JP2008522630A - 複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞株 - Google Patents
複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞株 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008522630A JP2008522630A JP2007545722A JP2007545722A JP2008522630A JP 2008522630 A JP2008522630 A JP 2008522630A JP 2007545722 A JP2007545722 A JP 2007545722A JP 2007545722 A JP2007545722 A JP 2007545722A JP 2008522630 A JP2008522630 A JP 2008522630A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- adenovirus
- nucleic acid
- cell line
- acid molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
- C12N2710/10352—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10361—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2710/10362—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Abstract
Description
この出願は、米国特許法(35U.S.C.)第119(e)の下での2004年12月13日に出願された米国仮特許出願第60/635,561号および2005年4月25日に出願された米国仮特許出願第60/674,488号(これらの開示は、本明細書においてその全体を参考として援用する)に関する優先権の利益を請求する。
本発明は、複製欠損アデノウイルスを効率的に産生するための有用な細胞株に関する。本発明は、複製欠損アデノウイルスを産生するためにこのような細胞株を使用する方法も記載する。
組換えアデノウイルス(rAd)ベクターは、広い組織親和性および細胞親和性、大型の発現カセットの収容能力および高い形質導入効率を包含する、遺伝子送達のための望ましい特徴を有している。加えて、アデノウイルスは、ウイルスが高い特定の力価まで増殖し、かつ大規模に実現可能な(scalable)製造プロセスが確立されているので、医薬の開発によく適合している(非特許文献1;非特許文献2)。rAdベクターの産生には、ウイルスゲノムから除去された機能を相補し得る、操作された細胞株が必要である。ウイルスベクターの医薬の開発および商業上の製造のためには、ベクター−細胞株の組み合わせも、スケールアップに適合し、かつ十分な質と純度の材料を提供しなければならない。
本発明は、アデノウイルス複製に必要とされる、選択されたウイルス機能および宿主機能の組み合わせに基づく、組換えアデノウイルスの産生のための新しい細胞株を提供することによって、前述の必要性に取り組む。
を含み、そして/または上記第3発現カセットは、配列番号18に記載の核酸配列を含む。具体的な実施形態において、上記第1発現カセットは、配列番号1に記載の核酸配列を含み、上記第2発現カセットは、配列番号20に記載の核酸を含み、そして/または上記第3発現カセットは、配列番号19に記載の核酸配列を含む。本発明はまた、上記のヒト細胞を提供し、ここで、この細胞は、SL0006の名称を有し、アクセッション番号PTA−6663の下でAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託されている。本発明の好ましい実施形態において、上記組換えアデノウイルス産生細胞株は、SL0006の名称を有し、アクセッション番号PTA−6663の下でAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託されている細胞株である。
本明細書中で使用される場合、用語「A549」は、ヒト肺癌腫細胞株をいい、これは、当該分野で一般に知られている。1つの実施形態において、E1−相補性細胞株を産生するために使用されるA549親細胞株は、ATCC株CCL−185である。
本発明は、とりわけ、rAd産生細胞株、このrAd産生細胞株を産生する方法、およびこのrAd産生細胞株を用いて組換えアデノウイルスを産生するための方法を、提供する。
本発明のヘルパーアデノウイルス核酸配列は:(i)組換えアデノウイルス構築物の複製および/またはその感染性ビリオンへのパッケージングのためのウイルス機能を提供し;そして(ii)測定可能な程度でウイルス粒子に複製もされず、ウイルス粒子へも組み立てられない。このヘルパーアデノウイルス核酸配列は、任意のアデノウイルス科またはアデノウイルス科の組み合わせから得られ得、そして/またはこれらに由来し得る。好ましい実施形態において、このヘルパーアデノウイルス核酸配列は、ヒトアデノウイルス科から得られ、そして/またはこれに由来し得る。別の好ましい実施形態において、このヘルパーアデノウイルス核酸配列は、ヒトアデノウイルス血清型2もしくは5から得られ、そして/またはこれに由来し得る。アデノウイルスタンパク質についての核酸配列は、例えば、GenBankデータベースもしくはそれに類似のデータベース、刊行物文献から得られるか、または慣用的なクローニングおよび配列決定によって得られる。
本発明の組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルスヌクレオチド配列、および必要に応じて、1つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、ヘルパーアデノウイルス核酸配列に対する相同性を有さないアデノウイルスヌクレオチド配列を含む。アデノウイルスヘルパー核酸配列と組換えアデノウイルスベクターとの間の相同性の欠如は、複製能力を有するアデノウイルスを産生するウイルスゲノム組換えの可能性を低下させる。好ましい実施形態において、組換えアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスをコードする。この実施形態に従い、組換えアデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスゲノム内の1つ以上の変異の導入(例えば、アデノウイルスタンパク質についての1つ以上のコード領域における欠失の導入)によって、変異したアデノウイルスゲノムを含むように操作され得る。好ましくは、アデノウイルスゲノム内の変異は野生型アデノウイルスよりも低いレベルのアデノウイルスタンパク質の発現をもたらす。アデノウイルスタンパク質発現の低下は、被験体におけるアデノウイルスタンパク質に対する免疫応答を減少させる。
本発明は、本明細書中で記載のヘルパーアデノウイルス核酸配列を含む宿主細胞、およびこのような細胞を産生するための方法を提供する。上記ヘルパーアデノウイルス核酸配列によってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞は、組換えアデノウイルス、特に複製欠損組換えアデノウイルスの産生において有用である。具体的には、本発明の宿主細胞は、目的の組換えアデノウイルスベクターおよび/または組換えアデノウイルスから失われた機能(すなわち、アデノウイルスE1A(例えば配列番号17)コード領域、およびE1B(例えば配列番号18)コード領域)を補う。より具体的には、本明細書中で記載のヘルパーアデノウイルス核酸配列によってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞は、本明細書中で記載の組換えアデノウイルスベクターを補うアデノウイルスタンパク質を発現する。好ましくは、上記宿主細胞は、目的の組換えアデノウイルスベクターにおける遺伝子に対して何ら相同性を有さない相補性アデノウイルス遺伝子を含み、このことは、ウイルスゲノムが細胞性DNAと組換えて、複製能力を有するアデノウイルスを産生する可能性を低下させる。本明細書中で記載の組換えアデノウイルスベクターを補う宿主細胞は、時々、本明細書中で、「相補性細胞株」、「rAd産生細胞株」、「rAd相補性細胞」および「rAd相補性細胞株」と呼ばれる。
実施例1に記載されるように、E1A変異E1Adl01/07遺伝子を構成的に発現する形質転換細胞株A549E1Adl01/07が、野生型E1Aまたは単一の1変異E1Ad1101もしくはE1Adl1107のいずれかを発現するA549細胞クローンよりも高いレベルでE1欠失rAdベクターの複製を支持したので、これをさらなる開発のために選択した。下記の実施例1に示されるように、A549細胞クローンであるA549E1Adl01/07−1〜A549E1Ad01/07−5は、E1欠失rAdベクターの複製を、A549細胞クローンA549E1Awt−1〜A549E1Awt−5、またはA549細胞クローンA549E1Adl1101−1〜A549E1Adl1101−5、またはA549細胞クローンA549E1Adl1107−1〜A549E1Adl1107−5よりも高いレベルで支持した。
実施例2に記載されるように、ウイルス収量を改善するために、形質転換細胞株A549E1Adl01/07を、アデノウイルスE2bポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子ならびにアデノウイルスE1B−55Kタンパク質およびアデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子によって形質転換した。実施例2に示した結果は、有効な相補が、A549細胞においてE1Adl01/07ならびにE2bポリメラーゼ、E1B−55KおよびE1B−19Kによって達成され得ることを示す。SL006細胞株からのrAdベクターの収量は、検出可能な複製能力を有するアデノウイルス(RCA)を産生せずに、293細胞から得られた収量と類似していた。
本発明に従い、組換えアデノウイルス(好ましくは、組換え複製欠損アデノウイルス)が、適切な細胞型をrAdベクターおよびヘルパーアデノウイルス核酸配列によって同時トランスフェクトすることにより、産生され得る。同時トランスフェクションは、DEAEデキストラン方法(McCutchenおよびPagano,1968,J.Natl.Cancer Inst.41:351−357)、リン酸カルシウム手順(Grahamら,1973,J.Virol.33:739−748)または当該分野で公知の任意の他の方法(マイクロインジェクション、リポフェクションおよびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない)によって実施され得る。トランスフェクションにおいて使用されるrAdベクターおよびヘルパーアデノウイルス核酸配列の量は、106個の細胞あたり約0.2〜10μgのDNAであるが、異なるDNA構築物および細胞型の間で変動し得る。トランスフェクションに適した細胞としては、アデノウイルス感染に対して許容性である任意の細胞株が挙げられ、これらとしては、HeLa細胞、293−D22細胞、A549細胞、HCT−15細胞、IGROV−I細胞、U87細胞およびW162細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の組換えアデノウイルスは、目的のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを発現させるために、インビトロで使用され得る。本発明の組換えアデノウイルスはまた、遺伝子治療において使用され得る。遺伝子治療の方法の一般的概説については、Goldspielら,1993,Clinical Pharmacy 12:488−505;WuおよびWu,1991,Biotherapy 3:87−95;Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573−596;Mulligan,Science 260:926−932(1993);ならびにMorganおよびAnderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191−217;1993年5月、TIBTECH 11(5):155−215を参照のこと。
