KR20060013368A

KR20060013368A - 티모신 베타 4, 유사물질, 이소폼, 및 다른 유도체들을전달하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20060013368A
Application number: KR1020057017561A
Authority: KR
Inventors: 알랜 엘. 골드스타인
Original assignee: 리지너크스 바이오 파마소티컬스, 인코포레이티드
Priority date: 2003-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2006-02-09
Also published as: EP1613369A2; JP2007525445A; WO2004091550A2; US20060263360A1; CA2517154A1; CN1852727A; EP1613369A4; MXPA05010390A; AU2004229336A1; AU2004229336B2; US20100204147A1; WO2004091550A3

Abstract

접착제 및 아미노산 서열 LKKTET 또는 그것의 보존성 변이를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 이용한 조성물 및 방법.

티모신 베타 4

Description

티모신 베타 4, 유사물질, 이소폼, 및 다른 유도체들을 전달하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERING THYMOSIN BETA 4, ANALOGUES, ISOFORMS AND OTHER DERIVATIVES}

본 발명은 폴리펩티드 약제를 전달하기 위한 조성물 및 방법의 분야에 관한 것이다.

폴리펩티드 약제는 여러 질병을 치료하는데 매우 효과적인 성분이다. 폴리펩티드 약제가 생산하는데 비용이 많이 들기 때문에, 폴리펩티드 약제를 전달하기 위한 향상된 조성물 및 방법이 당 업계에서 필요하다.

본 발명에 따라, 조성물은 접착제 및 아미노산 서열 LKKTET 또는 그것의 보존성 변이로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 포함하여 이루어진다. 폴리펩티드를 위치로 전달하는 방법은 그 장소로 상기 조성물을 도입하는 것을 포함하여 이루어진다.

본 발명은 티모신 ß4 (Tß4)와 같은 액틴 격리 펩티드 및 아미노산 서열 LKKTET 또는 보존성 변이를 포함하는 다른 액틴 격리 펩티드, 또는 펩티드 단편을 이용하는 조성물 및 방법을 제공해준다. KLKKTET 및 LKKTETQ 와 같은 N-말단 또는 C-말단 변이가 포함된다. 이러한 펩티드들 및 펩티드 조각들은 상처치유 촉진 및 다른 생리적인 용도에 유용하다.

티모신 ß4는 처음에는 시험관내에서 내피 세포 이동 및 분화를 촉진하는 단백질로 알려졌다. 티모신 ß4 는 43개의 아미노산이고, 4.9 kDa 의 여러 조직들에서 보이는 도처에 존재하는 폴리펩티드이다. 내피 세포 분화 및 이동, T 세포 분화, 액틴 격리 및 혈관 신생에서의 역할을 포함하여 여러 역할이 이 단백질이 수행하는 것으로 생각되었다.

티모신 ß4 는 여러 조직 및 타입에서 발견되는 매우 잘 보존된 극의 5-kDa 폴리펩티드의 ß티모신 패밀리의 일원이다. 원래 가슴샘으로부터 정제되었고, 가슴샘 호르몬으로 생각되었는데, 그후, 티모신 ß4 는 여러 생물학적 과정에 관여하는 것이 발견되었다. 주요한 G-액틴 격리 펩티드로서, 그것은 세포 증식, 이동 및 분화시에 액틴 어셈블리의 조절에 중요한 역할을 한다. 많은 연구에서 암발생, 염증, 혈관생성, 및 상처치료를 규율하는데에 있어서의 티모신 ß4의 역할을나타내고 있다. 티모신 ß4 의 발현이 액틴계 세포골격 조직을 통해 악성 세포주에서 암발생 및 전이 활성을 규율한다는 것이 발견되었다. 티모신 ß4는 튜브 형성 내피 세포에서 상승되는 것이 발견되었다; 그것은 그들의 부착을 증가시키고, 확산 및 이동을 하여 혈관생성을 촉진시킨다. 티모신 ß4 는 또한 궤양 추출물 및 상처액에서 높은 농도로 발견되었고, 항생인자로서 기능하는 것으로 제안되었다. 상처치유에 있어서 티모신 ß4의 자극 역할은 동물 모델에 대한 여러 연구에서 설명되었다. 몸의 제한된 장소 또는 복막 내에 투여되었을 때, 티모신 ß4는 쥐의 전층(full thickness) 모델에서 피부 상처 치유를 향상시켰다. 피부 상처치유를 가속화시키는 능력은 db/db 당뇨병 쥐들, 스테로이드-면역이 저하된 쥐들, 나이 든 쥐들에서 또한 발견되었다. 티모신 ß4 는 또한 화상 후의 각막의 상피의 치유를 가속화시킨다는 것과 각막 사이토카인 및 케모카인의 수가 적어지도록 규제하여 염증 반응을 감소시키는 것이 나타나 왔다.

혈관 상처의 응고 연속 단계의 활성화는 섬유소원(fibrinogen)을 섬유소(fibrin)로 변환시키는 트롬빈의 생성을 가져왔다. 섬유소는 자발적으로 중합되어 상처부위를 봉하는 핏덩이를 형성하여서 피의 손실을 막는다. 섬유소는 또한 여러 세포 타입이 부착, 이동, 및 증식하는 임시 매트릭스로서 뒤이은 상처치료 과정 동안 섬유소를 정상 조직으로 대체시키는 작용을 한다. XIIIa 요소는, 혈장 트랜스글루타미네이즈로서, 섬유소 덩어리를 공유적으로 교차 결합시켜 그 구조를 강화시킨다. 게다가, 그것은 또한 섬유소 매트릭스의 속성을 조절할 수 있는 많은 생리적으로 활성 있는 단백질을 섬유소에 교차 결합시킨다. 예를 들면,α₂-앤티플라즈민의 공유결합적인 삽입은 매트릭스 섬유소 용해에 대한 저항을 증가시키고, 피브로넥틴의 혼합은 그것의 세포 부착 및 이동을 지지하는 능력에 영향을 줄 수 있다. 조직 트랜스글루타메이즈는 섬유소에 티모신 ß4를 선택적으로 삽입시킬 수 있다.

티모신 ß4는 조직 트랜스글루타메이즈를 위한 특이 기질로서 작용을 하고, 그것에 의해 상기 과정에도 관여하는 콜라겐, 액틴, 섬유소원 및 섬유소, 단백질에 선택적으로 교차 결합될 수 있다. 트롬빈에 의해 혈소판이 활성화 후에, 티모신 ß4가 방출되고 섬유소에 시간 및 칼슘 의존 방법으로 교차 결합된다. 혈소판 인자 XIIIa 는 자극된 혈소판으로부터 함께 방출된다. 혈소판에서 방출된 티모신 ß4의 섬유소에로의 교차 결합은 XIIIa 인자에 의해 매개 되는 것으로 보이며, 상처치유, 혈관생성 및 염증 반응의 촉진을 위해, 덩어리 및 조직 손상 부위 근처에 있는 티모신 ß4의 국지 농도를 증가시키는 기작을 제공한다.

섬유소원은 화학물질의 이량체로서 동일한 두개의 서브유닛으로 이루어지는데, 각각은 많은 이황화 결합에 의해 결합된 Aα, Bß 및 γ 의 세 개의 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 6개 사슬 모두의 이황 연결된 NH₂-말단 부분은 중앙의 E 부위을 형성하는 반면, COOH-말단 부분은 두개의 말단 D 부위 및 두개의 αC-도메인을 형성한다. 섬유소원을 섬유소로 변환시킬 때, 트롬빈에 의해 매개된 섬유소원으로부터의 NH₂-말단의 피브리노펩티드 A 및 B의 제거, 및 섬유소원 Aα 및 Bß 사슬로부터의 NH₂-말단의 피브리노펩티드 A 및 B의 제거 각각은, 그들의 활성 서열 (중합 장소)을 노출하게 하고 이웃하는 분자들의 E 및 D 부위의 상호작용을 가능하게 하여(DD:E 상호작용) 섬유소 중합체를 형성한다. 그 중합체는 XIIIa 인자에 의해 섬유소 α 및 γ 사슬의 COOH-말단 부분을 통하여 교차 결합된다. 인접한 D 부위의 γ사슬의 분자간 교차 결합은 급격히 일어나서 γ-γ 이량체를 만드는 반면, α중합체들 (αC-도메인들) 간의 교차 결합은 더 천천히 일어나서, α중합체들을 형성하게 된다. 또한, α 사슬은 피브로넥틴, α₂-앤티플라즈민, 및 PAI-2 등과 같은 단백질들이 섬유소로 교차 결합하는 것을 도와준다. 그러므로 이러한 사슬이 또한 티모신 ß4의 교차 결합에 관여할 수 있다는 가설이 그럴듯해 보인다.

티모신 ß4의 섬유소(또는 섬유소원)에로의 삽입 기작을 명확히 하기 위해, XIIIa 인자가 존재시와 비존재시에, 섬유소원, 섬유소 및 그들의 재조합 단편들(도메인들)과의 그것의 상호작용을 연구되었다. 그 연구는, 비록 섬유소(또는 섬유소원)과 티모신 ß4간에 실질적인 비공유결합의 상호작용이 없는 것처럼 보이더라도, XIIIa 인자는 후자를 섬유소원 및 섬유소 둘 모두에 효율적으로 교차 결합시킨다는 것과 그 교차 결합이 주로 잔기 392-610을 포함하는 그들의 αC-도메인의 COOH-말단 부분을 통해 일어난다는 것을 밝혔다.

한 실시 태양에 따르면, 실질적으로 정제된 조성물이 공급되었는데, 그것은 접착제 및 아미노산 서열 LKKTET 또는 그것의 보존성 변이의 서열을 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다. 하나의 실시 태양에 따르면, 그 접착제는 부목과 같은 의료기기에 부착될 수 있다. 특히 바람직한 실시 태양에서, 그 접착제는 인간과 같은 생물의 조직에 부착될 수 있다.

바람직한 실시 태양에서, 그 접착제는 생분해성 접착제이다. 여기서 사용될 때, 생분해성 접착제라는 용어는 생 흡수성 또는 부식성 접착제를 포함하는 것이다. 바람직한 실시 태양에서, 발명된 조성물은 처음에는 유체 또는 반-유체 상태이고, 가장 바람직하게는, 액체 또는 반-액체 상태이다. 특히 바람직한 실시 태양에서는, 바른 후에, 접착제는 점성이 증가하고 또는 최소한 조직에 부착하는 동안 부분적으로 고체화되는 것이다. 그 조성물을 부위에 층으로 바르는 것으로 도입할 수 있고, 가장 바람직하게는 스프레이하거나 또는 브러시로 도입하는 것이다.

바람직한 실시 태양에서, 본 발명에서 사용된 접착제는 섬유소 봉함제 매트릭스(피브린 글루)이다. 피브린 글루는 섬유소원 및 트롬빈/칼슘의 별개의 용액의 두개의 구성 요소 시스템이다. 두개의 용액이 합쳐지면, 그 결과물인 혼합물은 섬유소 덩어리를 형성하기 위해 덩어리를 만드는 연속 단계의 마지막 단계를 모방한다. 그 섬유소원 구성 요소는 자기 조직의, 하나의-기증가로부터, 또는 공동의 혈액으로부터 제조될 수 있다. 피브린 글루는 유럽에서 상표명 Beriplast, Tissel, 및 Tissucol으로 이용 가능하다. 피브린 글루는 다양한 외과 시술에서 다양한 해부 위치에서의 조직의 회복, 봉함, 및 부착에 사용되어 왔다.

그래서, 본 발명은 LKKTET 폴리펩티드를 생물의 위치로 전달하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시 태양에서, 그 위치는 표면이다. 이 발명의 방법은 발명의 조성물을 그 위치에 바르는 것을 포함한다. 바람직한 실시 태양에서, 그 위치는 급성 또는 만성 상처와 같은 상처이다.

바람직한 실시 태양에서, 접착제는 섬유소, 섬유소원, 피브린 글루, 콜라겐, 상기 어느 것의 단편들 또는 상기 어느 것의 혼합물이다. 사용될 수 있는 콜라겐 접착제는 1, 2, 3, 4 및/또는 5 타입 콜라겐들을 포함한다. 다른 접착제들은 액틴 또는 인테그린 접착제들을 포함할 수 있다.

다른 실시 태양에서, 발명의 조성물에서 사용되는 그 생 분해성 접착제는 겔 (예, 접착제 콜라겐 겔), 겔/섬유소 혼합물, 분말 등이다.

바람직한 실시 태양에서, 접착제는 LKKTET 펩티드에 공유 결합 되어있고, 가장 바람직하게는 XIIIa 인자에 의해서이다. 특히 바람직한 실시 태양에서, 접착제는 섬유소 또는 섬유소원의 단편이다.

바람직한 실시 태양에서, LKKTET 폴리펩티드는 아미노산 서열 KLKKTET 또는 LKKTETQ, 티모신 ß4(Tß4 ), Tß4의 N-말단 변이, Tß4의 C-말단 변이, Tß4의 이소폼, Tß4의 스플라이스(splice)-변이, 산화된 Tß4, Tß4 술폭사이드, 림프계 Tß4, 페질레이티드 Tß4 또는 액틴 결합 도메인을 갖는 다른 액틴 격리 또는 근속단백질(筋束蛋白質), 또는 아미노산 서열 LKKTET 또는 그들의 보존성 변이를 포함하여 이루어지거나 그것을 필수적으로 하여 구성되는 펩티드 조각을 포함하여 이루어진다. 여기에 인용으로 포함된 국제 출원 일련 번호 PCT/US99/17282는 본 발명에 따라 사용 가능한 아미노산 서열 LKKTET 및 그들의 보존성 변이들뿐만 아니라, 본 발명에 따라 사용 가능한 Tß4의 이소폼들을 기술하고 있다. 여기에 인용으로 포함된 국제 출원 일련 번호 PCT/GB99/00833 (WO 99/49883)은 본 발명에 따라 사용 가능한 산화된 티모신 ß4를 기술하고 있다. 비록 본 발명이 하기에 주로 Tß4 및 Tß4 이소폼들에 관하여 기술하고 있지만, 다음 기술은 LKKTET, LKKTETQ의 아미노산 서열 및 LKKTET 또는 LKKTETQ, 그들의 보존성 변이들, 그리고 산화된 티모신 ß4를 포함하여 이루어지거나 그것을 필수적으로 포함하여 구성되는 펩티드들 및 단편들에도 똑같이 적용된다는 것이 이해되어야 한다.

상처부위에 접하는 예로는 그 위치를, 조성물 접착제/Tß4 홀로 이루어지는 조성물로 접촉시키는 것, 또는 Tß4 침투를 증진시키거나 Tß4의 펩티드들의 처치 부위에 방출하는 것을 지연 또는 감속시키는 하나 이상의 제제의 조합으로 이루어지는 조성물로 접하도록 하는 것을 포함한다. 대상은 포유동물일 수 있고, 바람직하게는 인간이다.

Tß4, 또는 이의 유사체들, 이소폼들 또는 유도체들은 어떠한 적합한 유효양으로도 투여될 수 있다. 예를 들면, Tß4는 Tß4의 약 0.1-50 마이크로 그램의 범위 내의 투약량으로 투여될 수 있고, 더 바람직하게는 약 1-25 마이크로그램의 범위 내의 양이다.

본 발명에 따른 조성물은 매일, 격일 등으로 투여일 당 한번 또는 여러 번 투여될 수 있는데, 예를 들면, 투여일 당 2, 3, 4, 또는 그 이상의 회수로 적용할 수 있다.

Tß4 이소폼들이 알려져 왔고 Tß4의 아미노산 서열에 대해 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80% 또는 그 이상의 상동성을 갖고 있다. 그러한 이소폼들은 예를 들면, Tß4 ^ala, Tß9, Tß10, Tß11, Tß12, Tß13, Tß14 및 Tß15 등을 포함한다. Tß4와 유사하게, Tß4, Tß10 및 Tß15 이소폼들뿐만 아니라, Tß4 스플라이스-변이들은 액틴을 격리하는 것을 보여왔다. Tß4, Tß10 및 Tß15 뿐만 아니라 이들 다른 이소폼들은 액틴 격리 또는 결합하는 것을 매개하는 것에 관여하는 것으로 보이는 아미노산 서열 LKKTET를 공유한다. 어느 특정 이론에 제한되고 싶지는 않지만, Tß4의 이소폼들의 활성은 부분적으로는 액틴의 중합을 규율하는 능력에 기인한 것일 수 있다. ß-티모신들은 유리 G-액틴을 격리시킴으로써, F-액틴의 중합을 해체하는 것으로 보인다. Tß4의 액틴 중합을 조절하는 능력은, 그러므로, 모두 또는 부분적으로, 그것의 LKKTET 염기서열을 통한 액틴에의 결합 또는 격리 능력에 기인한 것일 수 있다. 그래서, Tß4에서 처럼, 액틴에 결합하거나, 액틴을 격리시키는 또는 아미노산 서열 LKKTET을 갖는 Tß4 이소폼들을 포함하여 액틴 중합을 조절하는 다른 단백질들은, 여기에 기술한 것처럼 홀로 또는 Tß4 와의 조합으로 효과적일 거 같다.

그래서, Tß4 ^ala, Tß9, Tß10, Tß11, Tß12, Tß13, Tß14 및 Tß15등의 알려진 Tß4 이소폼들 뿐만 아니라 아직 밝혀지지 않은 Tß4 이소폼들 및 Tß4 스플라이스-변이들이 본 발명의 방법에 유용할 것이다. 그러한 Tß4 이소폼들이 대상에서 실시된 방법을 포함하여 본 발명의 방법에 유용하다. 그러므로 본 발명은 또한 Tß4 뿐 아니라 Tß4 이소폼들인 Tß4 ^ala, Tß9, Tß10, Tß11, Tß12, Tß13, Tß14 및 Tß15 및 약리적으로 허용되는 운반체를 포함하는 약리적 조성물을 제공한다.

또한, 액틴 격리 또는 결합 능력을 갖는 다른 단백질들, 또는 액틴을 움직이게 하고 또는 액틴 중합을 조절하는 것들은, 적당한 격리, 결합, 이동화 또는 중합 분석에서 증명되거나, 또는 예를 들면 LKKTET과 같은 액틴 결합을 매개하는 아미노산 서열의 존재하에서 밝혀진 것들은 마찬가지로 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 그러한 단백질들은 예를 들면, 겔솔린(gelsolin), 비타민 D 결합 단백질 (DBP), 프로필린(profilin), 코필린(cofilin), 아드세베르틴(adsevertin), 프로포미오신(propomyosin), 핀실린(fincilin), 데팩틴(depactin), 드나세아이(DnaseI), 빌린(villin), 프라그민(fragmin), 세베린(severin), 켑핑 단백질, ß액티닌 및 아큐멘틴등을 포함한다. 그러한 방법은 대상에서 시행된 방법을 포함하므로, 본 발명은 또한 약리적 조성물을 공급하는데, 이는 상기 기술된 겔솔린(gelsolin), 비타민 D 결합 단백질 (DBP), 프로필린(profilin), 코필린(cofilin), 데팩틴(depactin), 드나세아이(DnaseI), 빌린(villin), 프라그민(fragmin), 세베린(severin), 켑핑 단백질, ß액티닌 및 아큐멘틴을 포함하여 이루어진다. 그래서, 본 발명은 아미노산 서열 LKKTET (이것은 그 주요 아미노산 서열 내에 있을 수 있다) 및 그들의 보존성 변이들로 이루어진 폴리펩티드의 용도를 포함한다.

여기에 사용된 것처럼, "보존성 변이" 또는 그것의 문법적 변형은 아미노산 잔기가 다른 생물학적으로 비슷한 잔기에 의해 대치된 것을 뜻한다. 보전적 변이의 예로는 이소루이신, 발린, 루이신 또는 메티오닌과 같은 소수성 잔기로의 치환, 아르기닌은 라이신 대신, 글루타민산을 아스파르탐산 대신, 또는 글루타민을 아스파라긴 대신 치환하는 등의 극성 잔기로의 치환을 포함한다.

Tß4 는 많은 조직 및 세포 타입에 위치해 왔고, 그래서 Tß4의 생산을 자극하는 약리물질이 첨가될 수 있고 또는 조직 및/또는 세포로부터 Tß4를 생산하기 위한 조성물을 포함하여 이루어질 수 있다. 그러한 약리물질은 성장 인자들, 예를 들면 인슐린 비슷한 성장 인자 (IGF-1), 혈소판 유래의 성장 인자 (PDGF), 외피의 성장 인자 (EGF), 형질변환 성장 인자 베타 (TGF-ß, 기본적인 섬유아세표 성장 인자 (bFGF), 티모신 α1 (Tα1) 및 혈관의 내피 성장 인자 (VEGF) 등의 성장 인자 패밀리의 멤버들을 포함한다. 더 바람직하게는, 그 약리 물질이 성장 인자 베타 (TGF-ß 또는 TGF-ß 상과(분류상의 상과(上科))의 다른 멤버들을 형질 변환 시킨다.

추가로, 치유를 돕거나 또는 자극하는 약리 물질은 Tß4 또는 Tß4 이소폼과 함께 조성물에 첨가될 수 있다. 그러한 약리 물질은 혈관형성인자(血管形成因子), 성장 인자, 세포의 분화를 지시하는 인자를 포함한다. 예를 들면, 그렇지만 이에 제한되지는 않는데, Tß4 또는 Tß4 이소폼 홀로 또는 조합으로 다음 약리물질의 하나 또는 이상과의 조합으로 그 첨가될 수 있다: 유효량의 VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFß IGF-1, IGF-2, IL-1, 프로티모신 α 및 티모신 α11.

염증, 상처 및 퇴화를 치유하거나 예방하는 실제 투여량, 조제 또는 조성물은 많은 요소에 의해 좌우되는데, 이는 대상의 크기 및 건강을 포함한다. 그렇지만, 당업자가 사용될 적당한 투여량을 결정하는 데에 PCT/US99/17282, (상기 참조) 및 거기에 인용된 인용서류에 기술된 투여량을 결정하기 위한 방법 및 테크닉을 이용할 수 있다.

바람직한 실시 태양에서, 폴리펩티드의 농도는 접착제 몰당 폴리펩티드 약 0.01-1 몰의 범위 내이고, 더 바람직하게는 접착제 몰당 폴리펩티드 약 0.1-0.5 몰의 범위 내이고, 가장 바람직하게는 접착제 몰당 폴리펩티드 약 0.2-0.4 몰의 범위내이다.

적당한 조성은 Tß4 또는 Tß4 이소폼을 약 0.001 - 10 중량% 의 범위 내, 약 0.01 - 0.1 중량%의 범위 내, 또는 약 0.05중량%를 포함하는 것이다.

본 발명은 Tß4 펩티드 또는 그것의 기능적 단편들과 상호작용을 하는 항체의 용도를 포함한다. 별개의 단일 클론 항체뿐 아니라 다른 항원 결정기 특이성을 가진 혼주된(pooled) 단일클론들의 항체로 본질적으로 구성되는 항체의 제조가 제공된다. 단일 클론 항체들은 PCT/US99/17282(상기 참조)에 기술된 당업자에 잘 알려진 방법에 의해 단백질의 단편들을 포함하는 항원으로부터 만들어진다. 본 발명에서 사용된 항체라는 용어는 단일 클론 또는 다클론 항체들을 포함한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 대상을 Tß4 유전자 발현을 조절하는 약리물질의 유효량을 투여하여 대상을 치료하는 방법을 제공한다. "조절(modulate)"이라는 용어는 Tß4가 과량 발현되었을 때 Tß4의 발현을 저지 또는 억제시키는 것 및 Tß4가 너무 조금 발현되었을 때 발현을 유도하는 것을 의미한다.

"유효량"이라는 용어는 효과적인 치료에서 Tß4 유전자 발현을 조절하는 데 효과적인 Tß4 약리물질의 양을 의미한다. Tß4 또는 Tß4 p이소폼 유전자 발현을 조절하는 물질은 예를 들면 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 그 폴리뉴클레오티드 안티센스, 3층 물질, 또는 리보좀 일 수 있다. 예를 들면, 구조 유전자 부위 또는 Tß4의 프로모터 부위를 지시하는 안티센스가 사용될 수 있다.

다른 실시 형태에서, 본 발명은 Tß4 활성을 조절하는 화합물을 이용하기 위한 방법을 제공한다. Tß4 활성 (예를 들면, 길항약 및 작용약)에 영향을 미치는 화합물은 펩티드들, 펩티드유사물들, 폴리펩티드들, 화학물질의 화합물들, 아연과 같은 미네랄들, 생물학 제재들을 포함한다.

특정의 이론에 제한되지는 않는데, 본 발명은 말단의 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼레이즈(비주형 지시 DNA 폴리메라아제)를 유도하여 하나 또는 그 이상의 염증성의 사이토카인(cytokines), 또는 케모카인(chemokines)의 수준을 감소시키고, 내피 세포들을 위한 주화성 인자(chemotactic factor)로서 작용하여, 염증 또는 손상의 치유 또는 예방을 증진신킨다. 그럼으로써, 손상 또는 다른 퇴화 또는 환경 요인에 의한 조직에서의 퇴화 변형을 치유 또는 예방하는 것을 촉진한다.

본 발명은 다음 실시예에 의해 더 설명되는데, 이는 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

단백질들 및 시약들

플라즈모겐, 피브로넥틴 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrant factor)가 고갈된 인간의 섬유소원을 Enzyme Research Laboratories (South Bend, IN)로부터 구입하였다. 인간의 섬유소원 αC-도메인 (잔기 Aα221-610) 에 해당하는 재조합 αC-단편 및 그 끝 부위를 자른 NH₂및COOH-말단 절반(각각 잔기 Aα221-391 및 Aα392-610)에 해당하는 변이들이 pET20b 발현 운반체를 이용하여 대장균에서 생산되었다. 인간 섬유소원 γ 사슬의 잔기 148-411 을 포함하여 이루어지는 그 재조합 γ-모듈은 동일 발현 운반체를 사용하여 대장균에서 생산되었다.

소의 트롬빈 (1,000 NIHu/mg), 아프로티닌 (4.4 TIU/mg), 항토끼IgG-양고추냉이 접합체 및 플루오레세인(fluorescein) 이소티오시아네이트(FITC)를 시그마(Sigma)에서 구입하였다. 재조합 인자 XIII는 Zymogenetics, Inc. (Seattle, WA)로부터 기증되었다. 합성 티모신 ß4 는 Regenerx Biopharmaceuticals, Inc. (Bethesda, MD)로부터 기증되었다. 항-티모신 ß4 혈청은 출판된 방법에 따라 제조되었다.

XIII인자의 활성화.

15 M NaCl (TBS)이 들어있는 pH 8.0 의 25 mM 트리스 버퍼내의 XIII 인자는 트롬빈 또는 CaCl₂로 활성화 시켰다; 후자는 섬유소원을 활성화시킬 가능성이 있는 트롬빈의 존재를 피하기 위해 만들어졌다. 트롬빈에 의해 활성화된 FFXIII [FXIIIa(THr)] 는 소의 트롬빈을 최종 농도가 25 NIH u/ml 및 2.5 CaCl₂ mM 이 되도 록 첨가하여 만들어졌다. Ca² ⁺에 의해 활성화된 트롬빈 [FXIIIa(Ca)]은 CaCl₂ 를 최종농도 50 mM 이 되도록 첨가하여 만들어졌다. 두 혼합물 모두에서 FXIII의 최종 농도는 1.5 mg/ml이었다; 두 혼합물 모두 실험전에 상온에서 10분간 놓아두었다.

티모신 ß4를 FITC 로 표지

형광 표지된 티모신 ß4가 플루오레세인 이소티아시아네이트(FITC)와의 반응에 의해 제조되었다. 티모신 ß4는 NAP5 Sephadex G-25 컬럼 (Amersham Biosciences)에서 겔-여과에 의해 pH 9.5의 0.1 M NaHCO₃ 버퍼에 옮겨졌고 이어서 1.2 몰의 과량의 FITC 첨가 및 그 혼합물을 암소에서 37℃로 2시간동안 항온 보관하였다. 반응하지 않은 FITC는 NAP5 컬럼으로 제거하였다. 표지의 정도는 기술된 분광광도계에 의해 티모신 ß4 몰당 FITC 0.9 몰로 측정되었다.

고체상 결합 분석

FXIIIa의 존재 또는 비존재하에서, 티모신 ß4 과 섬유소(또는 섬유소원) 및 그것의 단편들간의 상호작용이 플라스틱 마이크로리터 판을 이용한 ELISA에 의해 연구되었다. 마이크로리터 판의 구멍(well)은 -4 ℃에서 하루밤동안 섬유소원 또는 섬유소 10 ㎍/ml으로 또는 재조합 단편 20 ㎍/ml 으로 코팅되었고, 이는 모두 pH 8.3의 0.1 M NaHCO₃ 버퍼내에서 수행되었다. 섬유소는 10 ㎍/mL의 섬유소원, 1 NIH u/ml의 트롬빈 및 400 u/ml 아프로티닌을 포함하는 혼합물을 구멍(well)에 첨가함으로써 만들어졌고, 이후 +4℃에서 하룻밤 동안 항온 보관하였다. 그 후 그 구멍(well)들은, 37℃ 에서 1 시간동안 Super Blocker(Pierce)에서 항온 보관함으로써 블락되었다. 뒤이어서 0.05% Tween-20 (TBS-Tween)를 포함하는 TBS로 세척하였고, 티모신 ß4, FXIII, FXIIIa(Thr) 및 FXIIIa(Ca)를 지시된 농도로 구멍(well)에 첨가하고 2-2.5 시간 동안 37℃에서 항온 보관하였다. 결합된(삽입된) 티모신 ß4는 토끼 항-티모신 ß4 혈청 및 퍼악시데이즈-결합된 항-토끼 IgG와의 반응에 의해 검출되었다. 티엠비 마이크로웰 퍼악시데이즈 기질(TMB Microwell Peroxidase Substrase)이 구멍(well)에 첨가되었고, 삽입된 티모신 ß4가 분광 광도계에 의해 450 nm에서 측정되었다.

티모신 ß4의 섬유소원 및 섬유소에의 삽입

FITC-표지된 그리고 표지되지 않은 티모신 ß4의 섬유소원 및 섬유소에로의 삽입 반응은 2.5 mM CaCl₂를 갖는 100 ㎕ TBS 내에 3 mg/mL (9㎛)의 섬유소원 및 150 ㎍/L (30 ㎛)의 티모신 ß4 또는 FITC-표지된 티모신 ß4의 혼합물을 포함하는 에펜도르프 튜브에서 수행되었다. 그 반응은 FXIIIa(Ca) 또는 FXIIIa(Thr)를 최종농도 30 ㎍/mL로 첨가함으로써 개시되었다. FXIIIa(Thr)를 포함하는 혼합물에서의 트롬빈의 최종농도는 2.5 NIH u/mL로 만들어졌는데, 이는 육안 관찰 가능한 섬유소 덩어리를 급속히 형성하는 데 충분하다. FITC-표지된 티모신 ß4와의 반응은 암소 에서 37℃ 로 4시간동안 지속되었고 5분동안 끊는 물에서 섬유소원 및 섬유소가 변성되고 침전되는 효소의 열에 의한 비활성화에 의해 중단되었다. 그 펠릿을 원심분리하고 TBS로 3번 세척후 용해시켰다. 용해된 펠린내의 섬유소(또는 섬유소원) 및 FITC-표지된 티모신 ß4 의 양은 분광광도계로 흡수 몰 계수 각각 E₂₈₀ _,1% = 15.0 및 ß₄₉₅ = 72,000 M^-1cm^-1에 의해 측정되었다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿에 의한 분석을 위해 표지되지 않은 티모신 ß4를 갖는 샘플을 제조하기 위해, 지시된 시간동안 반응 화합물을 상기 기술한대로 열에 의해 비활성화시켰고, SDS 및 환원제를 포함하는 샘플 버퍼(인비트로겐)에 의해 용해되었다.

동역학 분석

티모신 ß4를 다른 섬유소(또는 섬유소원) 단편들에 삽입시키는 동역학을 분석하기 위해, 마이크로리터 판의 구멍(well)에 고정시키고(모든 단편들의 농도가 20 ㎍/mL인것을 제외하고는, 상기 기술한 대로), 여러 농도의 티모신 ß4와 함께 10 ㎍/L 의 트롬빈에 의해 활성화된 XIIIa 인자의 존재하에서 항온 보관하였다. 혼합물의 은 이오드아세트아마이드(iodacetamide)를 최종 농도 10 mM이 되도록 첨가하여 항온 보관 한시간동안 매 15 분 억제되었다. 각각의 시간에 삽입된 티모신 ß4 는 상기 기술된 토끼 항-티모신 ß4 혈청에 의해 탐침되었다. 티모신 ß4의 다른 농도에서의 삽입 반응의 최초 속도(V)는 반응 시간 경과 플롯의 기울기로부터 결정되었고 탄젠트 α = A₄₅₀/t (분)로서 표현되고, 이때, A₄₅₀은 삽입된 티모신 ß4의 양에 비례하는 광학 유닛 (o.u) 내에서 450 nm에서의 흡수이다. 겉보기(apparent) 마이클리스 상수(Michaelis constants) K_m은, 라인위버-버르크 플랏 (Lineweaver-Burk plots), 1/V (분/o.u.) 대 1/[S](㎛^-1)에 의해 얻어지는데, 이때 [S] 는 티모신 ß4의 농도이다.

웨스턴 블럿 분석

섬유소(또는 섬유소원) 및 그것의 단편들에 삽입된 티모신 ß4 의 탐지는 다음과 같이 수행되었다. 상기 기술된대로 제조된 샘플을 전기영동하고 상기 기술된대로 나이트로셀룰로스 막 (인비트로겐)에 전기이동하였다. 그 막은 카세인 블록커로 한 시간 동안 막아놓았고, 티모신 ß4가 토끼 항-티모신 ß4 혈청 및 페록시데이즈-접합된 항-토끼 IgG와의 반응에 의해 탐지되었다. 페록시데이즈로 표지된 단백질 밴드의 가시화는 수퍼시그널 웨스트 피코 화학발광 기질을 사용하여 제작자가 권고한 절차에 따라 수행하였다.

엘리사로 탐지된(LISA-detected) 티모신 ß 4 의 섬유소원 및 섬유소에로의 삽입

XIIIa 인자가 티모신 ß4의 피브 (또는 섬유소원)으로의 교차결합을 매개할 수 있는지 시험하기 위해, 그리고 그러한 교차 결합의 기작을 규명 하기 위해 우리는 재조합 XIII 인자의 존재 및 비존재하에서 티모신 ß4 와 섬유소원 및 섬유소의 상호작용에 대해 직접적인 연구를 수행하였다. XIII 인자의 혈소판 형태에 상응하는 혈장 XIII 인자와는 달리 재조합 인자는 두개의 서브유닛(a₂)을 포함하여 이루어진다는 점을 주의해야 한다.

엘리사 실험에서, 150 ㎍/mL (30 ㎛)의 티모신 ß4 가 고정된 섬유소원과 함께 항온 보관되었을 때, 비활성된 XIII 인자의 존재하에서 뿐 아니라, XIII 인자가 비존재할때 오직 적은 신호만이 관찰된 것은 그들간의 상호작용이 있더라도 아주 약하다는 것을 암시해준다. 티모신 ß4가 비활성화된 XIIIa 인자의 존재 또는 비존재하에서 고정된 섬유소원과 함께 항온 보관되었을 때, 그것은 구멍(well)내에서 섬유소원이 섬유소로 변화되는 것을 막기 위해, CaCl₂의 첨가에 의해 활성화되는데, 신호가 상당히 증가하는 것은 XIIIa 인자가 티모신 ß4의 섬유소원에로의 결합(삽입)을 매개한다는 것을 암시한다. 삽입수준이 섬유소원에로의 것보다 더 높다는 것을 제외하고는 비슷한 상황이 고정된 섬유소에서 관찰되었다. 두 경우 모두에서 삽입은 투여량에 의존한다. 섬유소에로의 삽입은 XIII 인자가 Ca² ⁺대신에트롬빈에 의해 활성화되었을 때 더 증가한다. 그러한 차이점은 이들 두개의 XIIIa 인자 종류의 다른 특정한 활성에 기인한 것일 수 있다. 이러한 결과는 활성화된 XIII가, 조직 트랜스글루타메이즈와 비슷하게, 티모신 ß4의 섬유소원 및 섬유소에로의 삽입을 매개하는 것을 나타낸다. 그들은 또한 티모신 ß4 과 섬유소원 및 섬유소 모두에서 상당한 비공유 상호작용이 없다는 것을 암시한다.

티모신 ß4의 섬유소원 및 섬유소에로의 삽입의 더 이상의 분석

XIIIa 인자에 의해 매개되는 티모신 ß4의 섬유소(또는 섬유소원)에로의 삽입을 더 규명하기 위해, 트롬빈, XIII 인자, 티모신 ß4 및 섬유소의 혼합물이 다른 시간 지점에서 면역블롯에 의해 분석되었다. 분석을 위한 그 혼합물 및 샘플은 실험 절차에서 기술된 바에 따라 제조되었다. 샘플은 나이트로셀룰로스 막에 전기이동되어 항-티모신 ß4 혈청에 의해 탐침 되었다. 고정의 결과는 XIIIa 인자가 조직 트랜스글루타메이즈처럼 티모신 ß4를 섬유소로 공유적으로 삽입시킨다는 것을 나타내고 삽입된(교차 결합된) 티모신 ß4가 4시간 후에 포화되는 것처럼 보인다. 이 시간은 삽입 정도를 평가하기 위해 선택되었다. 이 목적을 위해 티모신 ß4가 FITC 발색단기로 표지되었고 이는 섬유소원/티모신 ß4 및 섬유소/티모신 ß4 혼합물들내에서 직접 측정을 가능하게 하였다. 그러한 변형은 웨스턴 블럿 분석에 의해 나타난 삽입 패턴에 기반하여 섬유소원 또는 섬유소로의 삽입에 영향을 미치지 않는다. FITC-표지된 티모신 ß4 이외에는 상기와 비슷한 혼합물이 4시간 동안 항온 보관되었고, 그 후 분광 광학적으로 결정된 각각의 샘플 내의 섬유소(또는 섬유소원) 및 삽입된 FITC- 티모신 ß4 에 의해 기반하여 그 삽입 정도가 평가되었다. 그 결과는 선택된 조건에서 섬유소원(9 ㎛), XIIIa 인자의 생리적인 농도에서 상당한 양의 FITC- 티모신 ß4이, 섬유소원 및 섬유소 몰당 각각 약 0.2 및 0.4 몰 이 삽입된다는 것이 드러났다.

티모신 ß 4 의 각각의 섬유소(또는 섬유소원) 사슬로의 삽입

세 개의 섬유소(또는 섬유소원) 사슬 중 어느 것이 티모신 ß4과의 교차 결합에 관여하는 지를 밝히기 위해, 우리는 티모신 ß4의 존재 및 비존재하에서, XIIIa 인자에 의해 매개된 섬유소원 및 섬유소의 교차결합을 시간의 경과에 따라 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 섬유소 XIIIa 인자가 γ 사슬의 COOH-말단 부분을 급격히 교차 결합시켜 γ-γ 이량체를 만들고, α 사슬의 교차결합에 의해 α-α 이량체를 형성하는 반응이 뒤를 있는 다는 것이 잘 알려져 있다; 섬유소원은 비슷한 방법으로 교차 결합하지만, 속도가 매우 느리다. 환원 조건에서 SDS-PAGE 에 의해 분석되었을 때 섬유소원 및 섬유소 Aα, Bß, γ 및 α, ß, γ의 폴리펩티드 사슬의 각각에 상응하는 밴드는 좋은 해상도로 나타난다. 섬유소원을 XIIIa 인자와 함께 항온 보관하면, γ-γ 이량체들 및 Aα-Aα 이량체들 및 삼량체들에 해당하는 밴드의 점진적이 고갈이 일어난다; 아마도 Aα 중합체들에 상응하는 것인 몇몇 물질의 출발 위치에서의 출현이 관찰되었다. 섬유소원이 티모신 ß4의 존재하에서 XIIIa 인자와 함께 상온 보관되면. 각각의 사슬 및 그들의 교차 결합된 변이들에 상응하는 밴드의 강도에서 실질적인 차이가 발견되지 않는다. 섬유소를 이용하여 비슷한 결과를 얻었는데, 그것의 α 및 γ 사슬의 교차 결합이 예상한 대로 더 급격히 일어났다는 점이 다르고 출발시의 물질의 양이 더 많았다. 뒤이은 웨스턴 블럿 실험에서는 항온 보관 30 분 후에 상당한 양의 티모신 ß4가 섬유소원 Aα 사슬로 삽입되었고 항온 반응 150 분후에는 몇몇 티모신 ß4가 또한 Aα-Aα 이량체로 삽입되었다. 티모신 ß4 의 섬유소 α 사슬 및 α-α 이량체로의 삽입은 항온 보관 150 분 후에 훨씬 더 급격히 일어났다. 티모신 ß4의 물질도 α사슬(α중합체)의 더 높은 분자량 형태로 관찰되었다. 이 결과들은 섬유소원 Aα 및 섬유소 α사슬이 티모신 ß4의 공유 결합에 의한 삽입의 주요 장소를 포함한다는 것을 의미한다. 동시에 150 분 이후에 γ-γ 및 α-α 이량체들의 이동성 사이의 이동성을 갖는 낮은 강도의 밴드의 출현은, 티모신 ß4가 또한 섬유소 γ사슬 (γ-γ 이량체) 에로 삽입될 수 있다는 것을 암시한다. 선택적으로, 이 밴드는 α-α 이량체의 단백질 분해에 의해 끝쪽이 잘린 변이에 상응할 수 있다.

티모신 ß4의 재조합 섬유소(또는 섬유소원) 단편들에로의 삽입

αC 도메인 및 γ-모듈을 형성하는 섬유소원 Aα 및 γ 사슬의 COOH-말단 단백질들이 반응성의 Gln 및 Lys 잔기를 포함하고 있다는 것은 확립되어 있는 사실이다. 그 잔기들은 섬유소에서 XIIIa 인자에 의해 교차 결합되어 있고, 그러므로 티모신 ß4와의 교차 결합에 관여할 가능성이 있었다. 이것을 시험하고 티모신 ß4 내에서의 섬유소(또는 섬유소원)의 위치를 더 알아보기 위해 티모신 ß4의 재조합 γ-모듈 (잔기 γ 148-411) 및 αC-도메인 (Aα221-391 및 Aα392-610) 서브-단편들의 삽입을, SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿팅에 의해 분석하였다. C-도메인 및 γ-모듈을 티모신 ß4의 존재하에서 XIIIa 인자와 함께 항온 보관하면 효과적인 교차 결 합이 일어나고 그들의 더 높은 분자량 형태, 이량체들, 삼량체들, 올리고머등이 출현한다. 동시에, 수용자 Gln 및 제공자 Lys 잔기를 주로 포함하는 Aα221-391 및 Aα392-610 서브-단편들의 교차결합은 훨씬 덜 효과적이다. 샘플들이 나이트로셀룰로스 막으로 전기 이동되고 항-티모신 ß4 혈청으로 탐침될 때, 상당한 양의 티모신 ß4가 αC-도메인, γ-모듈 및 그들의 더 높은 분자량 변이들, 이량체들, 삼량체들, 올리고머들에서 탐지되었다. Aα392-610 서브-단편 단량체 및 올리고머들에의 삽입은 또한 오직 매우 적은 양의 티모신 ß4가 Aα221-391 올리고머들에서 탐지될 때에도 상당하다. 이들 결과들은 티모신 ß4가 αC-도메인 및 γ-모듈에 둘 다 모두에 교차 결합될 수 있다는 것과, 전자의 Aα392-610 부위의 반응성의 Lys 잔기가 교차 결합에 관여한다는 것을 시사한다.

상기 관찰은 ELISA에 의해 확인되었다. XIIIa 인자의 존재하에서 티모신 ß4가 부착된 γ-모듈 또는 αC-도메인 변이들과 함께 상온 보관되면, 그것은 γ-모듈 및 αC-도메인 및 Aα392-610 서브-단편으로 효과적으로 삽입되는 반면, Aα221-391에로의 삽입은 매우 느리다. 여기서 모든 농도의 연구에서 γ-모듈의 삽입은 αC-도메인 변이들의 삽입보다 거의 두 배정도로 낮다는 것을 주의해야 한다. 티모신 ß4가 활성화되지 않은 XIII 인자의 존재하에서 또는 그것이 없을 때, 동일한 종류의 부착된 것과 함께 항온 보관되면, 모든 경우에서 삽입은 매우 느리다. 이것은, 섬유소원 및 섬유소의 경우에서와 같이, 티모신 ß4 및 재조합 단편들 간에 상당한 비공유결합성 상호작용이 없다는 것을 시사한다.

섬유소의 γ 사슬의 XIIIa 인자에 의한 교차 결합이 겉보기의(apparent) 마이클리스 행동을 보인다는 것은 이미 밝혀져 있다. 티모신 ß4를 부착된 γ-모듈 및 αC-도메인 변이들을 교차 결합시킬때 XIIIa 인자가 마이클리스 효소로서 행동한다고 가정한다면, 그러한 교차-결합의 동태적 변수들을 결정할 수 있을 것이다. 동태적 데이터들의 분석은 삽입 반응에 대한 하기의 겉보기 마이클리스 상수들이 (Michaelis constants) (K_m), 티모신 ß4의 γ-모듈로의 삽입에 대해 183 + 29 ㎛, 및 αC-도메인 및 그것의 Aα392-610 서브-단편 각각으로의 삽입에 대해 17.6 + 2.5 ㎛ 및 8.6 + 3.7 ㎛ 인것을 밝혔다. αC-도메인 및 그것의 서브-단편에 대한 값보다 γ-모듈에 대해 훨씬 높은 값의 K_m 을 보인 것은 티아민 ß4가 αC-도메인에 훨씬 더 효과적으로 교차 결합한다는 것을 보여준다. 이 점에서, Aα392-610 단편의 K_m은 XIIIa 인자에 의해 매개된 γ-γ 교차 결합에 대해 이미 결정된 K_m = 6.2 ㎛ 에 필적한다. K_m 값의 αC-도메인 및 Aα392-610 서브-단편에 대한 두배의 차이점은 티모신 ß4 및 Aα392-610 부위의 반응성의 Gln 잔기간의, 즉 αC-to-αC 및 티모신 ß4-to-αC 교차 결합간의 경쟁에 의해 설명될 수 있다. αC-도메인 및 Aα392-610 서브-단편의 이중 역수 플롯(double-reciprocal plot)은 경쟁적 억제에 특징적인 패턴을 보인다.

전체적으로, 그 결과는 XIIIa 인자는 티모신 ß4를 잔기 Aα392-610를 포함하는 분리된 αC-도메인의 COOH-말단 부분에 효과적으로 교차 결합시킨다는 것과, 분리된 γ-모듈로의 삽입은 덜 효과적이고, 섬유소원 또는 섬유소에서 그 삽입은 주로 αC-도메인들에서 일어난다는 것을 나타낸다.

섬유소(또는 섬유소원)은 생리적으로 활성 있는 단백질들 및 세포 수용체들과의 상호작용을 통하여 상처치유에 중요한 역할을 한다. 특히, 섬유소 매트릭스는 염증 반응과 내피 세포들에 의해 모세 시험관 형성(혈관생성)을 자극하는데, 이것은 상처 치유 과정에서 각각 백혈구 인테그린 Mac-1 및 내피 세포 수용체 VE-카드헤린(cadherin)의 상호작용을 통하는 필수적인 단계이다. 그것은 또한 기본적인 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 혈관의 내피 성장 인자(VEGF)와 높은 친화성으로 상호 작용하여 혈관생성에 대한 이들 강력한 자극원들이 섬유소 침착 장소에 같이 위치시키도록 하고 그들의 상처치유를 하게한다. 섬유소는 또한 인슐린 유사의 성장 인자 결합 단백질-3 (IGFPB-3)을 보유할 수 있는데, 이것은 IGF-1와 복합체를 형성한다. 강력한 진통 및 상처치유 인자인 티모신 ß4는 또한, 조직 트랜스글루타메이즈에 의해 섬유소에 삽입될 수 있고, 섬유소 매트릭스의 상처치료 가능성을 증가시키는 것으로 보인다.

비록 모든 트랜스글루타메이즈들이 동일 반응, 반응성의 Gln 및 Lys 잔기간의 γ-글루타밀-ε-라이실 이소펩티드의 공유 결합의 동일 형성에 대해 촉매작용을 하지만, 그들의 기질 특이성은 다를 수 있다. 예를 들면, XIIIa 인자, 플라즈마 트랜스글루타메이즈가 섬유소에서 γ 밑 α 사슬을 특이적으로 교차 결합시켜 각각 γ-γ 이량체들 및 α-중합체들을 만들지만, 조직 트랜스글루타메이즈 덜 특이적이 고 또한 α-γ 사슬 교차 결합을 발생시킬 수 있다. 세린 프로티에이즈 억제제 (세르핀(serpin))인 PAI-2의 섬유소(또는 섬유소원)에의 교차 결합 패턴 또한 조직 트랜스글루타메이즈 및 XIIIa 인자에 대해 다르다는 것이 발견되었다. 원래 티모신 ß4 가 섬유소에 기니 피그 간 조직 트랜스글루타메이즈에 의해 삽입된다는 것이 보여졌다; 그것의 섬유소에의 XIIIa 인자에 의한 삽입은. 트롬빈에 의해 활성화된 혈소판이 XIII 인자 및 티모신 ß4를 공동 방출한다는 것 및 후자는 섬유소에 교차 결합되는 사실에 기반하여 가설화되었다. 이 연구에서 티모신 ß4가 XIIIa 인자에 의해 섬유소원 및 섬유소 둘 다에 삽입된다는 것이 직접 증명되었다. 또한, 삽입의 정도는 꽤 높아 섬유소원 및 섬유소 각각의 몰에 대해 티모신 ß4의 0.2 및 0.4 몰임이 발견되었다. 혈장 내에서 섬유소원의 농도가 약 9 ㎛이기 때문에, 섬유소 침착되는 장소에서의 섬유소의 국지 농도가 훨씬 더 높아야 한다. 티모신 ß4 가 0.1 nM-1 ㎛ 에서 그것의 혈관생성을 돕는 활성을 나타내는 것을 고려해볼 때, 그러한 정도의 삽입은 명백하게 생리적으로 의미가 있고 섬유소 덩어리의 상처치유 가능성을 증가시키기에 충분하다.

XIIIa 인자가 섬유소, 많은 혈장 단백질들, α₂-앤티플라즈민, PAI-2, 피브로넥틴, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrant factor)를 섬유소에 삽입시킨다는 것이 알려져 있다. 삽입 기작은 오직 그들 중 몇몇에 대해서만 밝혀져 있다. 예를 들면, 피브로넥틴은 비공유 XIIIa 인자에 공유적으로 교차 결합하기 전에 높은 친화성을 가지고 비공유적으로 섬유소의 αC-도메인 에 결합한다; 각각의 단백질에서 인식부위 및 반응성의 Gln 및 Lys 잔기는 다른 부위에 위치하여 교차 결합 장소의 적절한 배향을 제공한다. 또한, XIIIa 인자는 αC-도메인들과 상호 작용하여 그 작용의 특이성을 더 증가시킨다. 티모신 ß4의 비공유성 결합이 그것의 섬유소에로의 교차 결합에 선행하는지를 시험하기 위해, 활성화되지 않은 XIII 인자의 존재 또는 비존재하에서 그것의 부착된 섬유소원 및 섬유소과의 상호작용을 연구하였다. 섬유소에 높은 친화성을 보이는 bFGF 및 VEGF등의 다른 혈관 형성을 돕는 인자들과는 달리, 모든 경우에서 티모신 ß4와의 비공유결합성 상호작용이 눈에 띄지 않았다. 활성화된 XIIIa 인자의 존재하에서만 삽입이 관찰된 것은 공유 교차 결합이 섬유소 덩어리에서 티모신 ß4를 보유하는 유일한 기작일지도 모른다는 것을 시사한다.

그 결과는 티모신 ß4가 XIIIa 인자에 의해 분리된 γ-모듈 및 αC-도메인 변이들에 삽입될 수 있지만, 섬유소(또는 섬유소원)내에서는 그것은 주로 αC-도메인, 즉 그들의 Aα392-610 부위에 교차 결합된다는 것을 나타낸다. 티모신 ß4 및 섬유소(또는 섬유소원)에서 알려진 반응성의 Lys 및 Gln 잔기의 분포 분석은 이러한 발견에 대한 합리적인 설명을 가능케 한다. 티모신 ß4는 반응성의 아민 공여자, Lys38, 및 두개의 아민 수용체, Gln23 및 Gln36를 포함하는데, 이들은 다른 단백질들과의 교차 결합에 관여할 수 있다. 분자간 γ-γ 교차 결합에 관여하는 γ 사슬 내에는 두개의 반응성 잔기, Gln398 (or GIn399) 및 Lys406 만이 있는데, 이들은 둘다 γ-모듈에 위치한다. 분리된 γ-모듈을 XIIIa 인자로 처리하면, 교차 결합이 임의적으로 일어나서, 이량체들, 삼량체들/올리고머가 만들어지는 것으로 보인다; 티모신 ß4는 이들 모든 종류에 삽입된다. 섬유소에서, 이들 부위는 DD:E 상호작용에 의해 역평형의 방법으로 정렬되어 하나의 사슬의 Gln398/399 및 다른 사슬의 Lys406 간의 교차 결합을 촉진하여 이량체들을 형성한다. 이 교차 결합 반응의 효율성은 이 잔기들 및 티모신 ß4 간에서 보다 훨씬 더 높고, 그래서 티모신 ß4가 섬유소 γ사슬에 삽입되는 것이 이 연구에서 전혀 또는 거의 발견되지 않았다는 것은 놀라운 일이 아니다.

γ 사슬에서와는 달리, Aα 사슬은 여러 반응성 클루타민 및 라이신 잔기를 포함한다. 하기 잔기들이 섬유소의 α 사슬들간 또는 재조합 αC-도메인들, Gln221, 237, 328 및 366, 및 Lys508, 539, 556, 580 및 601들 간의 교차 결합에 관여한다는 것이 발견되었다. Lys303 의 Aα 사슬은 XIIIa 인자에 의해 매개된 세르핀 α₂-앤티플라즈민을 섬유소(또는 섬유소원)에로의 교차 결합에서 아민 공여자로서 작용한다는 것이 나타났다. 이 라이신은 또 다른 세르핀인 PAI-2에 대해 반응하지 않는데, 그것은 조직 트랜스글루타메이즈 및 XIIIa 인자에 의해 다른 Aα 사슬 라이신 잔기들, 148, 176, 183, 230, 413 및 457을 통해 교차 결합된다. α₂-앤티플라즈민의 교차 결합 부위를 모방한 합성 펩티드를 사용한 연구에 의해 그것이 총 활성의 78%를 담당하는 12 개의 반응성 라이신 잔기, 라이신418, 448, 508, 539, 556 및 580를 통해 섬유소 α 사슬에 삽입되고, 반응성이 덜한 라이신 208, 라이신219 및/또는 224, 라이신427, 429, 601 및 606 를 통해 섬유소 α 사슬에 삽입된다는 것이 밝혀졌다. 섬유소(또는 섬유소원) Aα368-610 부위 내에 최소한 10 개의 라이신 잔기가 피브로넥틴과의 교차 결합 반응에 관련되었다. 상기 분석은 섬유소내의 확인된 반응성의 잔기 대부분이 그것의 αC-도메인들에 위치하고, 티모신 ß4가 우선적으로 교차 결합되는 αC-도메인의 392-610 부위는 최소한 11개의 반응성 라이신 잔기를 포함하며, 이중에서 오직 반의 잔기만이 α-α교차 결합에 이용된다는 것을 밝혔다. 또한, 비록 티모신 ß4가 α-α교차 결합에 관여하는 반응성의 라이신 잔기를 위해 경쟁하지만, 그들의 분자간의 αC-도메인에의 교차 결합이 독립적으로 일어날 수 있어서 섬유소로의 효율적인 삽입을 제공할 수도 있다는 것이 시사되었다. 그래서 그 αC-도메인의 반응성의 라이신 잔기는 α-α 교차 결합을 도울 뿐 아니라 동시에 섬유소 매트릭스의 속성을 조절할 수 있는 티모신 ß4를 포함한 생리적으로 활성 있는 단백질들에 편의를 제공해서, 상처치유 및 다른 생리적 및 병리적 공정에 기여할 수 있다.

섬유소원은 다른 세포들에 쉽게 부착하는 덩어리를 만들기 위해 조절가능한 방식으로 중합화하고 비면역원성 및 생분해성이다. 이것은 출혈을 중지시키기 위한 지혈제로서 그리고 조직 실링 및 상처 치유를 위해 많은 외과 수술에서 점점 더 많이 사용되고 있는 이상적인 지혈제 및 생 접착제 (섬유소 실런트)가 되도록 하였다. 상처치료 및 다른 치료에서 섬유소 실런트의 사용은 생 활성 제제를 포함함으로써 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 이것은 세포 및 동물모델에서 섬유소가 항생제 및 성장 인자들의 특정지역에의 전달을 위한 운반체로서 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 섬유소에 의해 캡슐에 싸인 항생제가 낮은 용해성 때문에 천천히 방출되는 반면, 성장 인자를 섬유소 실런트내에 보유는 그것의 섬유소과의 높은 친화성 상호작용에 의해, 또는 그들의 직접적인 공유 교차 결합에 의해 달성된다. 티모신 ß4가 XIIIa 인자로 교차 결합에 의해 섬유소(또는 섬유소원)에 삽입되는 능력은 섬유소 실런트에 그것을 부착하는 데에 사용될 수 있다. 이 연구는 섬유소원 및 섬유소에로의 그러한 삽입이 둘 다 높은 효율임을 보였고, 이것을 이러한 접근을 지지한다.

요약하면, 실험 연구는 생 활성 펩티드인 티모신 ß4 는 XIIIa 인자에 의해 섬유소에 공유결합적으로 교차결합되어 삽입된다는 것을 확인하였고, 그것의 구성 요소의 생리적인 농도에서 섬유소원 및 섬유소 둘 모두에 높은 효율로 삽입되는 것을 보였고, 섬유소(또는 섬유소원) αC-도메인들의 Aα392-610 부위 내에 삽입 장소를 특정하였다. 실험데이터는 생리적으로 의미있는 양의 티모신 ß4가 상처 치유 장소로 이동하기 위해 섬유소 실런트로 삽입되는 것을 지지한다.

조직 트랜스글루타메이즈 및 추측상 혈장 트랜스글루타메이즈, XIIIa 인자가 섬유소(또는 섬유소원) 및 생리적으로 활성 있는 펩티드인 티모신 ß4 에로 공유적으로 삽입될 수 있다. 이 삽입의 기작을 규명하기 위해 티모신 ß4 와 섬유소원, 섬유소, 및 그들의 재조합 단편들, γ-모듈 (γ 사슬 잔기 148-411), 및 αC-도메인 (Aα 사슬 잔기 221-610) 및 그것의 끝이 잘린 변이들과의 상호작용이 면역블럿 및 ELISA 에 의해 연구되었다. 활성화된 XIII 인자가 없는 경우에 그들간의 비공유적인 상호 작용이 탐지되지 않는 반면, 그것이 존재하는 경우에는 티모신 ß4가 섬유소로 효과적으로 삽입되었고 더 적은 양이 섬유소원으로 삽입되었다. 섬유소(또는 섬유소원) 및 XIII 인자의 생리적인 농도에서 삽입된 경우 티모신 ß4 대 섬유소원 및 섬유소의 몰 삽입 비율이 각각 0.2 및 0.4로 상당항 양이었다. 더 이상의 실험에서는, 비록 활성화된 XIII 인자가 티모신 ß4를 분리된 γ-모듈 및 αC-도메인에 삽입시켰지만, 섬유소에서 후자가 주요 삽입 장소로서 역할을 하였다는 것을 밝혔다. 이 장소는 잔기 392-610를 포함하는 αC-도메인의 COOH-말단 부분으로 더 특정되었다.

Claims

접착제 및 아미노산 서열 LKKTET 또는 그것의 보존성 변이를 포함하여 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 실질적으로 정제된 조성물을 포함하여 이루어지는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 접착제가 생물의 조직에 부착할 수 있는 것인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 접착제가 생분해 가능한 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 접착제가 섬유소(fibrin), 섬유소원(fibrinogen), 피브린 글루(fibrin glue), 콜라겐, 그것의 단편, 또는 그것들의 혼합물인 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 접착제 및 상기 폴리펩티드가 서로 공유 결합으로 결합되어 있는 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 접착제 및 상기 폴리펩티드가 XIIIa 인자에 의해 공유결합으로 결합되어 있는 것인 조성물.
제6항에 있어서, 상기 접착제가 섬유소 또는 섬유소원의 단편인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 아미노산 서열 KLKKTET 또는 LKKTETQ, 티모신 ß4 (Tß4), Tß4의 N-말단 변이, Tß4의 C-말단 변이, Tß4의 이소폼, Tß4의 삽입된(splice)-변이, 산화된 Tß4, Tß4 술폭사이드, 림프계 Tß4 또는 페질레이티드 Tß4인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 재조합 또는 합성에 의한 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체인 것인 조성물.
제10항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 또는 모노클로날 항체인 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 농도가 상기 접착제 몰당 상기 폴리펩티드 약 0.01-1 몰의 범위 내인 것인 조성물.
제12항에 있어서, 상기 범위가 상기 접착제 몰당 상기 폴리펩티드 약 0.1-0.5 몰인 것인 조성물.
제13항에 있어서, 상기 범위가 상기 접착제 몰당 상기 폴리펩티드 약 0.2-0.4 몰인 것인 조성물.
폴리펩티드를 위치(a site)로 전달하는 방법으로서, 제1항에 기술된 조성물을 상기 위치로 도입하는 것을 포함하여 이루어지는 방법.
제15항에 있어서, 상기 조성물이 상기 위치에 스프레이에 의해 적용되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 위치가 상처인 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 접착제가 생물의 조직에 부착할 수 있는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 접착제가 생분해 가능한 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 접착제가 섬유소, 섬유소원, 피브린 글루, 콜라겐, 그것의 단편, 또는 그것들의 혼합물인 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 접착제가 상기 폴리펩티드에 공유 결합으로 결합되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 상기 접착제가 상기 폴리펩티드에 XIIIa 인자에 의해 공유 결합으로 결합되는 것인 방법.
제22항에 있어서, 상기 접착제가 섬유소 또는 섬유소원의 단편인 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 아미노산 서열 KLKKTET 또는 LKKTETQ, 티모신 ß4 (Tß4), Tß4의 N-말단 변이, Tß4의 C-말단 변이, Tß4의 이소폼, Tß4의 삽입된-변이, 산화된 Tß4, Tß4 술폭사이드, 림프계 Tß4 또는 페질레이티드 Tß4인 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 재조합 또는 합성에 의한 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체인 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 항체가 다클론 또는 단클론 항체인 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 농도가 상기 접착제 몰당 상기 폴리펩티드 약 0.1-1 몰의 범위 내인 것인 방법.
제28항에 있어서, 상기 범위가 상기 접착제 몰당 상기 폴리펩티드 약 0.1-0.5 몰인 것인 방법.
제29항에 있어서, 상기 범위가 상기 접착제 몰당 상기 폴리펩티드 약 0.2-0.4 몰인 것인 방법.