JP2008529486A - 白人個体群の個体の大多数により認識され得るエプスタイン−バーウイルスのi型及びii型潜伏期抗原のtcd4+エピトープ、及びその適用 - Google Patents
白人個体群の個体の大多数により認識され得るエプスタイン−バーウイルスのi型及びii型潜伏期抗原のtcd4+エピトープ、及びその適用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008529486A JP2008529486A JP2007553650A JP2007553650A JP2008529486A JP 2008529486 A JP2008529486 A JP 2008529486A JP 2007553650 A JP2007553650 A JP 2007553650A JP 2007553650 A JP2007553650 A JP 2007553650A JP 2008529486 A JP2008529486 A JP 2008529486A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hla
- peptide
- ebv
- molecule
- peptides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16211—Lymphocryptovirus, e.g. human herpesvirus 4, Epstein-Barr Virus
- C12N2710/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【選択図】なし
Description
- 主に中国南部及び北アメリカで見られる未分化上咽頭癌(NPC);
- ホジキン病の40〜50%。EBVとの関連は、硬結節性(scleronodular)の形(15〜30%)におけるよりも、混合細胞性(mixed cellularity)の形(50〜75%)においてより一般的である。
- ある種のT及びNKリンパ腫、特に鼻類洞性(nasosinusoidal) T/NKリンパ腫
で発生する。
a) EBNA1の位置475〜500、514〜539、及び529〜552にわたる配列であるそれぞれ26、26及び24アミノ酸のペプチド;
b) LMP1の位置68〜83にわたる配列である16アミノ酸のペプチド;
c) LMP2の位置224〜244及び372〜388にわたる配列であるそれぞれ21及び17アミノ酸のペプチド;
d) a)、b)及びc)で定義されるペプチドと同じ長さでかつ同じ位置により定義される変異形であって、a)、b)及びc)で定義される前記ペプチドの少なくとも1つのアミノ酸配列を別のアミノ酸で置換することにより得られ、HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5及びHLA-DP4から選択される少なくとも7つの異なるHLA II分子に関して1000 nMより低い結合活性を示す変異形
からなる群より選択される。
- HLA II分子結合活性:本発明によるペプチドは、白人個体群において優勢なHLA II分子の大多数に対して高い親和性を有し、よって、白人個体群における大多数の個体でのHLA II分子により提示されることができる。これらのペプチドは、白人個体群における対立遺伝子頻度が5%より大きいHLA II分子に相当するHLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5及びHLA-DP4から選択される少なくとも7つのHLA II分子について<1000 nMの結合活性を有する。結合活性は、HLA-DR分子については米国特許第6,649,169号、HLA-DP4分子についてはPCT国際出願WO 03/040299に記載された原理、並びにTexierら, J. Immunol., 2000, 164, 3177及びEur. J. Immunol, 2001, 31, 1837、及びCastelliら, J. Immunol., 2002, 169, 6928〜6934の名の下での文献に記載された原理に従って、免疫酵素学的明示(revelation)を用いるHLA II/ペプチド競合結合アッセイにより測定できる。
この実施形態の有利な態様によると、上記のペプチドは、配列番号4、5、6、11、20及び21の配列からなる群より選択される。
好ましくは、上記のポリエピトープフラグメントは、20〜1000アミノ酸、好ましくは20〜100アミノ酸の長さである。
- HLA I分子により提示され、かつEBV-特異的細胞毒性Tリンパ球により認識されるEBVタンパク質のCD8+ Tエピトープ;EBV CD8+ Tエピトープの配列は当業者に知られ、特に、LMP1のペプチド51〜60、125〜133、156〜164及び159〜167、LMP2のペプチド131〜139、200〜208、236〜244、340〜350、419〜427、426〜434、442〜451、447〜455及び453〜461を含む;
- 天然又は合成のユニバーサルCD4+ Tエピトープ、例えば破傷風毒素TTペプチド830〜846 (O'Sullivanら, J. Immunol., 1991, 147, 2663〜2669)、インフルエンザウイルスヘマグルチニンHAペプチド307〜319 (O'Sullivanら, 上記)、PADREペプチド(KXVAAWTLKAA;Alexanderら, Immunity, 1994, 1, 751〜761)、HIV 1 Nefタンパク質のペプチド45〜69、及び熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)の抗原由来のペプチド、例えばCS.T3ペプチド(Sinigagliaら, Nature, 1988, 336, 778〜780)、並びにCSP、SSP2、LSA-1及びEXP-1ペプチド(Doolanら, J. Immunol., 2000, 165, 1123〜1137)。
本発明によると、上記のポリヌクレオチドの配列は、上記のペプチド又はポリエピトープフラグメント又は融合タンパク質をコードするcDNAの配列である。上記の配列は、有利には、それが発現される宿主内でのコドン使用が最適であるように改変されることができる。
本発明の目的のために、EBVペプチドをコードする核酸配列に関する用語「異種配列」とは、上記のEBVペプチドをコードする上記の核酸配列に天然に隣接する配列以外のいずれの核酸配列を意味することを意図する。
a) 転写及び任意に翻訳のための適切な調節配列(プロモーター、アクチベータ、イントロン、開始コドン(ATG)、停止コドン、ポリアデニル化シグナル)の制御下に上記で定義される少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現カセット、及び