本発明は、本発明の方法によって産生された組換えアデノウイルス(好ましくは、複製欠損組換えアデノウイルス)を含有する組成物を包含する。好ましい実施形態において、この組成物は、被験体への投与に適した薬学的組成物である。
本発明は、組換えアデノウイルスの産生のための細胞株を作製するためのプラスミド系を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、組換えアデノウイルスの産生のための細胞株(好ましくは、ヒト細胞株)を作製するためのプラスミド系を提供し、これは、別個の容器に、以下を含む:(a)p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む第1発現カセット;および(b)アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2核酸分子に作動可能に連結したこの細胞株中の調節エレメントを含む第2発現カセット。代替の実施形態において、このプラスミド系は、p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびアデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、1つの発現カセットを含む。
以下の実施例は単に例示的なものであり、そして本明細書において記載される本発明の範囲を限定する意味はない。
この実施例は、高力価の複製欠損、ヘルパー非依存性組換えウイルスの産生のためのE1AおよびE1b相補性細胞株の有用性を実証する。
(細胞培養)
293(ATCC#CRL−1573)細胞、A549(ATCC#CCL−185)細胞およびHeLa(ATCC#CCL−2)細胞を、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、VA)から得た。細胞株は、10%(v/v)ウシ胎児血清(JRH Biosciences、Lenexa、KS)、1%(v/v)抗生物質−抗真菌剤溶液(Cellgro、Kansas、MO)および1mMピルビン酸ナトリウム(BioWhittaker、Inc.、Walkersville、MD)を追加した、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で培養した。
Ad5野生型E1A遺伝子、およびE1Adl1101、E1Adl1107およびE1Adl01/07変異を含有するE1A配列を、標準的手順によって、pXC1(McKinnonら,(1982)Gene19:33−42)またはAd−dl01/07(Howeら,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5883−5887)から、pRc/RSV−Neo(Invitrogen,Carlsbad,CA)のRSVプロモーター/SV40ポリA発現カセットへクローニングし、
pRc/RSV−E1Awt、pRc/RSV−E1Adl1101、pRc/RSV−E1Adl1107およびpRc/RSV−E1Adl01/07を作製した。pcDNA3.1−E1B−55Kを、pXC1由来のE1B−55K遺伝子をPCRを使用してpcDNA3.1−hygro(Invitrogen,Carlsbad,CA)のCMVプロモーター/BGHポリA発現カセットへクローニングすることで作製した。p53con−lucは、4つのコンセンサスp53結合部位、およびサルウイルス−40(SV40)初期プロモーター由来のTATAボックス(Ramachandraら,(2001)Nat.Biotechnol.19:1035−1041)を、pGL3−basic(Promega、Madison、WI)中のルシフェラーゼ遺伝子の上流に含んだ。pE2F−lucは、アデノウイルス初期領域2プロモーター由来のE2F結合部位の4つのコピーおよびSV40のTATAボックスを、pGL3−basic中のルシフェラーゼ遺伝子の上流に含んだ。
rAd−β−galおよびrAd−GFPは、構成的に活性なCMV即時初期プロモーターの制御下にある、β−ガラクトシダ−ゼ(β−gal)遺伝子かまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子のいずれかを含む、発現カセットをE1−欠失中に挿入した、E1/E3欠失アデノウイルスベクターであった(Cheneyら,(1998)Cancer Res.58:2331−2334;Willsら,(1994)Hum.Gene Ther.5:1079−1088)。p53レポーターのrAd−PRE−GFPは、発現カセットをE3欠失中に含み、そこではp53−応答エレメント(p53−response element)(Ramachandraら,(2001)Nat.Biotechnol.19:1035−1041)が、GFPの発現を調節した。Ad5−dl309(JonesおよびShenk,(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.76:3665−3669)を野生型コントロールウイルスとして使用した。E1B−19Kタンパク質を産生しないAd5−dl309に基づく変異体ウイルスのE1B/19K−(Marcellusら,(1996)J.Virol.70:6207−6215)、およびE1A領域に大きな欠失を有するNT1010(Whyteら,(1989)Cell 56:67−75)が、以前に記載されている。dl1520(BarkerおよびBerk,(1987)Virology 156:107−121)は、E1Bコード領域での欠失(Ad5等価物の2496−3233)およびE1B−55Kの3番目のコドンでの終了コドンを含む、キメラアデノウイルス(Ad2およびAd5−dl309)であった。このAd−E1B−ウイルスは、プラスミドのpXC1中のE1Bコード領域を、Eco/VIおよびBg/IIの消化によって取り除き、クレノウ補充(Klenow fill in)ならびに平滑末端連結(blunt end ligation)によって構築され、pXC1−E1B−を作製する。変異したE1B領域を含むAd配列をpXC1−E1B−から、大型の転移プラスミド(transfer plasmid)のpTG9530(Transgene S.A.、Strasbourg)へ移し、pTG9530−E1B−を作製した。E.coli株BJ5183(Chartierら,(1996)J.Virol.70:4805−4810)における相同組換えを、pTG9530−E1B−およびウイルスプラスミドpTG4213−Ad5−dl309の形質転換によって、感染性のAd−E1B−アデノウイルスDNAを産生するために使用した。生じたAd−E1B−プラスミドを単離し、そして293細胞にトランスフェクトし、ウイルスを産生した。全てのウイルスは、以前記載された方法(Huygheら,(1995)Hum.Gene Ther.6:1403−1416)を用いてカラムクロマトグラフィーによって精製した。内部アデノウイルス標準(internal adenovirus standard)に対してインタクトなアデノウイルス粒子の濃度を決定する、イオン交換HPLCに基づく方法(RQ−HPLC)によって、粒子濃度を推定した(Shabramら,(1997)Hum.Gene Ther.8:453−465)。
E1AwtまたはE1A−変異体タンパク質を発現するクローンの選抜のために、プラスミドpRc/RSV−E1Awt、pRc/RSV−E1A1101、pRc/RSV−E1A1107およびpRc/RSV−E1A01/07をSuperfect試薬(Qiagen、Valencia、CA)を用いてA549細胞にトランスフェクトさせた。2日間のインキュベーションの後、350μg/mlのネオマイシン(Invitrogen、Carlsbad、CA)を含有する増殖培地中で選抜を開始した。E1Awt、またはE1A変異体選抜プラスミドでトランスフェクトした培養物由来の薬剤耐性コロニーを、トリプシン処理し、細胞プールとして確立し、96ウェルプレートに希釈クローニングした。ネオマイシンを含有する培養培地中の選抜を、さらに3週間行い、その後各トランスフェクションに由来する48個のそれぞれクローンを増殖させ、そしてウイルス産生能力についてスクリーニングした。A549−E1Adl01/07−4に基づく細胞株は、A549−E1Adl01/07−4細胞を、pcDNA3.1−E1B−55Kでトランスフェクトし、そして350μg/mlのハイグロマイシン(Invivogen、San Diego、CA)中で選抜する点を除いて、同じ手順を用いて、E1B−55Kを発現するように操作した。
E1Adl01/07変異を含むAd5E1A配列を、Ad−dl01/07(Howeら,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5883−5887)から標準的手順によって、pRc/RSV−E1AのRSVプロモーター/SV40ポリA発現カセットへクローニングし、pRc/RSV−E1Adl01/07を作製した。pRc/RSV−E1Adl01/07の地図については、図2を参照のこと。pcDNA3.1−E1B−55Kを、pXC1からのE1B−55K遺伝子(McKinnonら,(1982)Gene 19:33−42)を、PCRを用いて、pcDNA3.1−hygro(Invitrogen、Carlsbad、CA)のCMVプロモーター/BGHポリA発現カセットへクローニングすることによって作製した。pcDNA3.1−E1B−55Kの地図については、図3を参照のこと。
E1AwtまたはE1A変異体タンパク質を発現するA549に基づくクローンのウイルス産生能力を、6ウェルプレートに平板培養された細胞にrAd−GFP(1×108粒子/ml)を感染させることによって評価した。ウイルス複製効率を緑色蛍光タンパク質強度および細胞障害効果(cytopathic effect)(CPE)をモニターすることによって推定した。pcDNA3.1−E1B−55Kでトランスフェクトすることによって確立されたE1A01/07−4に基づくクローンをスクリーニングするために、細胞をrAd−PRE−GFP(1×108粒子/ml)に感染させ、そしてp53活性の低下、および確固としたCPEを示す、低いGFP強度のクローンをさらなる特徴づけのために選択した。
全細胞タンパク質溶解産物を、示した細胞を溶解A緩衝液(50mMトリス[pH8.0]、150mM NaCI、0.5%[vol/vol]IGEPAL CA−630[Sigma、St.Louis、MO]およびプロテアーゼインヒビターカクテル[Roche、Indianapolis、IN])中でインキュベートし、続けて遠心分離することによって調製した。溶解産物中の総タンパク質濃度を、Bio−Radタンパク質アッセイ(Bio−Rad、Hercules、CA)によって決定し、そして50μgのアリコートを、勾配(4%〜12%)NUPAGEゲル(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いた、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)によって分離した。PVDF膜(Invitrogen、Carlsbad、CA)上へ移した後、ウェスタン検出を、E1A(M73、Calbiochem、La Jolla、CA)またはα−アクチン(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)に特異的な抗体を使用して行った。結合パターンを、この膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスイムノグロブリンGおよびM抗体(Roche、Indianapolis、IN)を用いてインキュベートすることによって、決定し、そして増強された化学発光(Amersham BioSciences、Piscataway、NJ)によって検出した。
低分子量のDNAを、改変Hirt抽出(Hirt、1967)を用いて、示された時点で、6ウェルのプレート上でrAd−β−gal(1×10e8粒子/ml)を用いて感染させた細胞から単離した。感染した細胞を、引っかくことによって採取し、そしてTNE緩衝液(500mM NaCI、10mMトリス(7.5)、10mM EDTA、1% SDS、0.5mg/mlプロテイナーゼK(Sigma)、0.25mg/mlプロナーゼE(Sigma))に溶解した。凍結−解凍サイクルの後に、溶解産物を遠心分離によって清澄化し、フェノール:クロロホルム混合物(Sigma、St.Louis、MI)で抽出し、そしてエタノール沈殿させた。核酸ペレットを、RNase(Ambion、Austin、TX)を含有する60μlのTE中に懸濁し、その後12μlのサンプルをXhoIで制限切断し、1%アガロースゲルで分離した。DNA制限パターンを、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。
E1Awtクローン、E1A−変異体クローンおよびA549コントロール細胞を、ウェル当たり150,000細胞で、6ウェルプレート上で平板培養し、そして24時間後にrAd−β−gal(1×108粒子/ml)を用いて感染させた。感染から20時間後に、5μMのCaspACE FITCTM−VAD−FMK(Promega、Madison、WI)を直接に培養培地に加えた。20℃で20分間のインキュベーションの後に、細胞をトリプシン処理し、PBSで2回洗い、そして20℃で30分間0.5%ホルムアルデヒド中で固定した。フローサイトメトリー分析を、FACSCalibur(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて行い、そして蛍光は530nm(488nmの励起)において測定した
(ルシフェラーゼアッセイ)
Superfect(Qiagen、Valencia、CA)を用い、レポータープラスミドでトランスフェクトした細胞の溶解産物を、製造者の仕様書に従い、再構成したルシフェラーゼ基質(Promega、Madison、WI)と混合した。各溶解産物のルシフェラーゼ活性を、Analyst AD(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を用いて決定した。
上記のようにして調製した、タンパク質溶解産物(総タンパク質量1mg)を、プロテイン−Gセファロースビーズ(Amersham BioSciences、Piscataway、NJ)を用い予め清澄化し、そして5μgのE1B−55K特異的マウスモノクローナル抗体2A6(Sarnowら,(1982)Cell 28:387−394)とともにインキュベートした。E1B−55K−イムノグロブリン複合体を、プロテイン−Gセファロース上で精製し、溶解緩衝液で徹底的に洗い、そして還元剤(Invitrogen、Carlsbad、CA)を含むSDS−PAGEサンプル緩衝液とともにインキュベートした。サンプルを、SDS−PAGEゲル上で分離し、そしてE1B−55Kタンパク質を、2A6モノクローナル抗体を使用して、上記のようにウェスタンブロットによって検出した。
連続継代のために使用されるrAd−β−galウイルスを、まず3回プラーク精製し(plaque purified)、cell factory(Nunc A/S、Kamstrupvej、Denmark)中で生長させたSL0003細胞を使用して増殖させ、そしてカラムクロマトグラフィーによって精製した。生じたウイルスストック(virus stock)、rAd−β−gal(p0)は、以下に記載する21日間のバイオアッセイを使用して、複製能力を有するアデノウイルス(RCA)を含まないことを試験した。最初の連続継代のために、293またはSL0003を含むcell factoryを、精製した5×10e8粒子/mlのrAd−β−gal(p0)で感染させた。感染が完了した時に調製した細胞溶解産物を、cell factoryに接種された新鮮な293またはSL0003細胞の2回目のセットに感染させるのに使用した。継代2回目から5回目の感染の溶解産物を、同様にして調製し、継代5回目において、ウイルスをカラムクロマトグラフィーによって精製した。
以前に記載されたプロトコール(Zhuら,(1999)Hum.Gene Ther.10:113−121)に基づいた改変バイオアッセイを、293またはSL0003での増殖の後に精製された1×10e11の総粒子のrAd−β−galを用いて、RCAを検出するのに用いた。最初のRCAバイオアッセイ感染のために、10個のT225フラスコのそれぞれに1×10e7細胞のA549細胞を接種し、そして24時間後に、293またはSL0003細胞から調製されたフラスコ当たり1×10e10粒子のrAd−β−galを感染させた。3日後、感染したA549細胞から細胞溶解産物を調製し、そして3×10e6のA549細胞で接種してあったフラスコの2番目のセットに感染させるのに使用した。2回目の感染のために、最初の感染からのrAd−β−galおよびコントロールの溶解産物を半分に分け、そして5個のT225フラスコのセットを感染させるのに使用した。最初の感染から12日後に、第2回目の感染からの溶解産物を調製した。各溶解産物を半分に分け、そして3×10e6のA549細胞で接種した5個のフラスコを感染させるのに使用し、そしてさらに9日間インキュベートした。コントロールサンプルは、Ad5野生型(10フラスコ当たり6ウイルス粒子)および6ウイルス粒子のAd5野生型により増強された(spiked)1×10e11ウイルス粒子のrAd−β−galを包含した。増強されたコントロールおよび野生型アデノウイルスコントロールの両方が、21日間の感染の間にCPEを生成するために必要であった。このバイオアッセイの間にCPEがrAd−β−galサンプル中で観察された場合、低分子量DNAを、およそ1×10e7細胞から、ウイルスDNA分析のために単離した。
(産生レベル)
選択された細胞株のウイルス産生能力は、複製能力を有するウイルスのAd5−dl309を用いた感染によって評価した。A549細胞およびHeLa細胞は、それぞれ558,000粒子/細胞および444,000粒子/細胞のウイルスを産生した。試験した他の細胞株としては、DLD−1、U87MG、MDA468およびIGROV−1が挙げられ、全て120,000粒子/細胞未満のウイルスを産生した。293細胞はAd5−dl309ウイルスを139,000粒子/細胞で、およびrAd−β−galウイルスを127,000粒子/細胞で産生した。HeLa細胞株およびA549細胞株におけるAd5−dl309の産生能力は、これらのヒト腫瘍細胞株が、E1−相補性細胞株の開発における使用の最良の候補であることを示唆している。
野生型E1Aの発現は、A549細胞の増殖能力を減少させ、そして血清枯渇条件下でアポトーシスをもたらすことが報告されている(Hubbersteyら,(2002)Cancer Gene Ther.9:321−329)。A549細胞におけるE1A発現に付随する毒性を制限するために、数個のE1A変異体を、rAdベクター産生のためのE1機能の安定的発現および相補について試験した。使用したE1A変異体(E1Adl1101、E1Adl1107およびE1Adl01/07)は、細胞周期の進行およびアポトーシスの誘起に必要とされる(図1)E1Aタンパク質の領域中の欠失を保持したが、他の初期ウイルスプロモーターの刺激のために必要とされるE1Aトランスアクチベーションドメインを損なっていなかった。特に、このE1Adl1101およびE1Adl1107変異体は、それぞれ細胞タンパク質p300/CBPおよび細胞タンパク質pRbへの結合に欠陥がある一方、E1Adl01/07変異体は、両方の細胞タンパク質への結合に欠陥がある。
選択されたクローン(E1Adl1101−1からE1Adl1101−5、E1Adl1107−1からE1Adl1107−5、E1Adl01/07−1からE1Adl01/07−5、E1Awt−1からE1Awt−5)のE1Aタンパク質レベルを、E1AのC−末端領域のエピトープを認識するE1A特異的モノクローナル抗体(Harlowら,(1985)J.Virol.55:533−546)を使用して、ウェスタンブロット分析によって決定した。このエピトープは、dl1101およびdl1107変異によっては、影響を受けなかった。ウェスタン分析は、E1Aタンパク質の発現レベルは、クローン間で大きく変化することを示した。加えて、発現された野生型または変異体E1Aタンパク質の量は産生収量と相関しなかった。野生型E1AまたはE1Adl1101変異体を発現する全ての細胞クローンは、発現されるE1Aタンパク質の量にかかわらず、非効率的な産生クローンであった。ほとんど検出不可能なレベルのE1Aタンパク質を発現するが、E1Adl1107細胞クローンの中では、E1Adl1107−1のみが効率的な産生クローンであった。E1Adl1107−1細胞クローンは、増殖が貧弱(産生細胞株には望ましくない特徴)なので、さらには分析しなかった。E1Adl01/07細胞クローンもまた種々のレベルのタンパク質を示し、最良の産生細胞クローンであるE1Adl01/07−4は、比較的高レベルで発現するE1Adl01/07−5よりも低いレベルでタンパク質を発現する。
異なる産生収量についての生物学的基礎をさらに特徴づけるために、同様なレベルでE1Aタンパク質を発現したE1Awt−2細胞クローンおよびE1Adl01/07−5細胞クローンを選択した。E1Adl01/07−4細胞クローンは、あらゆる他の株よりも、ウイルス粒子を効率よく産生したので(表2を見よ)、さらなる特徴づけのために、これも選択した。
E1Aによるアポトーシスの誘発は、pRbおよびp300/CBPの結合と関連し、E2Fおよびp53転写因子の活性化をもたらすことが示されている(Queridoら, (1997)J.Virol.71:3526−3533)。選択された産生細胞クローンにおけるE2Fおよびp53活性レベルを測定するために、コンセンサスp53プロモーターかまたはE2Fプロモーターのいずれかの制御下にルシフェラーゼ遺伝子を置いたレポータープラスミドを作製した。p53およびE2Fプロモーター活性はE1Awt−2クローンにおいて上昇しているのが見出だされた(表4を参照のこと)。対照的に、E1Adl01/07−4およびE1Adl01/07−5クローンにおいては、p53およびE2F活性レベルは、コントロールのA549細胞と同様であった。
E1Adl01/07−4クローンは、複製欠損アデノウイルスを小規模形式で産生することができたが、収量はE1Bを使用した相補によってさらに改善され得ることが推論された。E1B相補の後のE1Adl01/07−4細胞の産生収量を試験するために、E1Adl01/07−4細胞を、2つの異なる濃度で(1×10e8粒子/mlおよび5×10e8粒子/ml)、E1B−19KおよびE1B55Kを個別にかまたは共にかのいずれかで発現する一連のE1アデノウイルス変異体で感染させた。E1Adl01/07−4細胞に、機能のない切断型E1Aおよび野生型E1Bを産生するウイルス(Ad−NT1010)を感染させるとAd5−dl309に匹敵するウイルスを産生することが見出された(表5を見よ)。対照的に、E1Aを発現するがE1Bは発現しない変異体ウイルス(AdE1B−)は、試験ウイルスの両濃度における感染の後にも細胞当たり約55,000粒子しか産生しなかった。これらの結果は、E1Bの相補は産生収量を増加させることを示唆した。E1B領域の寄与をさらに明確にするために、E1B−19K(dl1520)かまたはE1B−55K(AdE1B−19K−)かのいずれかのみを発現するウイルスをE1Adl01/07−4細胞での増殖に関して試験した。E1B−19Kを発現するウイルスの産生性は、Ad5−dl309のそれより相当に低かった一方、E1B−55K発現ウイルスは、Ad5−dl309よりも高いレベルで生産した。
rAdベクターの産生の間のRCA生成を試験するため、RCAを含まないウイルスロットを最初の接種材料として使用して、およそ1×10e9細胞を含有するcell factoryで増殖させたSL0003細胞かまたは293細胞のいずれかにおいて、rAd−β−galを連続的に継代した。RCAの検出のために使用したバイオアッセイは、rAd−β−gal、1.7×10e10粒子当たり野生型ウイルス1粒子の感度レベルを有した(上記を参照のこと)。5回の連続継代の後、RCAは293細胞から精製されたrAd−β−galウイルス中に検出されたが、SL0003細胞から精製されたrAd−β−gal中にはRCAは検出されなかった。PCR分析によって、293細胞からこのRCAアッセイで検出されたウイルスは、Ad5による汚染よりはむしろ組換えから生じたことが確認された。
本明細書において例示されるように、2つの別個の発現カセットを取り込んだヒト細胞株(「SL0003」と呼ぶ)を作製した。ここで、この第一の発現カセットは、dl01/07欠失を含むアデノウイルスE1A遺伝子を含み、第2の発現カセットは、A549腫瘍細胞においてアデノウイルスの複製を相補するための選択されたウイルス機能および細胞機能を提供する、アデノウイルスE1B−55K遺伝子を含む。SL0003細胞株におけるE1相補の最適化は、別々のE1AおよびE1B発現カセットの連続的付加を用いて達成された。SL0003細胞株においては、E1Adl01/07変異体遺伝子が、E1A機能を提供しそして野生型E1Aに付随する細胞毒性を減少させるために、構成的に発現される。SL0003細胞株におけるE1B機能は、E1B−55K遺伝子の構成的発現によって提供され;E1B−19K遺伝子は含まない。E1AおよびE1Bカセットの分離、変異体E1A遺伝子、およびE1B−55K遺伝子のみの使用は、相同組換えかまたは非相同組換えのいずれかを通した完全なE1領域の再構成およびその後のRCAの産生の可能性を排除した。SL0003細胞株において相補のために用いられたアデノウイルス配列は、293細胞における野生型E1アデノウイルス配列と比較して、広範に改変されているが、SL0003細胞株は293細胞株から得られるものに匹敵するウイルス産生レベルでrAdベクターを産生し、かつ検出可能なRCAを生成しないことが示された。
