JP2008542395A - 細胞バリア機能障害の調整 - Google Patents

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Abstract

本発明は、内皮細胞および上皮細胞のバリア疾患および障害のような、細胞バリア疾患および障害を治療するために、μ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与するための予防方法および治療方法を提供する。急性肺損傷、アテローム性動脈硬化、腸由来敗血症、熱傷、新生児壊死性腸炎、重症の好中球減少、中毒性大腸炎、炎症性腸疾患、腸疾患、移植拒絶反応、嚢炎、ピッグベリー(ピッグベル)、シュードモナス属を介した眼科感染、シュードモナス属を介した耳科感染およびシュードモナス属を介した皮膚感染のような炎症を含む疾患または障害に、この方法が適用可能であってもよい。より一般的に、予防方法および治療方法に適用可能なものとして、上皮細胞バリア障害が検討される。疾患および障害は、緑膿菌のような病原菌を含む微生物病原体によって誘導されてもよい。本発明は、細菌のPA-Iレクチン/アドヘシンの発現の阻害および細菌のMvfR活性レベルの阻害ための、予防方法および治療方法をさらに提供する。さらに、医薬製品において、μ-オピオイド受容体アンタゴニストを本明細書において記述された方法の用途のために使用する方法が提供される。
【選択図】 なし

Description

発明の詳細な説明
本発明は、国立衛生研究所(NIH)によって与えられた契約番号DE12322、DE00470、R01-GM-62344-01およびDE015830の下で、米国政府の援助により行なわれた。米国政府は、本発明に対する一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本願は、2005年6月3日に出願された米国仮特許出願番号第60/687,568号、2005年10月28日に出願された第60/731,009号、および2006年1月20日に出願された第60/760,851号の利益を主張するものである。本願は、米国を指定国とする、国際的な(PCT)特許出願PCT/US06/07892の優先権の利益も主張する。上記の識別された特許出願の各々は、ここにその全体の参照によって明らかに本明細書において組み入れられる。
技術分野
本発明は、ヒトなどの脊椎動物(例えば哺乳類)を苦しめる障害または疾患に特徴的な細胞バリア機能障害の調整におけるオピオイド受容体アンタゴニストの予防的および治療的な用途の分野に概して関する。
背景技術
脊椎動物(例えば哺乳類)細胞バリア機能障害は、多細胞生物の内部区画化および/またはそのような生物の内部環境と外部環境の分離に寄与する細胞バリアの透過性に変化をもたらす。典型的には、細胞バリア機能障害は、高等真核生物の血管で見出される内皮細胞の層、または皮膚、肺および腸を含む、外部環境に露出された組織で見出される上皮細胞の層のような特定の細胞層の透過性の増加として示される。ヒトのような脊椎動物を苦しめる様々な障害および疾患は細胞バリア機能障害を含む。総体として、これらの病弊は、ヒトおよび他の動物(例えば飼育動物、動物園の動物または外来の動物、ペット)の生活の質に影響し、その上重く漸増する保険費用の一因となる。以下の説明において、細胞バリア機能障害は前述の内皮細胞および上皮細胞を含む様々な細胞タイプに当てはまるという理解とともに、内皮細胞または上皮細胞のような特定の細胞型が説明の容易さのために使用されるだろう。
例えば、内皮細胞は、血液と下にある血管との間の半選択的なバリアを提供する。このバリアの破壊は血管透過性の増加と臓器機能不全をもたらす。例えば、炎症過程は、細胞間および細胞基質間接着を減少させることによって、ならびに求心的方向の張力を増加させることによって、巨大分子の輸送を増加させ、細胞間ギャップの形成をもたらす。内皮細胞のバリア機能を促進する薬剤は、様々な炎症性疾患、アテローム性動脈硬化および急性肺損傷のために望ましい治療方針を提供する。
細胞バリア機能障害は、微生物病原体を含む様々な因子、およびトロンビン、イオノマイシン、LPS、および同種のものを含む様々な薬剤により引き起こされるか悪化する。緑膿菌(P. aeruginosa)のような微生物病原体は、バリア機能を妨害することができる様々なペプチドおよび毒性因子を発現することができる。微生物学者は、多くの細菌が環境からの合図に反応して毒性遺伝子を活性化することを、長い間認識していた。一般に、そのような物理化学的な合図は、酸化還元状態、pH、浸透圧、および同種のものの変化のような、環境ストレスまたは副作用を伝える。例えば、緑膿菌および他の細菌は、レクチン/アドヘシンPA-Iを発現することができる。その環境に依存して、細菌のPA-Iの分布は、主として細胞質内または細胞外のいずれかであり得る。細菌が理想的な増殖条件で成長する場合、PA-Iの約85%は細胞内に位置し、少ないが有意な量で細胞膜中に、外膜上に、および細胞周辺腔中に位置する。際立って対照的に、ストレスを受けた宿主の胃管内では、PA-I存在量は増加し、外膜に局在し、腸上皮への緑膿菌の接着を促進する。さらに、遊離したPA-Iが細胞外環境へ脱落し、培養上清および緑膿菌に感染した肺からの痰の両方で25μg/mlもの高濃度で検出できるという証拠がある。培養された上皮細胞(例えばT-84、Caco-2bbe、MDCK、気管上皮細胞)への25μg/mlの精製PA-Iの投与が、重大な透過性欠損を引き起こすので、この発見はかなり重要である。この緑膿菌の効果は、インビボの腸管でも見られる。緑膿菌が院内感染の症例中で単離された最も一般的なグラム陰性菌であり、すべての院内感染の中で最も高い致死率を伴うことが報告されているので、これらの効果は臨床的に重要である。重症患者の腸管内でこの病原体がわずかに存在することは、死亡率の4倍の増加に、遠隔器官への伝搬に非依存的に関連する。
緑膿菌の毒性遺伝子発現を活性化する特異的な膜センサーについての研究はほとんどなかったが、CyaB、GacSと呼ばれる緑膿菌の細胞膜の中にある2つのセンサータンパク質は、3つの公知の外部シグナルである、宿主細胞接触、低カルシウムおよびビート種子抽出物に反応することが示された。CyaB(cAMPを介する)およびGacS4(リン酸化を介する)は、転写調節因子のVfrおよびGacAをそれぞれ活性化し、細胞密度感受性PcrAと共に、緑膿菌における毒性遺伝子調節のための2つの中心システムのQSおよびRpoSシグナリングシステムへ、全体的な調節性の影響を及ぼす。マウスにおいて、CyaBおよびGacSの欠損変異株の肺点滴後の致死性は減少した。
種子抽出物および細胞接触のような宿主の細胞要素は、膜バイオセンサーのCyaBおよびGacSを活性化する。これら二成分の膜貫通性の警報装置は、その後、毒性の2つの主要な全体的な調節因子のVfrおよびGacAを活性化する。Vfrは、LasRIの活性化に関与し、今度はQSのRhlRIシステムの活性化を促進する。GacAは、lasRおよびrhlR遺伝子の転写を誘導し、rpoSの発現に関与する。最終的に、第3のシステム(PQS)は、RhlRおよびRpoSの両方の発現を誘導する。したがって、膜バイオセンサーのうちのいずれかの活性化は、多くの異なる経路の関与によりPA-Iの発現を導くことができた。
オピオイドは、実質的には身体のすべての組織に分布し、様々なストレス条件に反応して多量に放出される大きな化合物グループを含む；例えばダイノルフィンおよびβ-エンドルフィンは、ストレスに続いて、優勢的に放出される内因性オピオイドであるようだ(S. Yoshida, et al., Surg Endosc 14, 137 (2000), C. Sternini, S. Patierno, I. S. Selmer and A. Kirchgessner, Neurogastroenterol Motil 16 Suppl 2, 3 (2004))。モルヒネ様化合物(オピオイド)と同様に、モルヒネおよびモルヒネ誘導体(オピエート)は、世界中で最も広く用いられている鎮痛剤であり、しばしば手術後の養生、慢性的疼痛の管理、および進行癌患者またはAIDSのような重症患者において、継続的な投薬間隔で高用量でも投与される。静脈内に投与されたモルヒネは、100μMという高濃度で腸粘膜のような細菌感染の組織部位で蓄積することが実証され(P. Dechelotte, A. Sabouraud, P. Sandouk, I. Hackbarth and M. Schwenk, Drug Metab Dispos 21, 13 (1993)) 、腸壁を横切って内腔へと急速に通過することが示された(M. M. Doherty and K. S. Pang, Pharm Res 17, 291 (2000))。したがって、緑膿菌のような日和見病原体(それは3日間の入院中に、重症患者の腸の50%以上に存在する)は、内因的に放出されたオピオイド化合物、外因的に適用されるオピオイド化合物の両方に曝露されるだろう。腸を越えた細菌の遊出が、腸運動性の減少した、熱傷またはICUの患者に、敗血症率の増大を導びくかもしれないことを、臨床データーは示唆する。
オピオイドと感染の関連は、CCR5受容体の発現増加によってオピオイドがヒトマクロファージのHIV感染を促進するという証拠を含めて、十分に確立される(Risdahl, et al., J Neuroimmunol 83:4 (1998))。Ho et al., J. Pharm. And Exp. Ther. 307:1158-1162 (2003)。それにもかかわらず、この領域のほとんどの研究は、免疫系に対するオピオイドの抑制効果に注目してきた(Eisenstein, et al., Adv Exp Med Biol 493, 169 (2001))。オピオイドは、細菌除去障害および動物死亡率促進をもたらす様々な免疫細胞の抑制を示したが(Wang, et al., J Leukoc Biol 71, 782 (2002))、オピオイド化合物が、さらに直接細菌の毒性を活性化するかもしれないことは、従来は考慮されてこなかった。
オピオイド、ならびにモルヒネおよびDAMGO([D-Ala2, N-MePhe4, Gly5-ol]、μオピオイドエンケファリン)のようなオピオイドアンタゴニストは、中枢神経系(CNS)および末梢組織にあるmOP-Rに結合する。mOP-Rは内皮細胞と上皮細胞を含む様々な細胞型で発現する。mOP-Rは、単一の遺伝子にコードされたmRNAのオルタナティブスプライシングに由来する複数のアイソフォームを持つGタンパク質共役型受容体である。ナロキソンを含むほとんどのμオピオイド受容体アンタゴニストは、荷電していない状態で存在し、CNS依存的鎮痛効果を反転させるように血液脳関門(BBB)通って急速に通過する。しかしながら、MNTXはBBBを透過することができないことで知られる荷電分子である。MNTXおよびノロキシモルフォン(noroxymorphone)(QDNM)の他の四級誘導体の細胞バリア調節に対する効果は、報告されていない。
いくつかの受容体は、細胞(例えば内皮細胞)のバリア機能に関係することが示されてきた。1つの重要な受容体ファミリーは、スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)受容体(Edg(内皮分化遺伝子)受容体とも呼ばれる)である。S1Pは、内皮を含む様々な細胞型で発現される、細胞膜Gタンパク質共役型S1P受容体1(Edg1)、2(Edg5)、3(Edg3)、4(Edg6)および5(Edg8)に結合する。S1P3シグナリングはGi、Gq/11およびG12/13経路に連動し、Rac1よりもはるかに大きな程度までRhoAを活性化するが、ヒト内皮細胞は、Gi経路およびRac1の活性化に連動するS1P1シグナリングにより、S1P1およびS1P3の高発現を示す。Rac1によるS1P1受容体依存的活性化は、血管構造の全体性を増進することが示された。対照的に、RhoAのS1P3受容体依存的活性化は、内皮細胞バリアの破壊を調節する可能性がある。
Src(pp60Src、c-Srcチロシンキナーゼ)は、アミノ末端のミリストイル化部位、Src相同(SH)部位(すなわちSH2とSH3)、チロシンキナーゼ触媒ドメインおよび調節性のチロシンリン酸化部位を含む、非受容体型チロシンキナーゼである。Srcの活性化は、内皮細胞バリアの破壊および内皮細胞の収縮を増進する。Srcの阻害は、心筋梗塞後の浮腫および組織損傷を減ずる。
チロシンホスファターゼタンパク質(PTP)は、無数の細胞的事象を調節する100以上の遺伝子によってコードされる多様なスーパーファミリーである。肺内皮で高発現する1つのPTPは、受容体様タンパク質のチロシンホスファターゼμ(RPTPμ)である。構造上、RPTPμは、細胞外のMAM(メプリン-A5タンパク質M型-RPTP(RPTPμ)、免疫グロブリン(Ig)様ドメインおよびフィブロネクチン3型(FN3)様ドメイン、ならびに細胞内のPTP触媒ドメインからなる。RPTPμは内皮細胞間結合に局在し、血管構造の全体性を調節する。
インビトロの分析は非常に有用であり、細菌性病因のメカニズムについての重要な情報を提供し続けるが、病原体は、感染する間に様々な点で宿主中の根本的に異なるいくつかの環境に出会うので、それらは宿主病原体相互作用のすべての局面を正確に再現することができるとは限らない。結果的に、インビトロの研究で重要に見える遺伝子はインビボで重要ではないかもしれないし、インビトロの分析で重要でなく見える遺伝子は自然感染の間に重大な役割を果たすかもしれない。更に、細菌の機能的なゲノムのおよそ3分の1が差異的に調節されていることにから判断されるように、固形アガーの表面で増殖する細菌は、培養液中で増殖する細菌とは著しく異なる生理状態を有することが最近示された。したがって、生育環境およびホスト環境の変数について制御する実験が、今やデザインされなければならないし、その上、ストレスを受けたマウスのような従来のモデルで可能でない遺伝子発現パターンおよび表現型分析の測定を同時に可能にしている。
重症の敗血症は引き続き重症患者の中で死亡率の一番の原因である。全身性の免疫反応の調節性のアームを減少させる介入は臨床的な失敗に終わた。代わりに、より新しくより強力な抗生物質は、使用の減少以外に考えられる治療がない、高耐性細菌株の出現をもたらした。緑膿菌は、今や公衆に対して現実的かつ当面の危険を提起する、新興耐性病原体の国際的なリストに載っている。
したがって、当技術分野において、内皮細胞バリア機能障害および上皮細胞バリア機能障害を含む細胞バリア機能障害の予防、緩和、または治療方法に対する要求は存在し続ける。さらに、細胞バリア機能障害の状態と関連した症状を緩和する組成物および方法に対する要求は満たされていない。
発明の開示
本発明は、効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニスト(OP-RA)の投与によって、細胞バリア機能障害を予防または治療のための組成物および方法を提供することで、当技術分野において前述の要求の少なくとも1つを満たす。本発明は、重要な実施形態において、内皮細胞または上皮細胞バリア機能障害の予防または治療に向けられる。具体的には、本発明は、中枢に作用するアンタゴニストと同様に、末梢に限定されたアンタゴニスト(例えばメチルナルトレキソンによって代表された極性アンタゴニストまたは荷電アンタゴニスト)を含む、オピオイド受容体アンタゴニストの細胞バリア機能障害抑制効果に関する。本方法は、炎症、アテローム性動脈硬化、および微生物による病因のような、様々な疾患および障害と関連した、バリア機能障害および付随する状態、ならびにそれから生じる症状の予防または治療に効果的である。特定の非限定例として、細胞バリア機能障害が起こる状態は、腸由来敗血症、熱傷、化学的接触損傷、急性肺損傷、新生児壊死性腸炎、重症好中球減少、中毒性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、腸疾患、移植拒絶反応、嚢炎、壊死性腸炎(ピッグベル)、尿毒症心膜液貯留、眼ガラス体液漏出、黄斑変性、網膜機能不全および感染(例えば、ウイルス感染、細菌感染、日和見細菌感染、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)感染、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)感染、シュードモナス属(Pseudomonas)を介した眼科感染、シュードモナス属を介した耳科感染およびシュードモナス属を介した皮膚感染)であってもよい。
本明細書において記述された本発明に有用なオピオイド受容体アンタゴニストは、詳細な説明でより包括的に以下で説明され、その説明は参照によってこの発明の開示に組み入れられる。適切なオピオイド受容体アンタゴニストの例は、いくつかのクラスの化合物に属するヘテロ環式アミン化合物を含む。1つのクラスは、モルフィナンの三級誘導体および特にノロキシモルフォンの三級誘導体である。1つ実施形態において、ノロキシモルフォンの三級誘導体、例えばナロキソン、ナルトレキソンが、検討される。他のクラスは、モルフィナンの四級誘導体および特にノロキシモルフォンの四級誘導体である。他のクラスは窒素置換ピペリジンである。他のクラスはベンゾモルファンの四級誘導体である。特定の実施形態では、オピオイド受容体アンタゴニストは、N-メチルナルトレキソン、アルビモパン、ADL 08-0011、ピペリジン-N-アルキルカルボキシレート、四級モルフィナン、アヘンアルカロイド誘導体または四級ベンゾモルファン化合物のような末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストである。さらに、四級モルフィナン化合物は、N-メチルナルトレキソン、N-メチルナロキソン、N-メチルナロルフィン、N-ジアリルノルモルヒネ、N-アリルレバロルファンまたはN-メチルナルメフェンの四級塩であってもよい。いくつかの実施形態では、四級ベンゾモルファン化合物は、2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2,2-ジアリル-6,7-ベンゾモルファニウム-ブロミド；2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-6,7-ベンゾモルファン；2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファン；2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファニウムブロミド；2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-プロパルギル-6,7-ベンゾモルファニウムブロミド；または2'-アセトキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファニウムブロミドである。いくつかの実施形態では、本方法は、さらに少なくとも15キロダルトンの平均分子量を有する高分子量ポリエチレングリコール様化合物の投与を含む。
好ましい実施形態では、アンタゴニストはμオピオイド受容体アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは末梢オピオイド受容体アンタゴニスト(例えばMNTX)であり、VEGF、血小板由来増殖因子(PDGF)、スフィンゴシン-1-リン酸(S1P)および/または肝細胞増殖因子(HGF)に刺激または誘導された細胞バリア機能障害を阻害するだろう。
述べられたように、本発明のいくつかの実施形態では、オピオイド受容体アンタゴニストはμオピオイド受容体アンタゴニストである。他の実施形態では、オピオイド受容体アンタゴニストは、κオピオイド受容体アンタゴニストである。本発明は、μオピオイド受容体アンタゴニストの組合せ、κオピオイド受容体アンタゴニストの組合せ、およびμおよびκのオピオイド受容体アンタゴニストの組合せ、例えば、メチルナルトレキソンおよびアルビモパン(またはADL 08-0011)の組合せ、またはナルトレキソンおよびメチルナルトレキソンの組合せを含む、1つ以上のオピオイド受容体アンタゴニストの投与も包含する。
本明細書において記述された本発明は、脊椎動物、およびより好ましくは哺乳類における細胞バリア機能障害の防止および/または処理を含む。治療される重要な被験体または「患者」は、家畜(例えばウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、サカナおよびニワトリ)および家庭動物(イヌおよびネコ)およびヒトである。
本明細書において記述された本発明は、細胞バリア機能障害の防止または治療を含む。本明細書において使用されるような防止は、細胞バリア機能障害のリスクがある患者へ、細胞バリア機能障害から生じる症状または有害な病状の出現の阻害、進行の減少、またはすべての出現の予防に効果的な量での、オピオイド受容体アンタゴニストの投与を意味する。本明細書において使用されるような治療は、細胞バリア機能障害に関連した状態または症状を有するまたは有すると思われる患者へ、細胞バリア機能障害から生じる症状もしくは有害な病状の阻害に、さらなる進行の停止に、減少に、またはすべての除去に効果的な量での、オピオイド受容体アンタゴニストの投与を意味する。
μオピオイド受容体アンタゴニスト(mOP-RA)様メチルナルトレキソン(MNTX)のようなオピオイド受容体アンタゴニストは、細胞バリア機能障害を阻害する。例えば、MNTXを含むμオピオイド受容体アンタゴニストは、μオピオイド受容体(mOP-R)依存的および非依存的メカニズムによって、オピエート誘導性、トロンビン誘導性およびLPS誘導性の内皮細胞バリア機能障害を阻害する。mOP-RA(例えばMNTX)誘導性の内皮細胞バリア調節のmOP-R非依存的メカニズムは、受容体様タンパク質チロシンホスファターゼμ(RPTPμ)の活性化、ならびにトロンビン誘導性およびLPS誘導性で、Src依存性のS1P3受容体トランスアクチベーション(チロシンリン酸化)の阻害を含む。したがって、MNTXのようなmOP-RAは、細胞バリア保護剤として有用である。
本明細書において記述された本発明は、細胞バリア機能(例えば、内皮細胞バリア機能および/または上皮細胞バリア機能)を促進する方法で、そのような治療を必要とする患者に、効果的な量の1つまたは複数のオピオイド受容体アンタゴニストを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。例えば、細胞バリア機能は、ある炎症性の症候群において破壊されている場合がある。したがって本発明は、アテローム性動脈硬化および微生物による病因(例えば感染)と同様に、細胞バリア機能障害、典型的には上皮細胞または内皮細胞バリア機能障害によって特徴づけられる、炎症性の症候群(例えば急性肺損傷)を予防または治療する方法を提供する。本明細書において記述された方法は、これらの疾患のうちのいずれかと関連した細胞バリア機能障害から生じる症状を、治療または予防することも含む。
本明細書において記述された本発明のすべての局面に関して、好ましくは患者はヒトである。いくつかの実施形態では、ヒト患者は、癌ではなく、および/またはメタドン維持療法プログラム中ではなく、および/または免疫抑制されていない。いくつかの実施形態では、患者は術後腸管機能不全を経験していない。患者の有する特定の障害、障害の重症度、および患者の疼痛管理の必要性に依存して、患者は併用オピオイド療法中であってもよいし、なくてもよい。いくつかの実施形態では、患者は併用オピオイド療法を採用している。いくつかの実施形態では、患者は併用オピオイド療法を採用していない。いくつかの実施形態では、患者は常習的な併用オピオイド療法を採用している。いくつかの実施形態では、患者は常習的な併用オピオイド療法を採用していない。いくつかの実施形態では、患者は、同時に投与されたオピオイド療法の任意の用量に依存しない、オピオイドのアンタゴニストの用量を受け取っている。
いくつかの実施形態では、効果的な量は、少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、およびさらに少なくとも4週間続けて、患者に効果的な循環血漿レベルのオピオイドのアンタゴニストがあるようなものである。1つの実施形態では、オピオイドのアンタゴニストは周術期（peri-operatively）に使用される。周術期は、手術手順前(例えば、準備ために)、手術手順中、および/または手術手順直後(すなわち3日または5日までさえ)を意味する。オピオイドのアンタゴニストは、細胞バリア機能を弱化、保存、または維持するように作用し、それによって炎症を阻害し、日和見感染を含む感染を阻害し、腫瘍および特に内皮細胞腫瘍でない腫瘍の除去に関する手術手順の場合の、腫瘍の再発および/または転移を阻害する。
本発明は、オピオイドアンタゴニストでないが、それにもかかわらず、細胞バリア機能障害と関連した障害、状態または症状を治療するのに有用な薬剤と共に、オピオイドアンタゴニストを同時投与することも含む。そのような薬剤の例は、抗癌剤、抗新血管新生剤(例えば、抗VEGFモノクローナル抗体)、抗感染薬剤(例えば抗菌剤および抗ウイルス剤)、抗炎症剤および抗アテローム性動脈硬化剤、抗血栓症剤および同種のものを含む。
本発明の局面は、オピオイド誘導性の副作用のない被験体に、効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細胞バリア機能障害によって特徴づけられた障害を治療する方法を提供する。オピオイド誘導性の副作用は、オピオイド誘導性の便秘、過敏性大腸症候群、術後腸閉塞または腸管機能不全、オピオイド誘導性の悪心、オピオイド誘導性の嘔吐、尿貯留、胃腸管排出の遅れ、胃腸管運動性の減少およびオピオイド誘導性の免疫系抑制を含む。いくつかの実施形態では、細胞バリア機能障害は、内皮細胞、上皮細胞または両方の型の細胞に起因してもよい。
本発明の他の局面は、障害を発症するリスクがある被験体に、予防に効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細胞バリア機能障害によって特徴づけられた障害を発症するリスクを減少させる方法を提供する。
本発明の他の局面は、化合物が、障害の少なくとも1つの症状を減少させるのに効果的な量で投与されるように、必要性のある被験体にオピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細胞バリア障害と関連した症状を減少させる方法を提供する。
本発明の他の局面は、外科的処置が適用可能な腫瘍を有する患者への効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを周術期に投与することを含む、腫瘍細胞転移を予防する方法である。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は内皮細胞腫瘍ではない。
本発明の他の局面は、そのような治療を必要とする患者に効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することによって、感染予防または感染リスク低下の方法を提供する。いくつかの実施形態では、患者は、内部損傷、手術、急性肺損傷または熱傷のような外傷を有する。他の実施形態では、患者は高レベルのストレスにさらされる。いくつかの実施形態では、感染は日和見感染因子からである。いくつかの実施形態では、感染は細菌感染である。いくつかの実施形態では、感染因子は、クロストリジウム・ディフィシル、または緑膿菌のような有毒な表現型を発揮することができる他の細菌である。
本発明の他の局面は、細菌性病因からの発症または被害のリスクがある被験体への効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、患者中の細菌による細菌のPA-Iレクチン/アドヘシンの発現を阻害する方法を提供する。クロストリジウム・ディフィシルのような任意の公知の病原体または緑膿菌のような有毒な表現型を発揮することができる細菌が、さらにPA-Iレクチン/アドヘシンオルソログを発現可能かについて検討される。
本発明の他の局面は、細菌性病因からの発症または被害のリスクがある被験体へ、効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細菌のMvfRタンパク質の活性を調整する方法を提供する。
本発明の他の局面は、経上皮細胞電気抵抗を減少、または増加を阻害するのに効果的なオピオイド受容体アンタゴニストの量を被験体に投与することを含む、細菌毒素への上皮の透過性を減少させるまたは透過性の増加を予防する方法を提供する。
本発明の他の局面は、そのような治療を必要とする患者に効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することによって、敗血症を予防または治療する方法を提供する。
本発明の他の局面は、そのような治療を必要とする患者に効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することによって、炎症を予防または治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、患者は、内部損傷、手術、急性肺損傷または熱傷のような外傷からの炎症を有する。他の実施形態では、患者は、感染からの炎症を有する。いくつかの実施形態では、感染は細菌感染である。いくつかの実施形態では、感染因子は、クロストリジウム・ディフィシル、または緑膿菌のような有毒な表現型を発揮することができる他の細菌である。
本発明の他の局面は、オピオイド誘導性の副作用のない被験体に、効果的な量の末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、μ-オピオイド受容体依存的効果のない細胞バリア機能障害を緩和する方法を提供する。いくつかの実施形態では、末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストはN-メチルナルトレキソンである。さらに、いくつかの実施形態では、細胞バリア機能障害は、トロンビンおよび細菌性脂質多糖体から成るグループから選択された誘発剤によって誘導される。本発明のこの局面は、S1P3受容体のリン酸化が減少する方法のような、プロテインフォスファターゼが細胞で活性化される方法までも及ぶ。この方法のいくつかの実施形態では、受容体蛋白質チロシンホスファターゼμのようなチロシンホスファターゼタンパク質が活性化される。
さらに、本発明の他の局面は、オピオイド誘導性の副作用のない被験体に、効果的な量の末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、S1P3受容体のトランス活性化によって誘導された細胞バリア機能障害を緩和する方法である。いくつかの実施形態では、末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストは、N-メチルナルトレキソンである。
さらに本発明に記載の他の局面は、炎症、アテローム性動脈硬化、急性肺損傷、腸由来敗血症、熱傷、化学的接触損傷、新生児壊死性腸炎、重症の好中球減少、中毒性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、腸疾患、移植拒絶反応、嚢炎、ピッグベル、尿毒症心膜液貯留、眼ガラス体液漏出、黄斑変性、網膜機能不全、感染(例えばウイルス感染、細菌感染、日和見細菌感染、クロストリジウム・ディフィシレ感染、緑膿菌感染、シュードモナス属を介した眼科感染、シュードモナス属を介した耳科感染およびシュードモナス属を介した皮膚感染)から成るグループから選択された障害または障害の症状を治療、改善、または予防するための医薬品の調製において、オピオイド受容体アンタゴニストを使用する方法である。
インビボおよび分子的な方法の組合せを使用して、外科的ストレスは、緑膿菌の毒性機構を直接活性化する、宿主細胞由来の細菌のシグナリング化合物(宿主ストレス由来のBSC)の腸管腔の中への放出を引き起こすことが示された。そのような宿主由来のBSCの放出(それはモルヒネ、κおよびδオピオイド受容体アゴニスト、およびインターフェロンγ(IFN-γ)を含む)は、不活性入植菌の表現型から致死の病原体へ、緑膿菌または正常な腸内菌叢の他のメンバーの表現型を変えることが可能である。宿主ストレス由来のBSCへの緑膿菌の曝露は、PA-Iレクチン/アドヘシン(PA-I)(マウスの致死性腸由来敗血症に関与する重要な毒性遺伝子)の発現を誘導する。少なくともいくつかの実例では、PA-I発現の誘導は、毒性遺伝子MvfR発現の転写調節因子によって仲介される。PA-Iは、この生物の少なくとも2つの強力な細胞毒素のエキソトキシンAおよびエラスターゼに対する上皮透過性欠損を誘導し、上皮細胞バリア機能障害によって特徴づけられた、致死性腸由来敗血症および他の障害を引き起こす。このデーターは、手術に由来するストレスのようなストレスの間に、重要な仲介物質が腸管中へ宿主によって放出されたことを知覚することによって、日和見病原体が宿主ストレスおよび脆弱性を感知するというモデルのための証拠を提供する。宿主ストレス由来の化合物は、緑膿菌において増強された毒性を導く重大な遺伝子を直接活性化する。
生理的なストレスの間に増加した量で放出されるオピオイドは、ピオシアニン、生物膜、およびレクチン/アドヘシンPA-Iのような、緑膿菌におけるいくつかの菌体数感知機構依存的毒性因子の発現を直接誘導する。具体的には、U-50,488(ブレマゾシンすなわちtrans-3,4-ジクロロ-N-メチル-N[2-(1-ピロリジニル)シクロヘキシル]ベンゼンアセトアミドメタンスルフォナート、典型的なκ- オピオイド受容体アゴニスト)は、全体的な毒性転写調節因子MvfRを介して、緑膿菌におけるピオシアニン産生を誘導する。U-50,488は、通常はピオシアニンを産生する細胞密度より低い細胞密度でもピオシアニンを誘導する。これらの研究結果は、外因性か内因性かにかかわらず、緑膿菌における毒性反応を活性化することができる、宿主ストレス由来の細菌のシグナリング分子としてオピオイドが作動することを示す。本発明に記載の1つの局面は、少なくとも1つのオピエートを受け取る、または少なくとも1つの内因性オピオイド(例えばエンドルフィン)放出を経験する、しかしオピオイド誘導性副作用を経験しない被験体への、効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニスト投与を含む、バリア機能障害(例えば上皮細胞または内皮細胞)によって特徴づけられた障害を治療する方法を提供する。オピオイド誘導性の副作用は、オピオイド誘導性便秘、過敏性大腸症候群、術後腸閉塞または腸管機能不全、オピオイド誘導性悪心、オピオイド誘導性嘔吐、尿貯留、胃腸管排出の遅れ、胃腸管運動性の減少およびオピオイド誘導性免疫系抑制を含む。いくつかの実施形態では、患者は、癌のための治療または薬物依存のためのメタドン治療を受けていないだろう。いくつかの実施形態では、被験体は外因性オピオイドまたは内因性オピオイドを受け取っていない、または経験しないだろう。
一局面において、本発明は、障害を発症するリスクがある被験体へ、予防に効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細胞バリア機能障害(例えば上皮細胞または内皮細胞)によって特徴づけられた障害を発症するリスクを減少させる方法を、このように提供する。本発明の他の局面は、化合物が障害の少なくとも1つの症状を減少させるのに効果的な量で投与されるように、必要性のある被験体へμ-オピオイド受容体アンタゴニスト投与することを含む、細胞バリア障害(例えば上皮細胞または内皮細胞バリア障害)と関連した症状を減少させる方法へと向けられる。本発明の他の局面は、細菌性病因からの発症または被害のリスクがある被験体へ、効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細菌のPA-Iレクチン/アドヘシンの発現を阻害する方法である。この方法のいくつかの実施形態では、細菌のPA-Iレクチン/アドヘシンは、哺乳類の腸に存在する細菌で見出される。この局面のいくつかの実施形態において、細菌のPA-Iレクチン/アドヘシンは、シュードモナス属菌PA-Iレクチン/アドヘシンである。重要なシュードモナス属菌は緑膿菌である。本発明の他の局面は、細菌性病因からの発症または被害のリスクがある被験体へ、効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細菌のMvfRタンパク質の活性を調整する方法へ向けられる。いくつかの実施形態では、細菌のMvfRタンパク質は、哺乳類の腸に存在する細菌で見出される。さらに、いくつかの実施形態では、細菌のMvfRタンパク質は、シュードモナス属菌MvfRタンパク質、好ましくは緑膿菌MvfRタンパク質である。他の列挙された局面では、本発明は、経上皮細胞電気抵抗(すなわち上皮の経細胞電気抵抗)を減少させる、または増加を阻害するのに効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを被験体へ投与することを含む、細菌毒素への上皮の透過性を減少させる、または透過性の増加を予防する方法を提供する。本発明のこの局面の文脈における上皮は、少なくとも2つの上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、上皮細胞は腸上皮細胞である。さらに、緑膿菌またはクロストリジウム・ディフィシルのような微生物病原体を含む被験体が、本発明のこの局面で検討される。
本発明の局面のすべてにおいて、当技術分野で公知であるオピオイド受容体アンタゴニストを投与する任意の方法が検討される、および特に、吸入およびエアロゾルを介するものを含む鼻孔吸入と同様に、非経口、経口、皮下、経皮、皮下埋め込み、筋肉内、静脈内、鞘内、眼内、ガラス体内、眼科的、脊髄内、滑液内、局所、直腸、経皮を含む経上皮、頬、舌下、筋肉内、腔内、および耳経路による送達である。緑膿菌のような微生物病原体は腸管に生息するだけではなく、これらの病原菌は、被験体(例えばヒト)の眼および耳および皮膚への感染が可能である。したがって本発明は、直接的な経路によって(例えば、局所送達、皮膚送達、ガラス体内送達および脳室内送達によって)、アンタゴニストの局所化された治療上有益な濃度を達成するためにオピオイド受容体アンタゴニストを投与することを包含する。さらに本発明は、治療上有用な全身性のレベルのアンタゴニストを達成するのに十分なレベルで、ガラス体内、脳室内、および局所的(例えば、眼科的に、耳科的に、皮膚で)経路を含む、従来の全身的経路によってオピオイド受容体アンタゴニストを投与することによって、緑膿菌のような微生物病原体によって少なくとも一部分は引き起こされた、シュードモナス属を介した眼科障害、シュードモナス属を介した耳科障害、またはシュードモナス属を介した皮膚障害を含む任意の障害の治療を包含する。
本発明の他の特徴および利点は、図面および例を含む以下の詳細な説明への参照によって一層よく理解されるだろう。
発明を実施するための最良の形態
様々な炎症性障害、腫瘍転移、ならびに様々な他の疾患および障害は、増加した細胞バリア透過性、または選択的透過性の消失、および細胞、細胞内含有量、液体またはタンパク質のバリアを越えた同時浸出として示された細胞バリア機能障害によって特徴づけられる。例えば、内皮細胞バリア機能障害は、血管透過性の増加を導き、炎症過程に特徴的なタンパク質および液体の管外溢出につながる。McVerry et al., Cell. Signal. 17:131-139 (2005)。同様に、細胞バリア機能障害は腫瘍細胞転移に対して寛容になることが可能である。例えば、哺乳類の腸の微生物による病因の情況で生じる上皮細胞バリア機能障害は、腸由来敗血症を含む様々な病気へと導くことが可能である。微生物による病因はさらに、病原菌(例えばクロストリジウム・ディフィシル)による感染、または生物と関連した正常細菌叢(例えば腸内菌叢)の通常は良性のメンバーの表現型の病原性または有毒状態(例えば緑膿菌)へのシフトによる結果でありえる。これらの説明例を除いて、脊椎動物(例えばヒトを含む哺乳類)のような多細胞生物は、一般に組織、器官および臓器系のための不連続の間隔をもたらす細胞レベル以上の区画化を示す。この必要な区画化へ主に寄与するのは、数種類の細胞バリアである。内皮細胞および上皮細胞バリアの面から例示されるのは、ほとんどの組織、器官および臓器系、例えば脳(例えば脳の内膜/血液脳関門)、脾臓、肝臓、眼、肺、血管(血液およびリンパ)、腎臓、膀胱、尿管、尿道、小腸および大腸を含む消化管、肺および同種のものと関連した細胞バリアがある。本発明は、疾患または障害がある被験体または患者の生活の質を低下させる、または健康に有害な影響を与える疾患または障害と関連した細胞バリア機能障害を、予防、減少、または除去する方法を提供する。
宿主ストレスシグナリング化合物、および感染性細菌のような病原性微生物上の受容体だけでなく、宿主細胞(例えば上皮および内皮細胞)上の受容体のような、それらが結合する膜受容体の同定は、その最も直接的な点で、感染を含む様々な細胞バリア疾患および障害における、防止または治療を可能にする治療標的の発見を導くだろう。その後更に、保存された受容体(例えば他の微生物種へ共通の細菌の受容体)の同定は、受容体アンタゴニストまたはデコイの開発へと導くだろう。受容細胞(例えばコロニーを形成する病原菌)を宿主ストレス活性化因子に対して無感覚にするようなアプローチは、細胞バリア機能障害によって特徴づけられる様々な疾患および障害のための効果的かつコスト効率の良い治療を提供する潜在能力がある。
「異常状態」は、細胞バリア機能障害によって特徴づけられる、哺乳類の疾患、哺乳類の障害、および哺乳類の健康の任意の異常状態を含むものと、広く定義される。細胞バリア機能障害を示す、またはそのような機能障害を発症するリスクにある典型的な細胞は、内皮細胞および上皮細胞を含んでいる。異常状態はヒト、ヒト以外の哺乳類、または任意の哺乳類で見出されてもよい。
「熱傷」は、(i)熱、例えば直火、蒸気、熱い液体、および熱面の形式への組織の露出に由来する哺乳類組織に対する損傷を意味する。
「化学的な接触損傷」は、化学薬品との直接的な接触によって引き起こされた損傷を指し、化学的熱傷または他の損傷を含むことができる。
「重症の好中球減少」には、循環好中球の数の著しい減少の、通常の習慣的な意味が与えられる。
「投与」には、当技術分野において認識される任意の適切な手段によって、必要とする生物への治療上の送達の、通常の習慣的な意味が与えられる。投与の典型的な形式は、鼻孔吸入(例えば霧状噴霧)と同様に、非経口、経口、皮下、経皮、皮下埋め込み、筋肉内、静脈内、鞘内、眼内、ガラス体内、眼科的、脊髄内、局所的、直腸、経皮、舌下腺、筋肉内、腔内、および耳経路による送達を含む。送達のメカニズムは、カニューレ挿入と同様に、直接的な穿刺または注入、または眼、耳、鼻、口、肛門もしくは尿道口へのゲルもしくは液体の適用であってもよい。
「有効量」は、用量を受け取る生物に対する有益な効果を提供し、用量を投与する目的、用量を受け取る生物の大きさおよび状態、および有効用量の測定へ関連するものとして当技術分野において認識された他の変数に依存して変化してもよい、物質の量である。有効量を決定する過程は、当技術分野における技能中にあるルーチンの最適化手順を含む。
「動物」には、非植物および非原生生物生物の、従来の意味が与えられる。好ましい動物はヒトのような哺乳類である。
本開示の文脈では、「必要」は、その状態によって特徴づけられた生物に対しての有効用量の投与から利益を得ることができる、生物の器官、組織または細胞の状態である。例えば、腸由来敗血症を発症またはその症状を提示するリスクがあるヒトは、本発明によれば、医薬組成物のような産物の有効用量を必要とする生物である。
「平均分子量」には、平均の測定の正確さにかかわらず、組成物の成分(例えば分子)の分子量の相加平均の、通常の習慣的な意味が与えられる。例えば、それらの分子量の相加平均がある程度のレベルの正確さで3.5のキロダルトンであるならば、3.5キロダルトンの平均分子量があるポリエチレングリコール(またはPEG)は、様々な分子量のPEG分子を含んでもよく、当技術分野において理解されるように、それらは相加平均の推定を反映してもよい。同様に、PEG 15-20は、上での言及に従う相加平均により、その分子量が相加平均15〜20キロダルトンをもたらすPEGを意味する。これらのPEG分子は単純なPEGポリマーを含むが、限定されない。例えば、複数の比較的より小さなPEG分子(例えば7,000から10,000のダルトン)は、より高平均分子量(例えば15,000から20,000のダルトン)を有する単一分子へと任意でフェノールのようなリンカー分子により結合されてもよい。
「PA-I」、または、「PA-Iレクチン/アドヘシン」、または「PA-IL」発現は、PA-Iレクチン/アドヘシンに特徴的な活性の産生または生成を意味する。典型的には、PA-Iレクチン/アドヘシンの発現は、PA-Iレクチン/アドヘシンに特徴的な少なくとも1つの活性を有するPA-Iレクチン/アドヘシンポリペプチドをもたらすような、PA-Iレクチン/アドヘシンをコードするmRNAの翻訳を含む。任意で、PA-Iレクチン/アドヘシンは、前述のmRNAをもたらすような、PA-Iレクチン/コードする(アドヘシン)DNAの転写をさらに含む。
「腸内病原菌」は、全体または部分で、ヒトのような動物の腸由来敗血症を引き起こすことができる微生物病原体を意味する。当技術分野において公知である腸内病原菌は、シュードモナス属菌(例えば緑膿菌)のようなグラム陰性杆菌を含み、この定義によって包含される。
「病原性の菌体数」は、当技術分野において公知であるように、生物(例えば腸内病原菌)が閾値濃度または閾値数で存在する、菌体数感知シグナルまたは伝達を開始または維持するのに、十分な数の病原性生物(例えば緑膿菌)の集合または群叢を意味する。
「経細胞の電気抵抗」(またはTER)は、このフレーズが当技術分野において得た意味が与えられ、それは規定の型の細胞(例えば上皮または内皮細胞)を横切った電気抵抗の測定を指し、そのような細胞間で密着結合の状態を評価するのに包括的に有用である。関連する用語の「TEER」は、本明細書において「経上皮細胞電気抵抗」または「経内皮細胞電気抵抗」を指すために使用され、特定の使用は文脈から明らかになる。
「医薬組成物」は、ヒト患者のような生きている動物に対する、治療上の投与のために適切な化合物の製剤を意味する。本発明に記載の好ましい医薬組成物は、同時係争中の米国特許公報20040266806番に記述され、それらの内容はそれらの全体の参照により本明細書において組み入れられる。本発明の医薬組成物は、電解質、デキストランでコートされたL-グルタミン、デキストランでコートされたイヌリン、ラクツラーゼ(lactulase)、Dガラクトース、N-アセチルD-ガラクトサミンおよび5〜20%のPEG(15,000-20,000)を含む、粘性、電解質組成および浸透圧でバランスのとれた溶液を含んてもよい。化合物は、好ましくは選択された投与経路に基づいて選択された薬学的担体、および例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980)に記述されるような標準の薬学的手段と組み合わせ、本開示はそれら全体で参照によりここで本明細書において組み入れられる。
「アジュバント」、「担体」または「希釈剤」は各々、それらの用語が当技術分野において得られている意味が与えられる。アジュバントは、同時投与された免疫原の免疫原性を延長する役目をする、1つまたは複数の物質である。担体は、運搬されている物質の移動のような操作を促進する、1つまたは複数の物質である。希釈剤は、希釈剤へ曝露された規定の物質の濃度を減少または希釈する、1つまたは複数の物質である。
「アルキル」は、飽和されており、直鎖、分岐鎖、または環状鎖であってもよく、および鎖中に1〜約10の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、ならびにその中の鎖のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーションも同様に指す。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルおよびデシルを含む。
「低級アルキル」は、1〜約6の炭素原子を有するアルキル基を指す。
「アルケニル」は、少なくとも1つの炭素炭素二重結合を含み、鎖中に2〜約10の炭素原子まで有する脂肪族炭化水素基、ならびにその中の鎖のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーションも同様に指す。典型的なアルケニル基は、ビニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、ヘプテニル基、オクテニル基、ノネニル基およびデケニル基を含む。
「アルキニル」は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含み、鎖中に2〜約10の炭素原子を有する脂肪族炭化水素基、ならびにその中の鎖のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーションも同様に指す。典型的なアルキニル基は、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、オクチニル基、ノニニル基およびデキニル基を含んでいる。
「アルキレン」は、1〜約6の炭素原子を有する二価脂肪族炭化水素基、ならびにその中の鎖のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーションを指す。アルキレン基は、直鎖、は分岐鎖、または環状鎖であってもよい。任意で、以前に記述されたように、アルキレン基中に1つまたは複数の酸素、硫黄または任意で置換チッ素原子が挿入されてもよく、ここで窒素置換基はアルキル基である。
「アルケニレン」は、少なくとも1つの炭素炭素二重結合を含むアルキレン基を指す。典型的なアルケニレン基は、エテニレン(CH=CH -)およびプロペニレン(CH=CHCH2 -)を含む。
「シクロアルキル」は、約3〜約10の炭素を有する任意の安定した単環式または二環式の環、ならびにその中の環のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーションを指す。任意で、シクロアルキル基は1つまたは複数のシクロアルキル基置換基と置換されてもよい。典型的なシクロアルキル基は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基およびシクロオクチル基を含む。
「シクロアルキルに置換されたアルキル」は、シクロアルキル基、好ましくはC3-C8シクロアルキル基と、炭素鎖末端において置換された、直鎖アルキル基、好ましくは低級アルキル基を指す。典型的なシクロアルキルに置換されたアルキル基は、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロペンチルエチル、シクロペンチルプロピル、シクロプロピルメチルおよび同種のものを含む。
「シクロアルケニル」は、約4〜約10の炭素を有するオレフィン性不飽和脂環式基、ならびにその中の環のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーションを指す。
「アルコキシ」は、アルキル置換ヒドロキシル(アルキル-O)基を指し、ここでアルキルは以前に記述されたものである。典型的なアルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシおよびヘプタオキシを含む。
「アルコキシ-アルキル」はジ-アルキルエーテル(アルキル-O-アルキル)基を指し、ここでアルキルは以前に記述されたものである。
「アシル」はアルキル-CO基を意味し、ここでアルキルは以前に記述されたものである。典型的なアシル基は、アセチル、プロパノイル、2-メチルプロパノイル、ブタノイルおよびパルミトイルを含む。
「アリール」は、約6〜約10の炭素を含む炭素環式芳香族基、ならびにその中の環のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーションを指す。任意で、アリール基は、1つまたは2つまたは複数のアリール基置換基と置換されてもよい。典型的なアリール基は、フェニルおよびナフチルを含む。
「アリール置換アルキル」は、任意で置換アリール基、好ましくは任意で置換フェニル環と、炭素鎖末端において置換された直鎖状アルキル基、好ましくは低級アルキル基を指す。典型的なアリール置換アルキル基は、例えば、フェニルメチル、フェニルエチルおよび3-(4-メチルフェニル)プロピルを含む。
「ヘテロ環式」は、約4〜約10員環を含む、単環式または多環式環系炭素環式基またはラジカル、およびその中の環のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーションを指し、ここで1つまたは複数の環のメンバーは、炭素以外の元素、例えば窒素、酸素、硫黄である。ヘテロ環基は、芳香族または非芳香族であってもよい。典型的なヘテロ環基は、例えば、ピロール基およびピペリジン基を含む。
「ハロ」はフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを指す。
「アヘンアルカロイド誘導体」は、アヘンアルカロイドの合成誘導体または半合成誘導体またはアナログである、μオピオイド受容体アンタゴニスト(例えば末梢アンタゴニスト)を指す。
「アゴニスト活性が実質的にない」は、アヘンアルカロイド誘導体に関して、1μMの濃度においては、受容体の最大の測定生理反応(例えば、電気的に刺激されたモルモット回腸)が、モルヒネと比較して約60%またはそれ以下であることを意味する。
「HMW PEG様化合物」は、3.5のキロダルトン(kD)以上の平均分子量を有するものとして定義される、比較的高分子量にPEG化合物を指す。好ましくは、HMW PEGは5キロダルトン以上の平均分子量を有し、および特定の実施形態では、HMW PEGは少なくとも8キロダルトン、12キロダルトン以上、少なくとも15キロダルトン、および15〜20のキロダルトンの平均分子量を有する。さらに、「HMW PEG様化合物」は、そのような誘導体の各々が少なくとも1つの追加の官能基を含むHMW PEGである、HMW PEG誘導体を包含する。好ましいHMW PEG誘導体は、カチオン性ポリマーである。典型的な官能基は、アルコキシ系のうちのいずれか、好ましくはC1-C10、アリールオキシ系のうちのいずれか、フェニル基および置換フェニル基を含む。そのような官能基は、末端または中央のいずれかを含むどの場所でも、HMW PEG分子と結合されてもよく；さらに、小さなPEG分子またはその誘導体を、単一のHMW PEG様化合物へと結合する役目をする官能基、例えばフェニルおよびその置換基を含む。さらに、追加官能基があるHMW PEG様分子は、1つのそのような基または1つ以上のそのような基を有してもよく；各々の分子は、さらに追加の官能基の混合物をしていてもよく、提供されたそのような分子は、その送達の間、または上皮細胞の疾患、障害または状態を治療、改善または予防中に、治療薬の少なくとも1つを安定化するのに有用である。
「培地(複数)」および「培地」は、出願の全体にわたって、細胞培養培地および細胞培養培地(複数)を指すために使用される。名詞の単数または複数は、各々の使用の文脈から明らかになる。
用語「末梢」オピオイド受容体アンタゴニストは、主として生理系および中枢神経系外部の構成要素に作用する(すなわち、アンタゴニストは容易には血液脳関門を通過しない)、μ-オピオイド受容体アンタゴニストを含むオピオイド受容体アンタゴニストを示す。いくつかの実施形態では、本発明の方法に使用した末梢オピオイド受容体アンタゴニストは、胃腸組織について高レベルの活性を示すが、中枢神経系(CNS)活性の減少、および好ましくは実質的に中枢神経系(CNS)活性が無いことを示す。用語「CNSの活性が実質的にない」は、本明細書において使用されるように、CNSの外部で示された末梢オピオイド受容体アンタゴニストの薬理活性の20%未満が、CNSの内部で示されることを意味する。好ましい実施形態では、本発明の方法で使用した末梢オピオイド受容体アンタゴニストは、CNSにおいて15%未満の薬理活性を示し、約10%未満がより好ましい。さらにより好ましい実施形態では、本発明の方法で使用した末梢オピオイド受容体アンタゴニストは、CNSにおいて5%未満の薬理活性を示し、約0%(すなわち、CNS活性はない)もより好ましい。本発明の好ましい末梢オピオイド受容体アンタゴニストはR-メチルナルトレキソンのようなノロキシモルフォンの四級誘導体である。
一般論として、微生物病原体が、生理的にストレスを受けた宿主の腸管内部から致死性敗血症症候群を引き起こす過程に対する独自の洞察を提供する、マウスの致死の敗血症のモデルが開発されている。生理的な3つの「打撃」例えば、外科的ストレス(30%の肝臓切除術)、飢餓(水のみ48時間)および遠位の腸管(盲腸)へ緑膿菌の導入は、死をもたらす。このモデルは100%の死亡をもたらすが、3つの因子のうちのいずれか1つの除去は、完全な生存をもたらす。単一の毒性決定因子PA-Iが緑膿菌で同定され、それは生理的にストレスを受けた宿主の腸管に特有の局所的に放出された化合物に反応して、インビボで発現されるものである。PA-Iは、マウスにおけるような致死性腸由来敗血症で役割を果たすことが実験によって実証され、この実験では、エキソトキシンAを分泌できるPA-Iを欠いた緑膿菌の変異株は、培養上皮細胞のバリア機能に対する効果は著しく弱まっており、致死性腸由来敗血症マウスモデルで完全に非病原性であった。PA-Iレクチン/アドヘシンは、エキソトキシンAおよびエラスターゼのような緑膿菌の強力かつ致死性の細胞毒素に対する透過性欠損を生成することによって、この生物の致死効果において重要な役割を果たす。腸の緑膿菌の致死効果は、完全に腸管外伝搬(移動)に非依存的に起こるように見える。意外にも、このモデルにおける緑膿菌の等しい用量の全身注射(静脈内、腹腔内)は、死亡および全身性炎症をもたらさない。以上をまとめて、このデーターは、外科的ストレスの間に生成された宿主ストレス由来の細菌のシグナリング化合物(BSC)で毒性が局所的に活性化される微生物病原体によって、敗血症を生成することができるという強い証拠を提供する。
緑膿菌が、血液感染性の場合よりも上皮表面で存在する場合のほうが、はるかにより有毒でより致死性であるという観察は、敗血症の肺モデルによって支持される。緑膿菌(PA103)の高度に細胞毒性のある株の静脈注射は、ウサギにおいて全身性のサイトカイン放出および死亡をもたらさなかったが、等しい用量(およそ108 cfu/ml)の肺点滴は、有意な全身性のサイトカイン放出(TNFα、IL-8)および100%の死亡をもたらした。大規模な数の研究は、今や、肺点滴後に敗血症を引き起こす緑膿菌の最有毒および最高致死性の株は、最も侵襲性 (移動/伝播)の高い表現型を示さず、むしろ局所的に放出された細胞毒素で細胞構造の全体性および上皮の選択透過性を最も破壊する株であることを実証した。これらの観察は、上皮細胞の存在下で培養された場合、緑膿菌の細胞外毒性因子(すなわちエラスターゼ、アルカリ性プロテアーゼ)が25倍増加するという研究結果と結び付けられて、この病原菌の致死性は上皮自体との相互作用および活性化により支配されることを示唆する。実験データーは、ストレス(例えば、手術、低酸素、熱ショック)に曝露された腸上皮の可溶性要素および接触を介した要素の両方は、PA-Iを発現する緑膿菌の能力を促進し、腸上皮細胞および肺上皮細胞の両方の細胞構造の全体性において深刻な破壊を引き起こすことができることを示す。
ストレスを受けた宿主の腸管内部から緑膿菌が死亡を誘導する主要な作用機序は、致死性細胞毒素のエキソトキシンAおよびエラスターゼに対するPA-I誘導性の透過性欠損を経由する。外科的にストレスを受けて擬似手術をされた対照マウスの盲腸へ、エキソトキシンAまたはエラスターゼのいずれかと精製されたPA-Iの組合せの点滴は、有意な死亡数を誘導した。しかし、いずれか化合物の単独の注入は効果がなかった。PA-Iの臨床的な役割は、起源が未同定の重症敗血症をともなう患者の糞便試料をスクリーニングすることによって調べられた。多数の研究室株および環境株の中での場合と同様に、重症患者の糞便から単離された緑膿菌の株の中で、PA-I遺伝子型は非常に優勢であることが見出された。今や腸管環境が、活性のある感染の間にのみ存在するまだ知られていない「合図」によって、高度に致死の病原菌(すなわちコレラ菌(Vibrio cholera))の重要な毒性決定因子が活性化される独自のニッチであるという説得力のある証拠がある。
PA-Iをコードする遺伝子(lecA遺伝子)は、宿主ストレス由来のBSCに反応した緑膿菌での全体の毒性遺伝子発現を検討するのに理想的な生物学的「読み出し」およびレポーター遺伝子である。
細菌のバイオセンサーを活性化する正確な宿主細胞要素は知られていない。PA-Iの発現はQSおよびRpoSの両方に依存的であるので、GFP-PA-Iレポーター株(本明細書において記述される)は、ストレスの間に放出される、膜センサーを活性化してPA-I発現を導く、宿主細胞由来の細菌のシグナリング化合物のスクリーニングする独自の機会を提供する。
内因性のモルヒネアルカロイドを含む様々なオピオイド受容体アゴニストは、激しいストレスの間に保持された濃度で放出され、維持される。オピオイドは非常に保存された化合物であり、緑膿菌を含む様々な細菌および菌類はモルヒネを合成および代謝する。同様に、本明細書において示されるように、IFN-γのような免疫系の要素は、さらに強力な宿主ストレス由来のBSCとして役立つことができる。緑膿菌は、IFN-γの存在を感知することができ、2つの菌体数感知依存的毒性因子のPA-Iおよびピオシアニンを発現することによって反応する。緑膿菌の立場から見ると、宿主の免疫活性化、特にIFN-γ(その機能は除菌へ向けられる)を感知し反応する能力は、この生物に宿主の免疫活性化に対する対抗策を提供する。特にインターフェロン-γは緑膿菌中の外膜蛋白のOprFに結合し、菌体数感知依存的毒性決定因子のPA-Iレクチンの発現をもたらすことが以下で示される。IFN-γは大腸菌膜にも結合した。これらの観察は、原核生物が真核生物宿主中の免疫活性化によって直接シグナリングされるメカニズムの詳細を提供する。
オピオイドへの緑膿菌の曝露は、緑膿菌でいくつかの菌体数感知依存的毒性因子の発現を導く。QSが緑膿菌の何百もの毒性遺伝子の発現を制御することから、QS系がオピオイドによって活性化されるかもしれないことは重要な発見である(M. Schuster, M. L. Urbanowski and E. P. Greenberg, Proc Natl Acad Sci U S A 101, 15833 (2004))。
本明細書において開示されたデーターは、MvfRがU-50,488に反応してPCNを産生するために必要であるという証拠を提供する。さらに、本研究からのデーターは、アントラニル酸メチルが、PCN産生に対するU-50,488を介した効果を弱めたので、U-50,488に反応したPCN産生がシュードモナス属キノロンシグナル(PQS)の合成も必要とすることを示唆する。C4-HSLがPCNを産生するために完全なMvfRも必要とすることは、複数のmvfR遺伝子を有する株における非常にアップレギュレートされたPCN産生の発見と結び付けられ、菌体数感知活性化がコアのQSの転写調節因子(すなわちRhlR、LasR)へのQSシグナリング分子の結合に依存するだけではなく、近位転写調節因子を活性化するQSシグナルも有していることと一致している。
本明細書において開示されたデーターは、緑膿菌の特定の毒性表現型を誘導する能力という点で、オピオイド化合物が異なってもよいことを立証する。緑膿菌の毒性の状態に影響を及ぼすことができる複数の宿主ストレス由来の細菌のシグナリング化合物があることが検討される。ノルエピネフリンは、さらに緑膿菌(J. Alverdy, et al., Ann Surg 232, 480 (2000))でQS依存的毒性因子のPA-ILに影響することが可能であり、低酸素腸上皮細胞によって培地へ放出された溶解性化合物も、PA-ILの発現を誘導する。これらの開示と一致している開示は、ノルエピネフリンが大腸菌 のQS回路に直接影響するものである(V. Sperandio, A. G. Torres, B. Jarvis, J. P. Nataro and J. B. Kaper, Proc Natl Acad Sci U S A 100, 8951 (2003))。
本発明は、オピオイド受容体アゴニスト、モルヒネ、およびインターフェロンγのような調節因子を含む、1つまたは複数のBSCによって誘導されたシグナリングの調節因子のためのスクリーニング方法を提供する。これらの治療薬は、それらを必要とするヒト患者のような生物に送達される。投与レベルおよび送達経路およびスケジュールは、ルーチン手順を使用して、当業者によって容易に同定および適応され、状況に依存して変化するだろう。
本発明に記載の治療薬はさらにHMWのPEG様化合物を含んでもよく、状態または障害を治療するのに適切である任意の手段によって投与されてもよい。化合物は、錠剤、カプセル剤、顆粒、粉末、またはシロップ剤を含む液体製剤ののような形式で経口的に；舌下、頬、または経皮的な送達によって;非経口、皮下、経皮膚、皮下埋め込み、静脈内、筋肉内、鞘内、眼内、眼科的、脊髄内、局所的、または胸骨内(例えば、滅菌注射可能な水溶液または非水溶液または懸濁液として)の注入または点滴によって；経口、経鼻的に吸入スプレーのようななもので；耳、直腸で坐剤のような形式で；経膣または尿道に座剤または点滴経由で、例えば、カニューレ挿入またはリポソームおよび腔内の送達によって送達されてもよい。無毒であり薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む用量単位製剤が投与されてもよい。化合物は即時放出または持続放出のために適切な形式で投与されてもよい。即時放出または持続放出は当技術分野において公知である適切な医薬組成物により達成されてもよい。
経口投与のための典型的な組成物は、例えば、インパーティングバルクのための微結晶性セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、粘性促進剤としてメチルセルロース、甘味料または香料、当技術分野において公知のそれらのようなものを含んでもよい懸濁液；および例えば、微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび/またはラクトースおよび/または、他の添加剤、結合剤、増量剤、錠剤分解物質、希釈剤および滑沢剤、当技術分野において公知のそれらのようなものを含んでもよい即時放出錠剤を含む。本発明の化合物は、舌下および/または頬の投与によって、例えば成型錠剤、圧縮錠剤、または凍結乾燥錠剤で経口的に送達されてもよい。典型的な組成物は、マンニトール、ラクトース、ショ糖、および/またはシクロデキストリンのような速溶性の希釈剤を含んでもよい。さらにそのような製剤に含まれるのは、比較的高分子量のセルロース(AVICEL(登録商標))またはポリエチレングリコール(PEG; GoLytely(登録商標)、3.34 kD)のような添加剤；ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、カルボキシルメチルセルロースナトリウム(SCMC)、および/または無水マレイン酸共重合体(例えばGANTREZ(登録商標))のような粘膜の接着を援助する賦形剤かもしれない。滑沢剤、流動促進剤、着香料および着色剤および安定剤も製作および使用の容易さのための加えられてもよい。
鼻エアロゾルまたは吸入投与のための典型的な組成物は、例えば、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、吸収および/または生体利用率を促進する吸収促進剤、および/または、他の可溶化剤または分散剤、当技術分野において公知のそれらのようなものを含んでもよい溶液を含む。
腸の投与のための典型的な組成物は、例えば、マンニトール、1,3-ブタンジオール、水、リンガー液、等張食塩水、または合成モノグリセリドまたはジグリセリドおよびオレイン酸を含む脂肪酸を含む、他の適切な分散剤、湿潤剤および懸濁化剤のような、適切な無毒の希釈剤または溶媒を含んでもよい溶液または懸濁液を含む。例えば、ココアバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコール(例えばGoLytely(登録商標))のような適切な刺激のない添加剤を含んでもよい坐剤が、この文脈で検討される。
本発明の効果的な量の化合物は、当技術分野において通常の技能の中の1つによって決定されてもよい。任意の特定の被験体のための特異的な用量レベルおよび投薬の頻度は変化し、用いられた特異的な化合物の活性、その化合物の代謝的安定性および活性の長さ、被験体の種、年齢、体重、公衆衛生、性別および食餌、投与の様式および時間、排泄率、薬剤の組合せ、および特定の状態の重症度を含む様々な因子に依存するだろう。治療のための好ましい被験体は、動物、最も好ましくはヒトのような哺乳類種、ならびにイヌ、ネコ、ウマおよび同種のもののような家庭動物、腸由来敗血症のような微生物を介した上皮の状態または疾患を発症するリスクにあるもの、または細胞バリア機能障害によって特徴づけられた炎症性障害(例えば急性肺損傷)を発症するリスクにあるものを含む。一般に、本発明の末梢オピオイド受容体アンタゴニストは、効果的な量、例えば10-6M〜10-9Mで投与される。患者の薬剤血漿中濃度は、当業者に公知のルーチンHPLC法を使用して測定されてもよい。
本発明は、細胞バリア機能障害を特徴的に示す疾患または障害と関連した症状を治療、予防、または緩和するために、オピオイド受容体アンタゴニストを投与する方法を提供する。オピオイド受容体アンタゴニストはμオピオイドのアンタゴニスト、またはこのアンタゴニストはκオピオイドのアンタゴニストであってもよい。本発明は、μアンタゴニストの組合せ、κアンタゴニストの組合せ、ならびに少なくとも1つのμアンタゴニストおよび少なくとも1つのκアンタゴニストの組合せを含む、1つ以上のオピオイドアンタゴニストの投与も包含し；本発明は、さらに少なくとも1つの中枢に作用するオピオイド受容体アンタゴニストおよび少なくとも1つの末梢に限定されたオピオイド受容体アンタゴニストの組合せの投与を包含する。例えば、メチルナルトレキソンおよびアルビモパンまたはその代謝物質ADL 08-0011のいずれかの組合せ、またはナルトレキソンおよびメチルナルトレキソンの組合せが、投与されてもよい。
実施例、特に実施例26で以下に記述されるように、モルヒネおよびDAMGOの両方が、肺の微小血管内皮細胞バリア破壊のような細胞バリア機能障害を誘導することも明らかになった。血液と組織の間の伝達は、細胞を経たまたは細胞間のいずれかでの方向性のある輸送によって、分子の送達および内皮バリアを超えて循環する物質を経て起こる。特定の炎症性の症候群(例えば急性肺損傷および敗血症)は、バリア機能を減少させる。そのようなバリア破壊は、血管透過性の増加および臓器機能不全をもたらす。本発明に従う末梢オピオイド受容体アンタゴニストが、内皮細胞バリア機能を促進したことを立証するデーターが以下で開示される。具体的には、細胞バリア破壊は末梢オピオイド受容体アンタゴニストによる前処理によって阻止される。例えば、末梢オピオイド受容体アンタゴニスト(例えばMNTX)による前処理は、μオピオイド受容体依存的効果またはμオピオイド受容体非依存的効果のいずれかから生じる細胞バリア機能障害から保護する。もちろん、末梢オピオイド受容体アンタゴニストは、μオピオイド受容体依存的効果から生じる細胞バリア機能障害(例えば、μオピオイド受容体アゴニスト(例えばモルヒネ)結合の効果)、およびμオピオイド受容体非依存的効果から生じる細胞バリア機能障害(例えば、内皮細胞などでのトロンビン依存的細胞バリア機能障害および/またはリポ多糖(LPS)依存的細胞バリア機能障害または破壊のような、μオピオイド受容体からの寄与なしで実現された効果)、の両方から保護するのにも有用である。したがって、μオピオイド受容体アンタゴニスト(例えば末梢μオピオイド受容体アンタゴニスト)は、炎症性症候群(例えば急性肺損傷、アテローム性動脈硬化、および細胞バリア機能障害によって特徴づけられた他の疾患)の予防または治療において有用である。したがって、本発明の方法は、バリア機能障害または破壊(例えばアテローム性動脈硬化、急性肺損傷、微生物感染、および同種のもの)によって特徴づけられる症候群の治療において治療的価値を有する。したがって、本発明が、細胞へ効果的な量の細胞バリア促進保護剤(例えばMNTX)を投与することによって、細胞バリア破壊を減少する方法を含むことが検討される。
本発明の方法は、オピオイド受容体アゴニストによる治療を受けている患者の治療も包含するが、いくつかの実施形態では、患者は任意のオピオイド受容体アゴニストの常習的な受容者ではない。オピオイド受容体アゴニストは、外因的または内因的に供給されてもよく、アゴニストは天然に存在するオピオイドまたは天然に存在しない合成化合物であってもよい。しかしオピオイド受容体アゴニストによる治療を受けている患者を治療する方法の1つの例として、癌患者は、その疾患の進行期に関連した痛みを制御するためにモルヒネをしばしば受け取り、この情況においてμオピオイド受容体アンタゴニストが痛みの制御を弱めずに、細胞バリア機能障害に対する有益な効果を提供することで有用な一方、これらのμオピオイド受容体アンタゴニストは、はるかに早期の段階で癌を治療することでも用途が見出される。特に、疼痛管理にモルヒネのようなμオピオイド受容体アゴニストの必要性がない場合には、μオピオイド受容体アンタゴニストは、前転移期腫瘍を有する癌患者に、例えば周術期に、有益に投与される。多くの癌の進行におけるこの比較的早期の段階で、μオピオイド受容体アンタゴニストは、細胞バリア機能障害を活用する転移過程(すなわち腫瘍細胞の播種)に対する耐性を促進して、正常細胞バリア機能の治療援助を提供する。結果的に、μオピオイド受容体アンタゴニストは、前転移癌患者集団(典型的にはモルヒネのようなオピオイド受容体アゴニストの常習的な受容者のない集団)において特定の適用を有する。本発明のこの局面の特定の実施形態では、μオピオイド受容体アンタゴニスト、例えばMNTXのような末梢μオピオイド受容体アンタゴニストは、癌手術の間の手術時または周術期に投与される。手術可能な任意の型の癌が、μオピオイド受容体アンタゴニストの周術期投与が可能になることが期待される。理論によって結び付けられていないのだが、外科的処置は、癌細胞の移動または転移を促進する細胞バリア機能障害を導く様式で、様々な組織および器官および臓器系(例えば肺、腸、血管、眼)の内皮細胞および/または上皮細胞のような細胞にシグナルを伝える宿主ストレスを生成する。この結び付けられていない理論を支持する間接的な証拠は、手術を受ける乳癌患者の後向き研究において利用可能である。「外科的ストレス」の調査は、傍脊椎麻酔(レボブピバカイン)に対する対外科患者のための術後のモルヒネ鎮痛作用の比較という形式での局所麻酔法の研究に結びついた。術後のモルヒネではなく、むしろ局所麻酔が投与された場合、腫瘍再発および腫瘍転移が実質的に減少する結果が示された。この結果は、転帰の差が局所麻酔薬の有益な効果ではなく、モルヒネの有害作用に起因したという見解と一致している。したがって、モルヒネの効果を打ち消す、末梢オピオイド受容体アンタゴニストを含むオピオイド受容体アンタゴニストのような任意の薬剤は、モルヒネのようなオピオイドのアゴニストが外科治療または手術後の養生手順の一部として検討されたかどうかにかかわらず、癌手術の周術期の環境において有益だろう。
オピオイド受容体アゴニストは、モルヒネ、メタドン、コデイン、メペリジン、フェンティジン(fentidine)、フェンタニル、サフェンタニル、アルフェンタニルおよび同種のものを含むが、限定されない。オピオイド受容体アゴニストは、受容体の1つの型を、もう一つのものよりも一桁分効果的に、アゴナイズする(作動する)能力によって分類される。例えば、μ受容体に対するモルヒネの相対的な親和度はκ受容体に対するものよりも200倍大きく、したがって、μオピオイド受容体アゴニストとして分類される。いくつかのオピオイド化合物は1つの受容体型へのアゴニストとして、および他の受容体型へのアンタゴニストとして作用してもよく；そのようなものはアゴニスト/アンタゴニスト(混合アゴニストまたは部分アゴニストとしても知られている)として分類される。「アゴニスト/アンタゴニスト」、「部分アゴニスト」および「混合アゴニスト」は、本明細書において同じ意味で使用される。これらのオピオイドは、ペンタゾシン、ブトルファノール、ナロルフィン、ナルブフィン、ブプレノルフィン、ブレマゾシン、およびベゾシン(bezocine)を含むが、限定されない。オピオイドアゴニスト/アンタゴニストグループの多くは、κ受容体のアゴニストおよびμ受容体のアンタゴニストである。さらに、オピオイド受容体アゴニストの活性代謝物も、本発明の方法において活性があるだろうことが予見される。例えば、モルヒネの代謝物質のモルヒネ3-グルクロニドおよびモルヒネ6-グルクロニドが、細胞バリア機能障害の予防、減少、消去において活性があると期待される。
例えば、患者の疼痛管理に対する受け入れがたい干渉を回避するための、末梢オピオイド受容体に選択的に拮抗する能力は、末梢オピオイド受容体アンタゴニストが細胞バリア機能障害関連した疾患および障害に取り組むのに有用になることを示す。末梢オピオイド受容体アンタゴニストは、末梢受容体相互作用への限定を維持しているが、構造の異なる化合物のクラスを形成する。これらの化合物は、三級および四級モルフィナン、特に、ノロキシモルフォン誘導体および窒素置換ピペリジン、および特に、ピペリジン-N-アルキルカルボキシレート、および三級および四級ベンゾモルファンを含む。末梢に限定されたアンタゴニストは、構造では変化するが、典型的には荷電した極性のおよび/または高分子量のものであり、その各々は血液脳関門の通過を妨害する。
血液脳関門を通過し、中枢(および末梢)で活性のあるオピオイド受容体アンタゴニストの例は、例えばナロキソン、ナルトレキソン(その各々はバクスター医薬品社(Baxter Pharmaceutical Products, Inc.)から市販で入手可能)、およびナルメフェン(例えば、デュポンファーマ(DuPont Pharma)から入手可能)を含む。これらは特定の患者(疼痛管理または他のオピエート治療のための治療をされていない患者ののような)の細胞バリア機能障害を減じることにおいて価値があってもよい。
特定の実施形態では、本方法は、ピペリジン-N-アルキルカルボキシレート化合物である末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニスの患者への投与を含む。ピペリジン-N-アルキルカルボキシレートのオピオイドアンタゴニストは、例えば、米国特許番号5,250,542；5,159,081；5,270,328；および5,434,171に開示された化合物を含み、この開示は、ここでそれらの全体で参照によって本明細書において組み入れられる。ピペリジン-N-アルキルカルボキシレートオピオイドのアンタゴニストのクラスは、次式(I)にあるものを含む：
Figure 2008542395
式中:
R1は水素またはアルキルであり；
R2は水素、アルキルまたはアルケニルであり；
R3は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキルまたはアリール置換アルキルであり；
R4は水素、アルキルまたはアルケニルであり；
AはOR5またはNR6 R7あり；ここに：
R5は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキルまたはアリール置換アルキルであり；
R6は水素またはアルキルであり；
R7は水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル、シクロアルケニル置換アルキル、アリール置換アルキル、アリール置換アルキル、もしくは、アルキレン置換Bであり、または、それらが結合されている窒素原子と共に、R6およびR7はヘテロ環を形成し；Bは
Figure 2008542395
C(=O)WまたはNR8 R9であり；ここに；
R8は水素またはアルキルであり；
R9は水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルケニル置換アルキル、アリールもしくはアリール置換アルキルであり、または、それらが結合されている窒素原子と共に、R8およびR9はヘテロ環を形成し；
WはOR10、NR11 R12またはOEであり；ここに；
R10は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、またはアリール置換アルキルである；
R11は水素またはアルキルである；
R12は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、アリール置換アルキルもしくはアルキレン置換C(=O)Yであり、または、それらが結合されている窒素原子と共に、R11およびR12はヘテロ環を形成し；
Eは
Figure 2008542395
アルキレン置換(C=O)D、または--R13OC(=O)R14であり；
ここに
R13はアルキル置換アルキレンであり；
R14はアルキルであり；
DはOR15またはNR16 R17であり；
ここに；
R15は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、またはアリール置換アルキルであり；
R16は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリール置換アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキルまたはシクロアルケニル置換アルキルであり；
R17は、水素またはアルキルであり、または、それらが結合されている窒素原子と共に、R16およびR17はヘテロ環を形成し；
YはOR18またはNR19 R20であり；
ここに:
R18は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキルで、シクロアルケニル置換アルキル、またはアリール置換アルキルであり；
R19は水素またはアルキルであり；
R20は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、もしくはアリール置換アルキルであり、または、それらが結合されている窒素原子と共に、R19およびR20はヘテロ環を形成し；
R21は水素またはアルキルであり；および
nは0〜約4であり；
または立体異性体、プロドラッグ、または薬学的に許容されるそれらの塩類、水和物もしくはN-酸化物。
上記の式(I)では、R1は水素またはアルキルである。いくつかの実施形態では、R1は水素またはC1 -C5アルキルである。重要な実施形態では、R1は水素である。
上記の式(I)では、R2は水素、アルキルまたはアルケニルである。いくつかの実施形態では、R2は、水素、C1 -C5アルキルまたはC2 -C6アルケニルである。いくつかの実施形態では、R2はアルキルであり、C1 -C3のアルキルがより好ましい。
上記の式(I)では、R3は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキルまたはアリール置換アルキルである。いくつかの実施形態では、R3は、水素、C1 -C10アルキル、C3 -C10アルケニル、フェニル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5-C8シクロアルキル置換C1 -C3アルキルまたはフェニル置換C1 -C3アルキルである。いくつかの実施形態では、R3はベンジル、フェニル、シクロヘキシル、またはシクロヘキシルメチルである。
上記の式(I)では、R4は水素、アルキルまたはアルケニルである。いくつかの実施形態では、R4は、水素、C1 -C5アルキルまたはC2 -C6アルケニルである。他の実施形態では、R4はC1 -C3アルキルであり、メチルがより好ましい。
上記の式(I)では、AはOR5またはNR6 R7である。上記の式(I)では、R5は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、またはアリール置換アルキルである。いくつかの実施形態では、R5は、水素、C1 -C10アルキル、C2 -C10アルケニル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5-C8シクロアルケニル置換C1 -C3アルキル、またはフェニル置換C1 -C3アルキルである。さらに、いくつかの実施形態では、R5が水素またはアルキルである、C1 -C3アルキルがより好ましい。
上記の式(I)では、R6は水素またはアルキルである。いくつかの実施形態では、R6は水素またはC1 -C3アルキルである。いくつかの実施形態では、R6は水素である。
上記の式(I)では、R7は水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル、シクロアルケニル置換アルキル、アリール置換アルキル、アリール置換アルキルまたはアルキレン置換Bである。いくつかの実施形態では、R7は、水素、C1 -C10アルキル、C3 -C10アルケニル、フェニル、シクロアルキル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5 -C8シクロアルケニル、C5-C8シクロアルケニル置換C1 -C3アルキル、フェニル置換C1 -C3アルキルまたは(CH2)q -Bである。いくつかの実施形態では、R7はq -Bである(CH2)。
特定の他の実施例では、上記の式(I)において、R6およびR7は、それらが結合されている窒素原子と共に、ヘテロ環を形成する。
R7の定義における基Bは、
Figure 2008542395
C(=O)WまたはNR8 R9である。いくつかの実施形態では、BはC(=O)Wである。
Bの定義における基R8は、水素またはアルキルである。いくつかの実施形態では、R8は水素またはC1 -C3アルキルである。
Bの定義における基R9は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルケニル置換アルキル、アリールまたはアリール置換アルキルである。いくつかの実施形態では、R9は、水素、C1 -C10アルキル、C3 -C10アルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、C5-C8シクロアルケニル置換C1 -C3アルキル、フェニルまたはフェニル置換C1 -C3アルキルである。
特定の他の実施形態では、Bの定義において、R8およびR9は、それらが結合されている窒素原子と共に、ヘテロ環を形成する。Bの定義における基Wは、OR10、NR11 R12またはOEである。
Wの定義における基R10は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、またはアリール置換アルキルである。いくつかの実施形態では、R10は、水素、C1 -C10アルキル、C2 -C10アルケニル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5-C8シクロアルケニル置換C1 -C3アルキル、またはフェニル置換C1 -C3アルキルである。さらに、いくつかの実施形態では、R10は、水素、アルキル、C1 -C5アルキル、フェニル置換アルキル、フェニル置換C1 -C2アルキル、シクロアルキルまたはシクロアルキル置換アルキル、C5-C6シクロアルキル置換C1 -C3アルキルである。
Wの定義における基R11は、水素またはアルキルである。いくつかの実施形態では、R11は水素またはC1 -C3アルキルである。
Wの定義における基R12は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、アリール置換アルキルまたはアルキレン置換C(=O)Yである。いくつかの実施形態では、R12は、水素、C1 -C10アルキル、C3 -C10アルケニル、フェニル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5-C8シクロアルケニル置換C1 -C3アルキル、フェニル置換C1 -C3アルキル、またはアルキレン置換C(=O)Yである。さらに、いくつかの実施形態では、mが1〜4である場合、R12は、水素、アルキル、いくつかのC1 -C3アルキルまたは(CH2)m C(O)Yである。
R12の定義における基Yは、OR18またはNR19 R20である。特定の他の実施形態では、Wの定義において、R12およびR13は、それらが結合されている窒素原子と共に、ヘテロ環を形成する。
Wの定義における基Eは：
Figure 2008542395
アルキレンに置換された(C=O)D、または--R13 OC(=O)R14である。いくつかの実施形態において、Eは：
Figure 2008542395
(CH2)m(C=O)D(ここでmは上で定義された通りである)、または--R13 OC(=O)R14である。
Eの定義における基R13は、アルキル置換アルキレンである。いくつかの実施形態では、R13はメチレン置換C1 -C3アルキルである。いくつかの実施形態では、R13は--CH(CH3)--または--CH(CH2 CH3)--である。
Eの定義における基R14は、アルキルである。いくつかの実施形態では、R14はC1 -C10アルキルである。Eの定義における基Dは、OR15またはNR16 R17である。
Dの定義における基R15は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、またはアリール置換アルキルである。いくつかの実施形態では、R15は、水素、C1 -C10アルキル、C2 -C10アルケニル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5-C8シクロアルケニル置換C1 -C3アルキル、またはフェニル置換C1 -C3アルキルである。さらに、いくつかの実施形態では、R15は水素またはアルキルであり、C1 -C3アルキルがより好ましい。
Dの定義における基R16は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、アリール置換アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキルまたはシクロアルケニル置換アルキルである。いくつかの実施形態では、R16は、水素、C1 -C10アルキル、C3 -C10アルケニル、フェニル、フェニル置換C1 -C3アルキル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5-C8シクロアルケニル置換C1 -C3アルキルである。いくつかの実施形態では、R16はメチルまたはベンジルである。
Dの定義における基R17は、水素またはアルキルである。いくつかの実施形態では、R17は水素またはC1 -C3アルキルである。さらによりいくつかの実施形態では、R17は水素である。
特定の他の実施形態では、Dの定義における、R16およびR17は、それらが結合されている窒素原子と共に、ヘテロ環を形成する。
Yの定義における基R18は、水素、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキルで、シクロアルケニル置換アルキルまたはアリール置換アルキルである。いくつかの実施形態では、R18は、水素、C1 -C10アルキル、C2 -C10アルケニル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5-C8シクロアルケニル置換C1 -C3アルキル、またはフェニル置換C1 -C3アルキルである。いくつかの実施形態では、R18は水素またはC1 -C3アルキルである。
Yの定義における基R19は、水素またはアルキルである。いくつかの実施形態では、R19は水素またはC1 -C3アルキルである。
Yの定義における基R20は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキル置換アルキル、シクロアルケニル置換アルキル、またはアリール置換アルキルである。いくつかの実施形態では、R20は、水素、C1 -C10アルキル、C3 -C10アルケニル、フェニル、シクロアルキル、C5 -C8シクロアルケニル、シクロアルキル置換C1 -C3アルキル、C5-C8のシクロアルケニル置換C1 -C3アルキル、またはフェニル置換C1 -C3アルキルである。いくつかの実施形態では、R20は水素またはC1 -C3アルキルである。
特定の他の実施形態では、Yの定義におけるR19およびR20は、それらが結合されている窒素原子と共に、ヘテロ環を形成する複素環。
Bの定義における基R21は、水素またはアルキルである。いくつかの実施形態では、R21は水素またはC1 -C3アルキルである。いくつかの実施形態では、R21は水素である。
上記の式(I)では、nは0〜約4である。いくつかの実施形態では、nは約1または2である。
R7の上記の定義では、qは約1〜約4である。いくつかの実施形態では、qは約1〜約3である。
Eの上記の定義では、mは約1〜約4である。いくつかの実施形態では、mは約1〜約3である。
式(I)の化合物は、ピペリジン環の3-位および4-位での置換によりトランスおよびシス立体化学的異性体として存在することができ、そのような立体化学的異性体は本請求の範囲内である。用語「トランス」は、本明細書において使用されるように、4位のメチル基から反対側にある3位のR2を指すが、「シス」異性体では、R2および4-メチルは環の同じ側にある。本発明の方法では、用いられた化合物は、立体異性体の混合物だけでなく、個々の立体異性体であってもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、3-位のR2基が、環の反対側(すなわち4-位のメチル基に対してトランス)、および環の同じ側に位置する、式(I)の化合物を含む。これらのトランス異性体は、3R,4R-異性体または3S,4S-異性体として存在することができる。
用語「R」および「S」は、キラル中心の特異的な立体配置を表わすために、有機化学において一般に使用されるように、本明細書において使用される。用語「R」は「右」を指し、最低の優先度の基に向かって結合に沿って見た場合の、基の優先度の時計回りの関係による(最高から下から2番目へ)キラル中心の立体配置を指す。用語「S」または「左」は、最低の優先度の基に向かって結合に沿って見た場合の、基の優先度の反時計回りの関係による(最高から下から2番目へ)キラル中心の立体配置を指す。基の優先度は原子番号(最も重い同位元素、1番め)に基づく。優先度の部分的なリストおよび立体化学の考察は以下の本に含まれる：有機化学のボキャブラリー(The Vocabulary of Organic Chemistry), Orchin, et al., John Wiley and Sons Inc., page 126 (1980), 全体の参照により本明細書において組み入れられる。
本発明の方法で使用されるピペリジン-N-アルキルカルボキシレート化合物は、ピペリジン環上の置換基の立体配置が3Rおよび4Rである式(I)のものである。
R3が水素でない場合、R3が結合されている炭素原子は非対称である。それゆえ、化合物のこのクラスは、このキラル中心で個々のRまたはS立体異性体として、または立体異性体の混合物としてさらに存在することが可能であり、すべては本発明の範囲内で検討される。本発明の化合物の実質的に純粋な立体異性体(すなわちR3が結合されているキラル中心で立体配置がRまたはSである異性体、すなわち3つのキラル中心で立体配置が3R、4R、Sまたは3R、4R、Rである化合物)を使用することができる。
更に、他の不斉炭素はAの構造に依存する分子へ導入することができる。それゆえ、化合物のこれらのクラスは、これらのキラル中心で個々のRもしくはS立体異性体として、または立体異性体の混合物として存在することが可能であり、すべては本発明の方法の範囲内として検討される。
本発明の方法で使用される、特定のピペリジン-N-アルキルカルボキシレート化合物は、以下を含む：
U--OCH2 CH3; U--OH; G--OH; U--NHCH2 C(O)NHCH3; U--NHCH2 C(O)NH2; G--NHCH2 C(O)NHCH3; U--NHCH2 C(O)NHCH2 CH3; G--NH(CH2)3 C(O)OCH2 CH3; G--NHCH2 C(O)OH; M--NHCH2 C(O)NH2; M--NH(CH2)2 C(O)OCH2 (C6 H5); X--OCH2 CH3; X--OH; X--NH(CH2)2 CH3; Z--NH(CH2)3 C(O)OCH2 CH3; X--NHCH2 C(O)OH; Z--NH(CH2)2 N(CH3)2; Z--NH(CH2)2 C(O)NHCH2 CH3; X--OCH2 (C6 H5); X--N(CH3)2; Z--NH(CH2)3 C(O)NHCH3; Z--NH(CH2)3 C(O)NH2; Z--NH(CH2)3 C(O)NHCH2 CH3; X--OCH2 C(O)OCH3; X--OCH2 C(O)NHCH3; およびX -- N(CH3)CH2 C(O)CH2 CH3;この中で：
Figure 2008542395
Figure 2008542395
本発明の方法で使用される、重要なピペリジン-N-アルキルカルボキシレート化合物は以下を含む：
Z--OH; Z--NH(CH2)2 C(O)OH; G--NH(CH2)2 C(O)NH2; G--NH(CH2)2 C(O)NHCH3; G--NHCH2 C(O)NH2; G--NHCH2 C(O)NHCH2 CH3; G--NH(CH2)3 C(O)NHCH3; G--NH(CH2)2 C(O)OH; G--NH(CH2)3 C(O)OH; X--NH2; X--NHCH(CH3)2; X--OCH2 CH(CH3)2; X--OCH2 C6 H5; X--OH; X--O(CH2)4 CH3; X--O--(4-メトキシシクロヘキシル);X--OCH(CH3)OC(O)CH3; X--OCH2 C(O)NHCH2 (C6 H5); M--NHCH2 C(O)OH; M--NH(CH2)2 C(O)OH; M--NH(CH2)2 C(O)NH2; U-NHCH2 C(O)OCH2 CH3; およびU-NHCH2 C(O)OH;ここで、Z、G、X、MおよびUは上で定義された通りである。
本発明のいくつかの実施形態に従って、他の方法を述べると、式(I)の化合物には、式Q--CH2 CH(CH2 (C6 H5))C(O)OH、Q--CH2 CH2 CH(C6 H5)C(O)NHCH2 C(O)OCH2 CH2、 Q--CH2 CH2 CH(C6 H5)C(O)NHCH2 C(O)OH、 Q--CH2 CH2 CH(C6 H5)C(O)NHCH2 C(O)NHCH3、 Q--CH2 CH2 CH(C6 H5)C(O)NHCH2 C(O)NHCH2 CH3、 G--NH(CH2)2 C(O)NH2、 G--NH(CH2)2 C(O)NHCH3、 G--NHCH2 C(O)NH2、 G--NHCH2 C(O)NHCH3、 G--NHCH3 C(O)NHCH2 CH3、 G--NH(CH2)3 C(O)OCH2 CH3、 G--NH(CH2)3 C(O)NHCH3、 G--NH(CH2)2 C(O)OH、 G--NH(CH2)3 C(O)OH、 Q--CH2 CH(CH2 (C6 H11))C(O)NHCH2 C(O)OH、 Q--CH2 CH(CH2 (C6 H11))C(O)NH(CH2)2 C(O)OH、 Q--CH2 CH(CH2 (C6 H11))C(O)NH(CH2)2 C(O)NH2、 Z--NHCH2 C(O)OCH2 CH3、 Z--NHCH2 C(O)OH、 Z--NHCH2 C(O)NH2、 Z--NHCH2 C(O)N(CH3)2、 Z--NHCH2 C(O)NHCH(CH3)2、 Z--NHCH2 C(O)OCH2 CH(CH3)2、 Z--NH(CH2)2 C(O)OCH2 (C6 H5)、 Z--NH(CH2 C(O)OH、 Z--NH(CH2)2 C(O)NHCH2 CH3、 Z--NH(CH2)3 C(O)NHCH3、 Z--NHCH2 C(O)NHCH2 C(O)OH、 Z--NHCH2 C(O)OCH2 C(O)OCH3、 Z--NHCH2 C(O)O(CH2)4 CH3、 Z--NHCH2 C(O)OCH2 C(O)NHCH3、Z -- NHCH2 C(O)O--(4-メトキシシクロヘキシル、Z--NHCH2 C(O)OCH2 C(O)NHCH2 (C6 H5) またはZ--NHCH2 C(O)OCH(CH3)OC(O)CH3があり；ここで、Q、GおよびZは上で定義された通りである。
いくつかの実施形態では、式(I)の化合物には、式(3R,4R,S)--Z--NHCH2 C(O)OCH2 CH(CH3)2、(+)--Z--NHCH2 C(O)OH、 (-)--Z--NHCH2 C(O)OH、 (3R,4R,R)--Z--NHCH2 C(O)--OCH2 CH(CH3)2、 (3S,4S,S)--Z--NHCH2 C(O)OCH2 CH(CH3)2、 (3 S,4S,R)--Z--NHCH2 C(O)OCH2 CH(CH3)2、 (3R,4R)--Z--NHCH2 C(O)NHCH2 (C6 H5)または(3R,4R)--G--NH(CH2)3 C(O)OHがあり、ここでZおよびGは上で定義された通りである。いくつかの実施形態では、式(I)の化合物には、式(+)--Z--NHCH2 C(O)OHまたは(-)--Z--NHCH2 C(O)OHがあり、ここでZは上で定義された通りである。
腸のような局所的に作用し、高効能を有しており、経口的に活性のある、式(I)の化合物。本発明の実施形態は、化合物(+)--Z--NHCH2 C(O)OH、すなわち、次式(II)の化合物である。
Figure 2008542395
式(II)の化合物は、低pHまたは高pHでの条件以外は水においては低溶解度である。両性イオンの性質は、化合物に固有であってもよく、経口投与に続いて、低全身性吸収および腸での保持された局所効果のような望ましい特性があってもよい。
代替の実施形態では、本発明の方法は、患者に四級モルフィナン化合物である末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストの投与を含んでもよい。本発明の方法で使用するために適切であろう四級モルフィナン化合物の実施例は、例えば、N-メチルナルトレキソンの四級塩、N-メチルナロキソン、N-メチルナロルフィン、N-ジアリルノルモルヒネ、N-アリルレバロルファンおよびN-メチルナルメフェンを含む。
さらに他の代替の実施形態では、本発明の方法は、患者にアヘンアルカロイド誘導体の形式で末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストの投与を含んでもよい。用語「アヘンアルカロイド誘導体」は、本明細書において使用されるように、アヘンアルカロイドの合成誘導体、半合成誘導体またはアナログである末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストを指す。好ましい形式では、本発明の方法で用いられたアヘンアルカロイド誘導体は、高レベルのモルヒネアンタゴニスト作用を示すが、アゴニスト活性の減少、および好ましくは実質的にアゴニスト活性が無いことを示す。用語「アゴニスト活性が実質的にない」は、アヘンアルカロイド誘導体に関して本明細書において使用されるように、電気的に刺激されたモルモット回腸についての最大反応が、1μMの濃度で、モルヒネと比較して約60%またはそれ以下であることを意味する。いくつかの実施形態では、本方法で用いられたアヘンアルカロイド誘導体のモルモット回腸についての最大反応は、1μMの濃度でモルヒネと比較して約50%またはそれ以下であり、より好ましくは最大反応は約40%またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、本方法で用いられたアヘンアルカロイド誘導体のモルモット回腸についての最大反応は、1μMの濃度でモルヒネと比較して約30%またはそれ以下であり、最大反応は約20%またはそれ以下である。さらに他の実施形態では、本方法で用いられたアヘンアルカロイド誘導体のモルモット回腸についての最大反応は、1μMの濃度でモルヒネと比較して約10%またはそれ以下である。特定の実施形態では、アヘンアルカロイド誘導体のモルモット回腸についての最大反応は、1μMの濃度でモルヒネと比較して約0%(すなわち反応はない)である。
電気的に刺激されたモルモット回腸についてのアヘンアルカロイド誘導体の最大反応を決定するための適切な方法は、例えば米国特許番号4,730,048および4,806,556に記述されており、本開示は、ここにそれらの全体の参照により本明細書において組み入れられる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられたアヘンアルカロイド誘導体には、次式(III)または(IV)がある：
Figure 2008542395
 III
（または）
Figure 2008542395
 IV

式中：
Rは、アルキル、シクロアルキル置換アルキル、アリール、アリール置換アルキルまたはアルケニルであり；
Zは水素またはOHであり；
R' はX'-J(L)(T)であり、ここで:
Jはアルキレンまたはアルケニレンであり;
Lは、水素、アミノ、またはCO2 H、OHもしくはフェニルで任意に置換されたアルキルであり；および、TはCO2 H、SO3 H、アミノまたはグアニジノであり；
X'は直接結合またはC(=O)であり；および
R"は、NH--J(L)(T)またはグアニジノであり；または立体異性体、プロドラッグ、または薬学的に許容されるそれらの塩類、水和物もしくはN-酸化物。
上記の式(III)および(IV)の化合物では、Rは、アルキル、シクロアルキル置換アルキル、アリール、アリール置換アルキルまたはアルケニルである。いくつかの実施形態では、Rは、C1 -C5アルキル、C3の-C6のシクロアルキルに置換されたアルキル、アリール、アリールアルキルまたはトランスC2 -C5アルケニルである。いくつかの実施形態では、RはC1 -C3アルキル、アリルまたはシクロプロピルメチルであり、シクロプロピルメチルがさらにより好ましい。
上記の式(III)および(IV)の化合物では、Zは水素またはOHである。いくつかの実施形態では、ZはOHである。
式(III)および(IV)の化合物では、R'はX--J(L)(T)であり、R"はNH--J(L)(T)またはグアニジノである。
R'およびR"の定義では、Gはアルキレンまたはアルケニレンである。いくつかの実施形態では、Jは、C1 -C5アルキレン、酸素原子により遮られたC2 -C6アルキレンまたはC2 -C5アルケニレンである。
R'およびR"の定義では、Lは、水素、アミノまたはCO2 H、OHまたはフェニルで任意に置換されたアルキルである。いくつかの実施形態では、Lは、水素、アミノ、またはCO2 H、OHもしくはフェニルで任意に置換されたC1 -C5アルキルである。いくつかの実施形態では、Lは水素またはアミノである。
R'およびR"の定義では、TはCO2 H、SO3 H、アミノまたはグアニジノである。いくつかの実施形態では、TはCO2 Hまたはグアニジノである。
R'の定義では、Xは直接結合またはC(=O)である。
本発明の方法で用いられてもよい重要なオピオイドのアルカロイド誘導体は、Rがシクロプロピルメチルであり、ZがOHであり、およびR'がC(=O)(CH2)2 CO2 H、 C(=O)(CH2)3 CO2 H、 C(=O)CH--CHCO2 H、 C(=O)CH2 OCH2 CO2 H、 C(=O)CH(NH2)(CH2)3 NHC(--NH)NH2またはC(=O)CH(NH2)CH2 CO2 Hから選択される、式(III)の化合物を含む。さらに重要なものは、Rがシクロプロピルメチルであり、ZがOHであり、およびR'がCH2CO2Hである、式(III)のオピオイドのアルカロイド誘導体である。他の実施形態では、本発明の方法で用いられてもよいオピオイドのアルカロイド誘導体は、Rがシクロプロピルメチルであり、ZがOHであり、R"がNHCH2CO2Hである、式(IV)の化合物を含む。例えばN-メチルナルトレキソン (またはメチルナルトレキソン、MNTX)は次式(V)である。
Figure 2008542395
 V
MNTXの合成、製剤化および製造のための方法は、2006年5月25日に出願された、特許弁護士協議事項表番号P0453.70119US01「(R)-N-メチルナルトレキソンの合成(SYNTHESIS OF(R)-N-METHYLNALTREXONE)」と表題をつけられた、同時係争中の米国の特許出願(まだ番号は割り当てられない)に記述されており、本明細書においてその全体の参照により組み入れられる。
本発明の方法で用いられてもよい他のオピオイドのアルカロイド誘導体は、例えば米国特許番号4,730,048および4,806,556に記述されており、その開示はそれらの全体の参照によりここで本明細書において組み入れられる。
さらに他の実施形態では、本発明の方法は、患者に四級ベンゾモルファン化合物の形式での、末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニスト化合物の投与を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられる四級ベンゾモルファン化合物は、高レベルのモルヒネアンタゴニスト作用を示すが、アゴニスト活性の減少、および好ましくは実質的にアゴニスト活性が無いことを示す。用語「アゴニスト活性が実質的にない」は、四級ベンゾモルファン化合物に関して本明細書において使用されるように、電気的に刺激されたモルモット回腸についての最大反応が、1μMの濃度で、モルヒネと比較して約60%またはそれ以下であることを意味する。いくつかの実施形態では、本方法で用いられた四級ベンゾモルファン化合物のモルモット回腸についての最大反応は、1μMの濃度でモルヒネと比較して約50%またはそれ以下であり、より好ましくは最大反応は約40%またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、本方法で用いられた四級ベンゾモルファン化合物のモルモット回腸についての最大反応は、1μMの濃度でモルヒネと比較して約30%またはそれ以下であり、最大反応は約20%またはそれ以下である。さらに他の実施形態では、本方法で用いられた四級ベンゾモルファン化合物のモルモット回腸についての最大反応は、1μMの濃度でモルヒネと比較して約10%またはそれ以下である。特定の実施形態では、四級ベンゾモルファン化合物のモルモット回腸についての最大反応は、1μMの濃度でモルヒネと比較して約0%(すなわち反応はない)である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられる四級ベンゾモルファン化合物は次式(VI)である：
Figure 2008542395
 VI

式中：
R24は水素またはアシルであり；および
R25はアルキルまたはアルケニルであり;
または立体異性体、プロドラッグ、または薬学的に許容されるそれらの塩類、水和物もしくはN-酸化物。
上記の式(VI)では、R24は水素またはアシルである。いくつかの実施形態では、R24は水素またはC1 -C6アシルである。いくつかの実施形態では、R24は水素またはC1 -C2アシルである。いくつかの実施形態では、R24は水素またはアセトキシであり、水素がさらにより好ましい。
上記の式(VI)では、R25はアルキルまたはアルケニルである。いくつかの実施形態では、R25はC1 -C6アルキルまたはC2 -C6アルケニルである。いくつかの実施形態では、R25はC1 -C3アルキルまたはC2 -C3アルケニルである。いくつかの実施形態では、R25はプロピルまたはアリルである。
本発明の方法で用いられてもよい重要な四級ベンゾモルファン化合物は、式(VI)の以下の化合物を含んむ：2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2,2-ジアリル-6,7-ベンゾモルファニウム-ブロミド；2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-6,7-ベンゾモルファン；2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファン；2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファニウム-ブロミド；2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-プロパルギル-6,7-ベンゾモルファニウム-ブロミド；および2'-アセトキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファニウム-ブロミド。
本発明の方法で用いられてもよい他の四級ベンゾモルファン化合物は、例えば米国特許番号3,723,440に記述されており、この開示は、ここにそれらの全体の参照により本明細書において組み入れられる。
上に例示されたものに加えて、本発明の方法および組成物に使用してもよい他のμオピオイド受容体アンタゴニストは、本開示の教示をいったん身に付けた当業者の一人には容易に明らかとなるだろう。
本発明の方法で用いられた化合物は、プロドラッグの形式で存在してもよい。本明細書において使用されるように、「プロドラッグ」は、そのようなプロドラッグが哺乳類の被験体に投与される場合、例えば式(I)もしくは(II)、またはインビボの本発明の方法で用いられた他の式もしくは化合物に記載されている活性のある親薬物を放出する、任意の共有結合で結合する担体を含むことが意図される。プロドラッグが医薬品の多数の望ましい特質(例えば溶解度、生体利用率、製造など)を促進することが知られているので、本方法で用いられた化合物は、所望の場合、プロドラッグの形式で送達されてもよい。したがって、本発明は、プロドラッグを送達する方法を検討する。本発明、例えば式(I)で用いられた化合物のプロドラッグは、薬理学的に活性のある部分をもたらすためにルーチン操作またはインビボのいずれかで修飾が切断されるような、化合物中に存在する官能基の修飾により調製されていてもよい。
したがって、プロドラッグは、例えば、プロドラッグが哺乳類被験体に投与される場合、遊離ヒドロキシル、遊離アミノ、またはカルボン酸を形成するために切断されるような、それぞれヒドロキシ基、アミノ基またはカルボキシ基が任意の基に結合される、本明細書において記述される化合物を含む。実施例は、アルコール官能基およびアミン官能基の酢酸誘導体、ギ酸誘導体および安息香酸誘導体；およびメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル、sec-ブチルエステル、tert-ブチルエステル、シクロプロピルエステル、フェニルエステル、ベンジルエステルおよびフェネチルエステル、および同種のもののような、アルキルエステル、炭素環式エステル、アリールエステル、およびアルキルアリールエステルを含むが、限定されない。
本発明の方法で用いられた化合物は、当業者に十分に公知の多くの方法で調製されてもよい。この化合物は、例えば下記に述べられる方法、または当業者により認識されるような、その変形によって合成することができる。本発明と関連して開示された過程はすべて、ミリグラム、グラム、マルチグラム、キログラム、マルチキログラムまたは商用産業上の規模を含む任意の規模で実行されるために検討される。
本方法で用いられた化合物は1つまたは複数の非対称的に置換された炭素原子を含んでもよく、光学活性体またはラセミ体で単離されてもよい。したがって、特異的な立体異性体または異性体が具体的には示されなければ、構造のキラル体、ジアステレオマー体、ラセミ体およびすべての幾何学的な異性体はすべて意図される。そのような光学活性体を調製および単離する方法は、当技術分野において周知である。例えば、立体異性体の混合物は、ラセミ体の分割および通常のクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびキラルクロマトグラフィー、優先造塩、再結晶、および同種のものを含む標準技術、またはキラルの出発物質からのキラル合成もしくは標的キラル中心の計画的な合成のいずれかによってによって分離されてもよいが、限定されない。
容易に理解されるように、存在する官能基は合成の経過の間に保護基を含んでもよい。保護基は、官能性に選択的に追加することができ、官能性から取り除くことができる、水酸基およびカルボキシル基のような、化学的な官能基としてそれ自体知られている。これらの基は、化合物が曝露される化学反応状態に対して、そのような官能性を不活性にするために、化学化合物中に存在する。様々な保護基のうちのいずれも本発明で用いられてよい。保護基はベンジルオキシカルボニル基およびtert-ブチルオキシカルボニル基を含む。本発明に従って用いられてもよい他の保護基は、Greene, T. W. and Wuts, P. G. M., 有機合成の保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)第2版Ed., Wiley & Sons, 1991に記述されるだろう。
本発明に記載のピペリジン-N-アルキルカルボキシレート化合物は、例えば米国特許番号5,250,542、5,434,171、5,159,081および5,270,328で教示された方法を用いて合成されてもよく、この開示は、ここでそれらの全体の参照によって本明細書において組み入れられる。例えば、本化合物の合成の出発物質として用いられた3-置換-4-メチル-4-(3-ヒドロキシ-またはアルカノイルオキシフェニル)ピペリジン誘導体は、米国特許番号4,115,400および米国特許番号4,891,379で教示された一般的な手順によって調製されていてもよく、それらの開示は、ここで全体の参照によって本明細書において組み入れられる。本明細書において記述した化合物の合成のための出発物質の(3R,4R)-4-(3-ヒドロキシフェニル)-3,4-ジメチルピペリジンは、米国特許番号4,581,456で記述されていた手順によって調製されてもよく、それらの開示は、ここで全体の参照によって本明細書において組み入れられるが、記述されるようにβ-立体異性体が好まれるような調節がなされた。
この過程の最初の工程は、アルキルリチウム試薬で3-アルコキシブロモベンゼンを反応させることによる、3-アルコキシフェニルリチウム試薬の形成を含んでもよい。この反応は、不活性状態下でおよび乾燥ジエチルエーテルまたは好ましくは乾燥テトラヒドロフランのような適切な非反応性の溶媒の存在下で実行されてもよい。この過程において使用される好ましいアルキルリチウム試薬は、n-ブチルリチウムおよび特にsec-ブチルリチウムである。一般に、ほぼ等モルよりわずかに過剰なアルキルリチウム試薬が、反応混合物へ加えられてもよい。反応は約−20℃〜約−100℃、より好ましくは約−50℃〜約−55℃の温度で行なわれてもよい。
いったん3-アルコキシフェニルリチウム試薬が形成されたならば、ほぼ等モルの量の1-アルキル-4-ピペリドンを、−20℃〜−100℃の間の温度を維持する間に混合物へ加えてもよい。この反応は、典型的には約1〜24時間後に完了している。この時点で、反応混合物を室温へと徐々に暖めてもよい。産物は、残存リチウム試薬をクエンチングするための飽和塩化ナトリウム溶液の反応混合物への追加によって単離されてもよい。適切な1-アルキル-4-(3-アルコキシフェニル)ピペリジノール誘導体を提供するために、所望の場合、有機質層は分離され、さらに精製されてもよい。
上で調製された4-フェニルピペリジノールの脱水は、周知の手順に記載の強酸で成し遂げられてもよい。脱水は、塩酸、臭化水素酸および同種のもののようないくつかの強酸のうちのいずれか1つの様々な量において起こるが、脱水は、好ましくはリン酸、または特にトルエンまたはベンゼン中のp-トルエンスルホン酸で行われる。この反応は、典型的には還流条件下で、より一般には約50℃〜150℃で行なわれてもよい。このように形成された産物は、産物の塩形態の酸性の水溶液の塩基性化、および適切な水不混和性の溶媒による水溶液の抽出によって単離されてもよい。その後、所望の場合、蒸発後に生じた残留物はさらに精製することができる。
1-アルキル-4-メチル-4-(3-アルコキシフェニル)テトラヒドロピリジン誘導体は、メタロエナミンのアルキル化によって調製されていてもよい。この反応は、窒素またはアルゴンのような不活性雰囲気下で、好ましくはテトラヒドロフラン(THF)中のn-ブチルリチウムにより行なわれる。一般に、n-ブチルリチウムのわずかな過剰量を、約−50℃〜約0℃、より好ましくは、約−20℃〜−10℃の範囲の温度へ冷却されたTHFの、1-アルキル-4-(3-アルコキシフェニル)-テトラヒドロピリジンの撹拌溶液へ加えてもよい。この混合物は、反応混合物の温度を0℃以下に維持しながら、およそ10〜30分間撹拌され、その後ハロゲン化メチルの約1.0〜1.5当量の溶液への追加が続いてもよい。約5〜60分後に、水は反応混合物へ加えられてもよく、有機相が回収されてもよい。産物は標準手順に従って精製することができる。しかし、粗製生成物は、好ましくは真空下で蒸留するまたは約2時間ヘキサン:酢酸エチル(65:35、容積:容積)およびシリカゲルの混合物中でスラリーにすることによって精製される。後者の手順によれば、それから濾過を行い、その後産物を減圧下で濾液を蒸発させることによって単離してもよい。
この過程の次の工程は、結合していない環内エナミンへのアミノメチル化のマンニッヒ反応の適用を含んでもよい。この反応は、好ましくは水溶性のホルムアルデヒドの約1.2〜2.0当量、および適切な溶媒中の適切な二級アミンの約1.3〜2.0当量を組み合わせることによって行なわれる。水が好ましい溶媒かもしれないが、アセトンおよびアセトニトリルのような他の非求核性溶媒もこの反応で用いることができる。この溶液のpHは非求核性陰イオンを提供する酸でおよそ3.0〜4.0に調節されてもよい。そのような酸の実施例は硫酸、メタンスルホン酸およびp-トルエンスルホン酸のようなスルホン酸およびリン酸およびテトラフルオロ硼酸を含み、硫酸が好ましい。この溶液に、典型的には水溶性の硫酸中で溶解された1-アルキル-4-メチル-4-(3-アルコキシフェニル)テトラヒドロピリジンの1当量を追加してもよく、溶液のpHは非求核性酸または適切な二級アミンで再調整されてもよい。反応の間のpHは好ましくは約1.0〜5.0の範囲中で維持され、pH約3.0〜3.5がより好ましい。約50℃〜約80℃、より好ましくは約70℃の範囲の温度で行われた場合、この反応は実質的には約1〜4時間後に、より典型的には約2時間後に完了する。それから、その反応はほぼ30℃に冷却され、水酸化ナトリウム溶液に加えられてもよい。次に、この溶液は、ヘキサンまたは酢酸エチルおよび有機相のような水不混和性の有機溶媒で抽出してもよく、残存ホルムアルデヒドを除去するための水による完全な洗浄後に、減圧下で乾燥するまで蒸発させてもよい。
この過程の次の工程は、対応するtrans-1-アルキル-3,4-ジメチル-4-(3-アルコキシフェニル)ピペリジンへの、調製した1-アルキル-4-メチル-4-(3-アルコキシフェニル)-3-テトラヒドロピリジンメタンアミンの触媒水素化を含んでもよい。この反応は、実際には2つの工程で起こる。第1の工程は、エキソC--N結合が3-メチルテトラヒドロピリジンを生成するように還元的に開裂される、水素化分解反応である。第2の工程では、所望のピペリジン環を与えるように、2,3-二重結合がテトラヒドロピリジン環中で還元される。
エナミンの二重結合の還元は、ピペリジン環の3および4の炭素原子で重大な相対立体化学を導入した。この還元は、一般に完全な立体選択性では起こらない。この過程で用いられる触媒は、様々なパラジウム触媒および好ましくは白金触媒の中から選択されてもよい。
この過程の触媒水素化工程は、好ましくは酸性の反応媒体中で行なわれる。この過程で使用される適切な溶媒は、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、トルエン、ヘキサンおよび同種のものと同様に、メタノールまたはエタノールのようなアルコールも含む。
適切な立体化学の転帰は、用いられた触媒の量に依存的かもしれない。所望の立体化学の結果をもたらすのに必要な触媒量は、様々な触媒毒の存在の有無に関連した出発物質の純度に依存的かもしれない。
反応槽の水素圧力は重要でないかもしれないが、約5〜200psiまでの範囲でありえる。容積による出発物質の濃度は、好ましくは出発物質1グラム当たり約20 mLの液体であるが、増加または減少した濃度の出発物質を用いることができる。本明細書において指定された条件下では、分子の過還元はできないので、触媒水素化のための時間は重大ではないかもしれない。反応は24時間またはそれ以上まで継続することができるが、理論上の水素2モルの取り込み後に還元条件を継続することは必要ではないかもしれない。次に、産物は、反応混合物を、例えば珪藻土を通してろ過し、減圧下で濾液を蒸発させ乾燥することによって単離されてもよい。このように単離された産物のさらなる精製は必要ではないかもしれなく、好ましくは、ジアステレオマーの混合物は次の反応へ直接導かれてもよい。
アルキル置換基は、標準の脱アルキル手順によってピペリジン環の1-位から取り除かれてもよい。好ましくは、クロロギ酸誘導体(特にビニルまたはフェニル誘導体)は用いられてもよく、酸で除去されてもよい。次に、調製されたアルコキシ化合物は、対応するフェノールへと脱アルキル化されてもよい。この反応は、一般に48%水性臭化水素酸溶液中で化合物を反応させることによって行なわれてもよい。約50℃〜約150℃の温度で、より好ましくは反応混合物の還流温度で行われた場合、この反応は、約30分〜24時間後に実質的に完了してもよい。次にこの混合物の溶液を冷やし、その後塩基によりpH8付近へ中和して使ってもよい。この水溶液は水不混和性の有機溶媒で抽出してもよい。次に、有機相の蒸発後に、残留物を次の工程で直接使用してもよい。
本発明の化合物へ出発物質として用いられた化合物も、1-アルキル-4-メチル-4-(3-アルコキシフェニル)-3-テトラヒドロピリジンメタンアミンを3位で臭素化し、このように調製されたブロモ化合物をリチオ化すること、および対応する1-アルキル-3,4-ジメチル-4-(3-アルコキシフェニル)テトラヒドロピリジンメタンアミンを提供するために臭化メチルのようなハロゲン化メチルでリチオ化された中間体を反応させることによって調製することができる。次に、この化合物は上に示されるような出発物質へ還元および変換されてもよい。
本発明の化合物は個々の立体異性体として存在することができる。好ましくは、米国特許番号4,581,456で開示されるように、または米国特許番号5,250,542の実施例1で示されるように、実質的に立体選択性で本質的に2つの鏡像異性体のラセミ混合物を提供するように、反応条件は調節される。次に、これらの鏡像異性体は分割されてもよい。これらの化合物の合成において使用される、分割された出発物質の調製に用いられてもよい手順は、分割された中間体を提供するために、(＋)-または(−)-ジトルオイル酒石酸のいずれかで、アルキル-3,4-ジメチル-4-(3-アルコキシフェニル)ピペリジンのラセミ混合物を処理することを含む。次に、この化合物はクロロギ酸ビニルにより1位で脱アルキル化され、最終的に、所望の4-(3-ヒドロキシフェニル)ピペリジン異性体に変換されてもよい。
当業者によって理解されるように、本発明の化合物の対応するラセミ混合物から、本発明の個々の鏡像異性体も(＋)または(−)ジベンゾイル酒石酸のいずれかにより、所望されたように、単離することができる。好ましくは(＋)-トランス鏡像異性体が得られる。
(＋)-トランス-3,4立体異性体が好ましいが、本明細書において記述された化合物の可能な立体異性体はすべて本発明で検討された範囲の内である。実質的に純粋な立体異性体だけでなく、立体異性体のラセミ混合物も、本発明の範囲内である。本明細書において使用されるように、用語「実質的に純粋な」は、他の可能な立体異性体と比較して、所望の立体異性体が、少なくとも約90モルパーセント、より好ましくは少なくとも約95モルパーセント、および最も好ましくは少なくとも98モルパーセント存在することを指す。
中間体は、Lが塩素、臭素またはヨウ素のような離脱基、Eはカルボン酸、エステルまたはアミド、およびR3およびnは上記に定義された通りである場合に、式LCH2(CH2),C1CHR3C(O)Eの化合物と3,4-アルキル-置換-4-(3-ヒドロキシフェニル)ピペリジンを反応させることによって調製することができる。好ましくは、Lは塩素であり、反応はピペリジン窒素をアルキル化するために塩基の存在下で行なわれる。例えば、4-クロロ-2-シクロヘキシルブタン酸、エチルエステルは、4-[(3R,4R)-4-(3-ヒドロキシフェニル)-3,4-ジメチル-1-ピペリジン]ブタン酸、エチルエステルを提供するために、(3R,4R)-4-(3-ヒドロキシフェニル)-3,4-ジメチルピペリジンと接触させることができる。カルボン酸のエステルが好まれてもよいが、遊離酸それ自体またはカルボン酸のアミドが使用されてもよい。
代替の合成では、置換ピペリジンは、ピペリジン窒素をアルキル化するためにメチレン基を含むアルキルエステルと接触させることができる。例えば、2-メチレン-3-フェニルプロパン酸、エチルエステルは、2-ベンジル-3-ピペリジンプロパン酸エチルエステルを提供するために所望のピペリジンと接触させることができる。
他の合成経路は、ハロアルキルニトリルによる置換ピペリジンの反応を含むことが可能である。もたらされたピペリジンアルキルニトリルのニトリル基は対応するカルボン酸へ加水分解することができる。
各々の合成経路で、修飾された化学構造を提供するために、もたらされたエステルまたはカルボン酸を、アミンまたはアルコールと反応させることができる。アミドの調製では、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ホウ酸、ボラン-トリメチルアミンおよび同種のもののような結合剤の存在下で、ピペリジン-カルボン酸または-カルボン酸エステルを、アミンと反応させてもよい。エステルは、p-トルエンスルホン酸、三弗化硼素エーテラートまたはN,N'-カルボニルジイミダゾールのような結合剤の存在下で、ピペリジン-カルボン酸を、適切なアルコールと接触させることによって調製することができる。代わりに、ピペリジン-カルボン酸塩化物は、塩化チオニル、三塩化リン、五塩化リンおよび同種のもののような試薬を使用して調製することができる。対応するアミドまたはエステルを提供するために、この塩化アシルを適切なアミンまたはアルコールと反応させることができる。
本発明に記載のアヘンアルカロイド誘導体は、例えば、米国特許番号4,730,048および4,806,556で教示された方法を用いて合成されてもよく、それらの開示は、ここに全体の参照によって本明細書において組み入れられる。例えば、式(III)のアヘンアルカロイド誘導体は、ナルトレキサミン(Rが(シクロプロピル)メチル、ZがOH、およびR!がHである、式(III))、またはオキシモルファミン(RがCH3、ZはOH、およびR!がHである、式(III))の6-アミノ基へ、親水性のイオン化部分のR'およびR"を結合することによって、調製されていてもよい。式IVのアヘンアルカロイド誘導体は、適切なアミノ化合物でシッフ塩基反応によって、オキシモルホン(RがCH3およびZがOHである、式(VII))またはナルトレキソン(Rが(シクロプロピル)メチルおよびZがOHである、式(VII)；式Vも参照)の6-ケト基を、イオン化の親水基(R"N=)に変換することによって、調製されていてもよい。
Figure 2008542395
 VII

同様の様式で、Zが水素である、式(III)および(IV)のデオキシオピエートは、容易に入手可能な出発物質から調製されていてもよい。
式(VII)の化合物は、例えば、米国特許番号3,723,440で、教示された方法を用いて、合成されてもよく、それらの開示は、ここで全体の参照によって本明細書において組み入れられる。
アンタゴニストは、例えば、不活性な希釈剤または吸収可能な食用の担体と共に経口的に投与されてもよく、またはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル剤で包まれてもよく、または錠剤に圧縮封入されてもよく、または食餌の食品と直接組み合わせてもよい。治療上の経口投与に対して、アンタゴニストは賦形剤と組み合わせてもよく、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤およびウエハースおよび同種のものの形式で使用される。そのような治療上有用な組成物のアンタゴニストの量は、当技術分野における技能の中のルーチン技術を使用して、適切な投薬量を達成するために調節される。アンタゴニストのための典型的な投薬量は、約0.1〜約1000 mgのアンタゴニストを含む、経口投薬単位の形式である。
錠剤、トローチ、ピル、カプセル剤および同種のものは、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンのような結合剤；リン酸カルシウムのような賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸および同種のもののような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、ラクトース、サッカリンのような甘味剤、および/または、ペパーミント、ウインターグリーン油またはサクランボ香味料のような香料の、1つまたは複数も含んでもよい。単位投薬形式がカプセルである場合、上記の型の材料に加えて、液体キャリアを含んでもよい。様々な他の材料は、コーティングとして、または他の場合には投薬単位の物理的形式を修飾するために存在してもよい。例えば、錠剤、ピルまたはカプセル剤は、セラック、糖または両方により覆われてもよい。シロップまたはエリキシルは、活性化合物(甘味剤としてショ糖、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、および/またはサクランボもしくはオレンジの風味のような香味料)を含んでもよい。もちろん、任意の単位投薬形式を調製するのに使用される任意の材料は、好ましくは、用いられた量において薬学的に純粋で実質的に無毒である。さらに、活性化合物は徐放性製剤および徐放性製剤へ組み入れられてもよい。
アンタゴニストは、さらに非経口的または腹腔内に投与されてもよい。未修飾の形式または薬理学的に許容できる塩としてアンタゴニストの溶液は検討され、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適切に混合された水で調製することができる。分散液も、グリセロール、液体のポリエチレングリコール好ましくは平均分子量が少なくとも15 kDaの高分子量ポリエチレングリコール、その混合物、および油脂で調製することができる。さらに、本明細書において開示された投与経路、または当技術分野において公知の任意の投与経路が使用されてもよい。
管理可能な組成物中の含有物のための薬理学的および薬学的に許容できる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸、パルモイン酸(palmoic)、3-ヒドロキシ-2-ナフタレンカルボキシル酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されたものを含むが、限定されない。適切な緩衝剤は、酢酸およびその塩(1〜2% WN)；クエン酸およびその塩(1〜3% WN)；ホウ酸およびその塩(0.5〜2.5% WN)；ならびにリン酸およびその塩(0.8〜2% WN)を含むが、限定されない。適切な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム(0.003〜0.03% WN)；5クロロブタノール(0.3〜0.9% WIN)；パラオキシ安息香酸エステル類(0.01〜0.25% WN)およびチメロサール(0.004〜0.02% WN)を含むが、限定されない。末梢オピオイドアンタゴニストの医薬組成物は、投与の容易性のために、滑沢剤、希釈剤、結合剤、担体および錠剤分解物質のような1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤も含んでもよい。他の助剤は、例えば安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、着色料、香味料および/または芳香活性化合物を含んでもよい。
薬学的に許容される担体または賦形剤は、任意の型の無毒な固形、半固形または液体の増量剤、希釈剤、封入材料または製剤補助物を指す。例えば、適切な薬学的に許容される担体、希釈剤、溶媒または賦形剤は、水、塩類(緩衝)溶液、アルコール、アラビアゴム、鉱物油および植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンのような炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、植物油、脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、および同種のものを含むが、限定されない。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング材の使用によって、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されてもよい。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸および同種のもののような、様々な抗菌性および抗真菌剤の含有によって確保されてもよい。
薬学的に許容される固形担体が使用される場合、アンタゴニストの投薬形式は錠剤、カプセル剤、粉末、坐剤またはトローチ剤であってもよいい。液体キャリアが使用される場合、ソフトゼラチンカプセル剤、経皮的貼付剤、エアゾルスプレー、塗り薬、シロップ剤または、液体懸濁液、エマルジョン剤または溶液が、投薬形式であってもよい。
非経口適用のためには、特に適切なものは、分散液、懸濁液、エマルジョンまたは坐剤を含む植込剤だけでなく、注射可能な滅菌液、好ましくは非水溶液または水溶液である。アンプルは単位投薬量を投与するのに便利な形式である。
注射可能な用途に適切な薬学的形式は、例えば、滅菌注射剤溶液または分散液の即時調製用の、滅菌水溶液または滅菌分散液および滅菌粉末を含む。すべての場合で、形式は好ましくは滅菌状態であり、注射による投与のための形式は、好ましくは、当技術分野において確立された規準に従って許容できる注射針通過性を提供するのに十分な粘性の低さである。アンタゴニストの形式は、好ましくは製造条件下および保存条件下で安定しており、好ましくは都合の悪い混入に対して耐性がある。担体は、例えば水、エタノール、多価アルコール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよび同種のもの)、それらの適切な混合物、植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えばレシチンのようなコーティング材の使用によって、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されてもよい。多くの場合では、等張の薬剤、例えば糖、塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤の使用、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンによって達成されてもよい。
滅菌注射剤溶液は適切な溶媒中で、必要な量の活性化合物を、上に開示された他の成分の様々なものと必要に応じ組み合わせること、その後の濾過滅菌または照射による滅菌によって調製されてもよい。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上に開示されたものからの必要な他の成分を含む滅菌賦形剤へ、滅菌された有効成分を組み合わせることによって調製されてもよい。滅菌注射剤溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製法は、有効成分の粉末に事前滅菌済み溶液からの任意の付加的な所望の成分を加えたものをも産出する、真空乾燥および/または凍結乾燥技術を含んでもよい。
注射可能なデポー形式はさらに適切であり、ポリラクチド-ポリグリコリド、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)のような生分解性高分子での薬剤のマイクロカプセルマトリックスの形成によって、作製してもよい。薬剤に対するポリマーの比率および用いられた特定のポリマーの性質によって、薬物放出率を制御することができる。デポー注射製剤も、体内組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンで薬剤を捕らえることによって調製される。注射製剤は、例えば、細菌を保持するフィルターを通した濾過によって、または使用直前に滅菌水または他の滅菌注射剤媒質中で溶解または分散することができる滅菌固形組成物の形式に滅菌剤を組み合わせることによって滅菌されてもよい。
腸への適用のために、特に適切なのは、錠剤、糖衣錠、液体、ドロップ、坐剤またはソフトゼラチンカプセル剤のようなカプセル剤である。甘味を付けた賦形剤が用いられる、シロップ、エリキシルまたは同種のものを使用することができる。
他の送達系は、徐放性、遅延放出性または徐放性(持続放出)送達系を含んでもよい。そのような系は、本発明の化合物の連続投与を回避し、患者および医師に対する利便性の増加が可能であり、所望の場合には化合物の一定の血漿中濃度を維持することができる。制御放出性送達系の多くの型が入手可能であり、当業者に公知である。徐放性組成物または制御放出性組成物は、例えば、リポソームとして、またはマイクロカプセル化、複数のコーティング、および同種のもののようなものによる差異的分解性のコーティングでの活性化合物の保護によって、製剤化することができる。
例えば、本発明の化合物は、治療上の組成物を形成するように生分解性高分子のような薬学的に許容される徐放性マトリックスと組み合わせてもよい。徐放性のマトリックスは、本明細書において使用されるように、典型的には、酵素的もしくは酸塩基の加水分解または溶解による分解性の、1つまたは複数のポリマーからなるマトリックスである。いったん身体に挿入されたならば、マトリックスは酵素および体液によって作用される。徐放性のマトリックスは、望ましくはリポソーム、ポリラクチド(ポリ乳酸)、ポリグリコリド(グリコール酸のポリマー)、ラクチドグリコリド共重合体(乳酸およびグリコール酸のコポリマー)、ポリ無水物、ポリ(オルト)エステル、多糖、ポリアミノ酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、およびシリコーンのようなポリマーに基づいた系のような生体適合性材料から選択されてもよい。非ポリマー系は、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、アミノ酸、ステロールのような脂質、ハイドロゲル放出系、シラスティック系、ペプチドに基づいた系、インプラントおよび同種のもののような化学成分からなる。具体例は、(a)米国特許番号4,452,775、4,675,189および5,736,152で開示されたように、多糖がマトリックス中に含まれている形式の侵食系(全体の参照によって本明細書において組み入れられる)、および(b)米国特許番号3,854,480、5,133,974および5,407,686で記述されるような、ポリマーから制御された比率で活性成分が浸透する拡散系(全体の参照によって本明細書において組み入れられる)を含むが、限定されない。さらに、ポンプ基づいた固定の送達系の使用が可能であり、それらのうちのいくつかは移植に適応する。適切な腸溶コーティングは、PCT公報番号WO 98125613および米国特許番号6,274,591に記述されており、両方は参照によって本明細書において組み入れられる。
長期的な徐放性のインプラントの使用は、慢性症状の治療に特に適切かもしれない。本明細書において使用されるように、「長期的な」放出は、インプラントが、有効成分の治療的レベルを、少なくとも7日間、および適切には30〜60日間送達するように構築および調整されることを意味する。長期的な徐放性のインプラントは当業者に周知であり、上に記述された放出系のうちのいくつかを含む。
局所適用のために、1つの実施形態では、非スプレー形式で、局所適用と適合する担体を含む、粘性のある状態から半固形または固形の形式の、水よりも好ましくは大きな動粘度を有するようなものを用いる。適切な製剤は、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、リニメント剤、膏薬、エアゾール剤、および同種のものを含み、それらは任意で滅菌、または助剤(例えば防腐剤および同種のもの)と混合されるが、限定されない。
末梢オピオイドアンタゴニストの医薬組成物の経皮的送達またはイオン導入送達も検討される。
本発明の治療上の化合物は、患者に単独でまたは薬学的に許容される担体と組み合わせて投与されてもよい。上に言及されるように、有効成分および担体の相対的比率は、例えば化合物の溶解度および化学的性質、選択された投与経路、および標準の薬学的手段によって決定されてもよい。
予防または治療に対して適切な本発明の化合物の投薬量は、投与の形式、選択された特定のアンタゴニスト、および治療下での特定の患者の生理的特性に応じて変化するだろう。典型的には、毎日の投薬量は、患者体重の1キログラム当たり約0.001〜約100ミリグラム(およびその中の範囲のすべてのコンビネーションおよびサブコンビネーション)の末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストの範囲でわたっていてもよい。好ましくは、毎日の投薬量は、患者の体重の1キログラム当たり約0.01〜約10ミリグラムの末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストであってもよい。さらに、毎日の投薬量は、患者体重の1キログラム当たり約0.1ミリグラムの末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストが好まれる。典型的な投薬量形式に関して、例えば錠剤状では、末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストは、約0.1〜約4ミリグラムの量で存在する。
本発明の1つの実施形態では、アンタゴニストが腸溶コーティングされている製品が経口的に投与される。腸溶コーティングによって、アンタゴニストが胃では放出されず、むしろ腸で放出されるように、胃腸管への放出を制御することは可能である。経口投与が望まれる場合、本発明の他の実施形態は、産物(例えばμ-オピオイド受容体アンタゴニスト)のうちの1つは、胃腸管の全体にわたって徐放性を達成し、さらにμ-オピオイド受容体アンタゴニストと産物製品中の他の化合物の間の物理的な接触を最小限にする役目をする、徐放性の材料により覆われる、組合せ製品を提供する。更に、この成分の放出が腸でのみ起こるように、徐放的に放出される成分はその上腸溶コーティングされてもよい。さらに他のアプローチは、その上活性のある成分を隔てるために、1つの成分が徐放性ポリマーおよび/または腸放出性ポリマーによりコートされ、他の成分も粘性度の低いヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)または当技術分野において公知の他の適切な材料のようなポリマーによりコートされる、組合せ製品の製剤を含む。ポリマーコートは、他の構成要素と相互作用への付加的なバリアを形成する役目をする。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、被験体に化合物の継続的な用量を提供する投薬処方計画(すなわち、従来の処方計画で見られるような体内の薬物濃度の変化を無くす処方計画)で投与される。適切には、継続的な用量は、本明細書において開示された送達方法のうちのいずれかを使用して、被験体へ毎日化合物を投与することによって達成されてもよい。1つの実施形態では、継続的な用量は、被験体へ継続的注入を使用して、または長期間に化合物の放出を促進するメカニズム、例えば経皮貼布または徐放性製剤によって達成されてもよい。適切には、本発明の化合物は、細胞バリア機能障害を阻害また減少させるのに効果的な、被験体血漿中の化合物濃度を維持するのに十分な量で被験体へ連続的に放出される。細胞バリア機能障害を、予防、減少、または除去するために、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて提供されたとしても、本発明に従う化合物は効果的な量で提供される。しかしながら、正常な医学的判断の範囲内で、主治医によって、本発明の化合物および組成物の毎日の合計使用量が決定されるであろうことは理解されるだろう。任意の特定の患者のための特異的な有効量レベルは、治療している障害および障害の重症度；用いられた特異的な化合物の活性；用いられた特異的な組成物；患者の年齢、体重、健康状態、性別および食餌；投与時間；投与経路；用いられた特異的な化合物の排泄率；治療の継続時間；用いられた特異的な化合物と共に併用使用または同時使用される薬剤、および医療技術で周知であるような因子を含む様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルの化合物用量で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投薬量を増加させることは、当技術分野における通常の技能のレベル内で適切である。
所望される場合、効果的な用量は投与の目的のために複数の用量に分割されてもよい。従って、単一の用量の組成物は、用量を作製するためにそのような量またはその分割量を含んでもよい。言及されたように、当業者は、適切な医学的手段および個々の患者の臨床状態によって決定されるような、有効量および同時投与の処方計画を、容易に最適化するだろう。
一般に、オピオイド受容体アンタゴニスト(特に末梢受容体アンタゴニスト)の経口投与量は、1日当たり約1〜約80mg/kg体重に及ぶだろう。2〜20mg/kg体重の範囲の経口投与量が、有益な結果をもたらすであろうことが期待される。一般に、静脈内投与および皮下投与を含む非経口的投与は、約0.001〜5mg/kg体重に及ぶだろう。0.05〜0.5mg/kg体重に及ぶ用量が、所望の結果をもたらすであろうことが期待される。投薬量は、投与様式に依存して、局所的または全身的で、所望の薬物濃度を達成するために適切に調節されてもよい。例えば、腸溶コーティング製剤中のオピオイドアンタゴニストの経口投与のための投薬量が、非コーティング製剤の経口投与量の10〜30%になるであろうことが期待される。そのような用量に対する患者の反応が不十分な場合、さらに高用量(またはより局所的な異なる送達経路による、より高い効果的な投薬量)は、患者の耐性が可能な程度まで用いられてもよい。1日当たり複数回の用量は、化合物の適切な全身的レベルを達成するために検討される。系の適切なレベルは、例えば、当業者に公知であるルーチンHPLC方法を使用して、患者の血漿中薬剤の濃度の測定によって決定することができる。
本発明のいくつかの実施形態では、オピオイド受容体アンタゴニストはオピオイド化合物と共に同時投与される。用語「同時投与」は、2つまたは複数の薬剤が患者または被験体に投与される任意の投与経路による併用療法を指すことが意味される。薬剤の同時投与は、併用療法または組合せ治療としても呼ばれてよい。薬剤は、同じ投薬製剤または個別の製剤でいてもよい。1つ以上の活性薬剤との組合せ治療のために、活性薬剤が個別の投薬製剤である場合には、活性薬剤は同時に投与すること、またはそれらは各々個別の時に投与することができる。これらの薬剤の投与が、両方の薬剤が身体中での有効濃度の達成を可能にすることが十分であるような様式で与えられる限り、薬剤は同時にまたは連続して投与されてもよい(すなわち、他の薬剤の投与のすぐ後に1つの薬剤が投与されてもよく、またはこの薬剤は一時的に与えられてもよい、すなわち、1つの薬剤は同時に与えられ、後で他の薬剤を続いて、例えば一週内に、与えることができる)。薬剤は、異なる経路によっても投与されてもよく、例えば、1つの薬剤は静脈内に投与されてもよいが、第2の薬剤は筋肉内に、静脈内にまたは経口的に投与されてもよい。言いかえれば、オピオイド化合物とのオピオイド受容体アンタゴニスト化合物の同時投与は、オピオイド受容体アンタゴニストおよびオピオイド化合物またはオピオイド薬剤を含む薬学的組合せ調製であり、毎日または断続的な方式のオピオイド受容体アンタゴニストの投与および毎日または断続的な方式のオピオイド薬剤の投与に適した調製であると適切には考えられる。したがって、オピオイド受容体アンタゴニストは、オピオイドの投与と同時に、またはオピオイドの投与後に、投与されてもよい。
同時投与可能な薬剤は、混合物として、例えば単一の製剤または単一の錠剤としても製剤化されてもよい。これらの製剤は、例えば米国特許番号6,277,384；6,261,599；5,958,452およびPCT公報番号WO 98125613に記述される製剤のような、非経口または経口のものであってもよく、各々は参照によって本明細書に組み入れられる。さらに、本明細書において開示または検討された同時投与と適合するような、当技術分野において公知の投与の任意の様式も、適切な投与の様式である。
さらに本発明の他の局面では、末梢オピオイド受容体アンタゴニストは、オピオイドアゴニストまたはオピオイド受容体アゴニスト、およびオピオイドアゴニストまたはオピオイド受容体アゴニストでない他の治療剤と共に同時投与されてもよい。オピオイドおよび末梢オピオイド受容体アゴニストは上に記述される。適切な治療剤は抗生物質および抗炎症剤を含む。その製剤は、当業者に公知の標準製剤化方法を使用して調製されてもよい。
抗生物質は、アセダプソン;アセトスルホンナトリウム;アラメシン(Alamecin);アレキシジン;アムジノシリン;アムジノシリンピボキシル;アミサイクリン;アミフロキサシン;メシル酸アミフロキサシン;アミカシン;硫酸アミカシン;アミノサルチル酸;アミノサリチル酸ナトリウム;アモキシシリン;アンホマイシン;アンピシリン;アンピシリンナトリウム;アパルシリンナトリウム;アプラマイシン;アスパルトシン;硫酸アストロマイシン;アビラマイシン;アボパルシン;アジスロマイシン;アズロシリン;アズロシリンナトリウム;塩酸バカンピシリン;バシトラシン;メチレンジサリチル酸バシトラシン;亜鉛バシトラシン;バンバーマイシン;ベンゾイルパスカルシウム;ベリスロマイシン(Berythromycin);硫酸ベタマイシン;ビアペネム;ビニラマイシン;塩酸ビフェナミン;ビスピリチオンマグスルフェクス(Bispyrithione Magsulfex);ブチカシン;ブチロシン硫酸;硫酸カプレオマイシン;カルバドックス;カルベニシリン2ナトリウム;カルベニシリンインダニルナトリウム;カルベニシリンフェニルナトリウム;カルベニシリンカリウム;カルモナムナトリウム;セファクロル;セファドロキシル;セファマンドール;セファマンドールナファート;セファマンドールナトリウム;セファパロール(Cefaparole);セファトリジン;セファザフルール(Cefazaflur)ナトリウム;セファゾリン;セファゾリンナトリウム;セフブペラゾン;セフジニル;セフェピム;塩酸セフェピム;セフェテコール（Cefetecol);セフィキシム;塩酸セフメノキシム;セフィメタゾール(Cefinetazole);セフィメタゾールナトリウム;セフォニシド1ナトリウム;セフォニシドナトリウム;セフォペラゾンナトリウム;セフォラニド;セフォタキシムナトリウム;セフォテタン;セフォテタン2ナトリウム;塩酸セフォチアム;セホキシチン;セフォキシチンナトリウム;セフピミゾール;セフピミゾールナトリウム;セフピラミド;セフピラミドナトリウム;硫酸セフピロム;セフポドキシムプロキセチル;セフプロジル;セフロキサジン;セフスロジンナトリウム;セフタジジム;セフチブテン;セフチゾキシムナトリウム;セフトリアキソンナトリウム;セフロキシム;セフロキシムアキセチル;セフロキシムピボキセチル;セフロキシムナトリウム;セファセトリルナトリウム;セフレキシン;塩酸セフレキシン;セファログリシン;セファロリジン;セファロチンナトリウム;セファピリンナトリウム;セフラジン;塩酸セトサイクリン(Cetocycline);セトフェニコール;クロラムフェニコール;パルミチン酸クロラムフェニコール;パントテン酸クロラムフェニコール錯体;コハク酸クロラムフェニコールナトリウム;ホスファニル酸クロルヘキシジン;クロロキシレノール;二硫酸クロルテトラサイクリン;塩酸クロルテトラサイクリン;シノキサシン;シプロフロキサシン;塩酸シプロフロキサシン;シロレマイシン(Cirolemycin);クラリスロマイシン;塩酸クリナフロキサシン;クリンダマイシン;塩酸クリンダマイシン;塩酸パルミチン酸クリンダマイシン;リン酸クリンダマイシン;クロファジミン;クロキサシリンベンザチン;クロキサシリンナトリウム;クロキシキン;コリスチンメタナトリウム;硫酸コリスチン;クーママイシン;クーママイシンナトリウム;シクラシリン;シクロセリン;ダルホプリスチン;ダプソン;ダプトマイシン;デメクロサイクリン;塩酸デメクロサイクリン;デメサイクリン(Demecycline);デノフンギン(Denofingin);ジアベリジン;ジクロキサシリン;ジクロキサシリンナトリウム;硫酸ジヒドロストレプトマイシン;ジピリチオン;ジリスロマイシン;ドキシサイクリン;ドキシサイクリンカルシウム;ドキシサイクリンホスファテックス;ドキシサイクリンヒクラート;ドロキサシンナトリウム;エノキサシン;エピシリン;塩酸エピテトラサイクリン;エリスロマイシン;エリスロマイシンアシストラート;エリスロマイシンエストレート;エチルコハク酸エリスロマイシン;グルコヘプトン酸エリスロマイシン;ラクトビオン酸エリスロマイシン;プロピオン酸エリスロマイシン;ステアリン酸エリスロマイシン;塩酸エタンブトール;エチオナミド;フレロキサシン;フロキサシリン;フルダラニン;フルメキン;ホスホマイシン;ホスホマイシントロメタミン;フモキシシリン(Fumoxicillin);塩化フラゾリウム;酒石酸フラゾリウム;フシジン酸ナトリウム;フシジン酸;硫酸ゲンタマイシン;グロキシモナム(Gloximonam);グラミシジン;ハロプロジン;ヘタシリン;ヘタシリンカリウム;ヘキセジン;イバフロキサシン;イミペネム;イソコナゾール;イセパミシン;イソニアジド;ジョサマイシン;硫酸カナマイシン;キタサマイシン;レボフラルタドン;レボプロピルシリン(Levopropylcillin)カリウム;レキシスロマイシン(Lexithromycin);リンコマイシン;塩酸リンコマイシン;ロメフロキサシン;塩酸ロメフロキサシン;メシル酸ロメフロキサシン;ロラカルベフ;マフェナイド;メクロサイクリン;スルホサリチル酸メクロサイクリン;リン酸メガロミシン(Megalomicin)カリウム;メキドクス;メロペネム;メタサイクリン;塩酸メタサイクリン;メテナミン;馬尿酸メテナミン;マンデル酸メテナミン;メチシリンナトリウム;メチオプリム;塩酸メトロニダゾール;リン酸メトロニダゾール;メズロシリン;メズロシリンナトリウム;ミノサイクリン;塩酸ミノサイクリン;塩酸ミリンカマイシン(Mirincamycin);モネンシン;モネンシンナトリウム;ナフシリンナトリウム;ナリジクス酸ナトリウム;ナリジキシン酸;ナタマイシン;ネブラマイシン;パルミチン酸ネオマイシン;硫酸ネオマイシン;ウンデシレン酸ネオマイシン;硫酸ネチルマイシン;ニュートラマイシン(Neutramycin);ニフラデン;ニフラルデゾン;ニフラテル;ニフラトロン;ニフルダジル;ニフリミド;ニフルピリノール;ニフルキナゾール;ニフルチアゾール;ニトロサイクリン(Nitrocycline);ニトロフラントイン;ニトロミド;ノルフロキサシン;ノボビオシンナトリウム;オフロキサシン;オルメトプリム;オキサシリンナトリウム;オキシモナム(Oximonam);オキシモナムナトリウム;オキソリン酸;オキシテトラサイクリン;オキシテトラサイクリンカルシウム;塩酸オキシテトラサイクリン;パルジマイシン(Paldimycin);パラクロロフェノール;パウロマイシン;ペフロキサシン;メシル酸ペフロキサシン;ペナメシリン(Penamecillin);ベンザチンペニシリンG;ペニシリンGカリウム;プロカインペニシリンG;ペニシリンGナトリウム;ペニシリンV;ベンザチンペニシリンV;ヒドラバミンペニシリンV:ペニシリンVカリウム;ペンチジドンナトリウム;アミノサリチル酸フェニル;ピペラシリンナトリウム;ピルベニシリン(Pirbenicillin)ナトリウム;ピリジシリン(Piridicillin)ナトリウム;塩酸ピルリマイシン;塩酸ピバンピシリン;ピバンピシリンパモエート;ピバンピシリンプロベネート;硫酸ポリミキシンB;ポルフィロマイシン;プロピカシン(Propikacin);ピラジンアミド;ピリチオン亜鉛;酢酸キンデカミン;キヌプリスチン;ラセフェニコール(Racephenicol);ラモプラニン;ラニマイシン(Ranimycin);レロマイシン;レプロマイシン(Repromicin);リファブチン;リファメタン(Rifametane);リファメキシル(Rifamexil);リファミド(Rifamide);リファンピン;リファペンチン;リファキシミン;ロリテトラサイクリン;硝酸ロリテトラサイクリン:ロサラマイシン(Rosaramicin);酪酸ロサラマイシン;プロピオン酸ロサラマイシン;リン酸ロサラマイシンナトリウム;ステアリン酸ロサラマイシン;ロソキサシン;ロキサルソン;ロキシスロマイシン;サンサイクリン(Sancycline);サンフェトリネム(Sanfetrinem)ナトリウム;サルモキシシリン(Sarmoxicillin);サルピシリン(Sarpicillin);スコパフンギン(Scopafingin);シソマイシン;硫酸シソマイシン;スパリロキサンシン(Spariloxacin);塩酸スペクチノマイシン;スピラマイシン;塩酸スタリマイシン(Stallimycin);ステフィマイシン;硫酸ストレプトマイシン;ストレプトニコジド(Streptonicozid);スルファベンズ;スルファベンザミド;スルファセタミド;スルファセタミドナトリウム;スルファシチン;スルファジアジン;スルファジアジンナトリウム;スルファドキシン;スルファレン;スルファメラジン;スルファメーター;スルファメタジン;スルファメチゾール;スルファメトキサゾール;スルファモノメトキシン;スルファモキソール;スルファニル酸亜鉛;スルファニトラン;スルファサラジン;スルファソミゾール;スルファチアゾール;スルファザメト;スルフイソキサゾール;スルフイソキサゾールアセチル;スルフイソキサゾールジオラミン;スルホミキシン(Sulfomyxin);スロペネム;スルタミシリン;サンシリン(Suncillin)ナトリウム;塩酸タランピシリン;テイコプラニン;塩酸テマフロキサシン;テモシリン;テトラサイクリン;塩酸テトラサイクリン;リン酸テトラサイクリン錯体;テトロキソプリム;チアンフェニコール;チフェンシリン(Thiphencillin)カリウム;チカルシリンクレジルナトリウム;チカルシリン2ナトリウム;チカルシリン1ナトリウム;チクラトン;塩化チドニウム(Tiodonium);トブラマイシン;硫酸トブラマイシン;トスフロキサシン;トリメトプリム;硫酸トリメトプリム;トリスルファピリミジン(Trisulfapyrimidine);トロレアンドマイシン;硫酸トロスペクトマイシン(Trospectomycin);チロトリシン:バンコマイシン;塩酸バンコマイシン;バージニアマイシン;またはゾルバマイシン(Zorbamycin)を含む。
抗ウイルス剤は、アセマンナン;アシクロビル;アシクロビルナトリウム;アデフォビル;アロブジン;アルビルセプトスドトックス(Alvircept Sudotox);塩酸アマンタジン;アラノチン;アリルドン;メシル酸アテビルジン;アブリジン;シドフォビル;シパムフィリン(Cipamfylline);塩酸サイトシンアラビノサイド;メシル酸デラビルジン;デスシクロビル;ジダノシン;ジソキサリル;エドクスジン;エンビラデン;エンビロキシム;ファムシクロビル;塩酸ファモチン;フィアシタビン;フィアルリジン;フォサリラート;ホスカメト(Foscamet)ナトリウム;ホスホネトナトリウム;ガンシクロビル;ガンシクロビルナトリウム;イドクスウリジン;ケトキサール(Kethoxal);ラミブジン;ロブカビル;塩酸メモチン;メチサゾン;ネビラピン;ペンシクロビル;ピロダビル;リバビリン;塩酸リマンタジン;メシル酸サキナビル;塩酸ソマンタジン;ソリブジン;スタトロン;スタブジン;塩酸チロロン;トリフルリジン;塩酸バラシクロビル;ビダラビン;リン酸ビダラビン;リン酸ビダラビンナトリウム;ビロキシム;ザルシタビン;ジドブジン;ジンビロキシムを含む。
抗真菌剤は、アクリゾルシン;アンブルチシン(Ambruticin);アムホテリシンB;アザコナゾール;アザセリン;バジフンギン(Basifungin);ビホナゾール;塩酸ビフェナミン;ビスピリチオンマグスルフェクス(Bispyrithione Magsulfex);硝酸ブトコナゾール;ウンデシレン酸カルシウム;カンジシジン;石炭酸フクシン;クロルダントイン;シクロピロックス;シクロピロクスオラミン;シロフンギン(Cilofungin);シスコナゾール;クロトリマゾール;クプリミキシン;デノフンギン(Denofungin);ジピリチオン;ドコナゾール;エコナゾール;硝酸エコナゾール;エニルコナゾール;硝酸エトナム(Ethonam);硝酸フェンチコナゾール;フィリピン;フルコナゾール;フルシトシン;フンギマイシン(Fungimycin);グリセオフルビン;ハマイシン(Hamycin);イソコナゾール;イトラコナゾール;カラフンギン(Kalafungin);ケトコナゾール;ロモフンギン(Lomofungin);リジマイシン(Lydimycin);メパルトリシン;ミコナゾール;硝酸ミコナゾール;モネンシン;モネンシンナトリウム;塩酸ナフチフィン;ウンデシレン酸ネオマイシン;ニフラテル;ニフルメロン;塩酸ニトララミン(Nitralamine);ナイスタチン;オクタン酸;硝酸オルコナゾール;硝酸オキシコナゾール;塩酸オキシフンギン;塩酸パルコナゾール;パルトリシン(Partricin);ヨウ化カリウム;プロクロノール;ピリチオン亜鉛;ピロルニトリン;ルタマイシン;塩化サングイナリウム;サペルコナゾール:スコパフンギン(Scopafungin);硫化セレン;シネフィンギン(Sinefingin);硝酸スルコナゾール;テルビナフィン;テルコナゾール;チラム;チクラトン;チオコナゾール;トルシクラート;トリンダート;トルナフタート;トリアセチン;トリアフンギン;ウンデシレン酸;ビリドフルビン(Viridofulvin);ウンデシレン酸亜鉛;または塩酸ジノコナゾールを含む。
抗炎症剤は、アルクロフェナク;プロピオン酸アルクロメタゾン;アルゲストンアセトニド;αアミラーゼ;アムシナファル(Amcinafal);アムシナファイド(Amcinafide);アンフェナクナトリウム;塩酸アミプリロース;アナキンラ;アニロラク;アニトラザフェン;アパゾン;バルサラジド2ナトリウム;ベンダザック;ベノキサプロフェン;塩酸ベンジダミン;ブロメライン;ブロペラモール;ブデソニド;カルプロフェン;シクロプロフェン;シンタゾン(Cintazone);クリプロフェン;プロピオン酸クロベタゾール;酪酸クロベタゾン;クロピラク;プロピオン酸クロチカゾン;酢酸コルメタゾン(Cormethasone);コルトドキソン;デフラザコルト;デソニド;デソキシメタゾン;ジプロピオン酸デキサメタゾン;ジクロフェナクカリウム;ジクロフェナクナトリウム;酢酸ジフロラゾン;ジフルミドンナトリウム;ジフルニサル;ジフルプレドナート;ジフタロン;ジメチルスルホキシド;ドロシノニド(Drocinonide);エンドリソン(Endrysone);エンリモマブ(Enlimomab);エノリカムナトリウム;エピリゾール;エトドラク;エトフェナマート;フェルビナク;フェナモール;フェンブフェン;フェンクロフェナク;フェンクロラク;フェンドサール;フェンピパロン;フェンチアザク;フラザロン;フルアザコルト;フルフェナム酸;フルミゾール;酢酸フルニソリド;フルニキシン;フルニキシンメグルミン;フルオコルチンブチル;フルオロメトロン酢酸;フルクァゾン;フルルビプロフェン;フルレトフェン;プロピオン酸フルチカゾン;フラプロフェン;フロブフェン;ハルシノニド;プロピオン酸ハロベタゾール(Halobetasol);酢酸ハロプレドン;イブフェナック;イブプロフェン;イブプロフェンアルミニウム;イブプロフェンピコノール;イロニダプ;インドメタシン;インドメタシンナトリウム;インドプロフェン;インドキソール;イントラゾール;酢酸イソフルプレドン;イソキセパク;イソキシカム;ケトプロフェン;塩酸ロフェミゾール;ロルノキシカム;ロテプレドノールエタボネート;メクロフェナム酸ナトリウム;メクロフェナム酸;メクロリソン(Meclorisone)ジブチラート;メフェナム酸;メサラミン;メセクラゾン;スレプタン酸メチルプレドニゾロン;モルニフルマート;ナブメトン;ナプロキセン;ナプロキセンナトリウム;ナプロキソール;ニマゾン;オルサラジンナトリウム;オルゴテイン;オルパノキシン;オキサプロジン;オキシフェンブタゾン;塩酸パラニリン(Paranyline);ペントサンポリサルフェートナトリウム;グリセリン酸フェンブタゾン(Phenbutazone)ナトリウム;ピルフェニドン;ピロキシカム;桂皮酸ピロキシカム;ピロキシカムオラミン;ピルプロフェン;プレドナザート(Prednazate);プリフェロン;プロドール酸;プロクァゾン;プロキサゾール;クエン酸プロキサゾール;リメキソロン;ロマザリット;サルコレクス;サルナセジン;サルサレート;塩化サングイナリウム;セクラゾン;セルメタシン;スドキシカム;スリンダク;スプロフェン;タルメタシン;タルニフルマート;タロサラート;テブフェロン;テニダプ;テニダプナトリウム;テノキシカム;テシカム;テシミド;テトリダミン(Tetrydamine);チオピナク;ピバル酸チキソコルトル(Tixocortol);トルメチン;トルメチンナトリウム;トリクロニド(Triclonide);トリフルミダート;ジドメタシン;グルココルチコイドまたはゾメピラックナトリウムを含む。
実施例
実施例１
GFP-PA-Iレポーター株の構築
GFP-PA-I融合構築物を含むプラスミドを、従来の組換型DNA技術を使用して構築した。テンプレートとしてpBI-EGFPプラスミド(クロンテック(Clontech))を使用して、緑色蛍光タンパク質をコードするEGFP遺伝子を増幅した。XbaIおよびPstI制限部位を、プライマーTCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGGATG(配列番号1)およびぷらいまーGCAGACTAGGTCGACAAGCTTGATATC(配列番号2)を使用して導入した。PCR産物は、TAクローニングキット(インビトロゲン(Invitrogen))を使用して、pCR 2.1ベクターへ直接クローニングし、その後pCR2.1/EGFP構築物を大腸菌DH5a大腸菌DH5aに形質転換した。EGFP遺伝子を、XbaIおよびPstIによる消化によってこの構築物から切り出し、切り出された遺伝子を含む断片を、同じ制限酵素で消化された大腸菌-緑膿菌シャトルベクターpUCP24へクローニングした。シャトルベクター中にEGFP遺伝子を含む、生じた構築物(すなわちpUCP24/EGFP)を、典型的には、緑膿菌の電気的コンピテント菌へ、25μFおよび2500Vで電気穿孔した。pUCP24/EGFPを含む細胞を、典型的には100μg/mlでゲンタマイシン(gm)の投与によって選択した。効果的に遺伝子工学的に遺伝子を連結して、EGFP遺伝子に隣接してPA-Iレクチン/アドヘシン遺伝子が配置されたpUCP24/EGFPの派生物を生成した。lecA構造遺伝子を組み込むことに加えて、構築物はrRNA配列と共に、lecAの5'非コード領域中のQS luxボックス配列およびRpoSコンセンサス配列を含んデーター。派生構築物は、pUCP24/PLL-EGFPと名付けられた。当業者は、lecA単独またはEGFPのようなマーカー遺伝子へ物理的に隣接したlecAを提供するために適切な他の構築物と同様に、上記構築物を作製および使用する方法を、様々な技術のうちのいずれかを使用して理解するだろう。
実施例２
PA-Iの所在
PA-Iレクチン/アドヘシンは、従来の技術を使用して、これまでに記述されていない、緑膿菌の外側表面上の構造的な付属物に局在が認められた。
実施例３
インビトロおよびインビボにおける観察の相関性
シー・エレガンス(C. elegans)は、BSCシグナリングおよびPA-Iの産生におけるBSC役割のインビボのモデル系として適切である。シー・エレガンスは、緑膿菌に対する宿主の反応の研究において、高精度の予測可能なモデルとして認められる。シー・エレガンス虫は、固形アガー上で緑膿菌の芝生状のもの（以下、芝生）を餌とし、したがって、微生物による病因、特に腸由来敗血症(感染様式は消化管経由であるので)に関する研究における、理想的な系を提供する。これらの線虫は、固形アガープレート上で増殖する大腸菌のような細菌を容易に餌とし、緑膿菌の特異株を与えた場合、死亡率は72時間内に50%を上回る。このモデルによる死亡率は、緑膿菌の株と同様にアガー環境の両方にも依存することが示された。特定の株はこのモデルでは高い致死性であるが(例えばPA14)、他の株(PAO1)は中間の死亡率を示す。完全配列決定緑膿菌株PAO1の芝生の上でをシー・エレガンスを扶養する能力、および選択されたトランスポゾン変異体は、PA-Iを発現する能力に対してスクリーニングされる様々な宿主ストレス由来のBSCを寒天プレートで濃縮しながら、腸上皮に対するインビボの毒性に積極的に関与する遺伝子のための迅速なスクリーニング系を利用可能とする。このアプローチにより、上皮細胞バリア機能障害を患うヒト患者で観察された毒性表現型を正確に特徴づけることで、そのようなモデルで得られた結果が非常に信頼できると証明されるだろうという期待と共に、インビトロで観察された毒性表現型はインビボのモデルに移された。
実施例４
外科的ストレスの間に放出されたインビボの「合図」のインビトロにおける再現
pH、浸透圧およびノルエピネフリンはPA-I発現を変化させないが、オピオイド、インターフェロンγ、C4-HSL、および低酸素および高温の腸上皮細胞からの培地はA-I発現を誘導したことが、インビトロの研究により実証された。PA-Iは、PA-Iを誘導する化合物の存在下の上皮細胞分析で機能的に発現された。
実施例５
上皮を渡る毒素流出
エキソトキシンAをAlexaFluor 594により標識し、経上皮流出を、純粋なPA-Iタンパク質の異なる濃度でのMDCK細胞のアピカル面（非接着面）への適用によって起こる、MDCK単層細胞の経上皮抵抗(TEER)の減少の様々なレベルで測定した。経上皮抵抗が対照の50%未満に減少した場合、MDCK細胞を越えたエキソトキシンA流出の5倍の増加が見られた。精製されたPA-Iは、緑膿菌と同じ程度まで上皮細胞のTEERを減少させた。緑膿菌のPA-Iのヌル変異体は、MDCK細胞の経上皮抵抗に対して有意な減少効果があった。実験の遂行に使用する技術は、実施例23に記述されるもの、または当技術分野において通常のものである。
実施例６
精製されたPA-Iに対する上皮の反応
細胞極性の程度(すなわち細胞密集度およびタイトジャンクション付着の程度)は、精製されたPA-Iタンパク質に対する反応の程度を決定することが示された。緩く密集した細胞は、「よりタイトな状態の」より分化した細胞の単層と比較して、PA-Iに反応しTEERは大きく減少した。さらに、創傷した単層は、PA-I結合が密である領域を露出した。実施例24に記述されるように、細胞培養が実行された；相対的な密集度を、当技術分野において公知であるような通常技術を使用して評価した。
実施例７
可溶性宿主因子は、PA-Iレクチン/アドヘシンの発現を誘導する
GFPレポーター株は、ストレスを受けた(30%の肝臓切除術)宿主の腸管内で、緑膿菌の毒性遺伝子発現がインビボで発現されるという実証を可能にする。EGPFレポーター構築物は、PA-I発現に関与する、公知の上流の制御領域(例えばluxボックス(QSプロモーターエレメント)およびRpoS)を含むように特異的に設計された。次に、PLL-EGFPと名付けられたEGFP-PA-Iレポーター株を、擬似手術をした(対照)マウスおよび外科的肝切除を受けたマウスの盲腸に注入した。次に24時間後に、糞便および洗浄された盲腸粘膜を蛍光性の細菌の存在について分析した。盲腸の内腔内および腸上皮との接触への反応の両方において、PA-Iは、異化(外科的)ストレスにさらされたマウスの局所的腸微環境(盲腸)の要素に反応して、インビボで(対照レベルの3〜6倍以上)発現された。これらの研究結果は、RNA保護システムの使用によって細菌のRNAが新鮮な糞便から抽出される分析を使用して、非レポーター株およびPA27853で確認された。対照マウスおよび肝臓切除マウスの盲腸へPA27853が導入された反復研究を実行し、次に細菌のRNAを、PA-IおよびエキソトキシンA(それぞれ、約600%および800%)の両方の定量的RT-PCR(QRT-PCR)のために新鮮な糞便から24時間後に回収した。この分析は、緑膿菌毒性遺伝子発現に対する盲腸環境のその場所での効果についての正確な分子的な「スナップ写真」を提供する。結果から、ストレスを受けた宿主の盲腸微環境が、PA-IおよびエキソトキシンA毒性遺伝子発現を誘導することが実証された。次に、これらの研究結果が、腸管腔へ放出された可溶性因子のためかどうか決定するために、微粒子のない濾液を、対照マウスおよび肝臓切除マウスの盲腸管腔の内容物から調製し、レポーター株PLL-EGFPの新鮮な培養に加えた。結果から、PA-I GFPレポーター株を、外科的肝切除を行なったマウスの濾過盲腸内容物に曝露した場合、擬似手術マウスのろ過された盲腸内容物の112%±15と比較して、蛍光の248%±12の増加が観察されることが実証された(P<0.001)。これらの結果は、PA-I発現を活性化する可溶性因子が、外科的ストレス後の腸管腔に存在することを示した。1番めは、可溶性のPA-I誘導性成分は、腸管自体の内部から、または全身的な区画から生成されるのかどうか、および2番目は、可溶性のPA-I誘導性成分は、肝臓切除術誘導性ストレスに特異的かどうか、という残存する2つの問題が含まれた。これらの問題に取り組むために、単離された腸の係蹄(6cm、近位回腸)の管腔にカニューレを挿入し、10分間の虚血後に10分間の再潅流が後続し、時刻を決めた管腔の灌流液の分割量を回収する、分節腸管虚血の動物モデルを開発した。次に、PA-I発現に対する全身的な因子の効果を決定するために、実験の終了時で血液を採取した。これらの結果は、1)肝臓切除術に類似する腸管虚血は、緑膿菌がPA-Iを発現するようにシグナリングできる可溶性因子を腸管腔へ放出することができる；2)虚血の間には腸が全身的な因子から分離されているので、これらの因子は腸管自体から生じるだろう；3)血液成分はPA-I発現を誘導しない；および4) 正常細菌叢(水洗された小腸部分で実質的には不在)の存在は、この反応に役割を持たないように見える、ということを示した。PA-Iのインビボの発現が、局所的な微環境の物理化学的変化に対する外科的ストレスの二次的効果のためであるという可能性を除外するために、緑膿菌株PA-27853およびレポーター株(PLL-EGFP)を、低酸素環境(0.3%O2)、pH変化(6〜8)、および80%CO2に曝露した。これらの条件のどれもPA-I発現を誘導しなかった。さらに、擬似手術後のマウスもしくは肝臓切除術後のマウスの血液または肝臓組織に曝露されたレポーター株は、促進された蛍光を示さなかった。これらの研究は、外科的および虚血性ストレスに反応して放出された細菌のシグナリング成分は腸管で高く濃縮され、腸管腔から分離可能であり、腸管腔内で検出される宿主細胞由来因子により生成されることを示唆する。これらの結果に基づいて、腸上皮細胞のような上皮細胞へのストレス(例えば手術、外傷のような損傷、病気、熱、飢餓、低酸素および同種のもの)のいかなる形式も、典型的には、細菌のシグナリングに関与する少なくとも1つの可溶性因子(すなわち少なくとも1つ可溶性BSC)のレベルの変化に結びつくだろうことが期待される。
実施例８
PA-Iレクチン/アドヘシン発現を誘導する細菌のシグナリング化合物(BSC)は、上皮細胞で見出される
Caco-2腸上皮細胞を使用して、PA-Iの発現の誘導に、腸上皮細胞の成分自体が役割を果たすかどうかについての問題に取り組んだ。株PA27853を、様々な時間間隔で、培地(アピカル面および側底部)およびCaco-2細胞画分(細胞質、核、膜)に曝露した。GalNac(特異的にPA-Iに結合し、Caco-2細胞への緑膿菌接着を妨げる糖)の存在下および非存在下で、様々なCaco-2細胞培地画分へ反応した、PA27853のPA-I mRNAを測定した。トランスウェル(Transwell)で増殖したCaco-2細胞からの培地(アピカル面または側底部)のみは、PA-I発現に効果がなかった。しかしながらCaco-2細胞膜画分は、非常に多量のPA-I mRNA(>10倍増加)の蓄積を引き起こした(GalNacの存在下では減少していた効果)。これらのインビトロの研究結果は、腸上皮との接触に反応してPA-Iを活性化することができることを示す上記のマウス研究に一致しており、さらに、ストレスを受けてないCaco-2細胞系では、対照マウスと同様に、管腔内容物(アピカル面の培地)は効果がなかった。PA27853をCaco-2細胞のアピカル表面上に接種し、しっかりと付着させた(伸展培養)実験は、PA-I mRNAの増加(それはGalNacの存在下でほとんど完全に消失する)を実証した。したがって、PA-I発現は膜結合型因子および可溶性因子の両方によって影響を受け、細菌のシグナリング過程の調節因子は、可溶性因子、膜結合型の因子、または両方の作用因子(すなわち促進因子および活性化因子および抑制因子)を含んでいるが、限定されないことが考えられる。
実施例９
ストレスを受けたCaco-2細胞は、PA-Iレクチン/アドヘシン発現を誘導する可溶性因子を放出する
外科的損傷の条件下で、腸上皮が曝露されるストレスの型を再現するために、Caco-2細胞の密集した単層培養を、低酸素ストレス(1時間0.3%の低酸素＋30分の正常酸素の回復)へさらした。次に、PA-I GFPレポーター株(PLL-EGFP)を、ストレスを受けた細胞およびストレスを受けていない細胞からのアピカル面の培地へ曝露した。この結果から、PLL-EGFPの相対的蛍光単位(RFUの)に基づいた、これらの株のPA-Iプロモーター作用の迅速で有意な増加が実証された。結果はノーザンブロット解析によって確認された。これらの実験の空間的時間的ダイナミクスについての分析を、蛍光顕微鏡を使用して行なった。低酸素細胞では、接触誘導性のPA-Iプロモーター活性の発現が観察され、Caco-2細胞の3細胞結合への細菌の優先的な接着が実証された(図8B)。熱ショックストレス(42℃1時間＋2時間の回復)へCaco-2細胞を曝露する反復実験は、低酸素と同様の研究結果を実証した。熱ショックストレスを受けたCaco-2細胞からのアピカル面の培地へ曝露されたPA-I GFPレポーター株で、蛍光の約10倍の増加が観察された。低酸素ストレスおよび熱ショックストレスを受けたCaco-2細胞からの膜画分は、グループ間で定量的に区別することができない、非常に高PA-I発現(およそ100倍)を誘導した。
低酸素ストレスおよび熱ショックストレスを受けたCaco-2細胞からの培地を、次に、セントリコン(centricone)を使用して、PA-I発現を誘導する特異的なMW画分を同定きるかを決定するために、5つの分子量画分(<3、3〜10、10〜20、20〜30、>30 kDa)へ分画した。さらに、細菌のシグナリング化合物(複数可)がタンパク質かどうか決定するために、画分を熱不活性化およびタンパク質阻害剤のプロテイナーゼKにより処理した。低酸素の培地については同定された画分は10〜30 kDであり、熱ショック画分については同定された画分は30〜50 kDだった。両方の画分が不活性化され、タンパク質であるBSCと一致していた。これらの実験からのデーターは、タンパク質(ペプチド)であるCaco-2細胞に低酸素ストレスおよび熱ショックストレスに反応してアピカル面の培地へ放出される2つの別個の細菌のシグナリング化合物があることを強く示唆する。1) 分画された化合物は可溶性で、Caco-2細胞の大きなシートの増殖によって無制限供給に大量生産することができ、2) 化合物はタンパク質で、したがって、質量分析によって容易に特徴づけることおよび同定できるので、これらの研究結果は重要である。より高度に精製され特徴づけられた因子は技術開発を促進するが、そのような因子の活性(例えば細菌のシグナル伝達活性)の調節因子のためのスクリーニングは、当業者に明らかな単なるルーチン手順を使用した規定のスクリーニング方法論に対する変形により、現在使用可能である。
刺激された免疫細胞は、PA-Iレクチン/アドヘシン発現を誘導する因子を放出する。
粘膜上皮の表面(緑膿菌のコロニー形成の原発部位)で放出された免疫要素は、宿主ストレスに由来する細菌のシグナリング化合物として適切な候補であると考えられた。免疫因子が緑膿菌毒性を活性化することができるかどうか決定する生理的に適切なインビトロの系として、抗原によって刺激されたT細胞からの上清を、PA-I-GFPレポーター構築物により、緑膿菌株PLL-EGFP/27853のPA-I発現を増加させる能力について評価した。緑膿菌細胞を、刺激されたT細胞からの上清とインキュベートし、PA-I発現をGFP発現レベル(蛍光)によって評価した。サイトカインの包括的なアレイを放出する、活性化T細胞からの培地は(D. J. Schwartzentruber, S. L. Topalian, M. Mancini, S. A. Rosenberg, J Immunol 146, 3674 (May 15, 1991))、PA-I-GFP融合レポーター株の蛍光の促進によって評価されるようなPA-I発現を誘導した(L. Wu et al., Gastroenterology 126, 488 (Feb, 2004)) (図1A)。
この効果がサイトカインのためかどうかを決定するために、レポーター株を、様々なサイトカイン(ヒトIL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、インターフェロンγ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子α(TNF-α))へ曝露し、IFN-γのみが、増殖の初期の定常相で始まるPA-I発現の有意な増加を示した(図1C)。検査されたサイトカインのどれも、細菌増殖にいかなる有意な効果はなかった(図1B)。PA-I発現を促進するために、活性化T細胞の培地中にIFN-γが必要かどうか検査するために、特異的抗体を使用して活性化T細胞の培地からIFN-γを枯渇させた。IFN-γの培地の免疫的枯渇はPA-Iを誘導する能力の完全な損失をもたらし(図1A)、IFN-γはこの系におけるPA-I発現にとって必須であることを示唆する。さらに宿主ストレス由来の細菌のシグナリング化合物としてのIFN-γの役割を確認するために、ヒト組換型IFN-γ、TNF-αおよび様々な他のサイトカイン(IL-2、IL-4、IL-8、IL-10)に対して、緑膿菌のPAO1のゲノムシークエンスされた株(C. K. Stover et al., Nature 406, 959 (Aug 31, 2000))を曝露し、ノーザンブロットによってlecA(PA-Iをコードする)mRNAを測定した。IFN-γはlecA mRNAを誘導したが、TNF-αまたは他のサイトカインはしなかった(図1D)。これらのデーターは、緑膿菌が促進された毒性をともなって反応する宿主細胞に由来する細菌のシグナリング分子として、ヒトIFN-γが作動することを示した。
実施例１０
候補薬剤のスクリーニングによる宿主ストレス由来のBSCの同定：サイトカインの役割
迅速に宿主BSCを同定する方法として、緑膿菌株を、アデノシン(低酸素に反応してCaco-2細胞により放出される)TNF、IL-2、IL-6 、IL-8(細菌の侵入/虚血に反応して上皮により放出される)、およびIFN-γ(細菌の侵入/虚血に反応して上皮内リンパ球により放出される)を含む培地に対して曝露した。さらに、株を、様々な上皮由来のサイトカインの単一および組合せに対して側底部側で曝露されたCaco-2細胞からのアピカル面の培地に対して曝露した。Jerrold Turner博士は、IFNγおよびTNFαの組合せに対するCaco-2細胞の側底部の曝露が、タイトジャンクションタンパク質および機能を変える細胞のシグナリングタンパク質を劇的に活性化することを実証した。これらのサイトカインの様々な組合せに対して曝露されたCaco-2細胞からの培地は、PA-I発現には効果がなかった。しかしながら、IFN-γは単独でPA-I発現に対する直接効果を誘導したが、他の化合物は単独ではどれも効果がなかった。他の問題は、株PA27853について、IFNγの緑膿菌への結合を実証することができるかもしれないということであった。ELISA、免疫蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーのどちらも使用して、IFNγの結合特性を緑膿菌の全細菌および膜画分の両方について決定した。結果から、IFN-γは、PA27853の細菌全細胞への高結合親和性を示すことが実証された。これらの効果は株PAO1でも観察された。次に、可溶化および分離した緑膿菌(PA27853)の膜蛋白質を可溶化および分離し、単一30 kDaタンパク質バンドに対してIFN-γが強く結合することを示した。PA27853からのこのタンパク質の有意な量を免疫沈降させるのは困難だったが、大腸菌からのこのタンパク質を免疫沈降させることができることは確定した。次に、IFN-γ結合特異性は、緑膿菌を含む様々なグラム陰性細菌株の存在下での反復結合研究を使用して、細菌全細胞に対して決定された。ELISA結合分析によって細菌の複数の株はIFN-γ結合を示し、IFN-γ結合部位は様々な原核細胞中で保存されることが示唆された。最終的に、PA-Iが、IFN-γの存在下でPA27853において機能的に発現されたかどうか決定するために、PA27853をIFN-γの存在下でCaco-2細胞単層上に接種し、このセルラインに対するPA27853のバリア調節異常のダイナミクスに対する効果を、IFN-γがダイナミクスを変えたかどうか決定することで評価した。IFN-γは、5時間のインキュベーション後に、腸上皮に対するPA27853のバリア調節異常効果を約20%まで促進した。したがって、IFN-γのようなサイトカインは、細菌のシグナリング、および結局、真核生物の、例えば上皮細胞バリア機能の効果的な調節因子として本発明によって包含される。
緑膿菌の毒性の発現は、菌体数感知シグナリング系(QS)、細菌細胞密度に依存する毒性遺伝子調節の階層システム、およびその結果増殖相によって大いに調節される(M. Whiteley, K. M. Lee, E. P. Greenberg, Proc Natl Acad Sci U S A 96, 13904 (Nov 23, 1999)) (S. P. Diggle, K. Winzer, A. Lazdunski, P. Williams, M. Camara, J Bacteriol 184, 2576 (May, 2002))。したがって、IFN-γへの緑膿菌の反応に対する増殖相の効果を決定するために、IFN-γへの曝露後に、様々な増殖相で細菌を採取し、PA-I mRNAおよびタンパク質をそれぞれノーザンブロットおよびイムノブロットにより測定した。PA-I mRNAおよびタンパク質の両方は、増殖の初期の定常相でIFN-γに反応して増加した(図1E、1F)。さらに、PAO1のPA-Iタンパク質の発現は、100ng/mlで最も大きな増加が見られ、用量依存的であった(図1G)。これらの結果を総合して、IFN-γへの緑膿菌の曝露により、PA-I発現は促進されが、増殖の初期相へ発現を移すことができないことが示唆された。
IFN-γは菌体数感知シグナリング系の活性化を介してPA-Iを誘導するかどうかを決定するために、IFN-γに反応したPAO1におけるrhlI遺伝子発現を、ノーザンブロットによって測定した。IFN-γは、PAO1のrhlI転写を誘導した(図2A、2B)。RhlIは、PA-Iの発現に重要な役割を果たすコア菌体数感知シグナリング分子である、C4-HSL(C4-ホモセリンラクトン)の合成のために必要な遺伝子である(M. R. Parsek, E. P. Greenberg, Proc Natl Acad Sci (USA) 97, 8789 (Aug 1, 2000))。次に、緑膿菌のIFN-γへの曝露がC4-HSLの合成を導くかを決定した。PAO1を100ng/mlのIFN-γへ曝露し、C4-HSLを細菌の上清中で測定した。C4-HSL合成は、IFN-γへ曝露されたPAO1において増加した(図2C)。IFN-γによるQS系の活性化が、他のQS依存的毒性産物の産生を導いたことを確認するために、、IFN-γへの曝露後の様々な増殖相で、PAO1におけるピオシアニン産生(レドックス活性化合物)を測定し、IFN-γがPAO1におけるピオシアニン産生を増加させたことを示した(図2D)。最終的に、IFN-γに反応したピオシアニン(PCN)およびPA-I発現の産生のために、rhlIおよびrhlRが必要かどうかを決定するために、rhlI-変異体緑膿菌株、およびrhlR-変異体緑膿菌株は、独立してIFN-γへ曝露された。IFN-γにより誘導されたPCN産生およびPA-I発現は、これらの変異株において消失した(図2E、2F)。これらのデーターは、QS系がIFN-γへの緑膿菌の反応において重要な役割を果たすことを示唆する。
実施例１１
インターフェロン-γは緑膿菌の表面へ結合する
緑膿菌の表面上のタンパク質へのIFN-γ直接的結合も、毒性活性化の過程で調査した。ELISA結合分析は、緑膿菌(株PAO1)で最初にマイクロタイタープレートをコートし、次に組換型ヒトIFN-γ(rH IFN-γ)、後続してビオチン標識抗IFN-γ抗体を加えることによって実行した。IFN-γは、用量依存的な様式で緑膿菌の固定全細胞へ強く結合した(図3A)。ELISAデーターは、IFN-γ、その後にビオチン標識抗IFN-γ抗体およびAlexa594標識ストレプトアビジンへ曝露した細菌細胞の免疫蛍光画像の結果により確認された。細菌細胞の大部分(73% 3.2%対8.5% 2.5%)は、IFN-γを結合した(図3B)。緑膿菌へのIFN-γの結合能力は細菌の増殖相に影響された(図4A)。緑膿菌(PAO1)へのIFN-γの結合部位の局在を定めるために、緑膿菌の膜画分およびサイトゾル画分を等しいタンパク濃度で調製し、ELISAマイクロタイタープレート上にコートした。ELISA結合分析は、IFN-γが緑膿菌の膜画分へ優先的に結合することを示した(図4B)。観察されたIFN-γによる膜結合がタンパク質依存的かどうかを決定するために、膜画分をプロテイナーゼKで3時間処理し、IFN-γ結合を評価した。プロテイナーゼKによる処理の後の緑膿菌膜へのIFN-γによる結合は減少し(図4C)、IFN-γが細菌細胞膜上データーンパク質へ結合することを示唆した。次にヒトTNF-α、IL-2、IL-4、IL-10、EGFおよびTGF-βによる反復結合研究の実行によって、緑膿菌細胞膜へ他のサイトカインが同様に結合するかどうかを決定した。結合はこれらのサイトカインのうちのいずれでも観察されなかった(図4D)。これらのデーターを総合して、IFN-γが緑膿菌上の膜蛋白質へ結合することが示される。
緑膿菌の細胞膜上でIFN-γが結合する推定上のタンパク質を分離するために、穏やかな界面活性剤で可溶化した膜蛋白質はIFN-γへの結合能力を保持することが、ELISAによって初めに示された(図3C)。IFN-γの推定上の結合タンパク質の単離前に、IFN-γが単一の膜蛋白質または複数の膜蛋白質へ結合したかどうか決定しようとした。次に、膜蛋白質を非変性ゲル電気泳動法によって分離し、PVDF膜へ転写し、IFN-γ、その後ビオチン標識抗IFN-γ抗体によりハイブリダイズした。結果は、約35 kDの単一の免疫反応性のバンドを実証した。免疫反応性はIFN-γ用量依存的だった(図3D)。推定上の結合タンパク質を同定するために、膜蛋白質を4Lの新鮮に増殖させた緑膿菌から抽出し、10〜100 kDの間の分子量で分画した。次に、可溶化したタンパク質を、IFN-γおよび抗IFN-γ抗体を使用して免疫沈降した。BSAを対照として使用した。免疫沈降によって、約35 kDの分子量を持った明瞭なタンパク質が出現した。さらに免疫沈降で分離されたタンパク質がIFN-γの存在に依存していたことを確認するために、等しく分割された可溶化膜蛋白質画分を、IFN-γ有りまたは無しで混合し、次に抗IFN-γ抗体で免疫沈降させた。35kDのバンドがIFN-γ有りで混合された可溶化膜蛋白質にのみ現われた。(図3E)。IFN-γに依存するバンドは、ESI-TRAPエレクトロスプレイLC-MSMSイオントラップ(ESI-TRAP-Electrospray LC-MSMS Ion Trap)によって緑膿菌外膜ポーリンOprFとして同定された(図3F)。これらのデーターは、IFN-γが緑膿菌外膜蛋白OprFへ結合することを立証した(A. O. Azghani, S. Idell, M. Bains, R. E. Hancock, Microb Pathog 33, 109 (Sep, 2002))。
緑膿菌株PAO1においてOprFが、IFN-γの主要な結合部位を表わすことを確認するために、確立しているELISAおよび免疫沈降法を使用して、緑膿菌株PAO1のOprFノックアウト株から可溶化した膜蛋白質を、IFN-γを結合する能力について、野生型株と比較して検査した。可溶化した膜蛋白質のELISA結合分析によって、OprF-株におけるIFN-γの結合の減少が実証された(図5A)。IFN-γおよび特異的抗体を使用する可溶化膜蛋白質の免疫沈降により、OprF突然変異株においておよそ35kDバンドの完全な消失が示され、OprFの役割が確認された(図5B)。IFN-γへの緑膿菌の反応性に対するOprFの機能的役割を確認するために、100ng/mlのIFN-γへ曝露された野生型およびOprFの変異株におけるPA-Iタンパク質の発現を検討した。結果から、野生型株と比較して、変異株ではIFN-γの効果的な刺激量に反応してPA-Iタンパク質の発現が増加しなかったことが実証される(図5C)。。野生型およびOprF変異株との融合レポーター遺伝子の結果により、IFN-γがOprFを介してPA-I発現を活性化することも実証された(図5D)。さらにOprFの役割を確認するために、OprFは、プラスミドpUCP24/OprFを使用して、変異体緑膿菌株31899中に再構成された。再構成した株では、PA-Iタンパク質発現の増加をともなうIFN-γへの反応性が回復したことを実証した(図5E)。最終的に、精製されたOprFは用量依存的な様式で直接ヒトIFN-γを結合することを示すことによって(図5F)、OprFおよびIFN-γの間の結合を確認した。
実施例１２
候補薬剤のスクリーニングによる宿主のストレスに由来するBSCの同定：内因性オピオイドの役割
逆調節ホルモン(ノルエピネフリン)が、ヒトO赤血球に対する緑膿菌の結合を増加させることは知られていたが、この過程中のPA-Iの関与に関連する情報はなかった。したがって、細胞外のPA-Iの存在を検出する分析を実行した。ノルエピネフリンが緑膿菌の宿主BSCとして機能するであろうこと、したがって大腸菌に影響を与えた方法と同様の様式でヒトO赤血球に影響を与えることは可能であった。広汎な分析にもかかわらず、PA-I発現はこの化合物によって影響されなかった。他のカテコールアミンのスクリーニング(全て陽性の結果はない)は、オピオイド、特にモルヒネアルカロイドがPA-Iを活性化するだろうという期待と結びついた。内因性のモルヒネは、動物およびヒト両方における外科的ストレス/損傷の大きさに正比例して、放出されると実証されている。初めに、モルヒネの効果について評価した。興味深いことには、シュードモナス属の株PA27853のモルヒネ(13μM)の生理的な濃度への曝露は、PA-I発現の4倍の増加をもたらした(比較では、同じ分析においてC4-HSLはPA-I発現の約16倍の増加を誘導した)。モルヒネが非選択的オピオイドであると考えられるので、μ、κおよびδ受容体への高選択的作用を有する特異的な内因性オピオイドアゴニストの、株PA27853およびPAO1におけるPA-Iレクチン/アドヘシン発現を誘導する能力について検査した。さらに、2つの純粋なμペプチドアゴニストの、エンドモルフィン-1(E1)(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2; 配列番号: 24)およびエンドモルフィン-2(E2)(Tyr-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2; 配列番号: 25)、強力オピオイド非ペプチドアゴニストU-50488および強力δオピオイド非ペプチドアゴニストBW373U86が、レポーター株緑膿菌PA27853/PLL-EGFPにおいて、PA-I発現を誘導するそれぞれの能力について検査された。結果から、GFPレポーター株の増加した蛍光により判断されるようなPA-I発現に対して、κおよびδ受容体を標的とするアゴニストが、最も大きな効果があることが実証された。様々なオピオイドアゴニストに曝露された場合にPA-Iが機能的に発現されたかどうかを決定するために、MDCK細胞のPA27853のバリア調節異常のダイナミクスを変化させるアゴニストの能力について検査した。結果から、PA-I発現を誘導したオピオイドの3つすべて(モルヒネ、κおよびδアゴニスト)は、アピカル面の曝露後のMDCK細胞のTEERの重大な減少(それぞれ、約15%、20%および25%の追加のTEER減少)によって判断されるような、PA27853の毒性を変化させることが示される。
モルヒネが緑膿菌のインビボの毒性を変化させるかどうかを決定するために、マウスに、臨床的に使用されるのと同様のモルヒネの用量を放出する持続放出性モルヒネペレットを埋め込んだ(国立薬物乱用研究所(National Institute on Drug Abuse)(NIDA)から得られたペレット剤)。対照マウスにはプラセボペレットを埋め込んだ。マウスは、毎日PA27853の1×108 cfu/mlの接種物を加えた特殊調製粉乳を飲んだ。モルヒネ処理マウスは、すべて重症の敗血症(4/4)を発症し、有意な死亡率であったが、対照マウスのいずれも敗血性を発症せず、すべて生存した。最終的に、PA27853において生物膜を誘導するアゴニストの能力(菌体数感知依存的表現型)について検査した。緑膿菌および他の生物による生物膜産生は、促進された毒性を示す主要な表現型として確立されている。オピオイドκおよびδアゴニストは、株PA27853におけるPA27853誘導の生物膜産生を、約150%および180%それぞれ有意に増加させた。総合して、これらの研究は、オピオイドアゴニストが、緑膿菌の毒性および潜在的な致死性に直接影響を及ぼすことを実証する。オピオイドアゴニストおよびアンタゴニストは、内因的に見られるものであってもそうでなくとも、化学的合成、天然ソースからの精製、またはその組合せによる産生であっても、微生物による病因、より具体的には真核生物の(例えば、上皮または内皮)細胞バリア機能に一般に影響する細菌のシグナリングの有用な調節因子として、本発明によって検討されることが期待される。
実施例１３
緑膿菌毒性発現におけるκ-オピオイドの役割
ストレス後の肺および腸のような組織で蓄積することが知られているオピオイド化合物は、ピオシアニン産生、生物膜形成およびPA-ILタンパク質の発現によって判断されるような緑膿菌の毒性を直接活性化する。具体的には、ピオシアニン産生は、選択的なκ-オピオイド受容体アゴニスト、U-50,488および天然に存在する内因性のペプチドのダイノルフィン(これも選択的なκ-オピオイド受容体アゴニストである)の存在下で促進された。緑膿菌のオピオイド誘導性の毒性遺伝子発現に関与する調節性の経路を理解するために、ピオシアニン産生に関与する重要な要素を欠損する多重変異緑膿菌株に対するU-50,488の効果を検討した。結果から、全体的な転写調節因子(MvfR)が、U-50,488に反応してピオシアニン産生に重要な役割を果たすことが実証された。完全なMvfRも、C4-HSL(何百もの毒性遺伝子を活性化することで知られる重要な菌体数感知シグナリング分子)へ緑膿菌が反応するために、必要とされることが示された。総合して、これらの研究は、細菌の毒性表現型を活性化する目的のために、宿主ストレスの最中に、細菌に知覚される宿主由来のシグナリング分子としてオピオイド化合物が役立つことを示す。
細菌株および培養条件。緑膿菌の株PAO1および27853、ならびにそれらの派生株(表1)を、テトラサイクリン(Isf)60μg/ml、および/またはゲンタマイシン(Gm)100μg/mlを必要な場合追加したトリプシン分解ダイズブロス(TSB)中で慣例的に増殖させた。好ましいμ-オピオイド受容体アゴニストのアルカロイドオピエートモルヒネ(A. Shahbazian, et al., Br J Pharmacol 135, 741 (2002))、特異的なκ-オピオイド受容体アゴニストのU-50,488(J. Szmuszkovicz, Prog Drug Res 53, 1 (1999))、および特異的なδ- オピオイド受容体アゴニストのBW373U86(S. F. Sezen, V. A. Kenigs and D. R. Kapusta, J Pharmacol Exp Ther 287, 238 (1998))は、特異的なκ-オピオイド受容体アゴニストのペプチドオピオイドダイノルフィン(Y. Zhang, E. R. Butelman, S. D. Schlussman, A. Ho and M. J. Kreek, Psychopharmacology (Berl) 172, 422 (2004))、および特異的なκ-オピオイド受容体アンタゴニストのノルビナルトルフィミン(A. Shahbazian, et al., Br J Pharmacol 135, 741 (2002))と共に、実験で使用された。モルヒネはアボットラボラトリーズ(Abbott Laboratories)から、U-50,488、BW373U86、ダイノルフィン、ノルビナルトルフィミンおよびアントラニル酸メチルはシグマアルドリッチ(Sigma-Aldrich)から、およびC4-HSLはフルカ(Fluka)から購入した。
mvfR遺伝子によるMvfR変異体の相補性。増幅されたmvfRを、pCR2.1(インビトロゲン(Invitrogen))で直接クローニングし、XbaI-HinDIII制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pUCP24/mvfRを生成するためにPlacプロモーター下にpUCP24へサブクローン化した。プラスミドpUCP24(ブランクの対照)およびpUCP24/mvfRを、MvfR産生を欠損する緑膿菌株/MvfR13375を生成するために、株13375に電気穿孔した(表1および2)。
gacA遺伝子によるGacA変異体の相補性。gacA遺伝子(多くのグラム陰性菌における毒性の合成に関与する二成分シグナリング方法のメンバー)を、増幅し、pCR2.1(インビトロゲン)へ直接クローニングした。次にこの遺伝子を、XbaI-HinDIII制限エンドヌクレアーゼにより切り出し、pUCP24/gacAを生成するためにPlacプロモーター下にpUCP24へサブクローン化した。緑膿菌株PAO6281/GacAを生成するために、プラスミドpUCP24(ブランクの対照)およびpUCP24/gacAを、GacA産生を欠損する緑膿菌株PAO6281に電気穿孔した(表1および2)。
MvfRの短縮。pUCP24/MvfRから増幅された短縮mvfR遺伝子のPCR産物およびそれぞれのプライマー(表1および2)を、ジーンクリーン(Geneclean)キット(キューバイオジーン(Qbiogene))を使用して精製し、XbaI-HinDIII制限エンドヌクレアーゼにより消化し、pUCP24へライゲーションし、その後緑膿菌株13375へのエレクトロポレーションが続いた。
ピオシアニン分析。細菌は、細菌増殖の初期指数増殖相(約0.15〜0.2のOD600 nm)で加えたオピオイド化合物と共に、220rpmで振盪条件下に37℃でTSB中で増殖させた。インキュベーション後に、記述されるように、ピオシアニンを培地から6クロロホルム中に抽出し、その後に0.2M HClでの再抽出が続き、OD 520 nmで測定した(D. W. Essar, L. Eberly, A. Hadero and I. P. Crawford, J Bacteriol 172, 884 (1990))。
PA-IL分析。GFP-PA-ILレポーター株のイムノブロットおよび蛍光を、PA-IL発現に対するオピオイドの効果を決定するために使用した。イムノブロットのために、緑膿菌PAO1を、100μM のU-50,488有りまたはU-50,488無しで、TSB培地中で増殖させ、細胞を増殖の後期指数増殖相(OD600 nm＝1.8)で回収した。各々のサンプルからの等量のタンパク質を、15%SDS-PAGEにより分離し、PDF膜へ転写し、アフィニティー精製したウサギポリクローン抗PA-IL抗体によりプロービングした。プロービングした膜を、抗ウサギホースラディシュペルオキシダーゼ結合IgGにより処理し、スーパーシグナルウェストフェムト(SuperSignal West Femto)化学発光の基質(ピアース(Pierce))を使用して現像した。PA-IL発現の蛍光による検出のために、GFP-PA-ILレポーター株27853/PLL-EGFP(L. Wu, et al., Gastroenterology 126, 488 (2004))の細菌培養物を、108のCFU/mlの最終濃度で、従来の培地(すなわち、60μMのU-50,488有りまたは無し、10%FBSおよびHEPES緩衝液を含むHDMEM培地)で96ウェル蛍光測定法プレート(コースター)中にプレーティングした。インキュベーションを37℃で100rpmで実行し、蛍光の読み取りを、485/528nmの励起/発光で96ウェル蛍光測定法プレートリーダー(シナジーHT(Synergy HT)、バイオテック社(Biotec Inc.))により、一時間ごとに実行した。蛍光強度は600nmで測定された細胞密度に対して正規化した。
生物膜形成分析。細菌細胞を、0.5%カザミノ酸、1mM MgSO4x7H20および0.2%グルコースを追加したM63S培地(13.6g KH2PO4 l-1、2.0g (NH4)2SO4 l-1、0.5mg FeSO4x7H2O l-1)で、107 CFU/mlの濃度で、96ウェルU字型底プレート(ファルコン(Falcon))中に四重でプレーティングし、静止状態下に37℃で一晩インキュベートした。U-50,488を接種点で加えた。接種後にウェルを水で完全にすすぎ、付着した物質を0.1%のクリスタルバイオレットにより染色し、水により洗浄し、エタノール中に可溶化した。記述されるように、可溶化した画分を回収し、吸収をプレートリーダーによって590nmで測定した(G. A. O'Toole and R. Kolter, Mol Microbiol 28, 449 (1998)) 。
κ-オピオイド受容体アゴニストU-50,488およびダイノルフィンは、緑膿菌にピオシアニン産生を刺激する。
外科的にストレスを受けたマウスの腸から採取された緑膿菌は、擬似手術をされた対照マウスの腸からの緑膿菌と比較して、非常に緑色が強く見えた。したがって、緑膿菌は、ストレスを受けたマウスの腸管に特有の環境からの合図に反応して、増加した量のピオシアニン(PCN)を産生するようにシグナルに対して反応しているかもしれない。ピオシアニン(細胞内の酸化ストレスを増加させるレドックス活性化合物)は、肺感染症の間の組織損傷および壊死を仲介する動物モデルにおける緑膿菌の毒性に、重要な役割を果たすことが示された(G. W. Lau, H. Ran, F. Kong, D. J. Hassett and D. Mavrodi, Infect Immun 72, 4275 (2004))。緑膿菌PAO1を、μ-、κ-、およびδ- オピオイド受容体アゴニストのグループを代表するペプチドオピオイドおよびアルカロイドオピエートに曝露した。結果から、一夜の曝露後に、アルカロイドオピエートU-50,488(特異的なκ-オピオイド受容体アゴニスト)は、緑膿菌PAO1において非常に明るい緑色を誘導したが、そのような効果は残りの化合物のうちのいずれかでも観察されなかったことが示された。色の変化がPCN産生のためであることを確認するために、ピオシアニンをOD520 nmで測定した(D. W. Essar, L. Eberly, A. Hadero and I. P. Crawford, J Bacteriol 172, 884 (1990))。結果から、U-50,488は、緑膿菌株PAO1および27853で観察されたPCN産生に対する用量依存効果を誘導することが実証された。ダイノルフィン(天然に存在する特異的なκ-オピオイド受容体ペプチドアゴニスト)への緑膿菌の曝露は、さらに用量依存的な様式でPCN産生を促進した。反復実験は、特異的なκ-オピオイド受容体アンタゴニストのノルビナルトルフィミン(NOR)の存在下で行ない、U-50,488への曝露後にPAO1において促進されたPCN産生を用量依存的な様式でNORが減少させること、および200μMの用量で促進されたPCN産生を完全に抑制することを実証した。
κ-オピオイド受容体アゴニストのU-50,488は、緑膿菌におけるより低細胞密度でピオシアニン産生を変化させる。
QSシグナリング分子がそれらの限界濃度に達する場合、QS依存的な遺伝子発現が高細菌細胞密度で起こることが知られているので、様々な細胞密度でU-50,488に反応したPCN産生のダイナミクスを評価した。陽性対照として、細菌をC4ホモセリンラクトン(C4-HSL)(PCN調節に関与するQSシグナリング分子)に曝露した(M. R. Parsek and E. P. Greenberg, Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8789 (2000))。より低細胞密度でPCNの産生のシフトにもたらす、U-50,488へのPAO1の曝露は、C4-HSLへの細胞の曝露と同様の効果があることを発見した。どちらの化合物もTSB培地中の細菌増殖に対して効果がなかった。
κ-オピオイド受容体アゴニストのU-50,488は、緑膿菌における菌体数感知系の要素を介してピオシアニン産生に対して誘導効果を発揮する。
PCN調節および生合成の経路が詳細に記述された(D. V. Mavrodi, et al., J Bacteriol 183, 6454 (2001), E. Deziel, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1339 (2004), T. R. de Kievit, Y. Kakai, J. K. Register, E. C. Pesci and B. H. Iglewski, FEMS Microbiol Lett 212, 101 (2002), S. L. McKnight, B. H. Iglewski and E. C. Pesci, J Bacteriol 182, 2702 (2000))。U-50,488がPCN産生を誘導する潜在的な経路を定義するために、PCN産生に関与する重要な遺伝子を欠損する変異株をU-50,488へ曝露し、ピオシアニン産生に対する効果を測定した。最初に、QS系のコア要素をコードする遺伝子を欠損する変異体(J. P. Pearson, E. C. Pesci and B. H. Iglewski, J Bacteriol 179, 5756 (1997)) (lasR、lasI、rhlI、rhlR)を分析し、この結果はこれらの変異体のうちのいずれかにおいても、U-50,488への曝露は、PCN産生(非変異株と比較して)を回復させないことを実証した。次に、PCN産生に対する全体的な毒性調節因子(GacAおよびMvfR)の役割を調査した。GacA(C. Reimmann, et al., Mol Microbiol 24, 309 (1997))およびMvfR(E. Deziel, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1339 (2004))の両方が、緑膿菌におけるPCN産生において主要な役割を果たすことが示された。ΔGacAもΔMvfRも予想通りにPCNを産生せず、U-50,488への曝露はPCN産生を回復させることができなかった。C4-HSLも、gacAおよびmvfRの変異体においてPCN産生を回復させることができなかった。C4-HSLがGacA変異体においてPCN産生を回復させなかったという発見は、類似したQS分子(N-ヘキサノイル-HSL(C6-HSL))がP.オーレオファシエンス(P.aureofaciens)のΔGacA変異体においてフェナジン産生を回復させなかったという発見と一致している(S. T. Chancey, D. W. Wood and L. S. Pierson, 3rd, Appl Environ Microbiol 65, 2294 (1999))。包括的なトランスポゾンライブラリーからの7つの追加のmvfR変異体(M. A. Jacobs, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 100, 14339 (2003)) (すなわち8902、47418、35448、51955、21170、47853、および47198)が、この結果を確認するために、C4-HSLへ曝露された。結果から、1 mMのC4-HSLの存在下でこれらの変異体のどれもPCNを産生しないことが実証された。
MvfRは、PAO1においてPCN産生を促進するU-50,488およびC4-HSLの能力に関与する。
PCN合成のU-50,488仲介アップレギュレーションにおけるMvfRおよびGacAの可能な役割を定義するために、マルチコピープラスミドのpUCP24上のそれぞれの遺伝子でΔMvfRおよびΔGacAを相補した(S. E. West, H. P. Schweizer, C. Dall, A. K. Sample and L. J. Runyen-Janecky, Gene 148, 81 (1994))。両方の相補された変異体は、有意に高量のPCNを産生した(図6A、B)。C4-HSLおよびU-50,488の追加は、ΔMvfR/mvfRにおいて既に高いPCN産生をさらに増加させた(図6C)。対照的に、1 mM U-50,488または100μM C4-HSLのいずれかへ一晩曝露された場合、ΔGacA/gacAにおいてPCN産生は最小限だが減少した(図6D)。U-50,488およびC4-HSLへ曝露された相補変異体ΔMvfR/mvfRにおけるPCN産生の動的なトラッキングは、親株PAO1における観察されたものと同様の、より低細胞密度でのPCN産生の変化を実証した(図6E)。gacAに相補された変異体(ΔGacA/gacA)それ自体は、親株PAO1で観察されたものよりも低細胞密度でPCNを産生した。C4-HSLへのΔGacA/gacAの曝露は、PCN産生のダイナミクスに対しては効果がなかったが、U-50,488への曝露はPCN産生を遅らせた(図6F)。これらの結果は、外因的に適用されるU-50,488およびC4-HSLによって、MvfRがPCN産生のアップレギュレーションに関与することを示す。
MvfRの完全な基質結合およびDNA結合ドメインは、U-50,488がPAO1のPCN産生を促進するために必要とされる。
MvfRは、N末端でヘリックスターンヘリックスのDNA結合性のモチーフ、およびC末端で基質結合ドメインを有する原核生物のLysR転写調節因子のファミリーに属している。NCBI保存ドメイン検索により、MvfR中の同様のドメインが示された：6〜64 アミノ酸に位置するLysR DNA結合ドメイン、および156〜293アミノ酸に位置するLysR基質結合ドメイン。したがって、PCN産生に対するκ-オピオイド受容体アゴニスト効果の仲介において機能的役割を演じる特異的領域を同定できるかどうかを決定するために、PAO1変異体は、N末端およびC末端を短縮したMvfRを産生するように構築された。結果から、アミノ酸121〜332を欠く(DNA結合ドメインを欠損する)変異体がPCNを産生しないこと、およびU-50,488またはC4-HSLと反応しないことが示された。基質結合ドメインに影響せずにC末端で短縮された、アミノ酸1〜299または1〜293のいずれかを欠く変異体は、PCNを産生し、促進されたPCN産生でU-50,488およびC4-HSLと反応した。しかしながら、アミノ酸Arg293、Leu292、およびPhe284を含むさらなる欠失は、変異体1〜292、1〜291、および1〜283における基質結合ドメインに影響した。3つの変異体はすべてPCNを産生せず、U-50,488およびC4-HSLと反応しなかった。これらの結果は、U-50,488およびC4-HSLに反応して、緑膿菌で促進されたPCN産生の仲介におけるMvfRの重要な機能的役割を確証する。
PCN産生に対するU-50,488の効果は、シュードモナスキノロンシグナル(PQS)のMvfR制御合成に依存する。
MvfRは、PQS、アントラニル酸(AA)および4-ヒドロキシ-2-ヘプチルキノロン(HHQ)の2つの12前駆物質をコードする、phnABおよびPQS ABCDEオペロンの正の転写調節を介してのPCN産生において、重大な役割を果たすかもしれない(E. Deziel, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1339 (2004))。したがって、U-50,488の存在下でPCNを産生する、変異体ΔPhnAおよびΔPqsAの能力について検討した。どちらの変異体もPCNを産生しなかった。増加は野生型株PAO1で観察されたものよりもはるかに少なかったが、U-50,488への各々の変異体の曝露は、PCN産生のわずかな増加をもたらした。これらのデーターは、MvfRに制御されたPQS合成は、U-50,488の能力がPCN産生を促進するのに重要かもしれないことを示唆した。最終的に、反復実験は、phzA1遺伝子(PCN生合成のコア遺伝子を含み、luxボックスがすぐ直前にあるオペロンの一部である)欠損緑膿菌変異体で実行された(D. V. Mavrodi, et al., J Bacteriol 183, 6454 (2001))。U-50,488へ曝露された場合でさえ、ΔPhzA1はPCNを産生しなかった。
PQSが、U-50,488がPCN産生を促進する経路に役割を果たすことを確認するために、U-50,488を、2 mMアントラニル酸メチル(MA)(緑膿菌においてPQS合成を阻害すると以前に示された化合物)と共にインキュベートした緑膿菌へ加えた(S. P. Diggle, et al., Mol Microbiol 50, 29 (2003), M. W. Calfee, J. P. Coleman and E. C. Pesci, Proc Natl Acad Sci U S A 98, 11633 (2001))。結果は、U-50,488がPAO1中のPCN産生を促進する能力を、MAが阻害することを実証した。これらの研究結果は、U-50,488が、転写調節因子MvfRの活性化およびMvfRに制御される分子のPQSの合成を含む、シグナル伝達経路を介して緑膿菌のPCN産生を引き起こすことを示す。
U-50,488は、生物膜形成およびPA-IL産生を含む、緑膿菌における他のQSに制御された毒性決定因子を刺激する。
U-50,488に反応して、他のQS依存的表現型を発現するかどうかを決定するために、このオピエートへ曝露された緑膿菌における生物膜産生(T. R. De Kievit, R. Gillis, S. Marx, C. Brown and B. H. Iglewski, Appl Environ Microbiol 67, 1865 (2001))およびPA-ILレクチン発現(K. Winzer, et al., J Bacteriol 182, 6401 (2000), M. Schuster, M. L. Urbanowski and E. P. Greenberg, Proc Natl Acad Sci U S A 101, 15833 (2004))を測定した。U-50,488は、濃度依存的な様式でPAO1中の生物膜形成を促進した。U-50,488に反応したPA-IL発現を、緑色蛍光性のPA-ILレポーター株の緑膿菌27853/PLL-EGFPを使用して動的に追跡した(L. Wu, et al., Gastroenterology 126, 488 (2004))。HDMEM培地中で9時間の増殖後に、著しい蛍光がこの株で観察された。結果はPA-ILに対するウサギのポリクローン抗体を使用して、イムノブロットにより株PAO1において確認された。
緑膿菌におけるPCN産生に対するU-50,488の効果は、抗感染薬高分子重合体PEG 15-20によって阻害することができる。
高分子重合体(PEG 15-20)は、細菌増殖に影響せずに、緑膿菌毒性を促進する、宿主要素(上皮細胞の接触)およびQSシグナリング分子C4-HSLの両方の能力を妨害することによって、緑膿菌による致死性敗血症からマウスを保護する(L. Wu, et al., Gastroenterology 126, 488 (2004))。緑膿菌に対するU-50,488の効果を妨害するPEG 15-20の能力は、5%PEG 15-20および0.5 mM U-50,488または0.2 mM C4-HSLの存在下でインキュベートされた緑膿菌PAO1の培地中のPCN産生を測定することによって評価された。結果は、PCN産生のU-50,488仲介アップレギュレーションおよびC4-HSL仲介アップレギュレーションの両方に対して、PEG 15-20が強い抑制効果を有していることを実証した。











Figure 2008542395




Figure 2008542395
実施例１３Ａ
緑膿菌PAO1は大量のPA-Iを発現し、PA-I依存的様式でMDCKの単層透過性を変える
シークエンスされた緑膿菌株(PAO1)がPA-Iを発現したことを確認するため、および株がPA-I依存的様式でMDCK細胞のTEERを変えたことを確認するために、野生型およびPA-I遺伝子(lecA)欠失PA-I変異株の両方は、PA-Iタンパク質発現およびMDCKの単層TEERを減少させる能力について分析された。PA-Iタンパク質発現は非常に大量であり、C4-HSL(同系統の菌体数感知シグナリング分子)の様々な用量へ反応する。さらに、この株では、緑膿菌がMDCK単層構造の全体性(TEER)を減少させる能力は、PA-Iの発現に高度に依存する。さらに、MDCK細胞におけるPA-I誘導性透過性欠損は、エキソトキシンA流出に5倍の増加をもたらす50%以上のPA-I誘導性TEER減少をともない、単層を超えたアピカル面から側底部へのエキソトキシンAの流出を可能にするのに十分な大きさであることが決定された。最終的に、株が様々なオピオイドアゴニストへ曝露された場合、PA-Iタンパク質はPAO1で多く発現されることが示された。PA-Iタンパク質については、δアゴニスト(BW373U86)はC4-HSLと匹敵する反応を誘導した。データーから、PA-I発現は真核生物の細胞バリア機能に影響することが立証される。したがって、PA-I活性の調節因子だけでなくPA-I発現の調節因子も、微生物病原体の毒性表現型に作用するのに役立つようになること、および表現型と関連した真核生物の(例えば、上皮)細胞バリア機能障害に作用するのに役立つようになることが期待される。
実施例１４
宿主細胞由来の細菌のシグナリング成分は、緑膿菌の上皮細胞に対するバリア調節を異常にする特質を促進する。
宿主ストレスBSCが、緑膿菌の上皮に対するバリア調節異常ダイナミックスを変化させるかもしれないことを実証するために、低酸素へ曝露されたCaco-2細胞からの培地および細胞の膜画分を、PA27853をアピカル面で接種したMDCK細胞のアピカル面のウェルへ加えた。TEERを経時的に測定した。C4-HSLも、PA-I発現の陽性対照とするために加えた。培地および細胞膜の両方は4時間で、C4-HSL曝露によるレベルと匹敵するレベルで、緑膿菌(PA27853)のMDCK細胞に対するバリア調節を異常にする特質を促進した。宿主細胞由来の細菌のシグナリング化合物単独ではどれも、MDCKのTEERに対していかなる効果もなかった。この結果は、微生物病原体(例えば緑膿菌)が宿主細胞のバリア機能を変えるのに必要であることを実証する。
実施例１５
PA-Iは、シノラブディス・エレガンスの消化管内のインビボで発現される。
PA-I-GFPレポータープラスミドを、エレクトロポレーションによって緑膿菌株PA14(シー・エレガンスに対して高度に致死性の株)へ導入した。次に、線虫に、GFPでタグを付けたPA14およびPA27853を与え、蛍光性の細菌について調べた。PA14およびPA27853の芝生の上で餌を与えられた線虫は、消化管内で蛍光性の細菌を示したが、蛍光は周囲の培地中で見られなかったことから、PA-Iプロモーター活性は局所的な因子により線虫消化管内で活性化されることを示す。最終的に、株PA-14(このモデルにおいて高度に致死性の株)の死滅ダイナミクスを、完全配列決定PAO1株と関連したダイナミクスと比較した。線虫が通常は餌として食べる大腸菌(OP50)の株は、100%の生存をもたらしたが、予測されたように、PA-14は速い死滅ダイナミックスを示した。PAO1株は、80時間で50%だけの死亡率のゆっくりした死滅を示した。したがって、PAO1は、宿主ストレス由来のBSCが、死滅曲線をより強い毒性の株のものへ変えるかどうかの査定を可能にする死滅ダイナミクスを示す。BSCが、可溶性か膜結合型かにかかわらず、致死性の微生物菌株によって示されたダイナミクスへと、比較的無活動(または良性)の微生物の死滅ダイナミクスを変化させるであろうことが期待される。言い換えると、BSCが有毒な表現型へ微生物の表現型を変化させるであろうことが期待される。そのような活性の調節因子が、任意のそのような微生物および特に緑膿菌による毒性表現型の提示に関係した障害を、予防および治療するのに役立つと期待される。そのような障害の症状を改善する方法においてもそのような調節因子が使用されると期待される。
実施例１６
BSC誘導性のPA-Iレクチン/アドヘシン遺伝子発現に関与する緑膿菌遺伝子
このデーターは、i)モルヒネ、κ受容体およびδ受容体をそれぞれ標的とする強力オピオイドアゴニストのU-50488およびBW373U86、ならびにIFN -γは、緑膿菌株PA27853およびPAO1においてPA-Iを発現する激しい反応を誘導する；ii) PA-I発現は、菌体数感知シグナリング系(QS)およびRpoSを含む、緑膿菌における毒性遺伝子調節回路の複数の要素に依存することを実証する。このデーターは、緑膿菌におけるPA-I反応を誘発するオピオイドおよびIFN-γに必要な遺伝子を示し、PA-I発現を活性化するために宿主ストレス由来のBSCが、共通遺伝子および膜受容蛋白質を使用するかどうかの測定を促進するだろう。
A. モルヒネ、κおよびδのオピオイドのアゴニスト、ならびにIFN-γに反応する、緑膿菌PA-I発現に必要な遺伝子
少なくとも2つの技術が遺伝子同定に使用するために検討される：1)モルヒネ、κおよびδオピオイド受容体アゴニスト、ならびにIFN-γに曝露された緑膿菌株PAO1に対して、トランスクリプトーム解析を実行する、および、2)オピオイドおよびIFN-γに反応してPA-Iタンパク質発現をアップレギュレートする能力に対応するトランスポゾン変異体のスクリーニングによって、トランスクリプトーム解析で同定された候補遺伝子の機能的役割を確立する。
トランスクリプトーム解析
株PAO1において発現がオピオイドおよび/またはIFN-γの存在下に増加する遺伝子は、初期の焦点となるだろう。モルヒネ(非選択的オピオイド受容体アゴニスト)、U-50488(κ受容体アゴニスト)、BW373U86(δオピオイド受容体アゴニスト)、およびIFN-γのような宿主細胞要素に反応する遺伝子を同定するために、株PAO1においてアフィメトリックス(Affymetrix)GeneChipゲノムアレイを使用して、トランスクリプトーム解析を実行する。以下の実験についての時間および用量の変数は、株PAO1におけるPA-I発現(mRNA)のデーターに基づく。
簡潔には、細菌をTSB中で一晩増殖させ、モルヒネ(20μM)、κアゴニスト(80μM)、δアゴニスト(80μM)またはIFN-γ(10μg/ml)のいずれかをを含むTSB中で1:100に希釈した。次に、3つの成長段階を表わす、OD600で0.5、1.0および2.0(それぞれ、指数増殖相、後期指数関増殖相、および定常相)まで、細菌を増殖させる。これらの3時点は、高細胞密度の時点と同様に、PA-Iシグナル経路の初期に発現する遺伝子の捕獲も可能にするだろう。トランスクリプトーム解析のために、増殖相中に指定される3点で細菌細胞(モルヒネ、κおよびδオピオイド受容体アゴニスト、ならびにIFN-γで処理、および処理しない)から、RNAを分離する。本明細書において記述されるように、または当技術分野において知られているように、緑膿菌GeneChipゲノムアレイ処理と同様に、cDNA合成、断片化、標識およびハイブリダイゼーションも実行される。各々の実験は、好ましくは三重で実行される。
候補遺伝子の機能分析
モルヒネ、κおよびδオピオイド受容体アゴニスト、および/またはIFN-γへの曝露に起因する発現で少なくとも2.5倍の変化を示す遺伝子を、PAO1トランスポゾンライブラリー(ワシントン大学ゲノムセンター、以下を参照)から、ドットブロット分析を使用して、変異株をスクリーニングすることによって、PA-Iタンパク質発現におけるそれらの特異的役割について個々に検査する。簡潔には、誘導化合物(オピオイド、IFN-γ)へ反応することが、前もって定められた、2つの個別の細菌細胞密度(1.0および2.0のOD600)で、384ウェルマイクロタイタープレートを使用して、連続的な稼動で株を増殖させる。スクリーニングのための至適条件を決定するために、野生型株およびいくつかの変異株において、異なる細菌細胞密度でPA-Iを誘導する化合物の様々な用量で、用量応答曲線を作製する。実験を、モルヒネ、U-50488、BW373U86、およびIFN-γについて別々に実行する。簡潔には、モルヒネ、U-50488、BW373U86、またはIFN-γのいずれかを、前もって定められた用量で変異株を含むウェルへ加える。全ての稼動は、対照として野生型株と共に実行される。PA-Iを誘導する化合物は、前もって定められた時間の間ウェルへ加える。次に上清を除去し、ウェルへ溶菌液の追加によって細菌細胞ペレットを直接溶解する。次に、384ウェルプレート全体を遠心(4000g)し、384レプリケーターを使用して、上清をイモビロン(Immobilon)P-PDF膜へ転写する。次に、膜を抗PA-I一次抗体および二次抗体で処理する。ドットブロット分析は、宿主ストレス由来の細菌のシグナリング化合物の存在下で、PA-Iをアップレギュレートしない全ての変異株の迅速な同定を可能にし、それによって、PA-I発現に必要な遺伝子を同定する。全ての分析は好ましくは、三重(3つの細胞密度x 5グループ(4つの実験な＋1つの対照)×三重(3)分析＝45遺伝子アレイ)で実行される。
PA-I発現における役割を果たすと既に確立された遺伝子(QSおよびRpoSレギュロンにおける遺伝子を含む)の多くが、同定されるであろうことが期待される。しかしながら、既知の遺伝子についての新しい予期しない機能も同定されるであろうことが期待される。さらにCyaBまたはGacSの転写がオピオイドまたはIFN-γに反応して増加する場合、および、Cya BおよびGacSのトランスポゾンノックアウトが、PA-Iの増加でオピオイドまたはIFN-γのいずれかへ反応しない場合、そのとき、緑膿菌へのオピオイドまたはIFN-γシグナリングの二成分の調節因子として確立しているバイオセンサーの役割が確認されるだろう。トランスポゾンライブラリーの機能分析とトランスクリプトーム解析の結果を組み合わせることは、オピオイドおよびIFN-γが、PA-I発現に関与する共通の膜バイオセンサーおよび共通の下流遺伝子を活性化するかどうかの決定を可能にするだろう。1つまたは複数の非ペプチドオピオイドが、二成分の膜バイオセンサーの下流の遺伝子活性化が開始される細菌細胞の細胞質へ直接拡散することは可能である。これがそうである場合、そのとき、膜蛋白質をコードする全てのトランスポゾンノックアウト株がPA-Iの増加をともなって反応すると期待され、マイクロアレイデーターは、膜蛋白質をコードする転写のレベルがオピオイドまたはIFN-γのいずれかによって不変になることを実証するだろう。しかしながら、膜バイオセンサーが構成的に発現されることはあり得、したがって遺伝子発現はオピオイドまたはIFN-γに反応して変化しない。これがそうである場合、そのとき、トランスポゾンライブラリー全体はオピオイドまたはIFN-γに反応したPA-I発現について、ドットブロット技術のハイスループットの性質を与えられて実現可能なアプローチでスクリーニングされるだろう。ここで注目すべきことは、遺伝子発現は培養の間の異なる時に起きることが可能であり、化合物の濃度に依存する様々な程度の外因性化合物へ反応することができることである。ゲノムシークエンスされた株PAO1は大量のPA-Iを作り、抗PA-Iレクチン/アドヘシン抗体は高い特異性がある。
データーから、オピオイド受容体アゴニストおよびIFN-γが、緑膿菌にPA-I mRNAおよびタンパク質を発現するようにシグナリングすることが実証される。さらに、これらのPA-Iシグナリング化合物は、上皮に対してより有毒な表現型を発現するように緑膿菌を誘導する。PA-I発現を制御する遺伝子は、緑膿菌において何百もの毒性遺伝子を活性化する2つの重要な全体的な調節系に依存する。毒性遺伝子調節の相互に連結した系の活性化は、転写調節因子VfrおよびGac Aに関与する階層的カスケード経由で宿主細胞の要素を認識し、CyaBおよびGacSを含む膜バイオセンサーによって直接影響を受けるが、限定されない。オピオイドおよびIFN-γに反応して差異的に発現する遺伝子は、不偏トランスクリプトーム解析アプローチを使用して同定されるだろう。このアプローチは、全ての従来の研究が高細胞密度で、いかなる宿主細胞要素のない状態でのみ実行されたので、既知のPA-I発現の経路に関与する個々の候補遺伝子を追跡する代わりに選択された。したがって、以前に記述された遺伝子発現パターンは、生理的なモデルにおいて適用可能でないかもしれない。この研究の目標は、モルヒネ、κおよびδオピオイド受容体アゴニスト、およびIFN-γに反応してPA-I発現に関与する遺伝子を同定し、機能的に検証することである。
B. モルヒネおよびIFN-γを結合する緑膿菌の受容体を同定する。
データーから、IFN-γを強く結合する単一の可溶化膜蛋白質を緑膿菌から分離できることが示される。さらに、モルヒネは、膜蛋白質画分へも結合する。IFN-γおよびモルヒネの各々を特異的に認識する抗体が入手可能であるので、初期の研究はこれらの2つのBSCの効果を検討している。市販の抗体を使用して、IFN-γおよび/またはモルヒネを結合する膜蛋白質を同定し、任意で精製する。このタンパク質に基づいたアプローチは、上に記述された実験を相補するデーターを提供する。
IFN-γおよび/またはモルヒネを結合する膜蛋白質の同定での使用に利用可能な2つのアプローチが今や記述される。最初に、緑膿菌株PAO1の膜蛋白質を、穏やかな界面活性剤を使用して可溶化する。そのとき、可溶化タンパク質分画のIFN-γまたはモルヒネに対する結合能力を、単純なELISA結合分析を使用して決定する。次に、それぞれの抗体を使用してタンパク質分画を免疫沈降し、タンパク質を、例えばマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析(Maldi-MS)によって同定する。
結合タンパク質の同一性の確認を、候補タンパク質をコードする遺伝子のトランスポゾンノックアウトが、PA-Iの増加でIFN-γまたはモルヒネへ反応しないことを、本明細書において記述された技術の使用での決定により達成する。これらの2つの分析において適合性を示す候補タンパク質の機能を確認するために、候補タンパク質を、PA-I反応の回復を確認するように、対応するトランスポゾンノックアウト中で再び発現させる。さらに、受容体アンタゴニストも開発されていてもよい。
データーから、可溶化膜からのタンパク質の同定によってモルヒネおよびIFN-γの膜受容体の同定が可能なことが示される。この技術を使用する潜在的な制限は、モルヒネが細菌細胞質の中に直接拡散し、膜蛋白質ではなく下流標的と相互作用できるということである。この可能性は、モルヒネが膜蛋白質をコードするいかなる遺伝子の転写プロフィールを変化させないことを実証する結果と一致するが、本明細書において開示されたIFN-γについてのデーターはこの解釈と一致しない。さらに、可溶化した細菌膜蛋白質のモルヒネ結合を、蛍光画像および蛍光分析を使用して実証した。さらに、膜貫通型タンパク質または宿主ストレス由来のBSCを結合するタンパク質が培養培地の中に分泌され、細菌の膜の中に存在できなかった可能性がある。そのようなタンパク質の例は細菌の鉄結合タンパク質(エンテロケリン)であり、それは細菌によって培養培地の中へ放出され、次に細菌細胞に再び取り込まれる。そのような状況下では、細胞質画分、内膜調製物および外膜調製物のスクリーニングは、結合タンパク質に対して特異的抗体でプロービングする反復実験と一緒に検討される。トランスポゾン変異体実験および細菌の膜から精製されたタンパク質の間のいかなる不一致も、表面プラズモン共鳴および質量分析を直接使用する、IFN-γ-膜タンパク質またはモルヒネ-膜タンパク質相互作用の分析によって一致させられるだろう。
実施例１７
微生物毒性状態に対する宿主シグナリングの影響
データーから、PA-Iノックアウト株(lecA -)は培養上皮細胞のTEERを減少させないことが実証される。オピオイドアゴニストおよびIFN-γへ曝露された緑膿菌の株の致死性は、十分に特徴づけられた無脊椎動物(シノラブディス・エレガンス)およびマウスの腸由来敗血症の確立されたモデルを使用して、インビボで定義することができる。
A. オピオイドアゴニストおよびIFN-γへ曝露された緑膿菌によって誘導された上皮バリア機能の欠損、およびこの反応におけるPA-Iの役割
1つの問題は、上皮細胞単層を越えたエキソトキシンA流出の増加によって判断されるように、PA-Iレクチン/アドヘシンの作用を経て、オピオイドまたはIFN-γが、上皮に対して致死表現型を発現するように、緑膿菌を活性化することができるかどうかである。
その問題を取り組むために、MDCK細胞をトランスウェル中で安定したTEERを維持するように密集するまで増殖させる。様々な用量のモルヒネ(約20μM)、κアゴニスト(約80μM)、δアゴニスト(約80μM)またはIFN-γ(約10μg/ml)の存在下および非存在下において、細胞を緑膿菌株PAO1(107 cfu/ml)によりアピカル面で接種する。緑膿菌の上皮細胞に対するバリア調節を異常にする効果へのオピオイドおよびIFN-γの効果の最適化のために、用量および時間の応答曲線を作製する。TEERは、チョップスティック電極を8時間の間一時間ごとに使用して測定する。Alexa-594-標識されたエキソトキシンAを使用するエキソトキシンAのアピカル面から側底部への流出は、各々の条件についてエキソトキシンA流出へTEERの減少を関連させるために、各々の一時間ごとの時点で実行された反復実験において決定される。エキソトキシンAの有意な透過性欠損が確立された選択実験において、PA-Iの特異的役割は、0.3%のGalNAc(N-アセチルガラクトシド)および0.6%のメリビオース(PA-I78へ特異的に結合する二糖オリゴサッカライド)の存在下および非存在下の反復実験の実行によって定義される。関連性がない糖(ヘパリン/マンノース)を、陰性対照として使用する。反復研究は、オピオイドおよびIFN-γへ曝露された株におけるPA-Iの特異的役割を定義するために、PA-Iトランスポゾンノックアウト(lecA -)変異体も使用して実行される。PA-Iが宿主上皮細胞と相互作用する位置にあり、それによって上皮細胞の細胞バリア性に最小で影響を及ぼす場合には、PA-Iが発現され、微生物病原体の細胞表面へ局在するであろうことが期待される。
オピオイドおよびIFN-γがMDCK細胞のTEERを減少させるであろうことが期待される。細胞単層において低TEERにより増加するエキソトキシンA流出は、オピオイドおよびIFN-γが緑膿菌の致死表現型を単独で誘導できることを示唆するだろう。GalNAc、メリビオース阻害研究またはPA-Iレクチン/アドヘシンノックアウト株が、緑膿菌がTEERおよび細胞単層を越えるエキソトキシンA流出を変えることを妨げる場合、そのとき、観察された反応がPA-Iに仲介されるものであることを示すだろう。PA-Iノックアウト変異株がTEERを変化させ、エキソトキシンAがオピオイドまたはIFN-γに反応して流入すれば、PA-Iは単独では、腸上皮に対する緑膿菌の毒性についての原因ではないかもしれないことを示すだろう。これらの研究からのデーターは、これらのインビトロの分析が正確にインビボで致死表現型を予想通りに予測するかどうかを決定する、線虫およびマウスの致死性の研究(以下を参照)と、直接比較され関連づけられる。
実施例１８
シノラブディス・エレガンスおよび外科的ストレスを受けたマウスを使用して示されるような、緑膿菌による腸由来敗血症に対するオピオイドアゴニストおよびIFN-γの役割
このデーターは、オピオイドアゴニストおよびIFN-γは、PA-Iの作用を介してインビトロの緑膿菌の毒性を促進するという強い証拠を提供する。さらに、オピオイドアゴニストおよびIFN-γが緑膿菌のインビボの致死性に影響を及ぼす程度は未知である。したがって、緑膿菌のインビボの致死性を促進するオピオイドおよびIFN-γの能力は、例えば、2つの相補的な動物モデルで評価される。
野生型のN2シノラブディス・エレガンス虫を、栄養源として大腸菌OP50と共に正常増殖培地(NGM)上でL4幼虫ステージまで増殖させる。PA-Iを誘導する化合物(媒質(陰性対照))、オピオイド(モルヒネ、κおよびδアゴニスト)、IFN-γ、およびC4-HSL(陽性対照)を加え、アガーの中に吸着した、エタノールについて記述されるような特殊化寒天プレートを調製する。シー・エレガンス増殖アガーの中に生物活性化合物を埋め込む能力は、十分に記述される。次に、液体培地中で一晩増殖した緑膿菌の培養を加えることによって、緑膿菌(野生型PAO1およびPA-IノックアウトPAO1(lecA -))の芝生を、寒天プレートの固形上で前もって増殖させる。NGM培地からの線虫を調製された培養皿上に転写し、死滅ダイナミックスを25℃の温度条件で経時的に評価した。PA-Iを誘導する化合物の各々についての死滅効果を実証できる最適条件を確立するために、異なる用量および再投与スケジュールで実験を実行する。
確立している腸由来敗血症のマウスモデルにおいて、PA-Iを誘導する化合物が緑膿菌の致死性を促進する能力を検査するために、マウスを24時間断食させ、全身麻酔、30%の外科的肝切除、および直接的な穿刺による野生型のPAO1またはPAO1(lecA-)の106 cfu/mlの盲腸点滴を行なった。このモデルにおいて緑膿菌の用量応答曲線は確立されており、緑膿菌の106 cfu/mlは48時間で50%の死亡率を誘導することを示す。オピオイドアゴニストまたはIFN-γがこのモデルにおいて緑膿菌の致死性を促進することを実証するために、各々の様々な用量を1mlの0.9%NaCl中に懸濁し、24時間の間にPA-Iを誘導する化合物の一定の供給を提供するために回腸に逆行性に注入した。生理食塩水単独が対照として使用される。この操作は、このモデルにおいて、盲腸への外因性化合物の連続供給の送達において効果的であることが知られている。マウスには次の24〜48時間水のみを与え、死亡率を記録した。瀕死のマウスは屠殺し、細菌付着および伝播パターンを定量するために、盲腸粘膜、肝臓、および血液をシュードモナス属単離アガー(PIA)上で緑膿菌増殖のために培養する。研究において使用するマウスは2つの系統(野生型およびPA-Iノックアウト)を含み、1つのグループ当たり10匹のマウスの6つのグループで、合計120匹のマウスが適切である。
オピオイドおよび/またはIFN-γの存在下で、緑膿菌の芝生上で餌を食べる線虫における死亡率の増加は、これらの化合物がこの生物の腸上皮に対して致死表現型を誘導する能力を実証する。これらの実験における線虫の死滅促進の実証は、このモデルの利用可能性および適用可能性を確立する役目もする。本明細書において開示されるように、PA-Iを誘導する化合物の非存在下で、シー・エレガンスは80時間で50%の死亡率を示す。オピオイドおよび/またはIFN-γの検査では、または一般にPA-Iレクチン/アドヘシン活性の調節因子のためのスクリーニングでは、48時間の増殖および生殖後に、線虫を繁殖させることができ、子孫線虫は親線虫と区別なしにプレートに一面に増殖することができることが言及されるべきである。PA-Iを誘導する化合物に反応する死滅ダイナミックスが、観察を48時間以上延長するようなものである場合、そのときは、温度感受性変異体、例えばシー・エレガンスGLP4(25℃で繁殖しない)の使用が好まれる。マウスにおける相補的な実験は、線虫で得られた結果を確認するだろう。
シー・エレガンスで得られた結果を確認するマウスの研究の使用は、管腔に送達されたPA-Iを誘導する化合物が、促進された毒性の一般的測定値としてのPA-Iのアップレギュレーションに効果的であるという立証を好ましくは含む。この可能性の制御のために、小腸に注入されたPA-Iを誘導する化合物がマウス盲腸におけるPA-I発現を促進することを示すように実験を実行する。1つのアプローチは、緑膿菌の盲腸点滴24時間後の盲腸内容物から新鮮に分離されたRNAについてのPA-IおよびエキソトキシンAの定量的RT-PCRの使用を含む。盲腸の中へのオピオイドおよびIFN-γの直接送達に対する代替アプローチは、モルヒネおよびIFN-γの両方を産生する非病原性の大腸菌株を操作することである。大腸菌中で、組換型モルヒネおよびIFN-γを作る可能性は十分立証される。次に、外科的ストレス(例えば肝臓切除術)を行なったマウスの盲腸の中へ、LD50用量の緑膿菌(およそ106)およびモルヒネ産生大腸菌株および/またはIFN-γ産生大腸菌株を直接同時接種する。この様式で、緑膿菌は、天然にインビボで起こるような、PA-Iを誘導する化合物の持続的な供給に直接曝露されるだろう。ここで関連するのは、多数の微生物菌株(大腸菌、シュードモナス属、カンジダ属)が天然にオピオイドを産生する(特にモルヒネ)という当技術分野における知識である。さらに、重症患者に典型的な「微生物スープ」は、高度に有害な環境で栄養物質を競合する細菌の高病原性耐性株から成る。したがって、モルヒネ産生大腸菌および/またはIFN-γ産生大腸菌の使用は、インビボのマウスデーター取得に対する実現可能な代替アプローチを構成するだけではなく、インビボでの実際の事象も再現するだろう。最終的に、正常に大腸菌株上で餌を食べるシー・エレガンスの死亡は誘導されない。モルヒネ産生大腸菌株および/またはIFN-γ産生大腸菌株の有効性を、シー・エレガンス分析において使用することができるかもしれない。マウスの腸粘膜の中へ組換型IL-10を産生する細菌の直接的な腸点滴を使用するIL-10の送達によって示されるように、他の研究は、このアプローチの可能性がマウスにおいて実現可能なことを示した。シー・エレガンス分析の使用が、哺乳類に接触または隣接する微生物病原体による毒性表現型の発現を調節する治療および予防薬の迅速な同定をもたらすと期待される。様々な測定を使用して、毒性表現型の査定は可能であり、それらのうちの多数は間接、例えば上皮細胞バリア機能の測定である。
実施例１９
宿主ストレスに起因するオピオイドおよび/またはIFN-γは腸管腔の中へ放出される
ヒトおよび動物の血液中の内因性のモルヒネ濃度は外科的ストレスの程度に対して直接的に反応して増加する。哺乳類の腸の神経回路網は身体の中でオピオイド受容体を最も高い濃度で含む。モルヒネは、μ3オピエート受容体サブタイプを介して哺乳類の胃腸管における一酸化窒素の放出を促進することが最近示された。さらに、線虫(豚回虫)は腸においてモルヒネを産生し、遊離することが示された。同様に、IFN-γは、細菌の攻撃および虚血/再潅流障害(I/R)を含む様々なストレッサーに反応して、腸によって腸上皮間リンパ球から放出されることが示された。
シー・エレガンスがモルヒネを産生または放出することを実証するために、従来の培養技術を使用して、液体培地中の大量培養で1×106の線虫まで20℃で許容的に線虫を増殖する。ストレス条件の負荷の24時間前に、ストック培養を抗生物質で処理する。当技術分野において公知の沈降およびショ糖浮遊によって、任意の残存細菌から線虫を分離する。次に、記述されるように、線虫を、2時間の回復が後続する熱ストレス(35℃1時間)、または1時間の正常酸素の回復が後続する低酸素ストレス(0.3%のO2、45分間)のいずれかへ曝露する。対照線虫を20℃および21% O2で維持する。増殖培地およびホモジナイズしたシー・エレガンスの上清の両方を、従来の技術を使用して、好ましくは、HPLC/GC/MSによってモルヒネについて分析する。モルヒネおよびIFN-γが外科的ストレス後にマウスの腸によって産生されるか、または腸の中に放出されるかどうか決定するために、マウス群(n＝10/群)に、30%の肝臓切除術または下記に述べられるような分節腸間膜虚血を行なう。肝臓切除術モデルを伴う外科的ストレスは、30%の外科的肝切除または対照のための擬似腹壁切開の実行、ならびにモルヒネおよびIFN-γ分析のための24時間後の盲腸組織盲腸管腔の内容物および血液の採取から成る。虚血再潅流モデル(I/R)は、カニューレの管腔への挿入および10分間の虚血(区動脈クランプ)に後続する10分間の再潅流が行なわれる遠位回腸の10cm部分の単離を含む。2mlのリンガー溶液による管腔灌流を、I/Rの前後に管腔内容物を回収するために実行する。管腔内容物、ホモジナイズした腸部分および血液を、HPLCおよびGC/MSによってモルヒネについて分析する；IFN-γ特異的な抗IFN-γ抗体を使用して、ELISAによって分析する。そのような分析のためのマウスの適切な数は30〜50匹のマウスである。
外科的ストレス後の腸中へのモルヒネおよび/またはIFN-γの有意な量の放出は、宿主ストレスの最中に、毒性表現型を活性化または促進することができる高活性化合物へ緑膿菌が曝露されたことを確かにする。さらに、緑膿菌がインビボで曝露されるモルヒネおよび/またはIFN-γの正確な濃度についてのよりよい理解は、これらの実験によって決定することができる。内腔または腸組織内で高濃度のモルヒネが放出されるかどうかに関わらず、実験的測定は可能である。管腔のモルヒネのレベルが、対照に対して肝臓切除術で上昇する場合、マウスは抗生物質(例えばシプロフロキサシン、メトロニダゾール)で混入除去することができる。そのような混入除去後に、管腔の細菌叢がオピオイドのレベルに寄与する範囲は、従来の技術を使用して決定することができる。例えばモルヒネに加えて、宿主ストレス由来のBSCとして積極的に関与する他のオピオイドおよびサイトカインは、緑膿菌のような微生物病原体から放出されてもよいことが言及されるべきである。さらに、オピオイドおよびIFN-γの両方が腸管腔の酵素で分解されることはありえる。代替のアプローチは、特異的にこれらの化合物を認識する抗体が容易に利用可能なので、組織中のモルヒネおよびIFN-γ存在を評価するために染色された組織の定量的免疫蛍光を使用することだろう。前の観察にもかかわらず、これらの化合物は、困難を伴わないで管腔内容物から他の研究者によって測定された。
実施例２０
PA-Iレクチン/アドヘシン活性に対するBSCの役割を確認するためのノックアウトマウスの使用
IFN-γは、急性感染症の間の局所的および全身的な細菌の除去に積極的に関与する重要な免疫の要素である。動物モデルは、局部組織部位(肺)での感染性攻撃の後に、IFN-γが十分なマウスと比較して、IFN-γノックアウトマウスが細菌除去能力の低下と関連してより高死亡率であることを示した。実質的には、緑膿菌感染に対するIFN-γの役割を評価したインビボの研究はすべて、外科的にストレスを受けたマウスのようなストレスを受けたマウスでではなく、感染性攻撃を肺に点滴されたストレスを受けていないマウスで実行された。
腸の緑膿菌の致死性を、確立している腸由来敗血症のモデルにおいて、IFN-γノックアウトマウスおよび野生型の対照(各々のグループでn＝10)で検査する。24時間断食したマウスは30%の外科的肝切除を受け、その後直接的な穿刺を介した各々の盲腸の中への野生型PAO1の106 cfu/mlの点滴が続いた。次に、マウスは実験の残り期間水のみを与え、48時間後に屠殺した。瀕死のマウスは屠殺し、盲腸粘膜、肝臓、および血液を、細菌付着の比率および伝搬を決定するために、シュードモナス属単離アガー(PIA)上で、定量的に培養する。緑膿菌におけるPA-I発現がIFN-γにより減少するかどうかを決定するために、GFP PA-Iレポーター株を30%の肝臓切除術が行なわれたマウスの盲腸に直接注入し、細菌株は蛍光を決定するために24時間後に回収する。これらの実験の結果は、分節腸間膜虚血モデルを使用する相補的な研究の遂行を導く。簡潔には、10cmの回腸の部分の管腔に擬似虚血(クランプはない)、10分間の虚血を行い、10分間の再潅流をリンガー液で潅流し、時間ごとの灌流液の分割量を、IFN-γノックアウトマウスおよび野生型集団の両方から集める。GFP-PA-Iレポーター株の使用は、各々の灌流液がPA-Iプロモーター活性を誘導する範囲の測定を促進する。そのような研究のためのマウスの適切な数は、各々の群において10匹のマウスで5つの群に分けられた、50匹のマウスである。
IFN-γノックアウトマウスにおいて、緑膿菌による致死性の減少が示されたことは、ストレス(例えば外科的ストレス)の間の宿主ストレス由来の細菌のシグナリング化合物(またはタンパク質)として、IFN-γが役割を果たすことと一致している。しかしながら、IFN-γは、異化ストレス状況下で、緑膿菌に対する完全な致死性毒性レパートリーを結集するのに必要な多くのシグナルのうちのたった1つかもしれない。肝臓切除術を行なったIFN-γノックアウトマウスが腸の緑膿菌に対して過補償の過剰炎症反応を発症し、微生物毒性の促進よりも免疫反応に多くもとづく死亡率の増加をもたらすことが言及される。これらの研究からの組織および血液培養の結果は、死亡率が一部分はそのような過剰補償のためかどうか決定するために使用される。これらの可能性を区別する代替アプローチは、マウス群が緑膿菌により全身的接種される(例えば、腹腔内、静脈内、肺点滴)場合に、死亡率の差があるかどうか決定するために、IFN-γノックアウトマウスおよび対応する野生型の集団(外科的肝切除有りおよび無し)において研究を実行することである。
実施例２１
ストレス誘導性の細菌のシグナリング化合物のためのスクリーニング
本明細書において開示されたデーターは、i)PA-Iを発現するように緑膿菌において強いシグナルを誘導する、肝臓切除術を行なったマウスの盲腸から、または腸間膜動脈閉塞を行なった腸部分の小腸管腔からろ過された管腔内容物；およびii)PA-I発現を誘導する、低酸素のCaco-2細胞または熱ショックを受けたCaco-2細胞からの培地および膜の調製、を確立する。
A. 虚血および熱ショック・ストレスへ曝露されたCaco-2細胞の培地に存在し、緑膿菌においてPA-I発現を誘導する、ストレス由来のBSC
外科的ストレス後の腸上皮の低酸素は、重病の共通の結果であり、多くの場合治療の不注意な結果である。さらに高熱は、損傷および感染への急性ストレス反応間にしばしば発生する。培養された腸上皮細胞(Caco-2)への低酸素または高熱ストレスが、細胞培養培地の中へ可溶性のPA-Iを誘導する化合物の放出を引き起こすことを実証するデーターが、本明細書において開示される。この実施例は、低酸素および高熱ストレスへ曝露されたCaco-2細胞によって放出される、PA-Iを誘導する化合物の単離および同定を開示する。
好ましくは、2セットの実験が実行される。実験の第1セットでは、細胞培養プレート(150 cm2)において密集するまで増殖させたCaco-2細胞を、正常酸素(O2、21%)または低酸素(O2、0.3%を2時間、その後1時間の正常酸素の回復が続く)のいずれかへ曝露する。実験の第2のセットでは、Caco-2細胞を、正常熱(37℃)または、高熱(23分間42℃で水浴の中で浸され、その後3時間の回復が続く)条件へ曝露する。次に、実験の各々のセットからのペアのサンプルは、検出系としてのGFP-PA-Iレポーター株を使用して、特異的な宿主ストレス由来の細菌のシグナリング化合物を同定するために処理される。Caco-2細胞からの培地を回収し、0.22μmフィルター(ミリポア(Millipore))を通してろ過し、3、10、30、50、100 KDa(<3、3〜10、10〜30、30〜50、50〜100、>100 KDa)のMWカットオフでセントリコンを使用して、分子量によって分離する。PA-I GFPレポーター株を使用して、PA-I発現を活性化する画分を決定するために、好ましくは全ての画分を、96ウェルプレート中で検査する。好ましい2つのアプローチが、ストレス-コンディションド培地(低酸素、高熱)中のPA-Iを活性化するタンパク質の同定についての使用のために検討される。第1アプローチは、生物活性画分(i.e、PA-Iを誘導する画分)およびそれらの分子量が対応する対照画分(PA-Iを誘導しない)を、Maldi-質量分析(MS)による分析を行なう。PA-Iを誘導するサンプルの中にのみある可能性のあるタンパク質分子イオンの外観を決定するために、対照培地画分からのスペクトルを、ストレス-コンディションド培地の画分と比較する。これは、PA-Iを誘導しない画分およびPA-Iを誘導する画分の両方の中に存在するタンパク質を差し引くことを可能にするだろう。PA-Iを誘導する画分の中にのみある分子イオンタンパク質ピークを分離するために、生物活性の画分をVydac C4カラムを装備したHPLCに載せる。溶出されたサンプルを画分として回収し、個々の画分を、GPF-PA-Iレポーター株を使用して、PA-I発現を誘導する能力について検査する。タンパク質をその後さらに、HPLCシステム中で段階的に適切にコントロールされた物理化学的分離手法を使用して、好ましくは分子量、疎水性、および荷電によって分離する。この様式で前分画したサンプルは、観察された質量スペクトルを単純化し、PA-I発現を誘導する任意の推定上のタンパク質を観察する可能性を増加させるに違いない。任意のそのようなタンパク質のために、ボトムアッププロテオミクス技術を使用する同定を実行する。
高度に複雑なスペクトルを提供する研究において適切な、分子イオンスペクトルの使用に対する代替物は、イオン交換、疎水性、サイズ排除、および/または親和性クロマトグラフィーのような従来の技術を使用するタンパク質精製のための古典的アプローチである。宿主ストレス由来のBSCの精製は、好ましくは、GFP-PA-Iレポーター株を使用して評価される。
タンパク分析のために、タンパク質含有画分をトリプシンの使用によって消化し、消化した画分を、LC/MSD XCTイオントラップ質量分析システム(アジレント・テクノロジー(Agilent Technologies)、サンタクララ、カリフォルニア)により分析する。マススペクトロメーターからのデーターのためのデーター分析を、SpectrumMillソフトウェアプラットフォーム(アジレント・テクノロジー、サンタクララ、カリフォルニア)を使用して行なう。同定されたタンパク質のPA-I発現を誘導する能力の確認は、PA-I:EGFPレポーター株における蛍光の測定および緑膿菌株PAO1におけるイムノブロット解析にによって簡便には達成される。
Caco-2細胞からPA-I発現を誘導する2つの蛋白分画が同定された。画分(複数可)中の特異的な活性タンパク質(すなわち上皮細胞由来のPA-Iシグナリングタンパク質)の同定は、任意の公知の技術を使用して、好ましくはシカゴ大学プロテオミクス設備のようなプロテオミクス設備を使用して達成される。上皮細胞膜との接触後に、PA-I発現の最も強力な誘導が起こるので、これらのタンパク質の多くは細胞膜自体の起源であってもよい。タンパク分析に加えて、そのようなタンパク質を特異的に認識する抗体は、細胞(例えばCaco 2)での局在性研究のような用途のために検討される。タンパク分析に対するより古典的なアプローチがあるが、質量分析が最も費用効率が高く迅速なアプローチである。非タンパク質性のPA-Iを誘導する化合物のために、画分をpH3.5へ合わせ、その後のHPLC、例えばSep-Pak C18カラムを使用することを含む、脂質分析が検討される。溶出されたサンプルを、フラクションコレクターで捕らえ、蒸発させ、PA-Iレポーター分析のためにPBSで再懸濁する。活性化合物の構造は、好ましくはIT/LC/MS/MSにより同定される。タンパク質または脂質でもない細菌のシグナリング化合物のために、関連する画分をC18カラムおよび四重極飛行時間質量分析計およびNMRを使用するIT/LC/MS/MSによって分離する。個別の化合物を質量断片化スペクトルによって決定し、分離し、GFPレポーター株を使用して、PA-Iを誘導する活性について調べた。タンパク質分離のための2D-SDS-PAGE電気泳動、および非蛋白の分離のためのTLCのような代替アプローチも検討される。2D-SDS-PAGEによって分離されたタンパク質は、典型的には、自動化エドマン分解N末端配列測定のために、ABI 477Aタンパク質配列決定装置(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems))を使用して、重合ビニリデンのジフルオリド転写タンパク質膜へ転写される。タンパク質分析は、データーベースに対する配列の比較によってさらに促進される。
調節因子のために前述のスクリーニングに加えて、本発明は、ヒトのような哺乳類に関連または隣接する微生物による毒性表現型の発現の調節因子のための任意の分析も検討する。特に本発明は、上皮細胞(例えば腸および肺および同種のものの上皮細胞)バリア機能のような、例えば真核生物の細胞バリア機能の調節因子のための様々な分析を包含する。本発明は、PA-Iの特異的活性の調整、または持続的な特異的活性のPA-Iの発現の調整、または両方によるものであるかに関わらず、さらにPA-Iレクチン/アドヘシン活性の調節因子のための多数の分析を包含する。一般に、本発明は、上記特質の少なくとも1つがある化合物および/または組成物を同定するのに役立つものとして、当技術分野において公知の任意の分析も検討する。
実施例２２
様々な方法
A. PA-Iレポーター構築物を使用するPA-I調節因子のためのスクリーニング。
低酸素または熱ショックストレスのいずれかへ曝露されたCaco-2細胞からの培地は、緑膿菌においてPA-I発現を誘導した。上皮のストレス後に、細胞外環境へ放出される候補PA-I誘導因子化合物は、ATP、乳酸塩、cAMP、サイトカインおよび熱ショックタンパク質を含む。
適切に作られたコンディションド培地中に見られる前述の候補調節因子および他の候補調節因子は、本発明の他の局面を構成するスクリーニング方法を使用して同定される。そのような調節因子のためのスクリーニングは、GFP-PA-Iレポーター株PA27853/PLL-EGFPを含む96のウェルプレートにおいて簡便には行われる(下記の実施例24を参照)。レポーター株を、熱ショックタンパク質(HSP 25、72、90、110)、細胞外ヌクレオシドおよびヌクレオチド(アデノシン、ATP、cAMP)およびサイトカイン(IL-1〜18)を含むが限定されない、候補宿主ストレスBSCの様々な濃度へ曝露する。薬剤をウェルへ加え、細菌の蛍光の動的査定を12時間の間行なう。陽性の結果は、好ましくはPA-I発現のウエスタンブロット分析によって確認する。PA-I反応を誘導するタンパク質については、本発明は、そのようなタンパク質が結合する緑膿菌上の受容体を同定する分析をさらに包含する。本発明のこの局面の1つの実施形態では、同定されたPA-I活性のタンパク質誘導因子は、ドットブロット分析による、例えば緑膿菌の包括的なライブラリーのスクリーニングに対するプローブとして使用される。スクリーニング結果の確認は、緑膿菌トランスポゾンライブラリーからの関連するコード領域が挿入不活化により破壊された対応するクローンの溶解物のタンパク結合能力の分析によって、利用可能である。
次に、そのような調節因子による毒性発現における役割についての理解を改良するために、同定された調節因子は、追加のインビトロおよびインビボの毒性分析を行なう。
B. Caco-2およびMDCKの細胞培養、TEERの測定、およびエキソトキシンA流出。
Caco-2細胞およびMDCK細胞は、密集した単層に増殖した場合、安定したTEERを維持する高分化型の上皮細胞株である。単層を越えたアピカル面から側底部へのエキソトキシンA流出を、Alexa594-標識エキソトキシンAにより、標準流出測定を使用して評価する。
C. 細菌株。
緑膿菌株PAO1はワシントン大学ゲノムセンターから得られ、好ましくは本明細書において開示された手順において、適切なところで使用される。
D. シノラブディス・エレガンス分析。
本明細書において記述されるように、緑膿菌の致死性のための分析への線虫の使用は、標準手順を使用して遂行される。
E.抗体。
PA-Iに対する抗体は従来の技術を使用して生成される。好ましくは、そのような抗体は親和性クロマトグラフィーによって精製される。IFN-γ抗体およびモルヒネ抗体は市販で入手可能である。
F. 膜結合のためのドットブロット分析。
大規模なマトリックスシステムでの細菌蛋白の検出のための免疫ドットブロット分析は、当技術分野において公知である。この技術は、高感度および正確であるとして検証された。
G. 細菌株PAO1のトランスクリプトーム解析。
本明細書において記述されるように、オピオイドおよび/またはIFN-γへ曝露された、0.5、1.0、2.0の光学的濃度の細菌培養からRNAを分離する。次に、1×109〜2×109の細胞をRNA保護細菌試薬(RNA Protect Bacteria reagent)(キアゲン(Qiagen))と混合し、製造者によって推奨されるような機械的破砕および溶解手順によって処理した。RNAは、製造者によって記述された、カラム上のデオキシリボヌクレアーゼＩ消化を含む、RNeasyミニカラム(キアゲン)の使用によって精製する。さらに溶出したRNAを、好ましくはデオキシリボヌクレアーゼＩ(RNA 1μg当たり0.1U)により37℃で1時間処理する。次に、デオキシリボヌクレアーゼＩはDNA-Free(アンビオン(Ambion))の使用によって、またはRNeasyカラム精製によって除去される。RNA全体性を、グリオキシル化されたサンプルのアガロースゲル電気泳動によってモニターする。次に、製造者(アフィメトリックス)によって記述されるように、緑膿菌GeneChipゲノムアレイのさらなるサンプル調製および加工を行なう。cDNA合成については、精製されたRNA 12μgを、好ましくは75%平均G＋C含有量のセミランダムヘキサマープライマーおよびSuperscript II逆転写酵素(ライフ・テクノロジーズ(Life Technologies))と組み合わせる。酵母、シロイヌナズナおよび枯草菌遺伝子(Bacillus subtilis)からの対照RNAを、分析の遂行をモニターするために反応混合物へ加える。これら転写のためのプローブを、GeneChipアレイ上に張り付ける。RNAをアルカリ加水分解によってPCR混合物から取り除く。cDNA合成産物を、デオキシリボヌクレアーゼＩでの短時間のインキュベーションによって精製および断片化し、断片化産物の3'末端をビオチン-ddUTPで標識する。断片化し標識したcDNAを、50℃で一晩のインキュベーションによりアレイへハイブリダイズする。マイクロアレイの洗浄、染色、およびスキャンを、アフィメトリックスの流体ステーションで実行する。
H. 発現プロファイリング。
アフィメトリックスマイクロアレイソフトウェア一式(MAS)(バージョン5.0)は、転写レベルの決定、および異なるサンプルが比較される場合、転写レベルに違いがあるかどうかを決定するのに適切なソフトウェア選択である。アフィメトリックススケーリングは、異なるアレイからのデーターを正規化するために使用する。スケール係数は、アレイ上の全プローブセットの平均のシグナルおよびユーザ定義の標的シグナルに由来する。個別のプローブセットからのシグナルにこのスケール係数を掛ける。既知のアレイについては、mRNAの18〜28%は、MASによって存在しないと考えられ、対応遺伝子がバックグラウンドレベル以上のレベルに発現しないことを示す。更に、対照転写強度における平均変化が配列データーの任意の比較に対して2倍未満であることは当技術分野において知られている。これは、cDNA合成の効率および標識がサンプル間で同様であることを示す。比較による分析については、規定の1ペアのアレイから得られた絶対的な転写シグナルに対するlog2比率は、MASの使用により計算されるだろう。ソフトウェアの統計アルゴリズムも各々の転写ペアを要求する変化を割り当てられ、ベースラインサンプルに対するレベルと比較して、転写のレベルが有意に増加、減少、または変化しないかどうかを示す。ベースラインサンプルは、追加オピオイドまたはIFN-γなしの緑膿菌PAO-1の培養に由来したものである。各々の実験(任意のペアのアレイ)からのシグナルのlog比率の図解分析は、非常に0近い平均(変化はない)をともなう正規分布を示すために実行される。1つまたは複数のサンプルにおいてベースラインと比較して、有意な増加または減少をともなう転写の中で、少なくとも2.5倍の変化を示したものは、詳しい分析を行なう。クラスター分析および転写パターン解析については、GeneSpringソフトウェア(シリコンジェネティックス(Silicon Genetics)、レッドウッドシティー、カリフォルニア)が、適切な選択として検討される。各々の遺伝子の倍変化値は、遺伝子に対する最大値の半分を1として定義し、その値を含む比率として他のすべての値を表わすことにより、独立して正規化されるだろう。このスケーリング手順は、実験間の比較と同様に、実験中の遺伝子発現パターンの直接的な目視比較を可能にするだろう。GeneSpringも緑膿菌ゲノムプロジェクトに従って遺伝子を選別することで使用のために検討される。
I. 緑膿菌からの未変性および変性膜タンパク質画分の可溶化。
緑膿菌細胞をPBSにより洗浄し、タンパク質阻害剤反応混液を含むPBSで再懸濁した。膜画分の調製については、緑膿菌細胞をフレンチプレスによって破壊し、残屑を除去するために10000g×30分で遠心分離機にかける。上清を、50000g×60分で再度遠心分離機にかける。ペレットは4%CHAPS中で3時間37℃で可溶化する。50000g×60分で再度遠心分離機にかけた後に、上清を100K セントリコンを通して遠心し、PBSに対して透析する。可溶化したタンパク質のIFN-γに対する結合能力をELISA結合分析によって確認する。
J. 統計分析および蛋白質間相互作用。
統計分析については、好ましくは全てのデーターはSigmaStatプラットフォームソフトウェアにかけられ、適切な検査を適用した。蛋白質間相互作用の研究は、当技術分野において公知のような従来の手順を使用して実行される。
K. Maldi-MS分析。
サンプル(0.5μL)を、水中に0.1%TFA、30%アセトニトリルを含む溶液にα-シアノヒドロキシ桂皮酸を5mg/mLで含む溶液の等しい容積と共に混合し、次に、192のスポット標的プレート(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)上に手動でスポットする。プレートを、4700のMALDI TOF/TOF(アプライド・バイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア)に挿入し、線形様式で操作した。サンプルは200HzのYAGレーザーによって脱着された。獲得プログラムは、5000〜100000トンプソンの範囲を越えた射程の合計されたスペクトル(200〜1000)を得るようにセットされている。
L. タンパク分析用の調製のためのトリプシン使用によるタンパク質含有画分の消化。
抽出タンパク質サンプルを、0.1%Rapigest SF酸不安定性界面活性剤を含む、50 mM炭酸アンモニウム緩衝液、pH 8.5中で希釈する(ウォーター社(Waters Corp)、ミルフォード、マサチューセッツ)。サンプルは、完全にタンパク質を変性させるために10分間100℃まで加熱する。10μLの10 mM TCEPを、ジスルフィド結合を減少させるために加え、サンプルを37℃で10分間インキュベートする。プールしたサンプルを、37℃で3時間1:100の質量比でLys-C(12.5 ng/μL)で消化し、次に37℃で3時間1:50(トリプシン: タンパク質)の質量比にてトリプシン(12.5 ng/μL)で消化する。最終的濃度1 mMまでのPMSFを加えることにより消化を停止する。消化後に、酸不安定性Rapigest界面活性剤を失活させるために、10μLのTFAを溶液へ加え、サンプルを37℃で45分間インキュベートする。
M. LC/MSD XCTイオントラップ質量分析分析。
消化したタンパク質試料を、Zorbax 300SB-C18(5×0.3mm)を含むC18トラッピングカラム(アジレント・テクノロジー(Agilent Technologies)、サンタクララ、カリフォルニア)を内蔵するHPLC(アジレント・テクノロジー1100)の上に注入する(10μL)。注入5分後にカラム弁を第2の位置へ切り替え、次に捕らえたペプチドを75μm id Zorbax Stablebond(300 Aポア)カラム上に溶出し、A: 0.1%ギ酸および5%アセトニトリルおよびB: 300 nL/分の流量で、0.1%ギ酸および100%アセトニトリルから成る、二成分溶媒系を使用してクロマトグラフィーで分離する。質量分析計は、データー依存的自動-MS/MS獲得モードに対するトラップセットによる陽イオンモードで操作される。ソース条件は、Vcap -4500V、乾燥ガス流量8L/分、乾燥ガス温度230℃およびCapEx 65Vである。1秒で400〜2200トンプソンからの質量スキャンするを完了するように器機をセットする。100,000任意強度単位以上のイオンを有する、LCカラムから溶出されるピークは、イオンを分離するイオントラップを引き起こし、MSフルスキャン後に、MS/MS実験スキャンを実行する。器機の動的イオン排除フィルターは、器機がペプチドからの質的データーの獲得を最大限にするよう、各々の検出されたイオンにつき2つまでのMS/MSのスペクトルの記録を可能にするようにセットされ(高存在量のペプチドが、その後MS/MSの実験で優勢になるのを妨げることによって)、励起エネルギーは、すべてのペプチドからの有用な産物のイオンスペクトルの生成の検出が保証されるよう、「スマートフラグ(smart frag)」モードへセットされる。データーファイルの結果は、次に、続くデーター整理のためにファイルサーバーへ転送される。
N. SpectrumMillソフトウェアプラットフォームによる質量分析計データー分析。
SpectrumMillはMSタグソフトウェアパッケージに由来し、適切なソフトウェアプラットフォームとして検討される。生データーはデーター抽出モジュールを使用してMSデーターファイルから抽出され、次にデーターはSherengaモジュールによってタンパク質ライブラリー検索およびデノボのスペクトル解釈を行なう。SpectrumMillは、生データーファイルからの抽出の間に、関連したMSおよびMS/MSのデーターの注意深いフィルタリングおよびグルーピングによって、ペプチドのMS/MSのスペクトルから得られた偽同定を最小限にするように設計されている。ライブラリー検索およびデノボ解釈は、検出されたタンパク質が個別のペプチドを形成すると同定する。検出されたすべてのタンパク質に対する結果は収集され、タンパク質の名称、検出されたペプチド配列、および検索スコアによってリストされる。その報告は、結果のデーターベースの取りこみのためにエクセル表計算ファイルへエクスポートされる。さらに、イオントラップからの生データーファイルから抽出されたデーターを、好ましくはマスコット(Mascot)(マトリクスサイエンス社(MatrixScience Inc)、ロンドン、イギリス)検索プログラムへ提出し、NCBIの非重複タンパク質データーベースおよびSWISSPROTタンパクデーターベースの両方に対して検索した。これらの2つの系からの同定は、同定されたタンパク質の最終的なコンセンサスリストに到達するように関連づけられる。
O. HPLCシステムでの脂質画分の分離。
画分をpH3.5へ調節し、HPLCシステム(ミリポア社、ミルフォード、マサチューセッツ)のSep-Pak C18カラムを通す。カラムを二段蒸留水で洗浄し、化合物を漸増的に極性の移動相(ヘキサン-蟻酸メチル-メタノール)で溶出する。画分を窒素気流下で濃縮し、1mlのPBS(PA-Iレポーター分析のために)、または100 ulのメタノール(UV/HPLCのために)中のいずれかで再構成する。Sep-Pakからの有効画分を、好ましくはChemStationTMソフトウェア(ヒューレット・パッカード(Hewlett Packard)、パロアルト、カリフォルニア)を使用して、1050シリーズHPLCで1ml/分で酸性化(0.1%酢酸)して、メタノール:水(60:40体積/体積)でC18逆相HPLCカラム(150mm×5mm、フェノメネクス(Phenomenex)、トランス、カリフォルニア)によってさらに分離する。
実施例２３
緑膿菌におけるモルヒネ誘導性のPA-Iレクチン/アドヘシン発現に対する、三級μ-オピオイド受容体アンタゴニストおよび末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストの両方の個別の効果が調べられた。研究のために使用された緑膿菌株は、上に記述されたPA-Iレクチン/アドヘシンレポーター株/PLL-EGFP 27853であった。具体的に示された場合以外には、本明細書において記述されるように、PA-Iレクチン/アドヘシン分析を実行した。レポーター株を96ウェルプレートのウェル中でインキュベートし、蛍光および細胞密度は従来の技術を使用して測定した。図7に示された結果は、細胞密度に対して正規化した20時間のインキュベーション後の蛍光データーを表わす。棒は、12個の値の中央値±標準偏差を表わす。図7から明らかなのは、PA-Iレクチン/アドヘシンのモルヒネ誘導性の発現に対する、20μMメチルナルトレキソンおよび20μMナロキソンの個別の抑制効果の各々と同様に、PA-IL発現に対する20μMモルヒネの効果である。
図7に示されるように、PA-Iレクチン/アドヘシンにおけるこれらのオピオイド誘導性の増加は、μ-オピオイド受容体アンタゴニスト、ナロキソンまたはメチルナルトレキソンのいずれかによって有意に減少する。オピエートを介した毒性に対する効果は、古典的なμオピオイド受容体を介して、またはオピオイド受容体またはスプライス変異のサブタイプで仲介されてもよい。理論によって結び付けられていないのだが、この効果は、VEGFと同様、またはVEGFに関連したMAPK/ERRリン酸化によって仲介されてもよい。このデーターは、三級μ-オピオイド受容体アンタゴニスト(例えばナロキソン)、および末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニスト(例えばメチルナルトレキソン)の両方は、宿主生物に対する微生物病原体の臨床効果に焦点を当てることで、予防上および治療上有用な化合物であることを立証する。
実施例２４
低酸素誘導性のPA-レクチンアドヘシン発現
この実施例に記述される研究の目的は、腸上皮の低酸素(外科的ストレスに対する共通の反応)がPA-I発現を活性化するかどうかを決定することであった。内臓の血管収縮および腸上皮の低酸素が外科的損傷の共通の結果であるので、本明細書において記述される実験の目的は、PA-I発現の上皮細胞低酸素および再酸素化の効果を検討することにより、緑膿菌に対するシグナリングにおける腸上皮の特異的役割を決定することであった。本明細書において記述されるように、緑膿菌におけるPA-I発現のために安定したレポーター株として役立ち、PA-I遺伝子の下流の緑色蛍光タンパク質を発現するように、融合構築物が生成された。分極したCaco-2単層を、2時間の正常酸素(21%のO2)の回復期間有りまたは無しで、低酸素環境(0.1〜0.3% O2)に1時間曝露し、次にPA-Iレポーター構築物を含む緑膿菌を接種した。低酸素のCaco-2単層では、正常酸素の単層に比べて、PA-Iプロモーター活性の有意な増加が起こった(1時間で165%；P<0.001)。同様のPA-Iの活性化も、低酸素のCaco-2単層からのアピカル面の細胞の無い培地によって誘導されたが、基底部からの培地では誘導されなかった。PA-Iプロモーター活性化は、低酸素の上皮と物理的に相互作用した細菌細胞で優先的に促進された。以下で示されるように、緑膿菌の毒性回路は、低酸素および正常酸素の回復の間の腸上皮の、可溶性要素および接触に仲介される要素の両方によって活性化される。
ヒト上皮細胞。
以前に記述されたように、SGLT1発現Caco-2BBe細胞を、10%ウシ胎仔血清、15 mM HEPESおよびpH 7.4および0.25mg/mlのジェネティシンを含む、25 mMグルコース(高グルコースDMEM)のDMEMで維持した(Turner JR et al., Am J Physiol 273: C1378-1385, 1997)。Caco-2細胞を、コラーゲンをコートした0.33 cm2の0.4μm孔径のポリカーボネート膜トランスウェル支持物(コーニング-コースター、アクトン、マサチューセッツ)上で20日間培養し、細菌接種の少なくとも24時間前に、培地をジェネティシンなしの同一の培地で置換した。
野生型の緑膿菌のGFP融合構築物。
緑膿菌(ATCC-27853、米国培養保存施設(American Type Culture Collection)、マナッサス、バージニア)を、プラスミドpUCP24/PLL-EGFPで形質転換した。この構築物は、pBI-EGFPプラスミド(クロンテック、パロアルト、カリフォルニア)から切り取られた強化緑色蛍光タンパク質(EGFP)遺伝子とCOOH末端で融合した、PA-I遺伝子全体が後続する、PA-Iの上流の制御領域を含むPA27853染色体DNA断片を有する。以前に記述されたように、PA-Iレクチンの発現を、このレポーター株の蛍光顕微鏡および蛍光測定によって検出した(Wu L. et al., Ann Surg. 238, 754-764, 2003)。
動的な蛍光測定。
Caco-2細胞を、コラーゲンをコートした96ウェル蛍光測定プレート(ベクトン・ディキンソン実験用具(Becton Dickinson Labware)、ベッドフォード、マサチューセッツ)上で密集するまで増殖し、5%CO2および21%O2で37℃のインキュベーターで維持した。実験前日に培地を除去し、150μlの抗生物質なしの培地で置換した。3つの実験条件が、以前にXu et al. (J Trauma 46:280-285, 1999)によって記述された方法の変更を使用して作成された。対照条件では、Caco-2細胞を5%CO2-21%O2のインキュベーターで2時間維持した。低酸素状態は、2時間5%CO-95%N2で37℃の加湿低酸素チャンバー中に、Caco-2細胞を置くことにより達成された。チャンバー中で測定されたO2は0.1〜0.3%の間で変化した。Caco-2細胞の低酸素の2時間後に、再潅流または再酸素化の状態(正常酸素の回復)を模倣するために、低酸素の培地を新鮮で正常酸素のHDMEM培地で完全に置換し、細菌接種2時間前に正常酸素下(37℃、5%CO2-21%O2)で、細胞を回復せた。次に、蛍光性レポーター株PA27853/PLL-EGFPを、Caco-2細胞の3つの群へ加えた。細菌を振盪条件下に37℃で20μg/mlのゲンタマイシンを含むルリア-ベルターニ培養液中で一晩培養した。増殖の〜12h後に、細菌懸濁液の50μlをCaco-2細胞の96のウェルプレートへ加えた。細菌のサンプルがすべて同一の期間にわたって培養され、ウェルが等しい細胞密度を含むことを保証するように注意した。細菌接種のすぐ後に、次に3時間までその後一時間ごとに、96ウェルマイクロプレート蛍光計を使用して蛍光を追跡した(シナジーHT、バイオテック社、ウィヌースキー、バーモント)。プレートを、すべての測定の間で5%CO2-21%O2で37℃の標準インキュベーターで維持した。蛍光値を以下のように計算した：
%対照＝100×(RFUxt=n−RFUxt=0)/(RFUct=n− RFUct=0)、ここでRFUxは低酸素群または正常酸素回復群を指し、RFUcは時間nにおける対照を指す。
Caco-2細胞からの濾過培地への細菌の曝露、およびPA-Iを誘導する潜在的な候補分子。
実験のこのセットでは、対照、低酸素、および正常酸素の回復(すなわち再潅流/再酸素化)の反復条件を、密集Caco-2細胞を含む96ウェルプレートで作成した。次に、すべてのウェルからの培地を収集し、0.22μmフィルターを通して通し、氷上で保存した。次に、Caco-2細胞なしの96ウェル蛍光測定プレート(コースター3631、コーニング、コーニング、ニューヨーク)を、PA27853/PLL-EGFPの一晩増殖させた培養を含む20μl細菌懸濁液を加えることにより調製した。次に、3つの実験群からの培地をウェルへ加え、測定の間で継続的な旋回振盪(100rpm)で37℃において維持されたプレートで5時間にわたり、蛍光を評価した。低酸素のCaco-2細胞培地の培地中に存在するPA-Iを誘導する潜在的な化合物に対するスクリーニングのために、精製されたアデノシン、D-乳酸およびL-乳酸(シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ)を、生理的に適切な投与量の範囲にわたってHDMEMを含むウェルへ加え、次に上に記述されるように検査した。
蛍光顕微鏡。
低酸素Caco-2細胞に対するPA27853/PLLEGFPの空間的時間的効果へ、上記の実験からの結果を視覚的に関連づけるために、細胞をバイオプテックス(Bioptechs)ディッシュ(バイオプテックス、バトラー、ペンシルバニア)上で密集するまで増殖し、2時間低酸素へ曝露し、PA27853/PLL-EGFPによる接種が後続した。実験を37℃の顕微鏡のステージ上で実行し、倒立蛍光顕微鏡(Axiovert 100、カール・ツァイス(Carl Zeiss)、ソーンウッド、ニューヨーク)を使用して視覚化した。Z軸での画像取り込みを、3時間の間30分ごとに収集した。画像を、ImageJグラフィックス解析ソフトウェア(バージョン1.31、国立衛生研究所、ベテスダ、メリーランド )を使用して、細菌の分布について分析した。
緑膿菌または精製されたPA-Iの存在下での、低酸素および正常酸素の回復の間のCaco-2細胞バリア機能。
バリア機能の測定であるCaco-2単層経上皮電気抵抗(TER)を、寒天橋および銀-塩化銀-カロメル電極、および電圧固定法(アイオワ大学、生物工学、アイオワシティ、アイオワ)を使用して評価した。TERをオームの法則を使用して計算した。液体抵抗をすべての値から差し引いた。上に詳しく述べられたように、低酸素への曝露および正常酸素の回復後に、細胞密度に対して正規化された、2マイクロリットルのPA27853の一晩の培養、または50μgの精製PA-I(シグマアルドリッチ)を、Caco-2細胞のトランスウェルのアピカル面チャンバーに対して加えた。Caco-2細胞TERを毎時間評価し、実験を通じて細胞を5%CO2-21% O2にて37℃で維持した。低酸素保持の条件下のPA27853の効果を決定するために、Caco-2細胞のバリア機能に対するTER測定が、EVOM抵抗測定装置(ワールド精密器具 (World Precision Instruments)、サラソタ、フロリダ)を使用して低酸素のチャンバー中で7時間の間毎時行なわれるような、反復実験が継続的な低酸素(37℃、5%CO2-95%N2)下で実行された。
ノーザンブロット解析。
選択された実験では、PA-I発現をノーザンブロット解析を使用して確認した。
統計分析。
データーを分析し、統計的有意性をプリズム4.0(グラフパッド・ソフトウェア(GraphPad Software)、サンディエゴ、カリフォルニア)を使用して決定した。統計的有意性は、必要に応じて、スチューデントのt検定または二元配置分散分析によってP<0.05として定義された。
結果
PA27853/PLL-EGFP緑膿菌は、Caco-2細胞低酸素および正常酸素の回復の環境に対して、蛍光の促進で反応する。
緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター株PA27853/PLL-EGFPを、低酸素(<0.3%O2で2時間)および正常酸素の回復(2時間の正常酸素の条件の回復が後続する低酸素)に対して曝露されたCaco-2細胞に加えた場合に、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター株PA27853/PLL-EGFPが増加したPA-Iプロモーター活性を示すかどうかを決定するために、レポーター株を、2つの条件に対して曝露したCaco-2細胞の培地に対して加えた。低酸素または正常酸素の回復のいずれかに対して曝露したCaco-2細胞とのインキュベーションの1時間以内に蛍光によって測定されるように、GFPレポーター株は有意にPA-Iプロモーター活性がより増加することを実証した。すべての実験条件における培地のpHをすべての時点で測定し、培地がすべて緩衝されているので(データー不掲載)ので、対照、低酸素、および正常酸素の回復群の中で有意差は実証されなかった。しかしながら、培地のpHがPA27853/PLL-EGFPの蛍光に影響を及ぼさないことを示すために、株をpH 6.5、7.4、および7.7の培地でインキュベートした。蛍光のパーセント変化は群の中で異なっていなかった(6.5＝106±10、7.4＝100±12、7.7＝112±12；P=有意でない)。同様に、このレポーター株のPA-Iプロモーター活性に対する高炭酸または低酸素単独の効果を除外するために、株を低酸素(2時間0.1%)および高炭酸(2時間80%CO2)に対して曝露した。蛍光の差は群の間で観察されなかった(データー不掲載)。総合して、これらの研究結果は、正常酸素の回復あり、または回復なしの低酸素に対して曝露されたCaco-2細胞からの培地が、PA-Iプロモーター活性を活性化することを実証する。
Caco-2細胞環境におけるGFPレポーター株の蛍光画像。
上皮細胞接触がPA-Iレポーター株のGFPの発現に寄与するかどうか決定するために、低酸素への曝露およびPA27853/PLL-EGFPによるアピカル面の接種後のCaco-2細胞を、蛍光顕微鏡によって画像化した。蛍光画像から、低酸素のCaco-2単層に対して曝露されたPA27853/PLL-EGFPは、120分の時点で正常酸素の単層に対して曝露された細菌よりも、著しく蛍光性が強いことが実証された。細菌/Caco-2細胞共培養の複数の画像から、非低酸素の細胞よりも、低酸素に対して曝露された細胞単層の面の近くに、またはその面の中に、より多くの細菌があることが実証された。複数の顕微鏡画像の定量分析から、低酸素上皮の表面のレベルで平均658±78の細菌/高倍率視野が示されたが、面が対応した対照(P<0.001)には細菌は見られなかった。
PA27853/PLL-EGFPレポーター株は、低酸素および正常酸素の回復へ曝露されたCaco-2細胞からの培地中にあるパラクリン因子に対して反応する。
Caco-2細胞の低酸素に反応して培地へ放出された可溶性化合物が、上皮と細菌の接触に非依存的にPA-I発現を活性化することができるかを決定するために、このレポーター株の蛍光を促進する低酸素のCaco-2細胞培養からの培地の能力を調べた。低酸素および正常酸素の回復へ曝露されたCaco-2細胞からろ過された培地へ曝露されたPA27853/PLL-EGFP細菌は、5時間の時点で最も強く見える蛍光の有意な促進を示した(図40；対照:3.7%±SD 3.9;低酸素:12.6%±SD 5.8;正常酸素の回復:13.1%±SD 3.9;P<0.001、二元反復測定分散分析によって)。結果をノーザンブロット解析によって確認した。このパラクリン因子がアピカル面区画または側底部区画へ単離されたかどうかを決定するために、アピカル面および側底部培地の混合物だけでなく、低酸素単層の側底部区画およびアピカルの区画から単離された培地を、GFP-PA-Iレポーター株PA27853/PLL-EFGPを含むウェルへ加える反復実験を実行した。アピカル面のチャンバーからの低酸素の培地または低酸素の混合培地へ曝露された細菌のみが、対照を超える統計的に有意な増加を示した(>125%の変化、初期値に対して正規化された；P<0.05)。
アデノシン単独で緑膿菌におけるPA-I発現を誘導する。
低酸素のCaco-2細胞によって特異的に放出された候補化合物がPA-Iの発現を誘導するかどうか決定するために、GFP-PA-Iレポーター株におけるD-乳酸およびL-乳酸およびアデノシンの効果を調べた。D-乳酸およびL-乳酸はPA-Iプロモーター活性に効果がなかった(データー不掲載)；しかしながら、PLL/PA27853は10 mMアデノシンへの蛍光の促進をともなって反応し、低酸素のCaco-2細胞によって放出されたアデノシンが、上記の研究において観察される増加したPA-I反応の推定上の仲介物質でありうる可能性を高める。しかしながら、PA-I発現のアップレギュレーションのために必要な時間は、低酸素細胞培地に反応して観察されたものよりも長く、他の因子がシグナル経路に関与するかもしれないことが示唆される。
低酸素および正常酸素の回復へ曝露されたCaco-2細胞は、精製されたPA-Iのバリア調節を異常にする効果に抵抗する。
低酸素および正常酸素の回復の条件が、Caco-2細胞に対するPA27853のバリア調節を異常にする特性を促進または減少するかどうかを決定するために、低酸素および正常酸素の回復への曝露後に、PA27853または精製PA-Iのいずれかでアピカル面で接種したCaco-2細胞において、TERを測定した。緑膿菌における低酸素および再酸素化されたCaco-2細胞からの培地のPA-Iの発現を増加させる能力にもかかわらず、これらの条件へ曝露されたCaco-2細胞のTERは、正常酸素の細胞と比較してTER低下の減少を示す精製PA-Iで接種した緑膿菌に反応して変化しなかった。
低酸素保持へ曝露されたCaco-2細胞は、PA27853のバリア調節を異常にする効果に完全に抵抗する。
低酸素保持へ曝露されたCaco-2細胞がPA27853のバリア調節を異常にする効果に抵抗するかどうかを決定するために、低酸素保持環境において、アピカル面でPA27853を接種したCaco-2細胞のTERを測定した。Caco-2細胞は、細菌なしの低酸素Caco-2細胞と等しいTERを維持し、7時間の時点でTERの予測される減少に完全に抵抗した。増加したPA-I発現にもかかわらず、Caco-2細胞がPA27853株のバリア調節を異常にする効果に部分的に抵抗することについて、局所的な粘膜の防御タンパク質およびバリア機能の促進により、低酸素へ上皮細胞が通常は反応することを示唆する、以前の観察によって説明することができるかもしれない。
低酸素のCaco-2細胞の培地中にある可溶性因子は、正常酸素の細胞のバリア抵抗性の増加を誘導する。
正常酸素のCaco-2細胞に、低酸素細胞培地中にあるシグナルを介して、緑膿菌によるバリア調節異常に対する耐性を増加させるように誘導することができるかどうかを決定するために、低酸素Caco-2細胞のアピカル面および側底部の区画からの濾過された培地で、正常酸素Caco-2細胞のアピカル面および側底部培地を交換し、緑膿菌をアピカル面で接種した場合の、これらの細胞のバリア機能を調べた。低酸素上皮からの培地へ曝露された正常酸素Caco-2細胞は、緑膿菌によって誘導されたバリア調節異常に対する延長された耐性を示し、正常酸素上皮が、低酸素の間に産生された可溶性メディエーターの存在下でバリア機能を促進するように活性化されるかもしれないことが示唆された。
緑膿菌は、古典的意味では腸内病原菌であると考えられないが、現在まで報告された任意の細菌の中で、最も迅速かつ大きな腸上皮TERの減少のうちの1つを誘導する。我々は、Caco-2およびT-84細胞の両方において、緑膿菌(PA27853)が、アピカル面の接種後4時間以内にTERの80%の減少を誘導できることを、以前に報告している。もしこの基準のみによって定義されれば、緑膿菌は、今までに記述された中で腸上皮に対して最も病原性の高い生物ある。正常な集団の5%ほどがこの病原菌を腸管中内部に持つという観察は、盲腸中への大量の緑膿菌の直接導入後に対照マウスが感染の症状を発症しないことを実証する我々の動物研究と結び付けて、この生物が、選択された環境からの合図に反応して毒性遺伝子のオンとオフを切り替えて古典的日和見菌のように作用することを示唆する。pH、レドックス状態および栄養成分のような環境からの合図が、様々な膜結合バイオセンサーのキナーゼを介して細菌の毒性遺伝子発現を活性化することは十分に立証されるが、生理的ストレスまたは虚血性ストレス後の宿主細胞によって細菌のシグナリング化合物が放出されることを示唆する以前の報告はない。しかしながら、微生物の進化学的適応度の観点から、宿主感受性を認識するシステムを有することが、宿主侵入の費用対利益のより正確な査定を可能にするので、病原菌が宿主細胞ストレスの生化学を認識するかもしれないことは論理的である。さらに、腸内病原菌が、それらが付着する細胞と直接情報をやりとりできることは十分に立証されているが、そのような分子的な対話が双方向であることはあまり記述されていない。
細菌が宿主細胞に対して直接感知および反応することを実証するために、レポーター遺伝子として緑膿菌のPA-Iレクチン/アドヘシンを使用した。PA-Iレクチンは、緑膿菌の毒性遺伝子調節の2つの重要なシステムの厳しい調節制御下にある：菌体数感知シグナリング系および代替のσ因子のRpoS。菌体数感知シグナリング系およびRpoSは、この病原菌の何百もの毒性遺伝子の発現を制御する、緑膿菌の毒性遺伝子調節の相互に連結した系である。PA-I発現が菌体数感知およびRpoSの両方の機能に依存するので、PA-I発現は緑膿菌の一般化された毒性遺伝子活性化に関連する生物学的な表示器として役立つ。腸上皮細胞の可溶分および特にアデノシンがPA-I発現を活性化することができるという結果は、弱っている感受性のある宿主に対して、緑膿菌のようなコロニー形成病原菌を伝える特異的な宿主細胞由来の化合物が放出されてもよいことを示唆する。アデノシンが放出され、低酸素組織の細胞外環境において高濃度で蓄積することができるとすれば、アデノシンが単独でPA-I発現を活性化することができることは重要な発見である。腸の活動性炎症の間に、移動多形核白血球に由来した5'-AMPは、腸のアピカル面の表層上皮によってアデノシンに変換される。Strohmeier et al. (14)は、正常条件の下では、ヒト腸上皮細胞株T-84は、30分以内にアピカル面の培地中に5 mMアデノシンと同じくらいまで蓄積する実質的な量の5'-AMPを、変換することができることを実証した。本研究では、緑膿菌のPA-Iプロモーター活性の活性化は、アデノシンの非生理的用量のように見えるものを必要としたが、延長低酸素および再酸素化の間に腸管中で、緑膿菌が曝露されるかもしれないアデノシンの正確な濃度は未知である。さらに、PA-Iプロモーター活性が観察される6時間前にアデノシン曝露を必要としたが、低酸素の培地ではPA-Iプロモーター活性は4時間で観察された。推測の問題として、緑膿菌のような日和見菌は、腸上皮に対して毒性攻撃を仕かけるのに必要な資源およびエネルギーを与えるような、極端に強力で長引く宿主由来のシグナルを必要としてもよい。そのような状況下では、緑膿菌の生存を左右する宿主が炎症および脆弱性の極度まで追い詰められ、従って生存に対する不利益を表わすことを、緑膿菌は「感知する」かもしれない。
PA-I発現がCaco-2細胞の低酸素および正常酸素の回復に反応して増加されたとすれば、緑膿菌がこれらの条件に対して曝露されたCaco-2細胞へアピカル面で接種された場合、TERのより大きな減少が期待された。緑膿菌のPA-I発現の促進が低酸素の間にCaco-2細胞のTERを減少させなかったことについては、Caco-2細胞バリア機能に対する低酸素自体の促進効果によって説明することができるかもしれない。この可能性は、正常酸素のCaco-2細胞へ運ばれた低酸素の培地が、緑膿菌に対する耐性を促進したという発見によって支持される。この考えは、低酸素のCaco-2細胞が精製PA-Iのバリア調節を異常にする特性に抵抗するという発見によってさらに支持され、さらに低酸素が、緑膿菌PA-Iタンパク質のバリア調節を異常にする効果に対して上皮バリア機能を促進したことを示唆する。これらの研究結果は、さらに腸上皮バリア機能に対する低酸素の既知の促進効果に一致する。Furutaおよび同僚は、低酸素へのCaco-2細胞の曝露がムチンおよびトレフォイルペプチドの両方の発現を増加させることを実証し、低酸素の間にCaco-2細胞でTERが維持または増加さえしていることも観察した。そのような状況下では、腸の上皮表面が潜在的に対立的な細菌叢に対して攻撃されやすくなるとすれば、この反応は生理的な意味をなす。しかしながら、ここで正常酸素の回復と称した、再潅流の間に、Caco-2細胞は緑膿菌の強力なバリア調節を異常にする効果に対して結局屈する。腸透過性および全身的炎症誘発性活性化の最も大きな変化が、腸への虚血性障害後の再潅流相の間に起こる点では、これは臨床研究および動物研究の両方と一致している。
要約すると、本明細書において、緑膿菌が宿主細胞ストレスの局所的要素を感知および反応きることを実証する。宿主由来の細菌のシグナリング化合物は、低酸素および正常酸素の回復に反応して腸上皮細胞によって放出されるように見え、多くの場合重病およびその治療の時に存在する。緑膿菌のような院内病原菌のコロニー形成により感知される、正確なホスト化合物またはシグナルのさらなる解明は、感染が最も重症な患者の経過をどのようにして悪化させ続けるかについてのよりよい理解へ結びつくかもしれない。
実施例２５
この研究は、ストレスを受けた宿主の腸管が、緑膿菌の毒性がインビボで促進される独自の環境かどうかを決定するように設計された。さらにこの問題を調べるために、本発明者は、本明細書において記述されるような、PA-I遺伝子および菌体数感知およびRpoSプロモーターの下流にGFPを挿入した緑膿菌のレポーター株を作成した。緑膿菌の毒性の活性化において、外科的ストレスおよび腸の低酸素がどのように役割を果たすかをさらに理解するために、本発明者はHIF-1-αがこの反応に中心的な役割を果たすかどうかを調べた。腸上皮細胞のHIF-1-αの蓄積を低酸素がもたらすことは周知である。腸上皮のホメオスタシスにおけるHIF-1- α活性化の漸増的に重要な役割を考えて、研究者は、HIF-1-α活性化が、PA-Iレクチン/アドヘシンの発現によって判断されるような緑膿菌毒性を活性化する可溶性化合物の放出を仲介するかどうかを決定しようとした。
これを遂行するために、HIF-1-aで安定的トランスフェクションされた樹立Caco 2細胞株、およびその親細胞株を使用した。簡潔には、両方の細胞株を密集まで増殖させた。培地を回収し、任意の潜在的な細胞成分を除去するために0.22uフィルターを通してろ過した。次に、培地を、上に記述されたGFP/PA-Iレポーター株の固定細菌細胞集団を含むマイクロタイターウェルへ加えた。蛍光を動的に経時的に追跡し、次式に従って計算した:
Figure 2008542395
結果は、対照と比較して、HIF-1α培地へ曝露されたGFP/PA-Iレポーター株で観察されたPA-I発現の時間依存性誘導があることを実証した(対照に比較して、接種後7時間および8時間で、PA-I発現でそれぞれ>400%および>600%変化)。この発見は、反復実験でウエスタンブロット解析によって確認された。
PA-Iを活性化する潜在的な化合物を同定するために、Caco-2細胞の3つの群、すなわち対照細胞、低酸素へ曝露されたCaco2細胞、およびHIF-1αの強制的な発現を有するCaco2細胞からの培地を調べた。培地画分は4つの分子量画分へ分離され、PA-I/GFPレポーター株を含むマイクロタイタープレートへ加え、動的蛍光測定によって評価した。
これらの実験からの結果は、<3kDaの分子量の培地画分は、PA-I発現を有意に誘導する(HIF-1-αおよび低酸素の培地でインキュベーション後7時間において、それぞれ>800%および>700%増加)ことを実証した。さらなる研究は、HIFおよび低酸素状態が同様の効果があることを示すために実行された。潜在的な誘導する化合物の分子量のために、本発明者は、HIF-1-α活性化に反応して発現する既知の遺伝子を調べた。この分子量範囲内で、ヌクレオチド代謝に関連した潜在的な候補化合物を同定した。特に、アデノシンが腸上皮低酸素およびHIF-1-α活性化後に高濃度で放出されることが示されたので、アデノシンに興味を持った。アデノシンは、5'-ヌクレオシダーゼ(CD73)活性のアップレギュレーションを含むメカニズムを介して、低酸素および/またはHIF-1a活性化に曝露された腸上皮細胞の培地に蓄積する。
したがって、培地画分を、対照Caco-2細胞、低酸素細胞(2時間0.1〜0.3%O2)、およびHIF-1-α過剰発現細胞からの3kDa セントリコン濾過培地の比較によって、アデノシンについてHPLC/MS/MSで調べた。アデノシンは、HIF-1-a活性化細胞培地および低酸素細胞培地で非常に上昇した(>8000%の増加)。
上記レポーター株でPA-I発現に対するアデノシンの効果の場合は、アデノシン存在下でのPA-I発現の増加が、用量依存的および時間依存的の両方で見られた(図8A)。結果はウエスタンブロット(図8A中の挿入図)で確認された。完全性のために、ATP、ADPおよびAMPの効果を同様の濃度で調べ、明白な誘導効果は示されなかった。
アデノシンが、PA-Iの発現を誘導するHIF-1-α活性化Caco-2細胞の培地中の推定上の成分であるかどうか決定するために、アデノシンデアミナーゼを培地のアデノシンを枯渇させるために加えた。意外にも、これらの実験はPA-I発現のさらに大きな増加をもたらし、アデノシンの代謝物質(すなわちイノシン)がPA-I発現に役割を果たす可能性が高まった(図8)。アデノシンデアミナーゼは、DNA塩基配列に基づき緑膿菌中に存在すると予測される。関連した研究では、イノシンは、アデノシンよりも10倍少ない濃度でPA-I発現を誘導した(図8C)。
イノシンおよびアデノシンの間でPA-I発現の変化を経時的に直接比較する反復実験は、イノシンの効果がより大きいだけでなく、初期の時点で起こることを実証する。さらなる研究は、アデノシンと比較して、より初期の時点、およびより低細胞密度(OD)でイノシンがPA-I発現を誘導することを示した。
結論として、本実施例は、Caco-2細胞の低酸素またはHIF-1-αの強制発現は、緑膿菌の毒性回路を活性化する可溶性化合物の細胞外放出をもたらすことを実証する。さらに、本明細書において示されたデーターは、アデノシンおよびイノシンがこの反応に重要な役割を果たすかもしれないことを示す。
実施例２６
この実施例は、MNTXの形式のμオピオイド受容体アンタゴニストは、μオピオイド受容体(mOP-R)依存的メカニズム、および非依存的メカニズムによって、オピエート誘導性、トロンビン誘導性およびLPS誘導性の内皮細胞バリア破壊を阻害することを確立するデーターを提供する。MNTX誘導性の内皮細胞バリア調節のmOP-R非依存的メカニズムは、受容体様タンパク質のチロシンホスファターゼμ(RPTPμ)の活性化、およびトロンビンおよびLPS誘導性のSrc依存的S1P3受容体トランス活性化(チロシンリン酸化)の阻害を含む。結果は、MNTXが、内皮細胞バリア保護剤のような細胞バリア保護剤として有用であることを示す。この実施例において開示されたデーターは、肺微小血管内皮細胞に関連するが、これらの細胞の行動はオピオイド受容体アゴニストおよびアンタゴニストへの任意の内皮(または上皮)細胞の行動を例示する。データーは、以下の材料および方法を使用して生成された。
材料および方法
細胞培養および試薬-ヒト肺微小血管内皮細胞を、キャンブレックス(Cambrex)(ウォーカーズビル、メリーランド)から入手し、実験のために継代6〜10を使用して、5%CO2、95%空気の加湿環境において37℃でEBM-2完全培地(キャンブレックス)中で以前に記述したように(2)培養した。特別の定めのない限り、試薬はシグマ(セントルイス、ミズーリ)から入手した。硫酸モルヒネはバクスター(Baxter)(ディアフィールド、イリノイ)から購入した。SDS-PAGE電気泳動のための試薬はバイオラッド(Bio-Rad)(リッチモンド、カリフォルニア)から、イモビロン-P転写膜はミリポア(ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ)から、および金微小電極はアプライド・バイオフィジックス(Applied Biophysics)(トロイ、ニューヨーク)から購入した。ウサギ抗μオピオイド受容体抗体はアブカム(Abcam)(ケンブリッジ、マサチューセッツ)から購入した。ウサギ抗S1P1受容体抗体はアフィニティ・バイオリエージェンツ(Affinity Bioreagents)(ゴールデン、コロラド)から購入した。マウス抗S1P3レセプター抗体はエクスアルファ・バイオロジカルズ(Exalpha Biologicals)(ウォータータウン、マサチューセッツ)から購入した。マウス抗RPTPμ抗体はセル・シグナリング・テクノロジーズ(Cell Signaling Technologies)(ダンヴァーズ、マサチューセッツ)から購入した。マウス抗リン酸化チロシン抗体、マウス抗pp60src抗体および組換活性型Srcは、アップステート・バイオテクノロジーズ(Upstate Biotechnologies)(レイクプラシッド、ニューヨーク)から購入した。PP2はカルビオケム(Calbiochem)(サンディエゴ、カリフォルニア)から購入した。マウス抗β-アクチン抗体、ウサギ抗リン酸化チロシン(418)Src抗体、ナロキソン、DAMGO、トロンビン、LPSおよびイオノマイシンは、シグマ(セントルイス、ミズーリ)から購入した。ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体は、アマシャム・バイオサイエンス(Amersham Biosciences )(ピスカタウェイ、ニュージャージー)から購入した。
免疫沈降およびイムノブロット - 処理または未処理のHPMVECからの細胞物質を、IP緩衝液(50 mM HEPES(pH 7.5)、150 mM NaCl、20 mM MgCl2、1%ノニデットP-40(NP-40)、0.4 mM Na3VO4、40 mM NaF、50μMオカダ酸、0.2 mMフッ化フェニルメチルスルホニル、カルビオケムプロテアーゼ阻害剤混合物3の1:250希釈)でインキュベートした。次に、サンプルを抗S1P3受容体IgGで免疫沈降し、4〜15%のポリアクリルアミドゲルにおけるSDS-PAGEが後続し、イモビロン(商標)膜上に転写し、特異的一次抗体および二次抗体で現像した。免疫反応性バンドの視覚化は、増強化学発光(アマシャム・バイオサイエンス)を使用して達成した。
μオピオイド受容体、S1P1、S1P3、RPTPμに対するsiRNAの構築およびトランスフェクション- ヒトmOP-R、S1P1、S1P3、RPTPμを標的とするsiRNA配列を、Gen-Bank(商標)(それぞれ、gi:56549104、gi:87196352、gi:38788192、およびgi:18860903)からのmRNA配列を使用して生成した。各々のmRNA(またはスクランブル)について、2つの標的が同定された。具体的には、mOP-R標的配列1(5'-AACGCCAGCAATTGCACTGAT-3'; 配列番号14)、
mOP-R標的配列2(5'-AATGTCAGATGCTCAGCTCGG-3'; 配列番号15)、
S1P1標的配列1(5'-AAGCTACACAAAAAGCCTGGA-3'; 配列番号16)、
S1P1標的配列2(5'-AAAAAGCCTGGATCACTCATC-3'; 配列番号17)、
S1P3標的配列1(5'-AACAGGGACTCAGGGACCAGA-3'; 配列番号18)、
S1P3標的配列2(5'-AAATGAATGTTCCTGGGGCGC-3'; 配列番号19)、
RPTPμ標的配列1(5'-AATCTGAAGGTGATGACTTCA-3'; 配列番号20)、
RPTPμ標的配列2(5'-AACACCTTGACTAAACCGACT-3'; 配列番号21)、
スクランブル配列1(5'-AAGAGAAATCGAAACCGAAAA-3'; 配列番号22)
および、スクランブル配列2(5'-AAGAACCCAATTAAGCGCAAG-3'; 配列番号23)を利用した。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドはジョンズホプキンズ大学DNA分析施設で提供、またはインテグレイティッドDNAテクノロジー(Integrated DNA Technologies)(コラルビル、アイオワ)から購入した。siRNAの構築のために、アンビオン(Ambion)からの転写に基づくキットを使用した(サイレンサー(Silencer)(商標)siRNA構築キット)。次に、アンビオンによって提供される手順に従って、トランスフェクション試薬としてsiPORTamine(商標)(アンビオン、テキサス)を使用して、ヒト肺内皮細胞にsiRNAをトランスフェクションした。細胞(約40%の密集度)に1時間の血清飢餓を行ない、無血清培地中で6時間、3μM(各々1.5μMのsiRNA)の標的siRNA(またはスクランブルsiRNAまたはsiRNA無し)とのインキュベーションが後続した。次に、生化学的実験および/または機能分析を行なう前に、血清含有培地を42時間加えた(最終血清濃度1%)。
S1P3受容体のチロシンリン酸化の測定 - IP緩衝液中で可溶化したタンパク質を、マウス抗S1P3受容体抗体で免疫沈降し、4〜15%のポリアクリルアミドゲルのSDS-PAGEが後続し、イモビロン(商標)膜(ミリポア、ベッドフォード、マサチューセッツ)上に転写する。5%ウシ血清アルブミンで非特異的部位をブロッキングした後に、ブロットを、マウス抗S1P3抗体またはマウス抗リン酸化チロシン抗体のいずれかでインキュベーションし、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウスIgGでのインキュベーションが後続した。免疫反応性バンドの視覚化は、増強化学発光(アマシャム・バイオサイエンス)を使用して達成した。
チロシンホスファターゼ活性分析 - 処理または未処理のHPAEC溶解物および/または免疫沈降したRPTPμを、蛍光測定器のRediplate(商標)96 EnzChekチロシンホスファターゼ分析キット(インビトロゲン(モレキュラープローブ(Molecular Probes))、ユージーン、オレゴン)を使用して、チロシンホスファターゼ活性について分析した。簡潔には、細胞物質を30℃で反応緩衝液においてインキュベートし、次に、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルフォスフェート(DiFMUP)でコートした96のウェルプレートに加えた。チロシンホスファターゼ活性は、358/452nmの励起/発光極大でDiFMUへDiFMUPを切断する。
インビトロのS1P3受容体リン酸化/脱りん酸化-S1P3受容体リン酸化/脱りん酸化反応は、40 mMトリス-HCl(pH 7.5)、2 mM EDTA、1 mMジチオトレイトール、7 mM MgCl2、0.1%CHAPS、100μM ATP、精製酵素(すなわち、100 ngの組換活性型Srcおよび/またはMNTX処理(1時間)内皮細胞から得た免疫沈降RPTPμ)および1時間の血清飢餓を行なったヒト肺内皮細胞から得た免疫沈降したS1P3受容体を含む、50μlの反応混合物中で行なった。30℃で30分間のインキュベーション後に、反応混合物をSDSサンプル緩衝液中で煮沸し、SDS-PAGEを行なった。イムノブロットをマウス抗リン酸化チロシン、マウス抗pp60src、マウス抗RPTPμまたはマウス抗S1P3抗体を使用して実行し、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIgGによるインキュベーションが後続した。免疫反応性バンドの視覚化は、増強化学発光(アマシャム・バイオサイエンス)を使用して達成した。
内皮細胞電気抵抗の測定-
Garcia et al., Am. J. Physiol. 273:LI 72-L184 (1997); J. Appl. Physiol. 89:2333-2343 (2000); J. Clin. Invest. 108:689-701 (2000)に以前に記述されたように、電気的細胞-基質インピーダンス検出器(アプライド・バイオフィジックス社、トロイ、ニューヨーク)により、高感度生物物理学的分析を使用して、細胞バリア特性を測定した。蒸着させた小さな金微小電極(10-4 cm2)を含むポリカーボネートウェル中で、細胞を密集するまで培養し、培養培地を電解質として使用した。電気抵抗の合計を、単層を横切って動的に測定し、細胞の底部表面および電極間の合成抵抗によって決定し、これは接着斑および細胞の間の抵抗性を反映する。細胞が付着し微小電極上で広がるにつれて、TERは増加した(密集で最大)が、細胞の収縮、球状化または接着消失はTERの減少に反映された。小さな金電極およびより大きな対向電極(1 cm2)を、位相敏感イオンイン増幅器へ内蔵の前置差動増幅器(アプライド・バイオフィジックス)で接続した。I-V、4000Hzの交流電流信号を、定電流源に近づけるためにMQ抵抗器を介して供給した。電圧および位相のデーターを保存し、従来の技術を使用して、コンピューターで加工した。実験は、定常抵抗が>1000Q(1つのウェル当たり10微小電極)達成された細胞でのみ行なわれた。以前に記述されたように、抵抗は同相電圧(抵抗に比例する)によって表現され、それは初期電圧に対して正規化され、正規化された抵抗値の割合として表現された(Garcia et al., (1997))。これらの測定は、傍細胞透過性の変化を反映する細胞形および接着斑の状態を示す感受性の生物物理的な分析を提供した。各々の微小電極からのTER値を個別の時点でプールし、平均±標準誤差として時間に対してプロットした。
動物の調製および処理-オスC57BL/6Jマウス(8〜10週、ジャクソンラボラトリーズ(Jackson Laboratories)、バーハーバー、メイン)は、首切開による右内頚静脈の露出前に、腹腔内のケタミン(150mg/kg)およびアセチルプロマジン(15mg/kg)で麻酔をかけた。LPS(2.5mg/kg)または水(対照)を、内頚静脈を介して静脈内に注入した。4時間後に、マウスの内頚静脈を通してメチルナルトレキソン(MNTX、10mg/kg)または水の管理を行なった。気管支肺胞洗浄タンパク質分析および/または肺の免疫組織化学を行なう前に、LPS後、24時間動物を回復させた。
マウス肺の免疫組織化学-マウス肺の血管内皮細胞のタンパク質の発現を特徴づけるために、対照(未処理)マウスからの肺をホルマリン固定し、5ミクロンのパラフィン切片を作製し、水和し、エピトープ検索を実行した(ダコサイトメーション(DakoCytomation )標的検索溶液、pH＝6.0、ダコサイトメーション、カーピンテリア、カリフォルニア)。次に切片を、抗μオピオイド受容体、抗RPTPμまたは抗S1P3受容体抗体のいずれか、およびDAB染色による二次HRP標識ポリマー(ダコ EnVision(商標)＋システム、HRP(DAB)(ダコサイトメーション、カーピンテリア、カリフォルニア))、後続するヘマトキシリンQSの対比染色(ベクター・ラボラトリーズ(Vector Laboratories)、バーリンゲーム、カリフォルニア)によって組織学的に評価した。免疫組織化学法のための陰性対照は、上記と同じ方法によるが、一次抗体なしで行われた。免疫染色された切片を、ライカ(Leica )Axioscope(バノックバーン、イリノイ)を使用して撮影した(100×)。
気管支肺胞洗浄タンパク質の測定 - 気管支肺胞洗浄(BAL)を、1ccのハンクス液の気管内注入、および温和な吸引の後続によって実行した。回収された液体を、タンパク濃度(BCAタンパク質測定キット; ピアス・ケミカル社(Pierce Chemical Co.)、ロックフォード、イリノイ)のために処理した。
統計分析 - スチューデントのt検定を2つまたは複数の異なる実験群からのデーターの手段を比較するために使用した。結果は平均±標準誤差として表現される。
結果
アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア破壊におけるメチルナルトレキソン(MNTX)の役割。内皮細胞バリア破壊は、アテローム性動脈硬化および急性肺損傷を含む様々な病理における原因因子である。荷電した末梢μオピオイド受容体(mOP-R)アンタゴニストであるメチルナルトレキソン(MNTX)の効果を、肺の微小血管内皮細胞構造の全体性に対して、経内皮抵抗(TER)を使用して調べた。図9-A、Bは、mOP-Rのためのリガンド(すなわち硫酸モルヒネ(MS)およびDAMGO)は、用量依存的な様式で内皮の細胞バリア破壊を誘導したことを示す。これらのバリア破壊効果は、MNTX(0.1μM)の生理的に適切な用量による前処理によって阻害された。MNTXの用量の0.1μM以下への減少により、バリア保護効果は減少したが、0.1μMを越えてMNTXの用量を増加させても作用は有意に変化しなかった(図9-C)。
次に、mOP-R非依存性アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア調節に対するMNTXの効果を調べた。トロンビンは、内皮細胞バリア機能において迅速な一時的減少を誘導した(図10-A)。リポ多糖類(LPS)は遅れた(約4時間)内皮細胞バリア破壊反応を誘導した(図10-B)。Ca2+イオノフォアのイオノマイシン(図10-D)による破壊ではなく、トロンビン(図10-A)およびLPS(図48-B)による内皮細胞バリア破壊を、MNTX(0.1μM)は減少させた。これらの結果は、MNTXを介した内皮細胞バリア保護における選択性を示した。MNTXがスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の保持された内皮細胞バリア増強効果を増加させたので、MNTXの保護効果はバリアを崩壊させる薬剤に限定されなかった(図10-C)。
メチルナルトレキソンは血液脳関門(BBB)を通過することができない荷電分子である。この特性は、MNTXが選択的に末梢のmOP-R活性を阻害することを可能にする。もう一つのmOP-Rアンタゴニストのナロキソン(それは非荷電で、末梢およびCNSのmOP-R阻害を促進する)の、アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア調節に対する効果を調べた。MNTXおよびナロキソン(0.1μM)の両方は、MSおよびDAMGO誘導性の内皮細胞バリア破壊を阻止した。しかしながら、ナロキソンは、トロンビンおよびLPSの攻撃に対してMNTXと同じ内皮細胞バリア防護効果を示さなかった(図11)。
アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア機能障害におけるS1P3受容体トランス活性化の役割。オピエートおよびS1P誘導性の内皮細胞バリア調節に対するMNTXの作用を考慮して、MNTXに制御された内皮細胞構造の全体性に対する、mOP-RまたはS1P受容体サブタイプをサイレンシングさせる(siRNA)効果が調べられた(図12および18)。mOP-R発現をサイレンシングさせることは、トロンビン誘導性およびLPS誘導性の内皮細胞バリア破壊からのMNTX保護に対する効果がほとんどなく、MNTXの潜在的なmOP-R非依存的効果が示される。内皮細胞は、S1P1受容体が活性化するRac1を介したシグナリングをともなって、S1P1受容体およびS1P3受容体の両方を発現するが、S1P3受容体はRhoAを介したシグナリングを活性化する。S1P1受容体のサイレンシングが、完全にS1P(1μM)のバリア保護効果を除去することが以前に示されていた。より高濃度(10〜30μM)で、S1P誘導性のバリア破壊は恐らくS1P3受容体活性化のためである。S1P1受容体とは対照的に、S1P3受容体のサイレンシングは、トロンビン誘導性およびLPS誘導性内皮細胞バリア破壊からのMNTX保護を阻害した(図12-B、C; 図18)。
S1P1受容体トランス活性化は、アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア促進において重要であることが知られている。図12の結果を考慮して、S1P3受容体トランス活性化が内皮細胞バリア破壊における重要な調節メカニズムになるであろうことが期待された。図13は、バリア破壊薬剤(しかしバリア促進薬剤ではなく) (すなわちS1Pを1μMで)が、Src活性化およびSrcファミリーキナーゼ仲介S1P3受容体のトランス活性化(チロシンリン酸化)を促進したことを示すデーターを提供する。さらに、PP2によるSrcファミリーキナーゼの阻害はアゴニスト誘導性のバリア破壊を阻止したが、S1Pを介した内皮細胞バリア促進に作用しなかった。最終的に、MNTXによる前処理はアゴニスト誘導性のS1P3受容体トランス活性化を完全に阻害した。対照的に、ナロキソン前処理は、S1P3受容体のトランス活性化に対するモルヒネおよびDAMGOの効果を阻害したが、トロンビンまたはLPSの効果は阻害しなかった。
アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア破壊からの、MNTXを介した保護における受容体蛋白質チロシンホスファターゼμ(RPTPμ)の役割。図13の結果は、MNTXがアゴニスト誘導性のS1P3受容体トランス活性化(チロシンリン酸化)を阻害することを示した。S1P3受容体チロシンリン酸化を減少させる1つのメカニズムは、チロシンホスファターゼ活性の調節を介するものである。結果は、MNTX(しかしナロキソン、モルヒネ、DAMGOまたはS1Pではない)が、内皮細胞チロシンホスファターゼ活性の合計を増加させることを示した(図14)。
ヒト肺内皮の細胞間接触の制御に関係する重要なチロシンホスファターゼは、受容体チロシンホスファターゼμ(RPTPμ)である。ヒト肺の微小血管内皮細胞(HPMVEC)のMNTX処理はRPTPμチロシンホスファターゼ活性(図15-A)を促進したが、ナロキソン処理は促進しなかった。さらに、RPTPμのサイレンシングはトロンビン誘導性のS1P3受容体チロシンリン酸化を延長した(図15-B)。分離したS1P3受容体のインビトロの分析により、MNTXに刺激されたRPTPμはS1P3受容体のSrcチロシンリン酸化を阻害することが示された(図15C)。さらに、RPTPμ(しかしmOP-RまたはS1P3受容体ではない)タンパク質発現のサイレンシングは、内皮細胞チロシンホスファターゼ活性の合計のMNTXを介した増加を有意に減少させた(図16-A)。最終的に、RPTPμのサイレンシングは、内皮細胞バリア破壊のMNTXの保護効果を阻害し、内皮細胞バリア破壊に対するトロンビン誘導性およびLPS誘導性の効果を促進した(図16-B、C)。
LPS誘導性の肺の血管透過性増大におけるMNTXのインビボにおける役割。ヒト肺の微小血管内皮細胞からの結果と同様に、マウス肺血管の内皮細胞がmOP-R、RPTPμおよびS1P3受容体を発現することが、免疫組織化学から明らかになった(図17-A)。次に、インビボにおけるLPS誘導性の内皮細胞バリア機能障害に対するMNTXの効果を検討した。マウス肺のLPS誘導性の内皮細胞を介した血管漏洩性の静脈注射を、気管支肺胞洗浄(BAL)液体中のタンパク濃度によって測定した(図17-B)。MNTX(10mg/kg)単独では、肺血管透過性に作用しなかった。しかしながら、LPS送達の4時間後のMNTXの静脈注射はマウス肺の過剰浸透性を減少させた(図17-B)。
この実施例において、メチルナルトレキソン(MNTX)(選択的末梢μオピオイド受容体(mOP-R)アンタゴニスト)は、アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア破壊からの、mOP-R依存的およびmOP-R非依存的メカニズムを介する保護を提供することを示すデーターが示される。結果から、S1P3受容体トランス活性化が、アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア破壊の重要な調節因子であることが示される。MNTXは、mOP-R非依存性の受容体チロシンリン酸μ(RPTPμ)活性を刺激し、アゴニスト誘導性のS1P3受容体トランス活性化(Srcを介したチロシンリン酸化)の阻害において重要である。MNTXは、アテローム性動脈硬化および急性肺損傷のような内皮細胞バリア機能障害と関連した疾患のような、細胞バリア破壊を含む疾患の治療に対する臨床的有用性を示した。
μオピオイド受容体アンタゴニスト(ナロキソン)は高脂溶性で、血液脳関門を容易に通過する。用量を制御する多数の試みにもかかわらず、mOP-Rアンタゴニストは、無痛覚反転および突出痛のために疼痛管理用のオピエートを受ける患者に適さないと証明された。MNTXは純粋な麻薬アンタゴニストのナルトレキソンの四級誘導体である。環中のアミンでのナルトレキソンへのメチル基の追加は、より大きな極性およびより低い脂質溶解度を有する化合物N-メチルナルトレキソンを形成する。MNTXは血液脳関門を通過せず、したがって特に無痛覚に対してオピエートの高用量をとる患者のために、緩和ケアにおけるオピエートの末梢効果を反転させるという点で治療上の役割を果たすことができた。ICU(例えば熱傷を有する患者)において、または高度医療疾患で、MNTXが周術期に臨床的な役割を持つと期待される。この集団が細胞バリア機能中の欠損、特に肺の機能障害に対するリスクが最もあるので、本明細書において開示されたこれらの研究は、三級オピエートアンタゴニストではなく、むしろMNTXについて注目した。
オピエートおよびMNTXについての従来の研究では、薬剤の血漿中濃度は、インビトロの研究で開示された効果の範囲中で適切であるように見えた。正常な治療用量では、静脈内または筋肉内のモルヒネのピーク血漿濃度は80ng/mlである。1つの総合的な総説では、癌患者の無痛覚は、6〜364ng/mlにわたる定常状態の血漿中モルヒネ濃度に関係した。用量を調整したモルヒネのピーク血漿中濃度のメタ分析は、単一投薬および複数投薬および集団の間で若干の差があったが、モルヒネ1mg当たり1〜10 nM/LのCmaxを示した。全体をまとめて、非経口投与または経口投与後の患者のモルヒネおよびMNTXの血漿中濃度は、インビトロモデルにおける内皮細胞バリア機能を制御したレベルと一致すいる。同様に、インビトロ研究におけるMNTXの濃度は薬剤の臨床試験で達成されたものと同様だった。0.1 mg/kgMNTXの平均用量を静脈内に受けたメタドン維持療法患者では、MNTXの平均の血漿中濃度は162 ng/mlだった。ボランティアのMNTXの反復静脈注射投与後に、血漿中のMNTXのレベルは、内皮細胞バリア機能に対する効果が観察された範囲以上で十分に維持された。
ナロキソンではなく、MNTXは、トロンビン誘導性内皮細胞バリア破壊およびLPS誘導性内皮細胞バリア破壊の両方からの保護を提供した。トロンビンは、PAR(プロテアーゼ活性化受容体)の活性化を介して迅速で一時的な内皮細胞バリア破壊を誘導し、結果として生ずるCa2+、RhoAおよびRas/MAPキナーゼシグナリングをともなった。対照的に、LPSは、TLR4、CD14およびMD2の受容体複合体の活性化によって、遅れた内皮細胞バリア破壊反応を誘導し、結果として生ずるNF-κB活性化およびサイトカイン産生をともなった。これらのアゴニストの対照をなすメカニズムを考慮して、MNTXが広範囲の破壊薬剤からの細胞バリア保護(内皮細胞バリア保護を含む)を提供すると期待される。
S1P1受容体トランス活性化(AKTを介したトレオニンリン酸化)は、アゴニスト誘導性の内皮細胞バリア促進における重要な構成要素であることが知られている。この実施例では、これらの研究結果は、S1P3受容体のトランス活性化(Srcを介したチロシンリン酸化)がアゴニスト誘導性の内皮細胞バリア破壊において重要な役割を果たしたことを示すために拡張された。S1P3受容体シグナリングは、アクチン細胞骨格再構築に関与する低分子量Gタンパク質(RhoA)を活性化した。
これらの結果に一致して、研究者は、Srcの阻害が内皮細胞バリア破壊から保護したと報告した。Srcは内皮細胞収縮および血管透過性を制御する。Srcの阻害は、VEGF受容体2/カドヘリン複合体を安定化し、心筋梗塞の後の浮腫を減少させた。
RPTPμは、内皮細胞バリア全体性を制御するという点で重要な役割を果たすとして本明細書において確立された。RPTPμは、肺血管系で高く発現し、内皮細胞間結合に局在する。本明細書において開示された結果と一致して、研究者は、HPMVECのRPTPμ発現のサイレンシングがバリア機能を阻害したことを示した。RPTPμは、VE-カドヘリン、N-カドヘリン、c-MetおよびVEGF受容体を含む様々な細胞表面レセプターと結合することができる。これらの研究結果は、RPTPμに制御されたS1P3受容体のトランス活性化を示すために拡張された。RPTPμは、IQGAP1、cdc42、RACK1、α-カテニン、β-カテニンおよびPKCδを含むシグナリング分子とさらに相互作用した。
肺の血管透過性のインビボのモデルは、MNTX単独では、底部の血管構造の全体性に作用しないことを実証した。しかしながら、MNTXはLPS誘導性の血管バリア破壊を減少した。これらの結果は、インビトロでのLPS誘導性のHPMVECバリア破壊に対するMNTXの防護効果に一致している。したがって、MTNXは、内皮細胞バリア機能障害のような、細胞バリア破壊または機能障害を伴う疾患に対して、有用な治療上の処理(予防的および改良的な治療を含む)であると期待される。
このように、本発明の各々のいくつかの局面の少なくとも1つの実施形態を記述すれば、様々な変化、変更および改良が当業者に容易に思い浮かぶであろうことは認識されることになっている。そのような変化、変更および改良は、この開示の一部であるように意図され、本発明の精神および範囲の中にあるように意図される。したがって、前述の説明および図面は例のみのためである。
IFN-γが、緑膿菌におけるPA-Iレクチンの発現を誘導することを示すグラフ、棒グラフおよび免疫ブロットのパネルである。 rhlIおよびrhlR(緑膿菌における中核菌体数感知シグナリング要素)の存在が、IFN-γに反応したPA-I発現およびピオシアニン産生のために必要であることを示す棒グラフのパネルである。 緑膿菌(PAO1)の可溶化膜画分へのγ-IFN結合部位の同定を示すグラフ、落射顕微鏡、免疫ブロットおよびMS/MSスペクトルのパネルである。 緑膿菌(PAO1)の膜画分へのγ-IFNの結合特性を示す棒線図表およびグラフのパネルである。 IFN-γがOprFへ結合しPA-I発現を誘導することを示すグラフ、棒線図表および免疫ブロットのパネルである。 PCN産生に対するU-50,488およびC4-HSLの効果に、MvfRが重要な役割を果たすことを示す棒グラフおよびグラフのパネルである。 μ-オピオイド受容体アンタゴニストのメチルナルトレキソン(MNTX)およびナロキソン(NAL)の個別の存在下で、モルヒネ誘導性PA-Iレクチン/アドヘシン発現の阻害を示す棒グラフである。 PA-I発現に対する、アデノシンおよびイノシンの効果を示すグラフおよび棒グラフのパネルである。 ヒト内皮細胞バリア調節に対する、メチルナルトレキソン(MNTX)およびDAMGOの効果を示すグラフおよび棒グラフのパネルである。 非オピオイドアゴニスト誘導性のヒト内皮細胞バリア調節に対するMNTX効果の効果を示すグラフのパネルである。 アゴニスト誘導性のヒト内皮細胞バリア破壊に対する、MNTXおよびナロキソンの差異的効果を示す棒グラフである。 MNTX誘導性のヒト内皮細胞バリア破壊からの保護に対する、μオピオイド受容体、S1P1受容体またはS1P3受容体のサイレンシング効果を示す棒グラフおよび免疫ブロット法のパネルである。 S1P3受容体トランスアクチベーション(チロシンリン酸化)に対する、MNTX、ナロキソンおよびSrcの効果を示す免疫ブロット法および棒グラフのパネルである。 ヒト内皮細胞においてアゴニスト誘導性の細胞のチロシンホスファターゼ活性の合計の分析を示す棒グラフのパネルである。 受容体チロシンホスファターゼμ(RPTPμ)による、S1P3受容体トランスアクチベーションおよび内皮細胞バリア機能の効果を示すグラフおよび免疫ブロット法のパネルである。 アゴニスト誘導性の細胞のチロシンホスファターゼ活性の合計、およびRPTPμによるMNTX誘導性のヒト内皮細胞バリア破壊からの保護の調節を示す棒グラフのパネルである。 免疫組織化学染色、およびLPS誘導性の肺の血管透過性増大に対するMNTXの効果をインビボで示す棒グラフのパネルである。 アゴニスト誘導性のバリア機能に対する、siRNAを使用した、μオピオイド受容体発現のサイレンシング効果を示す棒グラフのパネルである。 細胞バリア機能および機能障害に関連する経路の概略図である。

Claims (35)

  1. オピオイド誘導性の副作用のない被験体に、効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細胞バリア機能障害によって特徴づけられた障害を予防または治療する方法。
  2. 前記オピオイド誘導性の副作用が、オピオイド誘導性の便秘、過敏性大腸症候群、術後腸閉塞、オピオイド誘導性の悪心、オピオイド誘導性の嘔吐、掻痒症、尿貯留、胃腸管排出の遅れ、胃腸管運動性の減少およびオピオイド誘導性の免疫系抑制から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 細胞が、内皮細胞である、請求項１に記載の方法。
  4. 細胞が、上皮細胞である、請求項１に記載の方法。
  5. μ-オピオイド受容体アンタゴニストが、末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
  6. μ-オピオイド受容体アンタゴニストが、N-メチルナルトレキソン、アルビモパン、ADL 08-0011、ピペリジン-N-アルキルカルボキシレート、四級モルフィナン、アヘンアルカロイド誘導体および四級ベンゾモルファン化合物から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 四級モルフィナン化合物が、N-メチルナルトレキソン、N-メチルナロキソン、N-メチルナロルフィン、N-ジアリルノルモルヒネ、N-アリルレバロルファンおよびN-メチルナルメフェンの四級塩から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 四級ベンゾモルファン化合物が、2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2,2-ジアリル-6,7-ベンゾモルファニウム-ブロミド、2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-6,7-ベンゾモルファン、2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファン、2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファニウムブロミド、2'-ヒドロキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-プロパルギル-6,7-ベンゾモルファニウムブロミド、および2'-アセトキシ-5,9-ジメチル-2-n-プロピル-2-アリル-6,7-ベンゾモルファニウムブロミドから成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
  9. 前記被験体が、ヒト患者である、請求項１に記載の方法。
  10. 少なくとも15キロダルトンの平均分子量がある高分子量ポリエチレングリコール様化合物の投与をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  11. μ-オピオイド受容体アンタゴニストが、非経口、経口、皮下、経皮、皮下埋め込み、筋肉内、静脈内、鞘内、眼内、ガラス体内、眼科的、脊髄内、局所的、直腸、経皮、舌下腺、筋肉内、腔内、耳、および鼻孔吸入による送達から成る群から選択された経路によって投与される、請求項１に記載の方法。
  12. 細胞バリア機能障害によって特徴づけられた障害を発症するリスクを減少させる方法であって、前記障害を発症するリスクがある被験体に、予防に効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む方法。
  13. 細胞バリア障害と関連した症状を予防または減少させる方法であって、そのような処置を必要とする被験体に、μ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含み、前記化合物が前記障害の症状の少なくとも1つを減少させるのに効果的な量で投与される方法。
  14. 外科的処置が可能な腫瘍を有する患者に、効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを周術期に投与することを含む、腫瘍細胞転移を予防する方法。
  15. 細菌性病因からの発症または被害のリスクがある被験体に、効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細菌のPA-Iレクチン/アドヘシンの発現を阻害する方法。
  16. 細菌性病因からの発症または被害のリスクがある被験体に、効果的な量のμ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、細菌のMvfRタンパク質の活性を調節する方法。
  17. 経上皮細胞電気抵抗を減少または増加を阻害するのに効果的なμ-オピオイド受容体アンタゴニストの量を被験体に投与することを含む、細菌毒素に対する上皮の透過性を減少させるまたは透過性の増加を予防する方法。
  18. 障害が、腸由来敗血症、熱傷、新生児壊死性腸炎、重症の好中球減少、中毒性大腸炎、炎症性腸疾患、腸疾患、移植拒絶反応、嚢炎、ピッグベル、シュードモナス属を介した眼科感染、シュードモナス属を介した耳科感染およびシュードモナス属を介した皮膚感染から成る群から選択される、請求項１、１２、１３、１５、１６および１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. オピオイド誘導性の副作用のない被験体に、効果的な量の末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、μ-オピオイド受容体依存的効果のない細胞バリア機能障害を緩和する方法。
  20. 末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストが、N-メチルナルトレキソンである、請求項１９に記載の方法。
  21. 細胞バリア機能障害が、トロンビンおよび細菌性脂質多糖体から成る群から選択された誘発剤によって誘導される、請求項１９に記載の方法。
  22. プロテインフォスファターゼが、前記細胞で活性化される、請求項１９に記載の方法。
  23. S1P3受容体リン酸化が減少される、請求項２２に記載の方法。
  24. 受容体蛋白質チロシンホスファターゼμが活性化される、請求項２２に記載の方法。
  25. オピオイド誘導性副作用のない被験体に、効果的な量の末梢μ-オピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む、S1P3受容体のトランス活性化によって誘導された細胞バリア機能障害を緩和する方法。
  26. 末梢のμ-オピオイド受容体アンタゴニストが、N-メチルナルトレキソンである、請求項２５に記載の方法。
  27. 炎症、アテローム性動脈硬化、急性肺損傷、腸由来敗血症、熱傷、新生児壊死性腸炎、重症の好中球減少、中毒性大腸炎、炎症性腸疾患、腸疾患、移植拒絶反応、嚢炎、ピッグベル、シュードモナス属を介した眼科感染、シュードモナス属を介した耳科感染およびシュードモナス属を介した皮膚感染から成る群から選択された障害を、治療、改善、または予防するための医薬品の調製において、μ-オピオイド受容体アンタゴニストを使用する方法。
  28. 感染を予防または感染のリスクを低下させる方法であって、そのような処置を必要とする患者に、効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む方法。
  29. 患者が、外傷、内部損傷、手術、急性肺損傷、熱傷または高レベルのストレスを有する、または有すると予想される、請求項２８に記載の方法。
  30. 感染が、細菌の日和見感染因子から起こる、請求項２８に記載の方法。
  31. 感染因子が、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium dificile)または緑膿菌である、請求項３０に記載の方法。
  32. 炎症を予防または治療する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む方法。
  33. 炎症患者が、外傷、内部損傷、手術、急性肺損傷、熱傷または感染を有する、または有すると予想される、請求項３２に記載の方法。
  34. 敗血症を予防または治療する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、効果的な量のオピオイド受容体アンタゴニストを投与することを含む方法。
  35. 投与が、周術期である、請求項３４に記載の方法。
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