b) 本発明によるポリヌクレオチドを含む組換えベクター。有利には、これらのベクターは、上記で定義される少なくとも1つの発現カセットを含む発現ベクターである。
- ペプチド及びそれらの誘導体(変異形、ポリエピトープフラグメント)は、Merrifieldら(J. Am. Chem. Soc. 1964, 85: 2149-)により元々記載されたFmoc法に従って固相合成でき、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製できる、
- リポペプチドは、特に、国際出願WO 99/40113又はWO 99/51630に記載される方法に従って作製できる、
- ペプチド及び誘導体、例えば変異形、ポリエピトープフラグメント及び融合タンパク質は、当業者に知られるいずれの方法により得られる対応するcDNAから産生することもできる。cDNAは、真核又は原核発現ベクターにクローニングし、組換えベクターで改変された細胞で産生されるタンパク質又はフラグメントをいずれの適切な手段、特にアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。
アジュバントは、油性エマルジョン、鉱質物質、細菌抽出物、サポニン、水酸化アルミナ、モノホスホリルリピドA、及びスクアレンからなる群から選択されるのが有利である。
担体物質は、単層又は多層のリポソーム、ISCOM、ウイロソーム(virosomes)、ウイルス偽粒子(viral pseudo-particles)、サポニンミセル、糖類(ポリ(ラクチド-コ-グリコリド))又は天然に金を有するものである固体マイクロスフェア、及びナノ粒子からなる群より選択されるのが有利である。
本発明の目的のために、「EBV感染又は関連する腫瘍性病変の進展の診断及び監視」との表現は、EBV感染、EBV関連病変又は抗-EBV免疫療法若しくは免疫化プロトコルの経過の間のEBV-特異的CD4+ T免疫応答の評価を意味することを意図する。検出は、CD4+ T細胞を含む生体サンプル、特に末梢血サンプルから単離される単核細胞のサンプル(PBMC)を用いて行われる。
- 個体からの生体サンプルを上記で定義される診断試薬と接触させ、
- EBVのEBNA1、LMP1又はLMP2潜伏期抗原の1つに特異的なCD4+ Tリンパ球を、いずれの適切な手段により検出する
ことを含むことを特徴とする、EBV感染又は関連する腫瘍性病変の進展を診断及び監視する方法でもある。
細胞懸濁物(PBMC、CD8+細胞を欠乏させたPBMC、上記で定義されるペプチドを用いてインビトロ培養工程により予め富化させたTリンパ球、又はクローン化Tリンパ球)を、上記のペプチド、及び所望により適切な提示細胞、例えば樹状細胞、自己若しくは異種のPBMC、EBVでの感染後に得られるもののようなリンパ芽球状の細胞又は遺伝子改変細胞の存在下で3〜5日間培養する。初期の懸濁物中のEBV潜伏期抗原に特異的なCD4+ T細胞の存在は、次の方法の1つに従って、EBVペプチドにより検出される。
EBV潜伏期抗原に特異的なCD4+ T細胞の増殖は、細胞のDNAへのトリチウム化されたチミジンの取り込みにより測定される。
ELISPOTアッセイは、上記で定義されるペプチドに特異的なサイトカイン(IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及びIFN-γ)分泌T細胞の存在を明らかにすることを可能にする。このアッセイの原理は、Czerkinskyら, J. Immunol. Methods, 1983, 65, 109〜121及びSchmittelら, J. Immunol. Methods, 1997, 210, 167〜174に記載され、そしてその実施は、国際出願WO 99/51630又はGahery-Segardら, J. Virol., 2000, 74, 1694〜1703に示されている。
IL-2、IL-4、IL-5、IL-10及びIFN-γのようなサイトカインを分泌するEBV潜伏期抗原に特異的なT細胞の存在は、培養上清中に存在するサイトカインを免疫酵素学的アッセイにより、特に市販のキットを用いてアッセイするか、又はフローサイトメトリにより細胞内サイトカインを検出することにより検出される。細胞内サイトカインの検出の原理は、Goulderら, J. Exp. Med., 2000, 192, 1819〜1832及びMaeckerら, J. Immunol. Methods, 2001, 225, 27〜40に、そしてその実施は、Draenertら, J. Immunol. Methods, 2003, 275, 19〜29に示されている。
- 生体サンプル、好ましくは末梢血単核細胞(PBMC)を、可溶性HLA II分子と上記で定義されるEBVペプチドとの結合により形成される、特に蛍光色素で標識された標識マルチマー複合体と接触させ、
- 上記のマルチマー複合体で標識された細胞を、特にフローサイトメトリにより分析する。
- 細胞サンプルを、標識されたHLA II/ペプチドマルチマー複合体と、特に蛍光色素で標識されたものと接触させ、ここで該複合体は可溶性HLA II分子が上記で定義される少なくとも1つのEBVペプチドと結合することにより形成され、
- 上記のHLA II/ペプチド複合体に結合した細胞を、特にフローサイトメトリにより弁別する
を含むことを特徴とする、EBV潜伏期抗原に特異的なCD4+ T細胞を弁別する方法でもある。
- 図1は、HLA-DR1トランスジェニックマウスモデルにおける、白人個体群において優勢な12のHLA II分子に<1000 nMの親和性で結合しているEBV I型及びII型の潜伏期抗原に由来する6つのペプチドの混合物の免疫原性を示す。5匹のHLA-トランスジェニックAβ°/DR1マウス(Cocktマウス)の群を、Montanide (登録商標) Isa 720中で乳化したペプチド混合物(合計120μg)の第1の皮下注射で、次いで2週間の間隔で2回の半分の用量のブースターで免疫した。コントロール群(Teマウス)は、同じプロトコルに従って、Montanide (登録商標) Isa 720のみを受けた。最後の注射から7日後にリンパ節から抽出されたリンパ球の増殖応答を、種々の条件下での(3H)チミジンの取り込みにより測定した。A:抗原の非存在下(コントロール)又はコンカナバリンA (ConA)の範囲の存在下(48時間培養)。B:抗原の非存在下(コントロール)又はペプチド混合物の濃度の範囲の存在下(合計60、30、15又は7.5μg) (5日培養)。結果は、1分当たりのカウント数(cpm)で表す。
1) 材料及び方法
1.1) ペプチド合成