この実施例は、高力価の複製欠損、ヘルパー非依存性組換えウイルスの産生のためのE1A、E1bおよびE2b相補性細胞株の有用性を例示する。
(組織培養)
A549、CHO−Kl、Saos2、HeLa、およびHepG2細胞は、全てATCCから購入した。C7細胞(Amalfitanoら(1996)PNAS 93:3352−3356)はU.of MichiganのJ.Chamberlainから好意的に提供された。ヒトトノン嚢眼線維芽細胞(HOF細胞と呼ぶ)は、Perkinsら(2002)Arch.Ophthalmol.120:941−9に記載されているようにして単離した。クローン4細胞の開発は実施例1に上記した;このクローンは、指定されたクローン、E1A01/07−4iである。A549、C7、およびHepG2細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)を追加したダルベッコ改変イーグル培地(DME)で維持した。HeLa細胞は5%FBSを追加したイーグル最小必須培地(MEM)で維持した。CHO−K1およびSaos2細胞は、10%FBSを追加したHams F12/DME培地で維持した。HOF細胞はDME+20%FBSで維持した。クローン4細胞は、350μg/mlのG418(Geneticin、Invitrogen)を追加したDME+10%FBSで維持した。
クローン4細胞を、10μgの直線化プラスミドpMGCMVE2bPolでCaPO4トランスフェクション法を用いてトランスフェクトした(Sambrookら Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1998)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)。トランスフェクションに続けて、細胞を150μg/mlハイグロマイシンを追加したDME+10%血清中で選抜した。このプールは、薬剤選抜下で限界希釈クローニングをうけ、そしてクローン3D8を選択した。クローン3D8を、150μg/mlのハイグロマイシンおよび350μg/mlのG418を追加したDME+10%血清で増殖させた。
15M15細胞を、上記のクローン3D8に由来した。3D8細胞を、10μgの直線化pVITRO2IRESPuroE1b(図4)で、先のようにCaPO4トランスフェクション法を用いてトランスフェクトした。クローン15を、初め、0.2μg/mlピューロマイシンで処理したトランスフェクトされたプールから単離した。クローン15M15を、さらにクローン15から限界希釈単離を通して単離し、そして350μg/mlのG418、150μg/mlのハイグロマイシン、および0.2μg/mlのピューロマイシンを追加したDME+10%FBS中で増殖させた。
アデノウイルスE2bポリメラーゼ配列を、プラスミドpACN(Willsら(1995)Can.Gene Ther.2:191−197)から、最初の3つの上流アミノ酸「MAL」(Shuら(1988)Virol.165:348−356によって記載される)を、残りのAd 5 E2bポリメラーゼコード配列に加えるプライマーを利用したPCRによって、単離した。プライマーは制限部位もまた加え、この制限部位は、このPCR断片がベクターpMG(InvivoGen、San Diego、CA)の、CMVプロモーターの下流のBam HI制限部位へクローニングされることを可能にする。生じたプラスミドはpMGCMVE2Bpolと名づけられた(図5)。CMVに駆動される全長のE2bポリメラーゼコード配列に、IRES配列および選抜のために使用されるハイグロマイシン耐性遺伝子が続く。
GFCBの構築は以前に記載されている(Cheneyら,(1998)Can.Res.58:2331−2334)。手短に言えば、これは、ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーター/エンハンサーから増強型緑色蛍光タンパク質(eGFP、Clontech、Palo Alto、CA)およびE1欠失領域からAd 2 TPL cDNAを発現し、E1b/PIXウイルスポリAシグナルを、そのメッセージを終了させるために利用する、E1、PIX、E3欠失ウイルスである。CONGもまた以前に記載されている。これは、GFCBと類似するE1/E3欠失ウイルスバックボーンにおいて,欠失E3領域中の3’から5’の方向でeGFPを駆動するコンセンサスp53応答エレメントを含む。ウイルス構築物CGAB、42GC、46GC、および2GCPは、全て、プラスミドpEGFP−N1(Clontech、Palo Alto、CA)から単離した同一の発現カセットを利用する。カセットは、ヒトCMV即時初期プロモーター/エンハンサー、増強型緑色蛍光タンパク質遺伝子、およびSV40初期mRNAポリアデニル化シグナルを含む。CGABについては、この発現カセットは、GFCBに含まれるものを置き換える。42GC、46GCおよび2GCPは、全て、それらの発現カセットを、ウイルスバックボーンのE3欠失領域において5’から3’の方向に含む。42GCおよび2GCPは、また、pIXは完全なままで含み、E1aおよびE1bを欠失している。46GCは、E1は完全であるウイルスで、かつ複製能力を有する。2GCPウイルスはまた、Amalfitanoら(1998)((1996)PNAS 93:3352−3356)に報告されるように、E2bウイルスDNAポリメラーゼ領域におよそ600bpの欠失を有し、外因性のE2bポリメラーゼタンパク質なしでは、このウイルスは複製不能である。
E2bポリメラーゼ発現レベルを決定するために、クローン3C4、3C9、3D8および親クローン4およびA549細胞を、10cmデッシュに接種した。細胞をインキュベートし、そして2日間増殖し、そして次に採取した。Bradfordアッセイ(Bio−Rad cat#500−0006)によって決定した、等量のタンパク質を4−12%NuPAGE Bis−トリス ゲル(Invitrogen、Carlsbad、CA)にロードした。タンパク質を移し、そしてフィルターをブロックし、次に1:2,000希釈のウサギ抗E2bポリメラーゼポリクローナル抗体(Dr Padmanabhan、U.Kansasによって提供された)とともにインキュベートし、続けて1:2000希釈のヤギ抗−ウサギIgG−HRP(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA)とインキュベートした。フィルターを、SuperSignal West Pico Chemiluminescent kit(Pierce、Rockford、IL)で発光させ、そしてフィルムに曝した。このフィルターをストリッピング(strip)し、1:10,000希釈のβ−アクチン(Sigma、St.Louis、MO)で再プローブし、続けて1:2,000希釈のヒツジ抗マウスIgG−HRP(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)で処理した。
操作した細胞のウイルス産生性を評価するために、選抜したクローンを10cmデッシュに接種し、そして5×108p/mlの2GCPウイルスで感染させた。感染時のカウントのために、追加のコントロールプレートを接種した。感染させた細胞を感染後3−4日に採取した。この時、細胞の大多数が集まり、そしてプレートから離れており、このことはウイルス複製が起こっていたことを示していた。ウイルスは細胞溶解産物から、3サイクルの凍結/解凍および遠心分離による細胞破片の除去によって、放出された。次に、ウイルスを、先に記載されるように、カラムクロマトグラフィーによって精製し、そして定量した(Shabramら(1997)Hum.Gene Ther.8:453−465)。
細胞を6ウェルプレートに接種し、そして細胞が80−90%の集密度(confluency)に達するまでインキュベーターに戻した。次に、細胞を、ウェル当たり3mlの総容量となるように、5×108P/mlのウイルスにより三連で感染させた。細胞を、CytoFluorシリーズ4000マルチウェルプレートリーダー(PerSeptive Biosystems)を使用してGFPトランスジーン発現について測定し、そしてHammamatsu 3CCDアナログカメラおよびコントローラーを使用して撮影した。GFP蛍光を、バックグラウンドの蛍光を差し引いた、各時点での三連のウェルの相対細胞蛍光値の平均、および+/−標準偏差としてプロットする。週に2回、0.5mlの新鮮な培地を、ウェル毎に全ての細胞に対して加えた。
E1b発現について分析するクローンを、6ウェルプレートに接種し、そしてそれらがおよそ80−90%の集密度に達するまでインキュベートし、そして増殖させた。この時点で、細胞を5×108P/mlのGFCBウイルスまたはCONGウイルスのいずれかで、三連で感染させた。次に、感染させた細胞を、感染から48時間後に、Hammamatsu 3CCDアナログカメラおよびコントローラを使用して撮影し、そして、450nmの励起および508nmの放射にセットした、CytoFluorシリーズ4000マルチウェルプレートリーダー(PerSeptive Biosystems)を使用して、GFP蛍光についてアッセイした。二連のウェルからの平均値+/−標準偏差を、GFCBに由来する蛍光値に対するCONG蛍光の比として、プロットした。
(E1a相補細胞へのE2bポリメラーゼの追加)
クローン4細胞のE2bポリメラーゼ発現プラスミドpMGCMVE2bPolでのトランスフェクションに続いて、耐性細胞をハイグロマイシンでの処理によって選抜し、そして限界希釈精製によって個々のクローンを単離した。細胞溶解産物のウェスタン分析を、E2bポリメラーゼを表す140kdのバンドを特異的に発現するクローンを選択するのに使用した。図7Aでは、クローン3C4,3C9、および3D8の全てがE2b Polと予測されるバンドを示す。このバンドは、親クローン#4にも、全てのクローンが基づくA549細胞にも存在しない。全てのレーンに、Bradfordアッセイによって決定され、かつβ−アクチン検出によって確かめた等量の総タンパク質濃度をロードした。レーン当たり等しい総タンパク質をロードしたので、ポリメラーゼバンドの密度は、特定のクローンにおけるその発現のレベルを反映している。特定のクローンがポリメラーゼ欠失ウイルス2GCPを産生する能力と比較した場合、発現されるポリメラーゼの量とクローンの産生性の間には正の相関がある(図7B)。クローン4は、E2bポリメラーゼを発現するように操作されていないので、ポリメラーゼ欠失ウイルスの増殖を支援することができず、ウイルスは回収されなかった。クローン3D8は、最も多量のポリメラーゼタンパク質を発現し、そして細胞当たり最も多くのウイルスも産生した。このクローンを、さらなる分析のために選択し、そしてアデノウイルスE1bタンパク質を導入および発現させるための親株として使用した。
クローン3D8を、E1bをコードするプラスミドpVITRO2IRESPuroE1bでトランスフェクトし、そして先のように、ピューロマイシン処理に耐性の個々のクローンを選抜および単離した。機能アッセイを、ウイルスCONGおよびGFCBを使用して、単離過程の間、E1b機能を検出するために使用した。二連の6ウェルプレートまで増殖したクローンを限界希釈によって単離し、そして5×10e8P/mlのCONGまたはGFCBウイルスで感染させた。48時間後、感染クローンからのGFP発現を、細胞蛍光分析によって測定した。GFCBでの感染は、クローンのアデノウイルスに対する潜在的に異なる被感染能力を制御するために使用され、そしてGFP蛍光のE1b媒介性減少の比が確立され得る。CONGは、GFP発現を駆動するのに、p53コンセンサス配列応答エレメント(p53RE)を使用するウイルスである。これらのクローンは、p53発現について陽性である、A549細胞に基づいている。それゆえ、3D8などのA549に基づくクローンの感染は、p53媒介性のGFPの発現をもたらす。アデノウイルスE1b 55kdタンパク質は、p53を結合し、そしてそれを転写アクチベーターから転写リプレッサーへ変換することが知られている(YewおよびBerk(1992)Nature 357:82−85,RothおよびDobbelstein(2003)Methods MoI.Biol.234:135−149)。E1b 55を発現するクローンは、次にp53を拘束し、そしてCONG感染細胞からのGFP蛍光を防止するか減少させるはずである。GFP発現を駆動するp53REは、GFCBにおいて使用されるCMVよりも弱いプロモーターであるが、E1bタンパク質を発現するクローンは、発現されるE1b 55の量に依存して、CONGからのGFP発現をさらに減少させるはずである。図8Aでは、GFCBウイルスかまたはCONGウイルスのいずれかで感染させた、親細胞株3D8および3つのクローンが撮影されており、そしてこれらのGFP蛍光レベルを、細胞蛍光分析を使用して定量した。図8Bでは、GFCBに対するCONGのGFP蛍光の比をプロットした。値の変化は、細胞からのE1b 55kdの発現の差による、親3D8クローンに対しての、CONG感染からのGFP発現の種々の程度の減少を表す。クローン15が、最も大きな差を示し、これが最も多い量のE1bタンパク質を発現していることが示唆された。既にE1a機能を発現するA549に基づくクローンにE1b 55を追加することが、細胞におけるウイルス増殖の産生性の増大を導くことが先に示された。図8のクローンを、2GCPウイルスの増殖における産生性について試験した場合、GFP発現の程度および産生性の間には、逆相関が見られた(図8C)。より多いE1b 55タンパク質の発現から生じたに違いない最も減少したGFP発現を示したクローンが、E1bを発現しない親クローン3D8に比較して、最も増加した産生性を有した(図8C)。これらの結果に基づいて、クローンC15を、さらなる試験のために選択した。
クローン15を、G418、ハイグロマイシン、およびピューロマイシンの組み合わせ選抜培地中でのサブ−クローニングによるさらなる精製に供した。この組み合わせは、E1a、E1bおよびE2b機能の保持を選抜するはずである。2GCPウイルスを用いた産生性アッセイによる、単離されたクローンのさらなるスクリーニングが、新規の相補性細胞株の最終的な選択として、15M15の選抜をもたらした。図9Aは、親クローン3D8ならびにC7細胞と比較した、クローン15M15の2GCP増殖の産生性を示す。C7細胞は、E2bポリメラーゼも発現するようにさらに操作された、Ad E1相補293細胞に基づいている(Amalfitanoら(1996)PNAS 93:3352−3356)。この15M15細胞株は、ポリメラーゼ欠失ウイルス2GCPを、その293に基づく対応物(C7)またはそのE1b欠損親細胞株3D8よりも高度に増殖させることができる。この新しい株のゲノム安定性を、それらの完全な選抜培地混合物かまたは培地のみのいずれかの中で、細胞を連続継代および感染させることによって試験した。図9Bは、2つの異なる2GCPウイルスの用量で感染させた細胞について、継代1、5、および10回目での、各条件下の、ウイルス産生性の結果を示す。このクローンの、ポリメラーゼ欠失ウイルスを高収量まで増殖させるために必要とされるアデノウイルス機能を相補する能力は、10回の継代まで非常に安定なようであり、培地中に選抜薬剤がなくても安定なようである。ウェスタン分析を使用して、1回目、5回目、および10回目の継代で単離された細胞からE1aおよびE2bポリメラーゼタンパク質を検出した。図9Cに示されるように、選抜培地の非存在下でさえ、両方のタンパク質もまた、10回の継代にわたって安定なようであった。
図6は、本研究で使用されるウイルスの概略図を示す。示されるE3およびE1欠失は、2種を除く全てのウイルスで同じである。コントロールウイルスGFCBについては、E1欠失が、pIXコード配列へ、追加の700塩基対延長し、E1b/pIXウイルスポリAシグナルがGFP発現カセットのために使用されることを可能にしている。ウイルス46GCは、E1野生型であり、そして複製能力を有する。CMV−GFP−pA発現カセットは、制限酵素分析、PCR、および配列決定によって確かめられるように、CGAB、42GC、2GCPおよび46GCウイルスについて同一である。CONGウイルスでは、この発現カセット中のCMVプロモーターが、GFP遺伝子を駆動するために、p53コンセンサス応答エレメントによって置き換わっている。2GCP中のE2bポリメラーゼ欠失は、その増殖を、E2bポリメラーゼを発現する細胞株に限る。2GCPは、最初、E2bポリメラーゼ発現細胞株C7中で単離された。
感染細胞溶解産物を、アデノウイルスタンパク質発現について、Ad5に対するポリクローナル抗体を使用したウェスタン分析によって分析した。相補産生細胞株15M15を、GFCB、CGAB、42GC、および2GCPで感染させた。全ての4つのウイルスは、この細胞株で良好に複製することができ、そして全てが予期されるウイルスバンドを示した(図10A)。
インビトロでGFP蛍光を比較する場合、同一発現カセットを有するにもかかわらず、構築物には一貫した序列があった。GFP蛍光は一貫して2GCPで最も大きく、続いて42GC、そして次にCGABであった。これは、図11に示されるようなCHO細胞、Saos2細胞、およびヒト眼線維芽(HOF)細胞を含む、複数の細胞型で見られた。細胞蛍光値を三連の感染の平均値+/−標準偏差として、図11A−DにはHOF細胞およびSaos2細胞について、示された構築物で感染させた細胞の代表的写真とともに、図11E−FにはCHO細胞について、示された構築物で感染させた細胞の代表的写真とともに、プロットした。新しい構築物の高いレベルのインビトロの発現は、長期間にわたって持続した。
Claims (66)
- 単離ヒト細胞株であって、該細胞株は、以下:
(a)p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1核酸分子;ならびに
(b)アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2核酸分子
を含む、細胞株。 - 前記第2核酸分子は、アデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、請求項1に記載の細胞株。
- 単離ヒト細胞株であって、該細胞株は、以下:
(a)p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1核酸分子;
(b)アデノウイルスE2Bポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第2核酸分子;ならびに
(c)アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第3核酸分子
を含む、細胞株。 - 前記第3核酸分子は、アデノウイルスE1B−55Kタンパク質およびアデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の細胞株。
- 請求項1に記載の細胞株であって、前記E1Aタンパク質は、以下:
(a)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49
に対応する第1の欠失;ならびに
(b)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)
に対応する第2の欠失
を含む、細胞株。 - 請求項3または請求項4に記載の細胞株であって、前記E1Aタンパク質は、以下:
(a)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49
に対応する第1の欠失;ならびに
(b)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)
に対応する第2の欠失
を含む、細胞株。 - 請求項1に記載のヒト細胞であって、前記E1Aタンパク質は、以下:
(a)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)に対応する第1の欠失;ならびに
(b)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)に対応する第2の欠失
を含む、細胞。 - 請求項3または請求項4に記載のヒト細胞であって、前記E1Aタンパク質は、以下:
(a)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)に対応する第1の欠失;ならびに
(b)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)に対応する第2の欠失
を含む、細胞。 - アデノウイルスE2a DNA結合タンパク質、アデノウイルスE2b末端タンパク質前駆体、またはアデノウイルスE2b IVa2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第3核酸分子をさらに含む、請求項1に記載の細胞株。
- アデノウイルスE4タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第3核酸分子をさらに含む、請求項1に記載の細胞株。
- 前記アデノウイルスE4タンパク質は、アデノウイルスE4遺伝子のORF 6、ORF 3およびORF6/7によってコードされる、請求項10に記載の細胞株。
- L4 100Kによってコードされるアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第3核酸分子をさらに含む、請求項1に記載の細胞株。
- アデノウイルスE2a DNA結合タンパク質、アデノウイルスE2b末端タンパク質前駆体、またはアデノウイルスE2b IVa2タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第4核酸分子をさらに含む、請求項3に記載の細胞株。
- アデノウイルスE4タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第4核酸分子をさらに含む、請求項3に記載の細胞株。
- 前記アデノウイルスE4タンパク質は、アデノウイルスE4遺伝子のORF6、ORF3およびORF6/7によってコードされる、請求項14に記載の細胞株。
- L4 100Kによってコードされるアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第4核酸分子をさらに含む、請求項3に記載の細胞株。
- 前記第1核酸分子および前記第2核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、請求項1または請求項5に記載の細胞株。
- 前記第1核酸分子、前記第2核酸分子および前記第3核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、請求項3または請求項4に記載の細胞株。
- 前記第1核酸分子、前記第2核酸分子および前記第3核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、請求項6に記載の細胞株。
- 前記細胞株は、A549細胞株、HCT−15細胞株、IGROV−1細胞株、HeLa細胞株、U87細胞株、W162細胞株または293−D22細胞株に由来する、請求項1に記載の細胞株。
- 前記細胞株は、A549細胞株、HCT−15細胞株、IGROV−1細胞株、HeLa細胞株、U87細胞株、W162細胞株または293−D22細胞株に由来する、請求項3または請求項4に記載の細胞株。
- 前記第1核酸分子は、配列番号26に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1、請求項3または請求項4に記載の細胞株。
- 前記第2核酸分子は、配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の細胞株。
- 前記第2核酸分子は、配列番号23に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項3または請求項4に記載の細胞株。
- 前記第3核酸分子は、配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の細胞株。
- 前記第3核酸分子は、配列番号25に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項4に記載の細胞株。
- アクセッション番号PTA−6231の下でAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託された、SL0003の名称を有する組換えアデノウイルス産生細胞株。
- アクセッション番号PTA−6663の下でAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託された、SL0006の名称を有する組換えアデノウイルス産生細胞株。
- 組換えアデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するためのプラスミド系であって、該プラスミド系は、別個の容器に、以下:
(a)p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第1発現カセット;および
(b)アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第2発現カセット
を含む、プラスミド系。 - 前記第2核酸分子は、アデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、請求項29に記載のプラスミド系。
- 組換えアデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するためのプラスミド系であって、該プラスミド系は、別個の容器に、以下:
(a)p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第1発現カセット;
(b)アデノウイルスE2Bポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第2核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第2発現カセット;および
(c)アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第3核酸分子に作動可能に連結した調節エレメントを含む、第3発現カセット
を含む、プラスミド系。 - 前記第3核酸分子は、アデノウイルスE1B−55Kタンパク質およびアデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項31に記載のプラスミド系。
- 請求項29、請求項31または請求項32に記載のプラスミド系であって、前記E1Aタンパク質は、以下:
(a)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49
に対応する第1の欠失;ならびに
(b)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)
に対応する第2の欠失
を含む、プラスミド系。 - 複製欠損アデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するための方法であって、該方法は、ヒト細胞を第1核酸分子および第2核酸分子で形質転換させる工程を包含し、該第1核酸分子は、p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、そして該第2核酸分子は、アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法。
- 前記第2核酸分子は、アデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、請求項34に記載の方法。
- 複製欠損アデノウイルスの産生のためのヒト細胞を産生するための方法であって、該方法は、ヒト細胞を第1核酸分子、第2核酸分子および第3核酸分子で形質転換させる工程を包含し、該第1核酸分子は、p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該第2核酸分子は、アデノウイルスE2bポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、そして該第3核酸分子は、アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、方法。
- 前記第3核酸分子は、アデノウイルスE1B−55Kタンパク質およびアデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項36に記載の方法。
- 請求項34、請求項36または請求項37に記載の方法であって、前記E1Aタンパク質は、以下:
(a)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49
に対応する第1の欠失;ならびに
(b)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)
に対応する第2の欠失
を含む、方法。 - 前記第1核酸分子および前記第2核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、請求項34に記載の方法。
- 前記第1核酸分子、前記第2核酸分子および前記第3核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、請求項36または請求項37に記載の方法。
- 前記細胞は、A549細胞株、HCT−15細胞株、IGROV−1細胞株、HeLa細胞株、U87細胞株、W162細胞株または293−D22細胞株に由来する、請求項34、請求項36または請求項37に記載の方法。
- 前記第1核酸分子は、配列番号26に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項34、請求項36または請求項37に記載の方法。
- 前記第2核酸分子は、配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記第2核酸分子は、配列番号23に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項36または請求項37に記載の方法。
- 前記第3核酸分子は、配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記第3核酸分子は、配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項37に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスを産生するための方法であって、該方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたヒト細胞を、該細胞において該ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、該細胞は、以下:
(a)p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1核酸分子;ならびに
(b)アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第2核酸分子
を含む、方法。 - 前記第2核酸分子は、アデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない、請求項47に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスを産生するための方法であって、該方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたヒト細胞を、該細胞において該ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、該細胞は、以下:
(a)p300タンパク質ファミリーメンバーおよびpRbタンパク質ファミリーメンバーに対する結合に欠陥を有するアデノウイルスE1Aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第1核酸分子;
(b)アデノウイルスE2Bポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む第2核酸分子;ならびに
(c)アデノウイルスE1B−55Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第3核酸分子
を含む、方法。 - 前記第3核酸分子は、アデノウイルスE1B−55Kタンパク質およびアデノウイルスE1B−19Kタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記細胞を収集する工程および前記組換えアデノウイルスを回収する工程をさらに包含する、請求項47、請求項49または請求項50に記載の方法。
- 請求項47、請求項49または請求項50に記載の方法であって、前記E1Aタンパク質は、以下:
(a)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基4〜25(dl1101);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基36〜49
に対応する第1の欠失;ならびに
(b)以下:
(i)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基111〜123(dl1107);または
(ii)E1A 289Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)およびE1A 243Rタンパク質のアミノ酸残基124〜127(dl1108)
に対応する第2の欠失
を含む、方法。 - 前記第1核酸分子および前記第2核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、請求項47に記載の方法。
- 前記第1核酸分子、前記第2核酸分子および前記第3核酸分子は、調節エレメントに各々作動可能に連結している、請求項49または請求項50に記載の方法。
- 前記細胞は、A549細胞株、HCT−15細胞株、IGROV−1細胞株、HeLa細胞株、U87細胞株、W162細胞株または293−D22細胞株に由来する、請求項47、請求項49または請求項50に記載の方法。
- 前記第1核酸分子は、配列番号26に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項47、請求項49または請求項50に記載の方法。
- 前記第2核酸分子は、配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記第2核酸分子は、配列番号23に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項49または請求項50に記載の方法。
- 前記第3核酸分子は、配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記第3核酸分子は、配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記組換えアデノウイルスは、複製欠損である、請求項47、請求項49または請求項50に記載の方法。
- 前記組換えアデノウイルスは、異種遺伝子を含む、請求項47、請求項49または請求項50に記載の方法。
- 組換えアデノウイルスを産生するための方法であって、該方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたSL0003の名称を有するヒト細胞株を、該細胞株において該ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、該ヒト細胞株は、アクセッション番号PTA−6231の下でAmerican Type Culture Collectionに寄託されている、方法。
- 組換えアデノウイルスを産生するための方法であって、該方法は、組換えアデノウイルスベクターでトランスフェクトされたSL0006の名称を有するヒト細胞株を、該細胞株において該ウイルスゲノムの複製を可能にする条件下で培養する工程を包含し、ここで、該ヒト細胞株は、アクセッション番号PTA−6663の下でAmerican Type Culture Collectionに寄託されている、方法。
- 前記組換えアデノウイルスは、複製欠損である、請求項63または請求項64に記載の方法。
- 前記組換えアデノウイルスは、異種遺伝子を含む、請求項63または請求項64に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US63556104P | 2004-12-13 | 2004-12-13 | |
US67448805P | 2005-04-25 | 2005-04-25 | |
PCT/US2005/045097 WO2006065827A2 (en) | 2004-12-13 | 2005-12-12 | Cell lines for production of replication-defective adenovirus |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010199416A Division JP2011015696A (ja) | 2004-12-13 | 2010-09-06 | 複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞株 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008522630A true JP2008522630A (ja) | 2008-07-03 |
JP2008522630A5 JP2008522630A5 (ja) | 2010-10-21 |
JP4621743B2 JP4621743B2 (ja) | 2011-01-26 |
Family
ID=36282846
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007545722A Expired - Fee Related JP4621743B2 (ja) | 2004-12-13 | 2005-12-12 | 複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞株 |
JP2010199416A Withdrawn JP2011015696A (ja) | 2004-12-13 | 2010-09-06 | 複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞株 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010199416A Withdrawn JP2011015696A (ja) | 2004-12-13 | 2010-09-06 | 複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞株 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7851218B2 (ja) |
EP (1) | EP1831352B1 (ja) |
JP (2) | JP4621743B2 (ja) |
CN (1) | CN101208425B (ja) |
AT (1) | ATE516343T1 (ja) |
CA (1) | CA2590943C (ja) |
MX (1) | MX2007007145A (ja) |
WO (1) | WO2006065827A2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015500007A (ja) * | 2011-11-24 | 2015-01-05 | バイロメッド カンパニー リミテッド | アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途 |
KR20180118560A (ko) * | 2017-04-21 | 2018-10-31 | (주)지뉴인텍 | 비복제 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법 |
JP2022507857A (ja) * | 2018-11-21 | 2022-01-18 | メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ | アデノウイルスおよびアデノウイルスを使用するための方法 |
JP2023001374A (ja) * | 2017-07-10 | 2023-01-04 | ジェン-プローブ・インコーポレーテッド | 試料割り当てパラメータを使用した核酸増幅のための分析システムおよび方法 |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2003242585A1 (en) | 2002-05-27 | 2003-12-12 | Per Sonne Holm | Novel use of adenoviruses and nucleic acids coding therefor |
EP1689445B1 (de) | 2003-11-14 | 2015-02-25 | Per Sonne Holm | Neue verwendung von adenoviren und dafür codierende nukleinsäuren |
CN101208425B (zh) | 2004-12-13 | 2011-01-26 | 坎吉有限公司 | 产生复制缺陷型腺病毒的细胞系 |
CA2610360A1 (en) * | 2004-12-31 | 2006-07-06 | Per Sonne Holm | E1-minus adenoviruses and use thereof |
CA2633087C (en) | 2005-12-12 | 2014-12-02 | Canji, Inc. | Adenoviral expression vectors |
US9913832B2 (en) * | 2009-10-12 | 2018-03-13 | Rajabrata Sarkar | Accelerating thrombus resolution through augmentation of p53 activity |
WO2013052811A2 (en) | 2011-10-05 | 2013-04-11 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectors and methods of use |
IN2014DN03005A (ja) | 2011-10-05 | 2015-05-08 | Genvec Inc | |
CN103987726B (zh) | 2011-10-05 | 2017-10-03 | 金维克有限公司 | 猴(大猩猩)腺病毒或腺病毒载体及其使用方法 |
EP2855511B1 (en) | 2012-05-29 | 2019-07-24 | GenVec, Inc. | Herpes simplex virus vaccine |
CN105209054A (zh) | 2013-04-18 | 2015-12-30 | 阿尔莫生物科技股份有限公司 | 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法 |
JP7053453B2 (ja) | 2015-08-25 | 2022-04-12 | アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 疾患及び障害を治療するためのインターロイキン10の使用方法 |
AU2021251718A1 (en) * | 2020-04-07 | 2022-11-10 | Lung Biotechnology Pbc | Adenoviral expression vector and methods and cell lines for production |
CN113736780A (zh) * | 2020-05-28 | 2021-12-03 | 暨南大学 | 一种敲除p300基因的BCBL1细胞系及其构建方法与应用 |
CN112156181A (zh) * | 2020-09-29 | 2021-01-01 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种腺病毒四价疫苗 |
CN117264902A (zh) * | 2022-06-15 | 2023-12-22 | 上海元宋生物技术有限公司 | 一种腺病毒包装与生产细胞系的构建方法及应用 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6835557B1 (en) | 1980-01-08 | 2004-12-28 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human interferon-like polypeptides |
US6210939B1 (en) | 1993-10-25 | 2001-04-03 | Canji, Inc. | Recombinant adenoviral vector and methods of use |
TW442569B (en) | 1993-10-25 | 2001-06-23 | Canji Inc | Recombinant adenoviral vector |
US5837520A (en) | 1995-03-07 | 1998-11-17 | Canji, Inc. | Method of purification of viral vectors |
SI1445322T2 (sl) | 1995-06-15 | 2012-10-30 | Crucell Holland Bv | Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za gensko terapijo |
US6392069B2 (en) | 1996-01-08 | 2002-05-21 | Canji, Inc. | Compositions for enhancing delivery of nucleic acids to cells |
US5789244A (en) | 1996-01-08 | 1998-08-04 | Canji, Inc. | Compositions and methods for the treatment of cancer using recombinant viral vector delivery systems |
CA2177085C (en) | 1996-04-26 | 2007-08-14 | National Research Council Of Canada | Adenovirus e1-complementing cell lines |
US6248514B1 (en) | 1996-07-09 | 2001-06-19 | Canji, Inc. | Methods for measuring viral infectivity |
US6544769B1 (en) | 1996-12-13 | 2003-04-08 | Schering Corporation | Compostions comprising viruses and methods for concentrating virus preparations |
US6261823B1 (en) | 1996-12-13 | 2001-07-17 | Schering Corporation | Methods for purifying viruses |
US6146891A (en) | 1997-01-31 | 2000-11-14 | Schering Corporation | Methods for cultivating cells and propagating viruses |
DE69942708D1 (de) | 1998-02-17 | 2010-10-07 | Schering Corp | Virus enthaltende Zusammensetzungen und Methoden zur Konzentration von Viruspräparaten |
US6670188B1 (en) * | 1998-04-24 | 2003-12-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
US5994134A (en) | 1998-05-04 | 1999-11-30 | Canji, Inc. | Viral production process |
US6649158B1 (en) * | 1998-10-15 | 2003-11-18 | Canji, Inc. | Methods and compositions to induce antitumor response |
US7691370B2 (en) * | 1998-10-15 | 2010-04-06 | Canji, Inc. | Selectivity replicating viral vector |
US7001770B1 (en) | 1998-10-15 | 2006-02-21 | Canji, Inc. | Calpain inhibitors and their applications |
US6430595B1 (en) | 1999-05-20 | 2002-08-06 | Cisco Technology, Inc. | Method and apparatus for establishing a database used for correlating information gathered via SNMP |
US20020064860A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-05-30 | Schering Corporation | Method for purifying adenoviruses |
KR20060012661A (ko) | 2003-06-04 | 2006-02-08 | 캔지, 인크. | 인터페론 요법을 위한 방법 및 조성물 |
US7026164B2 (en) * | 2003-07-03 | 2006-04-11 | Cell Genesys, Inc. | Adenovirus packaging cell lines |
EP1691844B1 (en) | 2003-12-10 | 2011-03-23 | CANJI, Inc. | Methods and compositions for treatment of interferon-resistant tumors |
CN101208425B (zh) | 2004-12-13 | 2011-01-26 | 坎吉有限公司 | 产生复制缺陷型腺病毒的细胞系 |
DE112007000879A5 (de) | 2006-02-10 | 2009-01-15 | Freie Universität Berlin | Verfahren und Vorrichtung zum Präparieren von biologischen Proben |
-
2005
- 2005-12-12 CN CN2005800480722A patent/CN101208425B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-12 EP EP05853909A patent/EP1831352B1/en active Active
- 2005-12-12 CA CA2590943A patent/CA2590943C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-12 US US11/301,309 patent/US7851218B2/en active Active
- 2005-12-12 WO PCT/US2005/045097 patent/WO2006065827A2/en active Application Filing
- 2005-12-12 MX MX2007007145A patent/MX2007007145A/es unknown
- 2005-12-12 AT AT05853909T patent/ATE516343T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-12-12 JP JP2007545722A patent/JP4621743B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-09-06 JP JP2010199416A patent/JP2011015696A/ja not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6010024685, Mol. Ther., 2000, Vol.2, No.5, p.485−495 * |
JPN6010024686, J. Virol., 2000, Vol.74, No.13, p.6147−6155 * |
JPN6010024688, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1990, Vol.87, p.5883−5887 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015500007A (ja) * | 2011-11-24 | 2015-01-05 | バイロメッド カンパニー リミテッド | アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途 |
KR20180118560A (ko) * | 2017-04-21 | 2018-10-31 | (주)지뉴인텍 | 비복제 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법 |
KR20190067131A (ko) * | 2017-04-21 | 2019-06-14 | (주)지뉴인텍 | 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법 |
KR102122117B1 (ko) | 2017-04-21 | 2020-06-11 | (주)지뉴인텍 | 비복제 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법 |
KR102173189B1 (ko) | 2017-04-21 | 2020-11-02 | (주)지뉴인텍 | 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법 |
US11299713B2 (en) | 2017-04-21 | 2022-04-12 | Geneuin-Tech Co., Ltd. | Cell line for producing adenovirus and method of preparing the same |
JP2023001374A (ja) * | 2017-07-10 | 2023-01-04 | ジェン-プローブ・インコーポレーテッド | 試料割り当てパラメータを使用した核酸増幅のための分析システムおよび方法 |
JP2022507857A (ja) * | 2018-11-21 | 2022-01-18 | メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ | アデノウイルスおよびアデノウイルスを使用するための方法 |
JP7319368B2 (ja) | 2018-11-21 | 2023-08-01 | メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ | アデノウイルスおよびアデノウイルスを使用するための方法 |
US11746334B2 (en) | 2018-11-21 | 2023-09-05 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Adenoviruses and methods for using adenoviruses |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4621743B2 (ja) | 2011-01-26 |
CN101208425B (zh) | 2011-01-26 |
WO2006065827A3 (en) | 2006-10-12 |
US7851218B2 (en) | 2010-12-14 |
JP2011015696A (ja) | 2011-01-27 |
EP1831352B1 (en) | 2011-07-13 |
WO2006065827A9 (en) | 2006-08-24 |
MX2007007145A (es) | 2007-08-20 |
ATE516343T1 (de) | 2011-07-15 |
CA2590943A1 (en) | 2006-06-22 |
EP1831352A2 (en) | 2007-09-12 |
WO2006065827A2 (en) | 2006-06-22 |
CA2590943C (en) | 2013-10-22 |
US20060270041A1 (en) | 2006-11-30 |
CN101208425A (zh) | 2008-06-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4621743B2 (ja) | 複製欠損アデノウイルスの産生のための細胞株 | |
JP4210036B2 (ja) | ヒト細胞における組み換え蛋白質の生産 | |
US6365394B1 (en) | Cell lines and constructs useful in production of E1-deleted adenoviruses in absence of replication competent adenovirus | |
US8398968B2 (en) | Adenoviral expression vectors | |
US9404090B2 (en) | Adenovirus producing novel cell line and the use thereof | |
US20060292122A1 (en) | Adenoviral vectors for treating diseases | |
US6479290B1 (en) | Chimeric adenoviral vectors | |
Bernt et al. | A new type of adenovirus vector that utilizes homologous recombination to achieve tumor-specific replication | |
Fernandes et al. | Upstream bioprocess for adenovirus vectors | |
Fang et al. | Diminishing adenovirus gene expression and viral replication by promoter replacement | |
EP1135514B1 (en) | E1b-deleted adenoviral shuttle vectors | |
US6764674B1 (en) | Adenovirus E1B shuttle vectors | |
US20080089890A1 (en) | Methods of polypeptide production | |
WO2008143936A1 (en) | Methods of enhancing adenoviral delivery | |
Fernandes | Bioprocess Design of Canine Adenovirus Vectors for Gene Therapy Applications | |
WO2009006300A2 (en) | Production cell lines for adenoviral manufacturing | |
MXPA98004716A (en) | Complementary systems of adenoviral vectors and cell lines |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100506 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100806 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100813 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20100906 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100906 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101006 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101101 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131105 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |