがって、PSP94が結合形態にある場合に曝露されるPSP94のエピトープに結合する抗体は、上記の免疫化スキームを用いて産生する。抗体の結合特異性は、レポーター分子により接合される所望の抗体と、PSP94およびPSP94結合タンパク質により形成された複合体とを接触させることにより、ELISAアッセイまたはウェスタンブロットアッセイにおいて判定される。該抗体が該複合体に結合する場合、陽性反応は、レポーター分子により発生したシグナルの検出時に生じる。
PSP94が遊離形態(PSP結合タンパク質のない)にある場合のみに利用できるPSP94のエピトープに結合する抗体もまた、上記の免疫化スキームを用いて産生する。抗体の結合特異性は、レポーター分子により接合される所望の抗体と、実質的に純粋なPSP94とを接触させることにより、および平行実験で、該抗体とPSP94およびPSP94結合タンパク質により形成された複合体とを接触させることにより、ELISAアッセイまたはウェスタンブロット法において判定される。PSP94が遊離形態にある場合のみに利用できるPSP94のエピトープに結合する抗体(例えば、レポーター分子と接合された)は、実質的に純粋なPSP94と接触する場合に陽性反応を、該複合体と接触する場合に陰性反応(すなわち、シグナル(着色)が検出されず)を生じる。
遊離および結合形態双方のPSP94(全PSP94)に結合する抗体もまた、上記の免疫化スキームを用いて産生する。しかしながら、遊離および結合形態双方のPSP94に結合する抗体は、実質的に純粋なPSP94と接触する場合に陽性反応を生じ、また、PSP94およびPSP94結合タンパク質により形成された複合体と接触した場合にも陽性反応を生じる。
所望の抗体を産生するハイブリドーマを、上記のとおり単離し、増殖させ、保存する。
モノクローナル抗体の精製
マウスIgG1モノクローナル抗体は、Antibodies: A Laboratory Manual、編集者HarlowおよびLane、Cold Spring Harbor Laboratory(参考文献に関して上記参照)において詳述されている高塩タンパク質A手法を用いて精製される。
モノクローナル抗体のイソタイプ化
イソタイプ化は、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche Diagnostics社、インディアナポリス、米国)を用いて実施する。このキットは、クラス(IgG、IgAまたはIgM)タイプの軽鎖(カッパまたはラムダ)およびIgGサブタイプ(IgG1、IgG2a、IgG2bまたはIgG3)に関する情報を提供する。試験される抗体は、主としてIgG1カッパサブタイプである。しかしながら、1つの抗体は、IgMカッパサブタイプ(B26B10)であることが示された。
ポリクローナル抗体
本発明のPSP94に対するポリクローナル抗体は、ニュージーランド白色ウサギを免疫化することによって産生された。各ウサギを、フロイント完全アジュバント中、50マイクログラムの精製ヒトPSP94(>95%純度)により免疫化した。3週後、ウサギをさらに、50マイクログラムのPSP94によりブーストした。さらに4週後、ウサギから、12週間にわたって毎週採血した(毎週25mlの採血)。全血から血清を分離し、下記のとおり、アフィニティー精製抗体をIgGフラクションから精製した。
第一ステップ: タンパク質Aを用いるIgGフラクションの精製
Sigmaから入手したセファロースCL-4B上に固定されたタンパク質A(カタログ番号P-3391)の1.5gを膨潤させ、20容量のPBS(0.14m NaCl、10mMリン酸ナトリウム、pH7.4)で洗浄した。セファロースが膨潤したら、2つのさらに分割量のPBSを、マトリックスを2回洗浄するために使用した。膨潤したマトリックスの全容量は約5mlであり、これは、少なくとも50mgのウサギIgGの結合能力に相当する。
25ミリリットルのウサギ血清を、等容量のPBSで希釈し、0.22ミクロンフィルターを通してろ過した。5ミリリットルのタンパク質Aのスラリーを、この混合物に加え、混合物を室温で1時間ロッカー上で撹拌した。次に、この懸濁液を20mlの使い捨てプラスチック製クロマトグラフィーカラム内に注ぎ、流液を廃棄した。カラムをPBSで洗浄し、流液のO.D.(またはOD: 光学濃度)を、0.1未満に安定化されるまで280nMで定期的にモニターした。
pH3.0での0.1Mグリシンを、マトリックスに注意深く適用し、1mlのフラクションを、100マイクロリットルの1.0M Tris pH8.0に直接採取した。IgGは10ml内で溶出した。次に、堅固に結合したタンパク質が溶出され、0.1MグリシンpH2.0により廃棄し、カラムをPBSで再平衡化した。採取されたフラクションのOD280を測定し、IgGの大部分を含有するフラクションをプールした。25mlのウサギ血清の初期の開始容量からのIgGの収量は、約40〜50mg(1mg/ml溶液に対して1.4のOD280)であった。IgGフラクションは、短期保存(約1週間)については0.05%アジドと共に4℃で、または長期保存については凍結させて保存した。
ステップ2: PSP94アフィニティーカラム上の抗PSP94 IgGのアフィニティー精製
ステップ2A: マトリックス調製
抗PSP94 特異的IgG抗体の精製における第一ステップは、アフィニティー精製マトリックスを生成することであった。マトリックス1ミリリットル当り約1mgのPSP94を有するカラムを用いて良好な効率が達成できることが判明した。このプロトコルは、5mgの接合PSP94を有する約5mlのカラムを生成する。
7ミリグラムのPSP94を、5mlの200mMの重炭酸ナトリウム緩衝液(約pH8、pH調整が必要でない)中で調製された。この溶液のOD280は約2.24であった。
2グラムのシアノーゲンブロミド活性化セファロース(Sigma)を秤量し、安定化剤を除くために、100mlの氷冷1mM HCl中で3×10分間膨潤させた。マトリックスは、この工程中懸濁液に維持され、緩衝液を冷却急速ろ過または冷却遠心分離により変えた。最後に、セファロースを100mlの氷冷水で洗浄した。マトリックスをペレットにし、過剰の水を除去した。
冷PSP94溶液のODを最初に測定し、この溶液を5mlの冷却マトリックスに加えて混合した。1分後、1mlのスラリーを取り出し、ミクロ遠心分離器で10秒間回転させた。上澄液を取り出し、OD280を測定した。取り出されたスラリーおよび抗体溶液を、接合混合物に置き換えた。OD測定により、PSP94の約70%と80%との間が溶液から除かれたことが示されるまで、この反応を継続した。反応は、10mlの100mM重炭酸ナトリウム中の0.1 mグリシンを添加することによって中止した。混合物を約4℃で30分間インキュベートした。セファロースマトリックスに対するPSP94の代表的な接合結果を表Bに示す。
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71%のPSP94が溶液から除去されたことから、71%がマトリックスに付着していることが想定される。マトリックスを調節し、疎結合PSP94を除去するために、高低のpHで一連の高塩洗浄を実施した。使い捨て20mlのカラムを、PDP94アフィニティーマトリックスでパックし、3サイクルの10ml容量の0.1M重炭酸ナトリウム、0.5M NaCl、次いで0.1Mグリシン、0.5M NaCl、pH2.5により洗浄した。1分当り約2mlの流速で蠕動ポンプを使用することができる。最後にカラムを、0.05% NaN3を含有するPBS中で平衡化し、4℃で保存した。
ステップ2B: PSP94特異的IgGのアフィニティー精製
タンパク質A精製IgGは、0.1Mグリシン、中性pHでの100mM Tris中、1ml当り約5〜10mgの濃度であった。この溶液を、PBS中、1ml当り1mgの濃度(1.4のOD280)に希釈した。この緩衝液組成物は、アフィニティー精製にとって適切であった。
150ミリリットルのタンパク質A精製IgG(1mg/ml)を、1分当り2.5mlの流速で5mlのPSPアフィニティーカラムに適用した。流液のOD280をモニターし、約30%(約1.0のOD280)の減少を提供するために維持した。ODの減少は、特異的抗体がカラムに結合していることを示している。流液のODが適用される溶液のODにアプローチすると、カラムは飽和される。溶出液のODが、出発時から適用される溶液と同じである場合、カラムは不活性であるか、またはタンパク質A精製IgGは、その中にPSP94特異的抗体を有さない。
タンパク質A精製IgGがカラムを流下したら、OD280が安定化(0.05未満)するまでカラムをPBSで洗浄した。抗体は、0.1Mグリシン、pH2.5で溶出し、1mlの分割量を、150マイクロリットルの1M TRIS、pH8.0を含有するエッペンドルフチューブに直接採取した。10のフラクションを採取し、カラムは、0.05% NaN3を含有するPBSで平衡化した。溶出液のOD280を測定し、主要なフラクションをプールした。3ミリリットルの分割量は、PBSで平衡化されたPD10脱塩カラム(BioRad)を用いて脱塩した。抗体の濃度は、OD280(1mg/ml=1.40)を用いて算出し、分割量を-80℃で保存した。収量は、約25mgのポリクローナル抗PSP94 IgG抗体であった。
抗体の特性化
ELISAベースのハイブリドーマスクリーニングアッセイ
マウスから、またはマウスB細胞から生成したハイブリドーマから産生した抗体の力価および特異性を評価するために、ELISAスクリーニングアッセイを展開した。
手短に言うと、マイクロタイタープレート(Nunc、MaxiSorp)を、天然PSP94(ヒト精漿; 0.1M炭酸ナトリウム、pH9.6中5μg/ml)またはPSP94結合タンパク質(0.1M NaHCO3中0.1μg/ml)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS; 140mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム、pH7.5)の100μlの分割量で4℃で一晩コーティングした。プレートを、リン酸緩衝生理食塩水中、1%ウシ血清アルブミン(BSA)の溶液により34℃で1時間遮断した(BSAは、結合部位の飽和を可能にし、プレートに対する非特異的結合を制限する)。次に、プレート(ウェル)を、0.1%ポリエチレン-ソルビタンモノラウレートを含有するPBS(PBS-ツイーン)で洗浄してから、0.5% BSAで希釈されたマウス血清試料、またはハイブリドーマ上澄液を適用する。プレートを、34℃で1時間インキュベートしてから、マウス免疫グロブリンを認識するペルオキシダーゼ接合ポリクローナルウサギ免疫グロブリンのPBS 0.5% BSA中1:1000希釈をした。(ウサギ抗マウスIgGペルオキシダーゼ)。34℃でさらに1時間インキュベーション後、プレートをPBSツイーンで広範に洗浄してから、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)中、ペルオキシダーゼシグナルを展開した。30分後、630nmでの光学濃度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
抗体のビオチン化
精製抗体の希釈液(緩衝液)を、0.1M NaHCO3緩衝液pH8.0と交換し、タンパク質濃度を1mg/mlに調整した。DMSO中、2mg/ml溶液のビオチンアミドカプロエートN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを調製し、この溶液の適切な容量を加えて5、10または20倍過剰のビオチン化剤を得た。この溶液を、時々撹拌しながら2時間氷上でインキュベートしてから、0.1M NaHCO3中、等しい容量の0.2Mグリシンを加えて0.1Mグリシンの最終濃度を得た。
さらに1時間氷上でインキュベーション後、PD10ゲルろ過カラム(Biorad)を用いてゲルろ過により遊離のビオチン化剤から抗体を分離した。ビオチン化抗体を、保存剤として添加した0.05%アジドナトリウムと共に4℃で保存した。ビオチン化の最適範囲およびビオチン化抗体の最適使用濃度は、抗原コーティングプレート上で測定された。
相対的エピトープ分析
ELISAプレートを、PSP94結合タンパク質またはPSP94でコーティングし、上記のとおり遮断した。上記のとおり調製されたビオチン化抗体の適切な濃度は、50倍過剰の非標識抗体のパネルの存在または不在下でコーティングプレートと共にインキュベートした。非標識抗体との競合は、2種の抗体間に共有されるエピトープを示す。ストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いて検出を実施する。
競合の欠如は、独立したエピトープを示す。エピトープの分析結果を表10に示す。
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抗体接合
レポーター分子に接合した抗体を用いるキットを展開した。以下の操作を用いて、表10に挙げられた抗体をレポーター分子に接合させた。
セイヨウワサビペルオキシダーゼ(3mg)(HRP)を、0.6mlの脱イオン水に希釈させた。希釈HRPに、PBS pH7.5中、過ヨウ素酸ナトリウム 0.01Mの0.2mlを加え、混合物を室温で25分間インキュベートした。4℃で、酢酸ナトリウム溶液(1mM pH4.0)に対して透析を実施した。緩衝液交換は2時間おきに(3回)実施した。
例えば、5ミリグラムの精製タンパク質Aおよび凍結乾燥した1A6抗体を、50μlの炭酸緩衝液(0.2M、pH9.5)で希釈した。該抗体混合物に透析したHRP混合物を加えた。同じ炭酸緩衝液の0.2mlを加えた。室温で2時間、撹拌しながら反応を進行させた。0.1mlのナトリウムホウ素水和物(脱イオン水中、4mg/ml)を加え、4℃で2時間、撹拌しながらインキュベーションを実施した。
該混合物を円錐管に移し、1.2mlの硫酸アンモニウム飽和溶液(400mlの脱イオン水中、300gの(NH4)2SO4)を加え、4℃で1時間、撹拌しておいた。沈殿した溶液を、300RPMで20分間遠心分離した。ペレットを、硫酸アンモニウム飽和溶液中に再懸濁した。遠心分離を上記のとおり再度実施した。次いで、ペレットを、2mlのPBS(0.01M pH7.1)中に再懸濁した。0.01M PBS pH7.4に対して、透析を実施した。緩衝液は、新鮮な0.01M PBS pH7.4と2時間おきに交換した(4回の緩衝液交換)。安定化溶液(トリス-HCl(脱イオン水中、31.52g/L)中、50% ウシ胎仔血清、pH6.8)中、HRP接合抗体を希釈し、本発明のアッセイ、方法およびキットにおいて、1.5mg/mlから10mg/mlの間の濃度で用いた。
PSP94マスター溶液標品の調製
ウシ血清アルブミン/マンニトール安定化緩衝液(0.5ml中、4mg/mlのマンニトール中、5マイクログラムのPSP94、10mMのリン酸ナトリウム中、2% BSA(フラクションv)、20mMのEDTA、1ml当たり40マイクログラムのチメロサール pH7.5)中、調製し、凍結乾燥した。この目的のため、PSP94はUS Biologicalsから購入し、紫外線吸光度を用いて定量化した(280nmにおいて1mg/ml = 1.53)。マスター溶液の複数のバイアルを、-20℃で保存し、この材料を用いて、ELISAキットの各バッチに用いる標準曲線を検量した。該キット内で使用するための標品の幾つかの希釈は、下記に示されるとおりに調製した。
遊離PSP94または総PSP94に対するPSP94抗体の特異性
本明細書で生成された抗体の特異性をさらに特性化する目的で、モノクローナル抗体がPSP94を、その遊離形態で、および/またはそれがPSP94結合タンパク質に結合している場合に認識するかどうかを判定するために、アッセイを展開した。
PSP94/PSP94結合タンパク質複合体の形成を促進するために、2種の(実質的に、または部分的に)精製されたタンパク質を一緒に予備インキュベートした。手短に言うと、0.5% BSAを含有するPBS中、1mg/mlの濃度(総タンパク質濃度)の部分的に純粋なPSP94結合タンパク質調製物(実施例4を参照)を、5μg/mlの天然PSP94と共に、またはそれなしで、34℃で1時間、予備インキュベートした。
ELISAプレート(96ウェルプレート)を、2μg/ml(0.1MのNaHCO3 pH8.0中)の濃度の17G9モノクローナル抗体で、4℃で一晩のインキュベーションにより、コーティングした。本明細書に記載されているとおり、この抗体はPSP94結合タンパク質を認識する。引き続き、該プレートのウェルを、1% BSAにより、34℃で1時間、ブロックした。上記で生成したPSP94/PSP94結合タンパク質複合体を、17G9でコーティングしたプレートと共に、34℃で1時間インキュベートしてから、非結合物質を洗い落とした。次いで、該プレートを、ビオチン化PSP94特異的抗体(PBS 0.5% BSA中、2μg/ml)と共にインキュベートした。これらの抗体の何らかの陽性結合は、認識されるPSP94エピトープが、PSP94結合タンパク質に結合した場合でも曝露される(利用できる)ことを示すと考えられる。これらの結果は表10に示されている。結合PSP94に対するビオチン化PSP94特異的抗体の結合は、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ系によって可視化され、TMBによって展開されて青色を与えた。
図11に示された結果は、試験された抗体がいずれも、結合部位がPSP94によって飽和されなければ、捕捉されたPSP94結合タンパク質と反応しないことを示している。結合部位がPSP94によって飽和される場合、P1E8は、該複合体に対して強い反応性を示す。しかし、2D3および12C3はそうではない。したがって、P1E8は、結合PSP94および遊離PSP94を認識し、他の2種の抗体(2D3および12C3)は、該タンパク質の遊離体のみを認識する。抗体2D3および12C3は、PSP94結合タンパク質に結合している際にマスクされているPSP94エピトープを恐らく認識しているであろう。これらの抗体の各々は、ELISAプレート上にコーティングされた場合、天然および組換えPSP94を検出する。3種の抗体は全て、サンドイッチELISA様式において、捕捉抗体または検出抗体として機能し、有用な範囲のPSP94濃度にわたって、直線の標準曲線を生じさせる。しかし、12C3は、PSP94に対して、2D3またはP1E8よりも低いアフィニティーを有していると思われる。
PSP94を検出するこれらの抗体の有用性は、以下のアッセイにおいて示される: ELISAプレートを、pH9.6 炭酸緩衝液中、5μg/mlのPSP94でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。該プレートを、34℃で1時間、1% BSAによりブロックした。次いで、試料を4℃で一晩、プレート中でインキュベートした。1マイクログラム/mlのビオチン化P1E8を、34℃で2時間適用し、ペルオキシダーゼストレプトアビジンを、34℃で1時間適用してから、TMB中に展開した。定量化の下限(LLQ)は、1ng/mlの範囲にあることが示された。該アッセイ(例えば、標準曲線)が、天然PSP94(すなわち、ヒト血清から単離されたPSP94)でも組換えPSP94でも実施できることは、特に興味深い。
ウェスタンブロット
本明細書に記載された幾つかの抗体は、ウェスタンブロットによって評価した。手短に言うと、非減少条件下、7.5% SDS PAGEゲル上で、0.2マイクログラムの(実質的に)精製したPSP94結合タンパク質、または25マイクロリットルの部分的に純粋なPSP94結合タンパク質を操作した。該タンパク質をPVDE膜に移し、該膜を、1% BSAでブロックし、1:5希釈(PBS/0.5% BSA中)のハイブリドーマ上澄み液によって探索し、ウサギで増加させた抗マウス免疫グロブリンペルオキシダーゼ接合体によって、結合した抗体を検出した。0.05%ジアミノベンジジン 0.01%過酸化水素中で、シグナルを展開した。
遊離PSP94免疫検出アッセイ
例えば、PSP94(または試料)によりプレートをコーティングし、PSP94でコーティングしたプレートに対する該抗体の結合を阻害するために、試料内にPSP94を用いて、競合的ELISAアッセイには、上記のPSP94抗体(2D3(PTA-4240)、P1E8(PTA-4241)、12C3、ポリクローナルおよび1A6(PTA-6599))が使用できる。これらの抗体はまた、抗体がプレートにコーティングされ、PSP94を含有する試料が加えられる標準的ELISAアッセイにも使用できる。引き続き、PSP94に結合できる第2の抗体により、該複合体の特異的検出を実施する(第1および第2の抗体は、PSP94の異なるエピトープに結合する)。
第1の実験において、競合的ELISAフォーマットにおける2D3の使用を調べた。図12aに示されるように、プレートを2D3抗体によってコーティングし、PSP94を含有する試料を加えた。複合体をビオチン化P1E8(PSP94の異なるエピトープを認識する)によって検出した。ペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンを加え、引き続き、ペルオキシダーゼの基質を加えることによって、検出を行う。図12bは、図12aに示された方法を用いたELISAアッセイの結果を表している。
ELISAアッセイ中のPSP94/PSP94結合タンパク質複合体の可能な解離(例えば、2D3によって促進された)を制限するために、改善を導入した。手短に言うと、改善したアッセイは、アッセイを実施する前の、本明細書に記載されたPSP94結合タンパク質抗体によるPSP94/PSP94結合タンパク質複合体の予備吸収(除去)を含む。PSP94結合タンパク質抗体は、PSP94結合タンパク質およびPSP94/PSP94結合タンパク質複合体(すなわち、結合PSP94)を選択的に除去する。これは、PSP94結合タンパク質とPSP94との間の平衡反応の速度論を狂わせることなく行われる。予備吸収は、例えば、セファロースマトリックスに結合させた17G9によって実施でき、該複合体のない試料を与える(非結合のPSP94が残存する)。次いで該試料を、上記のとおり処理する(すなわち、複合体のない試料を、2D3でコーティングしたプレートと共にインキュベートし、ビオチン化P1E8、ストレプトアビジンペルオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの基質によって検出)。
他の標準的免疫検出アッセイ(遊離PSP94を測定するサンドイッチELISAアッセイ)を実施した。手短に言うと、ELISAプレートのウェルを、pH6.5のKPO4 0.1M、グルタルアルデヒド 0.001%中、3μg/mLにおける150マイクロリットルの抗PSP94ポリクローナル抗体(本明細書に記載されたとおりに生成させた)によりコーティングした。該抗体を室温で24時間、該プレートに結合させ、300マイクロリットルの脱イオン水でリンスする。洗浄後、該ウェルを、0.5% BSA(フラクションv)および2% スクロースを有する10mMのリン酸ナトリウム、140mMのNaCl、pH7.5の200マイクロリットルによってコーティングし、24時間インキュベートしてから、該溶液を吸引した。該プレートを室温で一晩乾燥させた。該プレートは直ちに使用することもできるし、その後の実験のために、乾燥して保存することもできる。
10mMのリン酸ナトリウム、20mMのEDTA、1ml当たり40マイクログラムのチメロサール、0.25% BSAの最終容量0.5mL中、0、1、5、10、20、40ng/mLの濃度を得るために、PSP94の原液を希釈することにより、6種のPSP94標品希釈物を調製した。PSP94またはPSP94標品を含有する血清試料(試料および標品は、室温、すなわち、約22℃+/-2℃にした)の25マイクロリットルを独立のウェルに加えた。また、セイヨウワサビペルオキシダーゼに接合させた抗遊離PSP94抗体(1A6(PTA-6599))の100マイクロリットルも各ウェルに加えた。該プレートを、室温(すなわち、約22℃+/-2℃)でプレートシェーカー(100+/-10rpm)上、60分間インキュベートした。該プレートを反転させることによって、該ウェルの内容物をデカントし、反転したプレートを吸収紙上に置くことによって、余分な液体を吸収させた。次いで、該ウェルを、300μLの洗浄液で3回洗浄した。最後の洗浄の際、残留液体の痕跡がなくなるまで、プレートを吸収紙に当てて軽くたたくことによって、プレートを完全にデカントした。各ウェルに、100マイクロリットルの酵素基質溶液を加え、室温(すなわち、約22℃+/-2℃)でプレートシェーカー(110+/-10rpm)上、15分間、反応を進行させた。50マイクロリットルの停止溶液(0.5Mの硫酸)を各ウェルに加えた。酵素基質(基質-クロモゲン溶液)を加えると、該酵素が反応を触媒し、青色が生じる。該停止溶液を加えると、その色が黄色になる。色の強度は該試料または標品中のPSP94の濃度に正比例する。該アッセイ完了の直後に、マイクロプレートリーダー(分光計)で、415nmまたは405nmにおける吸光度を読み取ることによって、色の強度を測定した。
該試料中の遊離PSP94の濃度を、標品の濃度(横座標上)の関数として標品に関して測定された光学濃度(縦座標)のプロットを作成することによって決定し、該試料に関して測定された光学濃度を与える対応濃度を評価した。表11は、上記の遊離PSP94測定のためのサンドイッチELISAアッセイを用いて2つの未知のヒト血清試料におけるPSP94の濃度を測定することによって得られた結果を表している。これらの結果は、図12cにグラフとしても示されている。
Figure 2008543791
本明細書に記載された遊離PSP94を測定するためのサンドイッチELISAアッセイの幾つかのパラメーターは、該アッセイの性能を検証するためにも測定された。
精度:
分析方法の精度は、検体の真の値(濃度)に対する、該方法によって得られた平均試験結果の接近度を表す。精度は、既知量の検体を含有する試料の反復分析によって決定される。
反復試験では、標準曲線および3つの対照濃度各々の5倍を測定する。対照の各濃度に関して、平均、標準偏差および変動の係数(パーセントで)を算出する。アッセイ内変動の係数%が15%未満であることが好ましい。
計算:
標準偏差
変動の係数%(CV)= -------------- ×100
平均
内部アッセイ精度は、3つの血清試料に関して各々10の反復試験の平均から決定した。結果は、下表12に示されている。
Figure 2008543791
アッセイ間の精度は、3つの血清試料に関して、20の反復試験の平均から決定した。結果は、下表13に示されている。
Figure 2008543791
精度: または回収試験: 該アッセイの回収性能を判定するために、既知量のPSP94をヒト血清試料に加えた。得られたデータは下表14に示されている。
Figure 2008543791
直線性:
直線性は、作業標準曲線により読み取られた際に比例値を示す患者の希釈試料の能力である。2つの血清試料を希釈して操作した。
患者の希釈の計算は、以下のとおりにおこなった: 標準曲線および患者の希釈曲線を計算して描いた。参照曲線に対して対照値を読み取った。次いで、理論値と予測値を比較した。直線性実験の結果は表15に示されている:
Figure 2008543791
特異性
該アッセイの性能を妨害する可能性のあり得る物質を用いて、交差反応性試験を実施した。結果は下表16に示されている(ND=検出不能):
Figure 2008543791
再現性、回収性、フック効果、マトリックス効果などの他のパラメーターも全て判定し、得られた結果は、遊離PSP94アッセイが、ヒト試料中のPSP94、特にヒト血清試料中の遊離PSP94の濃度判定に首尾よく使用できることを示した。
総PSP94免疫検出アッセイ
P1E8抗体は、遊離形態と結合形態双方におけるPSP94を認識できるため、総PSP94を測定するアッセイを展開した。例えば、P1E8をプレートに固定し、遊離PSP94およびPSP94結合タンパク質と複合体化したPSP94を含有する試料を加える。PSP94および該複合体は、該抗体に結合したままであり、P1E8とは異なるアフィニティー(PSP94上に異なる結合部位)を有する抗体を添加し得る。このような抗体の一例は2D3であるか、または任意の他の好適なPSP94-抗体である。2D3に接合し得る標識を用いることによるか、または2D3抗体を直接的または間接的に認識する第2の分子(抗体またはタンパク質)(例えば、ビオチン/アビジンまたはストレプトアビジン系)により、検出を行う。
しかし、2D3が、PSP94とPSP94結合タンパク質との間の結合平衡を妨害し得るという観察に基づいて、総PSP94(結合および非結合)を測定するアッセイを改善した。
具体的に、該アッセイは図13に示されるとおりに実施した。図13において、総PSP94をP1E8抗体により捕捉し、高濃度(過剰)のビオチン化2D3を用いて、PSP94結合タンパク質の解離(置換)を促進する。先に記載したアッセイにおいて、該プラスチックは50ng以下の能力しかないため、プレートをコーティングするための2D3の実際の濃度は低い。
該複合体(PSP94/PSP94結合タンパク質)が測定前に血清から吸着して除かれれば、このアッセイが遊離(非結合)PSP94もまた測定できることに注意されたい。
PSP94結合タンパク質免疫検出アッセイ
全てのPSP94結合タンパク質抗体に関する特異性は、先に検討したELISAアッセイにおいて、およびウェスタンブロットによって確認した。それらの各々が、ウェスタンブロットにより、該結合タンパク質の高分子量体と低分子量体双方を認識する。
表10に示されるように、抗体17G9は、3F4とは異なるエピトープを認識する。したがって、図14aに示されるとおり、これらの2つの抗体を用いて、サンドイッチELISAアッセイを展開した。図14bは、血清試料中のPSP94結合タンパク質を測定するために用いられたアッセイからの標準曲線を示している。これら2つの抗体が交換できることに注意されたい。例えば、捕捉抗体は交換して、検出試剤として用いることができる(標識した場合)。
男性ドナーからの40の血清試料を、上記のPSP94結合タンパク質ELISAアッセイによって評価した(図14aに示す)。PSP94結合タンパク質血清濃度は首尾よく測定された。これらの男性ドナーにおけるPSP94結合タンパク質の値は、約1μg/mlから約10μg/mlの範囲であり、2例では20μg/mlを超えていた。女性ドナーからの2例を評価した: 1つは約3μg/mlを有し、他方は7.8μg/mlを有した。
免疫検出アッセイの適用
参照の標準的研究室から、既知の総PSA値を有するヒト男性血清試料を得た。40例が低い総PSA血清濃度(1ml当たり<4ng)を有し、69例が高い総PSA血清濃度(1ml当たり>4ng)を有した。これらの低および高範囲について分析を行った。これらの患者には追跡可能な関連性はなく、したがって、総PSA値以外に該検体に関連した臨床的情報はない。この分析の目的は、PSP94測定値の臨床的関連性を判定するのではなく、傾向およびパターンを調べることである。総PSP、PSP94結合タンパク質、遊離PSP94および補正した遊離PSP94の血清濃度の分布は、本明細書に記載されたさらなる図に示されている。
さらなる図に関して:
図15Aは、PSA値が4ng/mlの切捨て値よりも低いか高いかが知られている個体の血清中の総PSP94の測定により、および図13に示され、実施例14に記載されたアッセイを用いて得られた結果を示すグラフである。結果は、各個体について測定された総PSP94濃度(ng/mlで)の対数として表されている。各点は、具体的な個体について得られた結果を表している。この図に関して、個体の血清中には、1ng/mlから2250ng/mlの総PSP94濃度が測定された。
図15Bに関して、この図は、PSA値が4ng/mlの切捨て値よりも低いか高いかが知られている個体の血清中の遊離PSP94の測定により得られた結果を示すグラフである。サンドイッチELISAアッセイにおける2D3およびP1E8モノクローナル抗体による遊離PSP94の測定前に、本明細書に記載された抗PSP94結合タンパク質抗体を用い、血清からPSP94結合タンパク質およびPSP94/PSP94結合タンパク質複合体を除去(減耗)することに基づくアッセイを用いて、結果が得られた。結果は、各個体について測定された遊離PSP94濃度(ng/mlで)の対数として表されている。各点は、具体的な個体について得られた結果を表している。
図15Cに関して、この図は、PSA値が4ng/mlの切捨て値よりも低いか高いかが知られている個体の血清中の総PSP94結合タンパク質の測定により得られた結果を示すグラフである。図14aに示され、実施例15に記載されたアッセイを用いて結果を得た。結果は、各個体について測定された総PSP94結合タンパク質濃度(ng/mlで)の対数として表されている。各点は、具体的な個体について得られた結果を表している。この図に関して、個体の血清中には、0.7 マイクログラム/mlから125マイクログラムg/mlのPSP94結合タンパク質濃度が測定された。
図15Dに関して、この図は、PSA値が4ng/mlの切捨て値よりも低いか高いかが知られている個体の血清中の遊離PSP94濃度の補正により得られた結果を示すグラフである。減耗後にも血清中に1%から5%の残留PSP94/PSP94結合タンパク質複合体が残留しており、それが得られる結果に影響を及ぼし得ること、すなわち、2D3抗体の添加後に、PSP94が該複合体から解離し得、「遊離PSP94」値を誤って増加させ得ることを考慮して、結果を補正した。結果はやはり、各個体について測定された補正遊離PSP94濃度(ng/mlで)の対数として表されている。各点は、具体的な個体について得られた結果を表している。この図に関して、補正遊離PSP94濃度は、高いPSA範囲(>4ng/ml)において、著しく上昇した。
図16は、個体の血清中に測定された総PSP94結合タンパク質濃度(ng/ml)対全PSP94濃度(ng/ml)を示すグラフである。各点は、具体的な個体について得られた結果を表している。この図に関して、これら2つのパラメーター間に、有意な正の相関を見ることができる。
個々の刊行物または特許出願の各々が、参照として組み込まれていることが具体的に個々に示されているように、本明細書に引用された全ての刊行物および特許出願は、参照として本明細書に組み込まれている。いずれの刊行物の引用も出願月日の前の開示に関するものであり、本発明が、先行発明によってこのような刊行物より前の日付けを付ける資格がないということを認めるものとして解釈すべきではない。
先の発明は、明確な理解を目的として、図示および実施例によっていくらか詳細に説明したが、それらに対する一定の変更および修飾を、添付の請求項の精神および範囲から逸脱せずに行うことができることは、本発明の教示に照らして、通常の当業者であるならば容易に明らかである。
ヨードの同位体元素125(125I)で放射性標識されたPSP94に結合された(特異的な結合)ヒト男性血清からのタンパク質のゲルろ過クロマトグラフィー結果を示すグラフである。125I-PSP94のヒト男性血清タンパク質への結合は、各フラクションにおいて1分当りのカウント(cpm)で発現される放射活性により判定される。非特異的結合は、ヒト男性血清と125I-PSP94と一緒のインキュベーション混合物において遊離PSP94を含むことによって判定された。遊離PSP94および複合PSP94(担体と結合したPSP94)を含有するフラクションの位置は、グラフに示している。 硫酸アンモニウム沈殿により部分的に精製されたヒト男性血清からのタンパク質のフラクションにおける125I-PSP94結合結果を示すグラフである。全ヒト男性血清は、硫酸アンモニウムの種々の濃度(硫酸アンモニウムの(w/vで算出される%)0%から32%、32%から47%、47%から62%および62%から77%)で沈殿し、フラクション内でのPSP94結合活性の存在は、血清の各フラクション(高分子量成分)に含有するタンパク質と結合する放射性標識PSP94の能力を測定することにより評価された。結果は、結合アッセイに使用された放射活性の全量に比して各フラクションにおけるヒト男性血清タンパク質に結合した放射活性量として(パーセンテージに換算して)表される。 硫酸アンモニウムにより精製されたタンパク質で装填されたMacroPrep High Qアニオン交換カラムを用いて、アニオン交換クロマトグラフィー結果を示すグラフである。タンパク質は塩化ナトリウムで溶出される。A点とB点との間に位置するピークは、PSP94結合タンパク質を含有するタンパク質フラクションを表す。タンパク質を検出し、280nmで測定された吸光度により定量化される。 PSP94-アフィニティークロマトグラフィー後に得られた試料で装填された還元性ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルを示す図である。ゲルを電場で操作し、Gelcode(登録商標)Blue Code Reagent(Pierce)で染色した。レーン1は、分子量マーカーを表す。レーン2は、PSP94接合アフィニティーマトリックスに結合されたタンパク質を表す。レーン3は、過剰の遊離PSP94がインキュベーション混合物内に含まれた場合、PSP94接合アフィニティーマトリックスに結合されたタンパク質を表す。 種々の溶出(解離)条件を用いて、PSP94接合アフィニティーマトリックスからのPSP94結合タンパク質の溶出後に得られた試料で装填された非還元性SDS-PAGEゲルを示す図である。インキュベーション後、種々の溶出緩衝液において、アフィニティーマトリックスを、遠心分離により溶出緩衝液から除去した。マトリックスをPBS中で洗浄し、非還元性SDS-PAGE試料緩衝液中で沸騰させた。SDS-PAGEを電場で操作し、Gelcode(登録商標)Blue Code Reagent(Pierce)で染色した。矢印は、高分子量結合タンパク質(HMW)および低分子量結合タンパク質(LMW)の位置を表す。レーンAは、分子量マーカーを表す。レーンBは、未処理試料を表す。レーンCは、PBS中、34℃で1時間インキュベートされた試料を表す。レーンDは、水中、34℃で1時間インキュベートされた試料を表す。レーンEは、1mlのPBS中、300μgのPSP94と共に34℃でインキュベートされた試料を表す。レーンFは、競合対照を表す。レーンGは、2M尿素中でインキュベートされた試料を表す。レーンHは、8M尿素中でインキュベートされた試料を表す。レーン1は、pH2.7での100mMの酢酸ナトリウム中でインキュベートされた試料を表す。レーンJは、pH11.0での100mMの3-(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸(CAPS)中でインキュベートされた試料を表す。 硫酸アンモニウム沈殿に次いでアニオン交換クロマトグラフィーにより精製された試料のアフィニティークロマトグラフィー(PSP94接合アフィニティーマトリックスを用いる)結果を示すグラフである。PSP94結合タンパク質は、過剰のPSP94を添加することによってカラムから溶出された。A点とB点との間に位置するピークは、PSP94結合タンパク質のフラクションを表す。タンパク質を検出し、280nmでの吸光度により定量化した。 非還元性条件下で実施されたSDS-PAGEを示す図である。レーンAは、分子量マーカーを表す。レーンBは、硫酸アンモニウム沈殿およびアニオン交換クロマトグラフィーにより精製されたPSP94結合タンパク質とのインキュベーション後で、競合PSP94よる溶出前のPSP94アフィニティーマトリックスを表す。レーンCは、競合対照を表す。レーンDは、過剰のPSP94による溶出後のアフィニティーマトリックスを表す。レーンEは、最終溶出および濃縮(実質的に)純粋なPSP94結合タンパク質を表す。 PSP94結合タンパク質用に提案された精製工程を示す系統図である。 ヒト組織ポリ-A RNAの試料に対して実施されたノーザンブロット法を示す図である。レーン1は、脳RNAを表し、レーン2は、心臓RNAを表し、レーン3は、骨格筋RNAを表し、レーン4は、大腸RNAを表し、レーン5は、胸腺RNAを表し、レーン6は、脾臓RNAを表し、レーン7は、腎臓RNAを表し、レーン8は、肝臓RNAを表し、レーン9は、小腸RNAを表し、レーン10は、胎盤RNAを表し、レーン11は、肺RNAを表し、レーン12は、末梢血リンパ球(PBL)RNAを表す。 ヒト組織ポリ-A RNAの試料に対して実施されたノーザンブロット法を示す図である。レーン1は、脾臓RNAを表し、レーン2は、胸腺RNAを表し、レーン3は、前立腺RNAを表し、レーン4は、精巣RNAを表し、レーン5は、卵巣RNAを表し、レーン6は、小腸RNAを表し、レーン7は、大腸RNAを表し、レーン8は、末梢血リンパ球(PBL)RNAを表す。 特異的モノクローナル抗体(1B11)によるPSP94結合タンパク質の認識(結合)を示すウェタンブロット法の図である。レーン1は、分子量マーカー(上部から下部に向けて、212、132、86、44kDa)である。レーン2は、0.2μgの(実質的に)純粋なPSP94結合タンパク質であり、レーン3は、25μlの部分的に純粋なPSP94結合タンパク質である。 PSP94の結合および遊離形態に対してモノクローナル抗体の特異性が評価されるELISAプレートを示す図である。着色ウェルは陽性結果を示す。 遊離PSP94の量を測定するために使用された方法を示す略図である。 図12aに示された方法を用いてELISAアッセイの結果を示すグラフである。 遊離PSP94の量を測定するために使用されたサンドイッチELISAアッセイを示す略図である。 遊離PSP94を測定するためにサンドイッチELISAアッセイの結果を示すグラフである。 試料中の全PSP94の量(PSP94サンドイッチELISA)を測定するために使用される提案された方法を示す略図である。 試料中の全PSP94結合タンパク質の量(PSP94結合タンパク質のサンドイッチELISAを用いて)を測定するために使用される方法を示す略図である。 図14aに示された方法を用いて試料中のPSP94結合タンパク質を測定するために用いられたELISAアッセイの結果を示すグラフである。 低(<4ng/ml)および高(>4ng/ml)PSAカテゴリにおいて個体の血清からの全PSP94レベルの濃度を表す図である。 低(<4ng/ml)および高(>4ng/ml)PSAカテゴリにおいて個体の血清からの遊離PSP94レベルの濃度を表す図である。 低(<4ng/ml)および高(>4ng/ml)PSAカテゴリにおいて個体の血清からの全PSP94結合タンパク質レベルの濃度を表す図である。 低(<4ng/ml)および高(>4ng/ml)PSAカテゴリにおいて個体の血清からの補正遊離PSP94レベルの濃度を表す図である。遊離PSP94値は、1〜5%のPSP94結合タンパク質(および複合PSP94)が吸収プロトコル後に残ったことから補正された。この補正は、結合PSP94×吸収されないPSP94結合タンパク質の比率を未補正の遊離PSP94値から差し引く。 全PSP94と比較された全PSP94結合タンパク質濃度を表すグラフである。

Claims (32)

  1. PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体。
  2. 特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されるおよびその抗原結合断片である、請求項1に記載の抗体。
  3. 特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されるおよびその抗原結合断片である、請求項1に記載の抗体。
  4. 請求項1に記載の抗体を含むキット。
  5. 前記抗体が、レポーター分子と複合化される、請求項4に記載のキット。
  6. 前記レポーター分子が酵素である、請求項5に記載のキット。
  7. 前記酵素がペルオキシダーゼである、請求項6に記載のキット。
  8. 前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項7に記載のキット。
  9. 既知量のPSP94を含有する対照試料をさらに含む、請求項4に記載のキット。
  10. 前記抗体が、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される、請求項4に記載のキット。
  11. PSP94の異なるエピトープに結合する第二抗体をさらに含む、請求項10に記載のキット。
  12. PSP94に結合するポリクローナル抗体をさらに含む、請求項10に記載のキット。
  13. 前記第二抗体が、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される、請求項11に記載のキット。
  14. 前記抗体が、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される抗体である、請求項4に記載のキット。
  15. PSP94の異なるエピトープに結合する第二抗体をさらに含む、請求項14に記載のキット。
  16. PSP94に結合するポリクローナル抗体をさらに含む、請求項14に記載のキット。
  17. 前記抗体が固体マトリックスに結合される、請求項4に記載のキット。
  18. 前記固体マトリックスの非特異的結合部位が遮断される、請求項17に記載のキット。
  19. PSP94に結合する第一および第二抗体を含むキットであって、前記第一または第二抗体の少なくとも1つが、PSP94の遊離形態のみに結合し、前記第一および第二抗体が、PSP94の異なるエピトープに結合するキット。
  20. PSP94を認識できる分子を有する容器を含み、PSP94量の評価またはPSP94の異常なレベルまたは上昇レベルに関連する状態の診断に使用するためのキット。
  21. PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
  22. 特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託される、請求項21に記載のハイブリドーマ細胞系。
  23. 特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託される、請求項21に記載のハイブリドーマ細胞系。
  24. 第一部分および第二部分を含む抗体複合体であって、前記第一部分が、PSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体であり、前記第二部分が、製薬剤、固体支持体、レポーター分子、レポーター分子を担持する基、キレート化剤、アシル化剤、架橋剤、および標的基からなる群から選択される抗体複合体。
  25. 前記第一部分が、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される抗体である、請求項24に記載の抗体複合体。
  26. 前記第一部分が、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生される抗体である、請求項24に記載の抗体複合体。
  27. 試料中のPSP94の遊離形態を検出または測定する方法であって、
    a.前記試料をPSP94が遊離形態である場合に利用できるPSP94のエピトープに結合できる抗体と接触させること; および
    b.前記抗体、または前記標識を担持する第二分子により提供される標識からシグナルを検出すること
    を含む方法。
  28. 前記抗体が、特許寄託番号: PTA-4240の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系およびその抗原結合断片により産生される、請求項27に記載の方法。
  29. 前記抗体が、特許寄託番号: PTA-6599の下でATCCに寄託されたハイブリドーマ細胞系およびその抗原結合断片により産生される、請求項27に記載の方法。
  30. 前記試料に対して得られたシグナルを、所定量のPSP94を含有する対照試料に対して得られたシグナルと比較する、請求項27に記載の方法。
  31. 前記試料が、血液、血漿、血清、尿、精液、細胞培養培地および細胞溶解液からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
  32. 試料中の遊離PSP94量を測定する方法であって、前記試料とPSP94を認識できる抗体とを接触させることを含む方法。
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