TEPITOPEソフトウェア(Sturnioloら, Nature Biotechnology, 1999, 17, 555〜561)を用いて、EBV II型潜伏期抗原(EBNA1、LMP1及びLMP2)の配列における可能性のあるクラスII HLA分子結合モチーフを選択した。対応するペプチドを、固相(Neosystem)でのパラレル合成によるFmocストラテジに従って合成し、高速液体クロマトグラフィーにより精製し(HPLC;C18カラム、Synmetry)、質量分析(ES-MS)によりコントロールした。
HLA II分子への結合のアッセイは、免疫酵素学的明示を用いる競合結合アッセイであり、その原理は米国特許6,649,169号にHLA-DR分子について、PCT国際出願WO 03/040299にHLA-DP4分子について記載され、Texierら, J. Immunol., 2000, 164, 3177及びEur. J. Immunol., 2001, 31, 1837並びにCastelliら, J. Immunol., 2002, 169, 6928〜6934の名の下での文献にも記載されている。
これらのアッセイの例は、PCT国際出願WO 02/090382、WO 03/040299及びWO 2004/014936に示される。
フランス人個体群において最も豊富であり、対立遺伝子頻度が白人個体群に特徴的な12個のHLA II分子(10個のHLA-DR分子及び2個のHLA-DP分子)を選択した。
* β鎖がDR1遺伝子によりコードされているHLA-DR分子
これらは、β鎖がDRB1遺伝子座の対立遺伝子によりコードされているHLA-DR1、-DR3、-DR4、-DR7、-DR11、-DR13及び-DR15分子であり、その頻度はフランス人個体群において5%を超え:DRB1*0101 (9.3%)、DRB1*0301 (10.9%)、DRB1*0401 (5.6%)、DRB1*0701 (14%)、DRB1*1101 (9.2%)、DRB1*1301 (6%)及びDRB1*1501 (8%)、それら自体で個体群の64%を表す。これらの同じ対立遺伝子は、別の白人個体群において最も豊富なHLA-DR対立遺伝子である。それらの頻度は、53% (スペイン)と82% (デンマーク)の間である。米国及びカナダについて、これらは、個体群のDR対立遺伝子のそれぞれ58%及び55%を表す。
これらは、フランス人個体群において最も一般的な対立遺伝子によりβ鎖がコードされているHLA-DRB3、-DRB4及び-DRB5分子である:HLA-DRB3*0101 (9.2%)、HLA-DRB4*0101 (28.4%)及びHLA-DRB5*0101 (7.9%)。これらの分子は、それら自体で対立遺伝子頻度の45%をカバーする。
これらは、DPB1*0401及びDPB1*0402対立遺伝子によりコードされる分子を一緒に群にするHLA-DP4分子である。これらのDP4分子は、欧州及び米国で最も豊富なHLA II分子である。それらの対立遺伝子頻度は、それぞれ実際には40%及び11%であり、このことは、それらのいずれかが個体の約76%で見出されることを意味する。タンパク質配列に存在するので、これらの分子全てに結合するペプチドは、よって、個体群の大多数のCD4+ Tエピトープを含む。
HLA II分子は、エプスタイン−バーウイルス(EBV)で形質転換されたヒトBリンパ球の種々の同型接合系統から免疫親和性により精製される;すなわち、HOM2 (DRB1*0101, DPB1*0401)、SCHU (DRB1*1501, DRB5*0101, DPB1*0402)、STEILIN (DRB1*0301, DRB3*0101)、PITOUT (DRB1*0701, DBR4*0101, DPB1*0401)、SWEIG (DRB1*1101)、BOLETH (DRB1*0401, DRB4*0103)、HHKB (DRB1*1301, DRB3*0101, DPB1*0401)。HLA-DR分子は、Gorgaら, J. Biol. Chem., 1987, 262, 16087〜16094に記載されるようにして、プロテインA-セファロースCL 4Bゲル(Pharmacia)に結合したL243単形態性モノクローナル抗体(Smithら, P.N.A.S., 1982, 79, 608〜612)を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより精製する。HLA-DP4分子は、同じプロトコルに従って、B7/21単形態性抗体(Watsonら, Nature, 1983, 304, 358〜361)を用いて精製する。簡単に、細胞(5×108細胞/ml)を、氷上で、1% Nonidet P40、10 mg/lアプロチニン、5 mM EDTA及び10μM PMSFを含有する150 nM NaCl、10 mM Tris HCl、pH = 8.3のバッファー中で溶解させる。100000 gで1時間の遠心分離の後に、上清をセファロース4Bカラム及びプロテインA-セファロース4Bカラムに載せ、次いで特異的アフィニティカラムに載せる。HLA II分子は、1.1 mM n-ドデシル-β-D-マルトシド(DM)、500 mM NaCl及び500 mM Na2CO3, pH = 11.5のバッファーで溶出される。フラクションを、2M Tris HClバッファー、pH = 6.8で直ちにpH = 7に中和し、1 mM DM、150 mM NaCl、10 mM、pH = 7のバッファーに対して長時間透析する。
結合アッセイにおいて用いられるトレーサペプチドは、以下のものである。:HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT、配列番号23)、A3 152-166 (EAEQLRAYLDGTGVE、配列番号24)、MT 2-16 (AKTIAYDEEARRGLE、配列番号25)、YKL(AAYAAAKAAALAA、配列番号26)、B1 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE、配列番号27)、LOL 191-210 (ESWGAVWRIDTPDKLTGPFT、配列番号28)、E2/E168 (AGDLLAIETDKATI、配列番号29)及びOxy 271-287 (EKKYFAATQFEPLAARL、配列番号30)。ペプチドは、固相上でのパラレル合成によるFmocストラテジに従って合成し、ビオチン-6-アミノカプロン酸(Fluka Chimie)を用いて末端NH2残基にてTexierら, J. Immunol., 2000, 164, 3177〜3184に記載されるプロトコルに従ってビオチン標識し、トリフルオロ酢酸(95%)を用いて樹脂から切断して、C18カラム(VydacTM)での逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製する。
HLA II分子は、所定のpHにて適切なビオチン標識ペプチド(トレーサペプチド)、及び競合ペプチドの連続希釈(試験されるペプチド)の存在下で、150 mM NaCl、1 mMドデシルマルトシド(DM)、10 mMクエン酸及び0.003%チメロサールを含有する10 mMリン酸バッファー中で希釈する。つまり、HA 306-318ペプチドを、1 nM及び30 nMでpH = 6にて、それぞれDRB1*0101及びDRB1*0401対立遺伝子について用い、20 nMでpH = 5にて、DRB1*1101対立遺伝子について用いる。YKLは、20 nMでpH = 5にて、DRB1*0701対立遺伝子について用いる。インキュベーションは、DRB1*1501、DRB1*1301及びDRB1*0301対立遺伝子について、pH = 4.5にて、それぞれA3 152-166 (10 mM)、B1 21-36 (200 nM)及びMT 2-16 (200 nM)の存在下で行う。オキシビオチン標識ペプチドは、pH = 5 (10 nM)にて、DPB1*0401及びDPB1*0402対立遺伝子について用いる。
EBNA1、LMP1及びLMP2抗原の配列の分析により、いくつかのHLA-DR分子のモチーフを含んでいると考えられる15〜31アミノ酸の24個のペプチド配列を同定することが可能になった。これらの24個のペプチドのうち、22個はf-moc化学により、HPLCによる純度が90%程度で合成できた。9つのペプチドはEBNA1に由来し、7つはLMP1に、そして6つはLPM2に由来する。それぞれEBNA1、LMP1及びLMP2についてのアクセッション番号NP_039875、CAA26023及びAAA45886を有する配列に由来するペプチド配列は、添付の配列表及び表IIに示す。
実施例1で定義されるようなHLA II分子について良好な親和性を有するペプチドの、免疫応答を誘導する能力を、HLA-DR1分子についてトランスジェニックなマウス(Aβ°/DR1トランスジェニックマウス;Pancreら, Clinical and Experimental Immunology, 2002; 129: 429〜437)でのインビトロ増殖アッセイにより評価した。
6週齢のトランスジェニックマウスの第1群は、Montamide (登録商標) Isa 720 (Seppic)中で乳化した実施例1で決定したペプチド混合物(各ペプチド20μg、すなわち合計120μg)の第1の皮下注射と、その後、2週間の間隔で、Montamide (登録商標) Isa 720で乳化した半分の用量のペプチド混合物(各ペプチド10μg、合計60μg)の2回のブースター注射で免疫した。コントロール群は、同じプロトコルに従ってMontamide (登録商標) Isa 720の注射のみを受けた。最後の注射の7日後に、動物を犠牲にし、脾臓及びリンパ節を回収した。脾臓細胞又はリンパ節細胞(5×105/ウェル、96ウェルマイクロタイタープレート(Falcon (登録商標)、3重)を、抗原の非存在下(ネガティブコントロール)、又はLPSの範囲(Sigma (登録商標)、10 mg及び1 mg)若しくはコンカナバリンAの範囲(Sigma (登録商標)、10 mg及び1 mg) (ポジティブコントロール、48時間培養)の存在下、又はペプチド混合物の濃度の範囲(合計60μg、30μg、15μg、7.5μg) (5日培養)の存在下のいずれかで培養に付した。培養後、トリチウム化チミジン((3H)チミジン) (1 mCi/ウェル、49.0 Ci/mmol、Amersham)を加え、ガラス繊維フィルタ(Wallac)を通して吸引により、6時間後に細胞を回収した。取り込まれたチミジンを、β-シンチレーションカウンタ(1450 Trilux, Wallac)を用いて測定した。結果を、増殖指数として表した(抗原存在下での1分当たりのカウント数(CPM)/抗原の非存在下でのCPM数)。
図1及び2に示す結果は、HLA II分子結合アッセイにより選択されたペプチドが、免疫された個体において強いEBV-特異的CD4+応答を誘導できることを示す。ペプチド混合物でインビトロにて再刺激した後に、免疫された動物から抽出した脾臓及びリンパ節のリンパ球の増殖応答がある。一方、この増殖は、免疫していないコントロール動物では観察されない(図1及び2)。これらの結果は、選択されたペプチドが、EBV感染に関連する病変の予防及び治療のための免疫原性組成物において用い得ることを示す。
1) 材料及び方法
a) ドナー及びHLA型決定
EBVについて血清反応陽性でかつ種々のHLA IIハプロタイプを有する12人の正常な有志のドナーから血液を採取した。
ドナーからの血液単核細胞(PBMC)を、通常のフィコール勾配法により分離した。PBMC (5×105細胞/ウェル、96ウェルプレート)を、無血清培地(AIM V、GibcoTM)中で、ペプチド混合物の存在下(合計60μg/ml、すなわち各ペプチド10μg/mL)又は非存在下で4〜6日間培養した。増殖応答は、(3H)チミジン(1 mCi/ウェル, 49.0 Ci/mmol, Amersham)の取り込みにより測定した。結果を、刺激指数として表す(刺激したTリンパ球の1分当たりのカウント/刺激していないTリンパ球の1分当たりのカウントの平均)。刺激したTリンパ球に相当するウェルを個別に分析し、1分当たりのカウント数が1000より大きく、刺激指数が3より大きいときに(ペプチド混合物の存在下での1分当たりのカウント数がペプチドの非存在下で観察されるもの(バックグラウンドノイズ)よりも3倍より大きい)、陽性であるとみなした。ペプチドは、6人のドナーにおいて(ドナー1、3、5、6、9及び10)個別に試験もした。このことを行うために、濃度の範囲(2.5、5、10及び20μg)を、各ペプチドについて3重で試験した。応答は、3重に試験したものの刺激指数の平均が2より大きく、かつ1つのウェルが3より大きい刺激指数を有する場合に陽性であるとみなした。
ドナーからのこれらのPBMC (1×106細胞/ウェル、24ウェルプレート)を、10%のグループABヒト血清を補ったAIM V培地(GibcoTM)又はRPMI 1640培地(GibcoTM)で、ペプチド混合物の存在下(60μg/mL)又は非存在下で、2又は5日間培養した。培養上清中に存在するIL-2、IL-4、IL-10及びIFN-γは、標準的なプロトコルに従って、これらのサイトカインのそれぞれに指向された抗体(BD PharMingen)を用いるサンドイッチELISAによりアッセイした。492 nmでの吸光度を、分光光度計(Multiskan RC, Labsystems)を用いて測定した。示す結果は、2つのウェルで得られた平均に相当する。
a) ペプチド混合物により誘導されるEBV-特異的CD4+ T応答
ペプチド混合物がヒトCD4+ Tリンパ球により認識されるか否かを決定するために、EBVについて血清反応陽性で、種々のHLAハプロタイプを有する(表III)正常な有志のドナー由来の血液単核細胞を、ペプチド混合物でインビトロにおいて刺激した。まず、記憶Tリンパ球応答の存在の確立を可能にするTリンパ球の増殖応答を、ペプチド混合物の存在下で4〜6日間培養したあとの(3H)チミジンの取り込みを測定することにより評価した。増殖応答は、11人のドナーで評価可能であった(図3)。ドナー毎に増殖のレベルは変動するが、全てのドナーは増殖応答を示す。これらの結果は、試験したドナーの全てにおいて、ペプチド混合物を認識できる記憶Tリンパ球の存在を示す。これらの結果は、混合物が、EBV感染の間に天然に提示されるペプチドを含むことも示す。
Claims (20)
- HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5及びHLA-DP4分子から選択される少なくとも7つの異なるHLA II分子により提示され得るEBNA1、LMP1又はLMP2潜伏期抗原のうちの1つの少なくとも1つのCD4+ Tエピトープを含み、
a) EBNA1の位置475〜500、514〜539、及び529〜552にわたる配列であるそれぞれ26、26及び24アミノ酸のペプチド;
b) LMP1の位置68〜83にわたる配列である16アミノ酸のペプチド;
c) LMP2の位置224〜244及び372〜388にわたる配列であるそれぞれ21及び17アミノ酸のペプチド;
d) a)、b)及びc)で定義されるペプチドと同じ長さでかつ同じ位置により定義される変異形であって、a)、b)及びc)で定義される前記ペプチドの少なくとも1つのアミノ酸配列を別のアミノ酸で置換することにより得られ、HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5及びHLA-DP4から選択される少なくとも7つの異なるHLA II分子に関して1000 nMより低い結合活性を示す変異形
からなる群より選択されることを特徴とする、エプスタイン−バーウイルス(EBV)の免疫原性ペプチド。 - 前記HLA-II分子が、対立遺伝子DRB1*0101 (HLA-DR1分子)、DRB1*0301 (HLA-DR3分子)、DRB1*0401 (HLA-DR4分子)、DRB1*0701 (HLA-DR7分子)、DRB1*1101 (HLA-DR11分子)、DRB1*1301 (HLA-DR13分子)、DRB1*1501 (HLA-DR15分子)、DRB3*0101 (HLA-DRB3分子)、DRB5*0101 (HLA-DRB5分子)、DP*0401又はDP*0402 (HLA-DP4分子)によりそれぞれコードされるβ鎖を含むことを特徴とする請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号4、5、6、11、20及び21の配列からなる群より選択されることを特徴とする請求項1又は2に記載のペプチド。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドの配列を有する少なくとも1つのCD4+ Tエピトープを含む2つの同一又は異なるエピトープを含むことを特徴とするポリエピトープフラグメント。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドの配列を有するCD4+ Tエピトープと、
- EBV抗原のCD8+ Tエピトープ、
- EBV抗原のBエピトープ、及び
- 天然又は合成のユニバーサルCD4+ Tエピトープ、例えばTTペプチド830-846、PADRE、HIV-1 Nefタンパク質のペプチド45〜69、並びにCS.T3、CSP、SSP2、LSA-1及びEXP-1ペプチド
からなる群より選択される少なくとも1つのその他のエピトープとを含むことを特徴とする請求項4に記載のポリエピトープフラグメント。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド、又は請求項4若しくは5に記載のポリエピトープフラグメントに融合されたタンパク質又はタンパク質フラグメントからなることを特徴とする融合タンパク質。
- 前記タンパク質又は前記タンパク質フラグメントが、HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4、HLA-DR7、HLA-DR11、HLA-DR13、HLA-DR15、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5及びHLA-DP4分子から選択されるHLA II分子のα鎖若しくはβ鎖、又は可溶性HLA II分子に相当する前記鎖のフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする請求項6に記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド又は請求項4若しくは5に記載のポリエピトープフラグメントのα-アミノ官能基又は側鎖の反応性官能基に脂質を付加することにより得られることを特徴とするリポペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド、ポリエピトープフラグメント又は融合タンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチドを、転写及び任意に翻訳のための適切な調節配列の制御下に含むことを特徴とする発現ベクター。
- 請求項9に記載のポリヌクレオチド又は請求項10に記載の発現ベクターで改変されたことを特徴とする宿主細胞。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の少なくとも1つのペプチド、少なくとも1つのポリエピトープフラグメント、少なくとも1つのリポペプチド、又は少なくとも1つの発現ベクターと、医薬的に許容される担体及び/又は担体物質及び/又はアジュバントとを含むことを特徴とする免疫原性の又はワクチン用の組成物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のEBVペプチドの少なくとも2つ、好ましくは3〜5つのペプチド、好ましくは請求項3に記載の6つのペプチドを、ペプチド混合物の形で、又は請求項8で定義されるリポペプチドの形で、請求項4若しくは5に記載の前記ペプチドを含むポリエピトープフラグメントの形で、又は請求項10に記載の前記ペプチド若しくは前記フラグメントをコードする発現ベクターの形で含むことを特徴とする請求項12に記載の免疫原性組成物。
- 請求項5で定義されるEBV CD8+ Tエピトープ、EBV Bエピトープ及びユニバーサルCD4+ Tエピトープからなる群より選択されるエピトープを含む少なくとも1つのペプチドも含むことを特徴とする請求項13に記載の免疫原性組成物。
- EBV感染又は関連する腫瘍性病変の予防及び/又は治療のためのワクチンとしての請求項1〜5、8及び10のいずれか1項に記載のペプチド、ポリエピトープフラグメント、リポペプチド又はベクター。
- 請求項1〜5、8及び10のいずれか1項に記載のペプチド、ポリエピトープフラグメント、リポペプチド又はベクターの、EBV感染又は関連する腫瘍性病変の予防及び/又は治療用のワクチンの製造のための使用。
- 任意に標識されているか又は複合体化されている、特に標識されたHLA II分子と複合体化されている請求項1〜3のいずれか1項に記載の少なくとも1つのペプチドを、マルチマー複合体の形で含むことを特徴とする、EBV感染又は関連する腫瘍性病変の診断用試薬。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチドの、EBV感染又は関連する腫瘍性病変の診断用試薬の製造のための使用。
- - 個体からの生体サンプルを、請求項17に記載の診断用試薬と接触させ、
- EBVのEBNA1、LMP1又はLMP2潜伏期抗原の1つに特異的なCD4+ T細胞を検出する
ことを含むことを特徴とする、EBV感染又は関連する腫瘍性病変を診断する方法。 - 少なくとも次の工程:
- 細胞サンプルを、可溶性HLA II分子と請求項1〜3のいずれか1項に記載の少なくとも1つのペプチドとの結合により形成された標識されているマルチマー複合体と接触させ、
- 前記HLA II/ペプチド複合体に結合した細胞を弁別する
を含むことを特徴とする、EBVのEBNA1、LMP1又はLMP2潜伏期抗原の1つに特異的なCD4+ T細胞を弁別する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0501198 | 2005-02-07 | ||
FR0501198A FR2881746B1 (fr) | 2005-02-07 | 2005-02-07 | Epitopes t cd4+des antigenes de latence de type i et ii du virus epstein-barr aptes a etre reconnus par la majorite des individus de la population caucasienne et leurs applications |
PCT/FR2006/000229 WO2006082313A2 (fr) | 2005-02-07 | 2006-02-02 | Epitopes t cd4+ des antigenes de latence de type i et ii du virus epstein-barr aptes a etre reconnus par la majorite des individus db la population caucasienne et leurs applications |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008529486A true JP2008529486A (ja) | 2008-08-07 |
JP2008529486A5 JP2008529486A5 (ja) | 2009-02-26 |
JP4972562B2 JP4972562B2 (ja) | 2012-07-11 |
Family
ID=35116028
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007553650A Expired - Fee Related JP4972562B2 (ja) | 2005-02-07 | 2006-02-02 | 白人個体群の個体の大多数により認識され得るエプスタイン−バーウイルスのi型及びii型潜伏期抗原のtcd4+エピトープ、及びその適用 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090130134A1 (ja) |
EP (1) | EP1861418B1 (ja) |
JP (1) | JP4972562B2 (ja) |
AT (1) | ATE455791T1 (ja) |
CA (1) | CA2596929C (ja) |
DE (1) | DE602006011859D1 (ja) |
FR (1) | FR2881746B1 (ja) |
WO (1) | WO2006082313A2 (ja) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995011699A1 (en) * | 1993-10-29 | 1995-05-04 | The Trustees Of Boston University | Physiologically stable compositions of butyric acid, and butyric acid salts and derivatives as anti-neoplastic agents |
AU774861B2 (en) * | 1998-02-11 | 2004-07-08 | Douglas V Faller | Compositions and methods for the treatment of cystic fibrosis |
FR2830940B1 (fr) | 2001-10-17 | 2007-06-15 | Commissariat Energie Atomique | Procede de selection de ligands d'hla-dp4 et ses applications |
GB0710529D0 (en) | 2007-06-01 | 2007-07-11 | Circassia Ltd | Vaccine |
DK2190473T3 (da) | 2007-08-15 | 2013-03-25 | Circassia Ltd | Peptid med reduceret dimerdannelse |
WO2010105112A1 (en) * | 2009-03-11 | 2010-09-16 | Hemaquest Pharmaceuticals, Inc. | Detection of short-chain fatty acids in biological samples |
WO2011038224A1 (en) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | Trustees Of Boston University | Methods for treating viral disorders |
WO2011072086A1 (en) | 2009-12-08 | 2011-06-16 | Hemaquest Pharmaceuticals, Inc. | Methods and low dose regimens for treating red blood cell disorders |
WO2011113013A2 (en) | 2010-03-11 | 2011-09-15 | Hemaquest Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating viral or virally-induced conditions |
US10576144B2 (en) | 2013-06-28 | 2020-03-03 | Auckland Uniservices Limited | Amino acid and peptide conjugates and conjugation process |
JP2018505152A (ja) | 2014-12-23 | 2018-02-22 | アン ブリンブル マーガレット | アミノ酸複合体及びペプチド複合体ならびにそれらの使用 |
CN104491857B (zh) * | 2014-12-24 | 2018-08-31 | 深圳市中美康士生物科技有限公司 | 一种用于免疫治疗ebv相关疾病的抗原组合物、生物制剂及其制备方法 |
SG11201807036QA (en) | 2016-02-26 | 2018-09-27 | Auckland Uniservices Ltd | Amino acid and peptide conjugates and conjugation process |
CN110809716B (zh) | 2017-02-12 | 2023-07-07 | 百欧恩泰美国公司 | 基于hla的方法和组合物及其用途 |
CA3085975A1 (en) | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Epstein-barr virus antigen constructs |
MX2021007556A (es) * | 2018-12-21 | 2021-09-10 | Biontech Us Inc | Método y sistemas de predicción de epítopos específicos de hla de clase ii y caracterización de células t cd4+. |
AU2020283590A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-01-20 | Viracta Subsidiary, Inc. | Methods of treating virally associated cancers with histone deacetylase inhibitors |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040157780A1 (en) * | 1993-11-29 | 2004-08-12 | Epimmune Inc. | CTL inducing peptides from c-erb2 (HER-2/neu) |
WO1996002563A1 (en) * | 1994-07-13 | 1996-02-01 | Cornell Research Foundation, Inc. | Epstein-barr virus nuclear antigen 1 protein and its expression and recovery |
US20020141995A1 (en) * | 1997-06-10 | 2002-10-03 | Irvin Charles G. | Method for treatment of inflammatory disease |
AU783502B2 (en) * | 1999-11-24 | 2005-11-03 | Oklahoma Medical Research Foundation | Assays and therapies for latent viral infection |
EP1229043A1 (en) * | 2001-01-30 | 2002-08-07 | Cyto-Barr B.V. | Peptides derived from Epstein Barr virus (EBV) proteins LMP1, LMP2 and BARF1 antibody reagents reactive therewith |
GB0214528D0 (en) * | 2002-06-24 | 2002-08-07 | Univ Aberdeen | Materials and methods for induction of immune tolerance |
WO2004007536A2 (en) * | 2002-07-16 | 2004-01-22 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Interactions of the epstein-barr virus protein ebna1, and uses thereof |
TW200416043A (en) * | 2002-11-07 | 2004-09-01 | Queensland Inst Med Res | Epstein barr virus peptide epitopes, polyepitopes and delivery system therefor |
US20040141995A1 (en) * | 2002-12-10 | 2004-07-22 | Rongfu Wang | MHC class I-restricted and MHC class II-restricted EBNA1 peptides |
-
2005
- 2005-02-07 FR FR0501198A patent/FR2881746B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-02-02 US US11/883,814 patent/US20090130134A1/en not_active Abandoned
- 2006-02-02 AT AT06709221T patent/ATE455791T1/de not_active IP Right Cessation
- 2006-02-02 JP JP2007553650A patent/JP4972562B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-02-02 WO PCT/FR2006/000229 patent/WO2006082313A2/fr active Application Filing
- 2006-02-02 DE DE602006011859T patent/DE602006011859D1/de active Active
- 2006-02-02 CA CA2596929A patent/CA2596929C/fr not_active Expired - Fee Related
- 2006-02-02 EP EP06709221A patent/EP1861418B1/fr not_active Not-in-force
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20090130134A1 (en) | 2009-05-21 |
DE602006011859D1 (de) | 2010-03-11 |
ATE455791T1 (de) | 2010-02-15 |
CA2596929A1 (fr) | 2006-08-10 |
WO2006082313A2 (fr) | 2006-08-10 |
WO2006082313A3 (fr) | 2007-01-11 |
EP1861418B1 (fr) | 2010-01-20 |
JP4972562B2 (ja) | 2012-07-11 |
EP1861418A2 (fr) | 2007-12-05 |
FR2881746A1 (fr) | 2006-08-11 |
FR2881746B1 (fr) | 2007-04-13 |
CA2596929C (fr) | 2015-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4972562B2 (ja) | 白人個体群の個体の大多数により認識され得るエプスタイン−バーウイルスのi型及びii型潜伏期抗原のtcd4+エピトープ、及びその適用 | |
JP5452923B2 (ja) | Cd4+tサバイビンエピトープ及びその使用 | |
CA2142007C (en) | Immunomodulatory peptides | |
US7157091B1 (en) | MAGE-A1 peptides presented by HLA class II molecules | |
EP1256352A2 (en) | Immunomodulatory peptides | |
RU2761653C2 (ru) | Пептиды и способы для лечения диабета | |
WO1994004171A9 (en) | Immunomodulatory peptides | |
EP3466980A2 (en) | Improved human herpesvirus immunotherapy | |
WO1994004557A1 (en) | Immunomodulatory peptides | |
KR20210093933A (ko) | 개선된 산화환원 효소 모티프를 갖는 면역원성 펩티드 | |
JP2011525108A (ja) | ミッドカインタンパク質に由来する抗ガンワクチンとしての免疫原性ペプチド | |
Brett et al. | Human T cell recognition of influenza A nucleoprotein. Specificity and genetic restriction of immunodominant T helper cell epitopes. | |
CA2536735A1 (en) | Methods for determining cd8+ t-cell epitopes | |
Nicholas et al. | A 16-amino acid peptide of respiratory syncytial virus 1A protein contains two overlapping T cell-stimulating sites distinguishable by class II MHC restriction elements. | |
CA3163178A1 (en) | Methods for stratifying diabetes patients | |
US20040141995A1 (en) | MHC class I-restricted and MHC class II-restricted EBNA1 peptides | |
US10550166B2 (en) | Immunogenic peptides of the cyclin B1 tumor antigen | |
WO2022244891A1 (ja) | SARS-CoV-2由来のT細胞エピトープペプチド | |
US20040115622A1 (en) | Mixture of peptides originating from a Nef protein and applications thereof | |
VON BONIN et al. | MHC and Antigen Presentation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090108 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090108 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110719 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111011 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111018 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111219 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20120119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120119 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120313 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120409 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150413 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |