JP2008542265A - 細胞核に侵入する組成物 - Google Patents

Abstract

細胞核への侵入のための薬学的に許容される組成物および方法では、細胞核の中で少なくとも１つの治療的適用または診断的適用を有している生理活性物質に連結させられた、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、アミノ酸配列ＬＫＫＴＮＴ、またはアミノ酸配列ＫＳＫＬＫＫ、あるいはそれらの保存的変異体の少なくとも１つが含まれている細胞核に侵入するポリペプチドが利用される。

Description

発明の背景
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年５月２７日に提出された米国仮特許出願番号６０／６８４，９９３の権利を請求する。

発明の分野
本発明は、生理活性物質を送達するための組成物および方法の分野に関する。

背景技術の説明
生理活性物質を送達するための改良された組成物および方法が、当該分野で必要とされている。

発明の概要
本発明にしたがうと、細胞核に侵入するための薬学的に許容される組成物には、上記細胞核の中で少なくとも１つの治療的適用または診断的適用を有している生理活性物質に連結させられた、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、アミノ酸配列ＬＫＫＴＮＴ、またはアミノ酸配列ＫＳＫＬＫＫ、あるいはそれらの保存的変異体の少なくとも１つが含まれている、細胞核に侵入するポリペプチドが含まれる。

発明の詳細な説明
本発明は、サイモシンβ４（Ｔβ４、ＴＢ４、またはＴベータ４）のようなアクチン封鎖ペプチド、およびアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、もしくはＫＳＫＬＫＫ、またはそれらの保存的変異体を含む他のアクチン封鎖ペプチドもしくはペプチド断片を利用する組成物および方法を提供する。ＫＬＫＫＴＥＴおよびＬＫＫＴＥＴＱのようなＮ末端またはＣ末端変異体が含まれる。これらのペプチドおよびペプチド断片は、様々な症状を処置および／または予防するため、ならびに、多数の生理学的機能に影響を与えるための、細胞核への侵入に有用である。いくつかの好ましい実施形態においては、細胞に侵入するペプチドはＴβ４である。

生理活性物質は、任意の適切な位置で細胞に侵入するペプチドに連結させることができる。例えば、上記物質は、Ｔβ４のＮ末端に、または、別の位置にある細胞に侵入するペプチドのアミノ酸（最も好ましくは、グルタミン残基）に連結させることができる。上記物質は、薬物、化学療法薬、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ−もしくはＲＮＡ−活性化物質または不活化物質、診断薬などであり得る。

好ましい実施形態においては、細胞に侵入するペプチドは、核内に連結させられた物質を運搬するように、核膜を通り抜ける。核膜は、好ましくは、哺乳動物のものであり、より好ましくは、ヒトのものである。

本発明はまた、哺乳動物被験体に、物質を保有している細胞に侵入するペプチドを投与する方法に適用することができる。この方法は、被験体の核膜または組織を本明細書中で定義される組成物（好ましくは、薬学的に許容される組成物）と接触させる工程を含み得
る。好ましい実施形態においては、被験体は哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

サイモシンβ４は当初、インビトロでの内皮細胞の移動および分化の間に上方制御されるタンパク質として同定された。サイモシンβ４は４３個のアミノ酸の４．９ｋＤａの至る所に存在しているポリペプチドであり、様々な組織の中で同定されている。いくつかの役割がこのタンパク質のものであるとされており、これには、内皮細胞の分化および移動、Ｔ細胞の分化、アクチンの封鎖、および脈管形成における役割が含まれる。

サイモシンβ４は、様々な組織および細胞のタイプの中で見られる、高度に保存されている極性の５ｋＤａのポリペプチドのβ−サイモシンファミリーのメンバーである。最初は胸腺から精製され、胸腺ホルモンと考えられているサイモシンβ４は、その後、多数の生物学的プロセスに関係していることが明らかにされた。主要なＧ−アクチン封鎖ペプチドとして、これは、細胞増殖、移動、および分化の間のアクチンのアセンブリの調節において有用な役割を担っている。多数の研究によって、サイモシンβ４は、発ガン、炎症、血管形成、および創傷の治癒の調節に関係しているとされている。サイモシンβ４の発現によって、アクチンをベースとする細胞骨格の形成を通じて、悪性細胞株における腫瘍原性および転移活性が調節されることが明らかにされた。サイモシンβ４は管を形成する内皮細胞の中に多くあることが明らかになっている；これは、それらの付着、拡散、および移動を増大させ、したがって、血管形成を促進する。サイモシンβ４はまた、核抽出物および創傷分泌液の中でも高濃度で見られ、そして、抗菌性の因子として機能することが示唆された。創傷の治癒におけるサイモシンβ４の刺激の役割は、動物モデルを用いたいくつかの研究において明らかにされた。局所投与または腹腔内投与されると、サイモシンβ４は、ラットの全層モデルにおいて皮膚の創傷の治癒を増進した。皮膚の創傷の治癒を加速させる能力はまた、ｄｂ／ｄｂ糖尿病マウス、ステロイドで免疫抑制されたマウス、および年老いたマウスにおいても観察されている。サイモシンβ４はまた、火傷後の角膜上皮の治癒を加速させること、そして炎症反応を軽減する角膜のサイトカインおよびケモカインの数を下方制御することも示されている。

血管の損傷の際の凝固カスケードの活性化によっては、トロンビンの産生が生じ、これはフィブリノーゲンをフィブリンに変換させる。フィブリンは自発的に重合して血餅を形成し、これが損傷した部位を塞ぎ、これによって血液の消失を防ぐ。フィブリンはまた、様々な細胞のタイプがそれに接着する一時的なマトリックスとしての役割も担っており、その後の創傷の治癒のプロセスの間に移動し、増殖し、フィブリンは正常な組織に置き換わる。

サイモシンβ４は、組織トランスグルタミナーゼの特異的な基質としての役割を担っており、それによってコラーゲン、アクチン、フィブリノーゲン、およびフィブリン（これらもまた上記のプロセスに関係しているタンパク質である）に対して選択的に架橋することができる。トロンビンでの血小板の活性化後、サイモシンβ４が放出され、時間依存性およびカルシウム依存性の様式でフィブリンに対して架橋される。

好ましい実施形態においては、細胞に侵入するポリペプチドは、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、ＫＳＫＬＫＫ、ＫＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＥＴＱ、サイモシンβ４（Ｔβ４）、Ｔβ４のＮ末端変異体、Ｔβ４の核に侵入するＣ末端変異体、Ｔβ４のＮ末端断片、Ｔβ４のイソ型、Ｔβ４のスプライシング変異体、酸化型Ｔβ４、Ｔβ４スルホキシド、リンパ様Ｔβ４、ペグ化Ｔβ４、またはアクチン結合ドメインを有している任意の他のアクチン封鎖タンパク質もしくはアクチン束化タンパク質、あるいは、基本的にアミノ酸ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、もしくはＫＳＫＬＫＫ、またはそれらの保存的変異体が含まれているかまたはこれらから構成されるペプチド断片を含む。国際特許出願番号
ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（引用により本明細書中に組み入れられる）には、Ｔβ４のイソ型（これは、本発明にしたがって有用であり得る）、ならびにアミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴおよびその保存的変異体（これは、本発明と共に利用され得る）が開示されている。国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／００８３３（ＷＯ９９／４９８８３）（引用により本明細書中に組み入れられる）には、酸化型のサイモシンβ４が開示されている。これは、本発明にしたがって利用され得る。本発明は、本明細書中では以後、主にＴβ４およびＴβ４イソ型に関して記載されるが、以下の記載は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、ＫＳＫＬＫＫ、ＫＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＥＴＱ、基本的にＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、ＫＳＫＬＫＫ、ＫＬＫＫＴＥＴ、もしくはＬＫＫＴＥＴＱを含むかまたはこれらから構成されるペプチドおよび断片、それらの保存的変異体、ならびに、酸化型サイモシンβ４、Ｔβ４スルホキシド、リンパ様Ｔβ４、ならびに、ペグ化Ｔβ４に対しても同様に適用できることが意図されることが理解される。

物質が連結させられている細胞に侵入するペプチドは、任意の適切な有効量で投与され得る。例えば、物質が連結させられている細胞に侵入するペプチドは、約０．１〜５０マイクログラムの範囲の投与量で、より好ましくは、約１〜３０マイクログラムの範囲の量で、投与され得る。

本発明の組成物は、１回、毎日、１日おき、１週間おき、１ヶ月おきなどで投与することができ、投与日１日あたり単回投与または複数回投与で、例えば、投与日１日あたり２回、３回、４回、またはそれ以上の回数で投与することができる。

Ｔβ４イソ型が同定されており、これは、Ｔβ４の公知のアミノ酸配列と、約７０％、または約７５％、または約８０％、またはそれ以上の相同性を有している。このようなイソ型としては、例えば、Ｔβ４^ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、およびＴβ１５が挙げられる。Ｔβ４と同様に、Ｔβ１０およびＴβ１５イソ型、さらには、Ｔβ４スプライシング変異体は、アクチンを封鎖することが示されている。Ｔβ４、Ｔβ１０、およびＴβ１５、ならびに他のイソ型は、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを共有しており、これはアクチン封鎖または結合の媒介に関与しているようである。いずれの特定の理論にも束縛されることは望まないが、Ｔβ４イソ型の活性は、アクチンの重合を調節する能力が一部原因であり得る。β−サイモシンは、遊離のＧ−アクチンを封鎖することによってＦ−アクチンを脱重合させるようである。したがって、Ｔβ４のアクチンの重合を調節する能力は、ＬＫＫＴＥＴ配列を介してアクチンに結合するかまたはアクチンを封鎖するその能力に、全てまたは一部、起因し得る。したがって、Ｔβ４と同様に、アクチンに結合するかまたはアクチンを封鎖する、あるいは、アクチンの重合を調節する他のタンパク質（これには、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴを有しているＴβ４イソ型が含まれる）も、本明細書中で示されるように、単独で、またはＴβ４との組み合わせにおいておそらく有効である。なぜなら、これらは、細胞に侵入する配列を含む細胞に侵入するペプチドであるからである。

このように、公知のＴβ４イソ型（例えば、Ｔβ４^ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、およびＴβ１５）、ならびに、未だ同定されていないＴβ４イソ型およびＴβ４のスプライシング変異体は、本発明の方法において有用であろうことが、具体的に予想される。このように、Ｔβ４イソ型は本発明の方法（被験体において実施される方法を含む）において有用である。したがって、本発明はさらに、物質を保有しているＴβ４、ならびに、Ｔβ４イソ型であるＴβ４^ａｌａ、Ｔβ９、Ｔβ１０、Ｔβ１１、Ｔβ１２、Ｔβ１３、Ｔβ１４、およびＴβ１５と、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。

加えて、適切な封鎖、結合、移動、または重合アッセイにおいて明らかにされたか、あ
るいは、アクチン結合を媒介するアミノ酸配列（例えば、ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、またはＫＳＫＬＫＫ）の存在によって同定された、アクチン封鎖能力またはアクチン結合能力を有している他のタンパク質、あるいは、アクチンを移動またはアクチンの重合を調節することができる他のタンパク質も、本発明の方法において同様に使用することができる。このようなタンパク質としては、例えば、ゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、アドセベルチン（ａｄｓｅｒｖｅｒｔｉｎ）、プロポミオシン、フィンシリン（ｆｉｎｃｉｌｉｎ）、デパクチン（ｄｅｐａｃｔｉｎ）、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セベリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニン、およびアクメンチン（ａｃｕｍｅｎｔｉｎ）が挙げられる。このような方法には、被験体において実施される方法が含まれるので、本発明はさらに、本明細書中に記載されるように、ゲルゾリン、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）、プロフィリン、コフィリン、デパクチン、ＤｎａｓｅＩ、ビリン、フラグミン、セベリン、キャッピングタンパク質、β−アクチニンおよびアクメンチンを含む薬学的組成物を提供する。したがって、本発明には、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、またはＫＳＫＬＫＫ（これらは、その一次アミノ酸配列の中に存在し得る）、およびこれらの保存的変異体を含むポリペプチドを利用する組成物ならびに方法が含まれる。

本明細書中で使用される場合は、用語「保存的変異体」またはその文法上のバリエーションは、別の生物学的に類似している残基によるアミノ酸残基の置換を示す。保存的バリエーションの例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンのような疎水性残基の別の疎水性残基での置換、極性残基の別の極性残基での置換、例えば、アルギニンのリジンでの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸での置換、あるいはグルタミンのアスパラギンでの置換などが挙げられる。

利用される実際の投与量、処方、または組成は、被験体の大きさおよび健康状態を含む多くの要因に応じて様々であり得る。しかし、当業者はＰＣＴ／ＵＳ９９／１７２８２（前出）、およびその中で引用されている参考文献において開示されているような臨床的な投与量を決定するための方法および技術が記載されている教示を、使用に適切な投与量を決定するために使用することができる。

適切な処方物には、担体の中に、物質を保有しているＬＫＫＴＥＴ、ＬＫＫＴＮＴ、またはＫＳＫＬＫＫペプチドが、約０．０００１〜１０重量％の範囲、より好ましくは、約０．０１〜０．１重量％の範囲、最も好ましくは、約０．０５重量％の濃度で含まれ得る。任意の適切な薬学的に許容される担体（例えば、注射用蒸留水）が利用され得る。

本発明はまた、生理活性物質を細胞核に送達するための方法にも関する。この方法は、細胞核に対して、本明細書中に記載される薬学的に許容される組成物を投与する工程を含む。この方法は、組成物を、核を含む細胞に、細胞内の核に、哺乳動物被験体に投与する工程を含み得るか、あるいは、被験体の組織を本発明の組成物と接触させる工程を含み得る。

実施例１
細胞核内で治療的適用および／または診断的適用を有している生理活性物質を、以下のようにＴβ４に連結させる。物質は、薬剤、化学療法薬、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ＤＮＡもしくはＤＮＡ活性化物質または不活化物質、ならびに診断薬から選択される。

物質を連結させたサイモシンβ４は、２４０μｇのサイモシンβ４（２００μＭ）を１２０μｇの物質（１ｍＭ）および０．２Ｕのモルモットトランスグルタミナーゼとともに、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５ｍＭのＣａＣｌ_２、３ｍＭのＤＴＴ
からなる２４０μｌの緩衝液中で室温でインキュベートすることによって調製する。１時間後および２時間後に、５μｌの反応混合物についてＨＰＬＣ分析を行う。反応を、５μｌのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の添加によって４時間後に停止させる。その後、反応混合物について、分取ＨＰＬＣを行う。分離させたペプチドを減圧下で濃縮し、ついで、アミノ酸分析と質量スペクトル分析によって特性決定する。

物質を連結させたサイモシンβ４のタンパク質分解による断片を、以下の手順によって調製する：５０μｇのペプチドを２０μＵのＡｓｎＣ−エンドプロテイナーゼと共に、１００μｌの反応緩衝液（５０μＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、０．２ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ）の中で室温で１６時間インキュベートする。その後、反応を、５μｌの１０％ＴＦＡの添加によって停止させ、生成物を分取ＨＰＬＣによって分離させる。分析の前に、試料を減圧下で濃縮する。

マイクロインジェクション実験
マイクロインジェクションを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に適合するマイクロマニピュレータ５１７０とマイクロインジェクタ５２４２とからなるＥＣＥＴ細胞インジェクションシステム（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行う。マイクロインジェクションは、ＴＶモニタ（ＳＳＭ １２１ＣＥ、ソニー（Ｓｏｎｙ）、東京、日本）に取り付けたＣＣＤカメラによって視覚的に制御する。物質を連結させたサイモシンβ４と架橋させたＡＤＰ−リボシル化アクチン：サイモシンβ４複合体をそれぞれ、１３５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．２）中の３２μＭおよび８．２７μＭの濃度で細胞質に注入する。注入圧力は、６５から８０ｈＰａ（１ｈＰａ＝０．１ｋＰａ）の間であり、注入時間は０．５から０．７秒の間である。

物質を結合させたサイモシンβ４を細胞の細胞質の中にマイクロインジェクトする。マイクロインジェクションの直後は、連結させたペプチドは細胞質全体に均一に分配される。１時間のインキュベーション後には、細胞核への顕著な局在化が検出される。

サイモシンβ４のＮ末端部分には、リジン残基（^１４ＫＳＫＬＫＫ^１９）が多く含まれている配列ストレッチが含まれており、これは、機能性の核局在化シグナルであり得る。^１４ＫＳＫＬＫＫ^１９配列が含まれているＮ末端断片（サイモシンβ^{２７−４３} _４）は、顕著な核局在化を示す。

Claims (20)

1. 細胞核への侵入のための薬学的に許容される組成物であって、前記細胞核の中で少なくとも１つの治療的適用または診断的適用を有している生理活性物質に連結させられた、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴ、アミノ酸配列ＬＫＫＴＮＴ、またはアミノ酸配列ＫＳＫＬＫＫ、あるいはそれらの保存的変異体の少なくとも１つが含まれている細胞核に侵入するポリペプチドを含む、組成物。
2. 前記生理活性物質が、薬剤、化学療法薬、または核酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記細胞核に侵入するポリペプチドが、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴまたはアミノ酸配列ＫＳＫＬＫＫを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記細胞核に侵入するポリペプチドが、サイモシンβ４を含む、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ポリペプチドが、サイモシンβ４のＮ末端断片を含む、請求項１に記載の組成物。
6. 前記物質に連結させられた前記細胞に侵入するポリペプチドが、薬学的に許容される担体の中に存在している、請求項１に記載の組成物。
7. 前記物質に連結させられた前記細胞核に侵入するポリペプチドが、前記担体の約０．０００１〜１０重量％の範囲の濃度で前記担体の中に存在している、請求項６に記載の組成物。
8. 細胞核に請求項１に記載の組成物を投与する工程を含む、生理活性物質を細胞核に送達する方法。
9. 前記組成物を哺乳動物被験体に投与する工程を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記被験体の組織を前記組成物と接触させる工程を含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記生理活性物質が、薬剤、化学療法薬、または核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
12. 前記細胞核に侵入するポリペプチドが、アミノ酸配列ＬＫＫＴＥＴまたはアミノ酸配列ＫＳＫＬＫＫを含む、請求項８に記載の方法。
13. 前記細胞核に侵入するポリペプチドが、サイモシンβ４を含む、請求項８に記載の方法。
14. 前記ポリペプチドが、サイモシンβ４のＮ末端断片を含む、請求項８に記載の方法。
15. 前記物質に連結させられた前記細胞核に侵入するポリペプチドが、薬学的に許容される担体の中に存在している、請求項８に記載の方法。
16. 前記物質に連結させられた前記細胞核に侵入するポリペプチドが、前記担体の約０．０００１〜１０重量％の範囲の濃度で前記担体の中に存在している、請求項１５に記載の方法。
17. 前記生理活性物質が、前記サイモシンβ４のＮ末端部分に連結させられている、請求項４に記載の組成物。
18. 前記生理活性物質が、前記Ｎ末端断片のＮ末端部分に連結させられている、請求項５に記載の組成物。
19. 前記生理活性物質が、前記サイモシンβ４のＮ末端部分に連結させられている、請求項１３に記載の方法。
20. 前記生理活性物質が、前記Ｎ末端断片のＮ末端部分に連結させられている、請求項１４に記載の方法。