JP2008522584A - Korean Ishidai Iridovirus gene and vaccine using the same - Google Patents
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Abstract
本発明は、韓国型イシダイイリドウイルスの免疫原性を有する蛋白質をコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされる蛋白質、該蛋白質から由来した合成ペプチド、該遺伝子を含む組み換え発現ベクター、該組み換えベクターを含む形質転換体、該形質転換体を不活性化させて製造した不活性化ワクチン及び該ワクチンを利用して魚類を免疫させる方法である。 The present invention includes a gene encoding a protein having the immunogenicity of a Korean type rainbow trout virus, a protein encoded by the gene, a synthetic peptide derived from the protein, a recombinant expression vector containing the gene, and the recombinant vector A transformant, an inactivated vaccine produced by inactivating the transformant, and a method of immunizing fish using the vaccine.
Description
本発明は、タイ類に感染して集団斃死を誘発するイシダイイリドウイルス（Ｒｏｃｋ Ｂｒｅａｍ ＩｒｉｄｏＶｉｒｕｓ；以下、ＲＢＩＶ）であって、韓国型分離株であるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１から分離された遺伝子、前記遺伝子を含む組み換え発現ベクター、前記発現ベクターを含む形質転換体、前記形質転換体で製造された不活性化ワクチン等に関する。 The present invention relates to a gene isolated from RBIV-KOR-TY1, which is a Korean-type isolate, which is a rock bream iridovirus (hereinafter referred to as RBIV), which infects Thailand and induces mass drowning. The present invention relates to a recombinant expression vector containing, a transformant containing the expression vector, an inactivated vaccine produced from the transformant, and the like.
タイ類は、高級魚種の１つであって、その需要が多くて、日本、韓国、中国などを含むアジア諸国で養殖されている。日本及び韓国の場合、刺身に対する嗜好度が高くて、養殖魚類の消費が増加しつつあり、養殖業は、国家の経済にも大きく寄与し、特に、排他的な保護水域が増えて行くにつれ、その重要性はますます大きくなっている。特に、韓国は、三面が海で囲まれており、東海岸、南海岸、西海岸、済州島一帯は、魚類の養殖に適した水質及び水温を保っており、疾病などの管理が徹底的に行われれば、タイ類の養殖業が発展する可能性は非常に高い。しかし、タイ類の養殖において、ウイルス性の疾病による集団斃死が大きな問題となってきた。
毎年、イリドウイルスの感染によるウイルス性疾病が発生することによって、数千万尾のタイ類が斃死し、また、前記のようなウイルス性疾病が一度発生すれば、治療が非常に難しいだけでなく、経済的な損失が大きく、漁村地域の養殖漁家に莫大な経済的な打撃を与えて、魚族資源の確保にも悪影響を及ぼしている。
イリドウイルスには、イリドウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、クロルイリドウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｃｈｌｏｒｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）、ラナウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｒａｎａｖｉｒｕｓ）及びリムフォキスティウイルス属（ｇｅｎｕｓ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉｖｉｒｕｓ）などの４種類の属が存在し、魚類に感染するイリドウイルスは、ラナウイルス属及びリムフォキスティウイルス属がある。このうち、魚類の大量斃死を誘発するイリドウイルスは、ラナウイルス属のイリドウイルスである。
タイ類、スズキ、ヒラメ及びブリなどの腎臓、脾臓、神経細胞または魚類免疫関連の細胞を感染させて、それらの感染魚類の大量斃死を誘発するイリドウイルスは、１９９７年までは韓国で発生しなかった疾病であるが、１９９８年の夏期に、南海岸の閉じ込め養殖場のイシダイの大量斃死が発生し始めて（Ｓｏｈｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈ，１３（２）：１２１〜１２７，２０００）、現在まで養殖漁民に相当の経済的な被害を与えている。
魚類イリドウイルスワクチンの開発は、イリドウイルスに感染された魚類の組織を磨砕及び濾過して、ＧＦ（Ｇｒａｎｔ Ｆｉｎ）細胞に接種した後、培養されたウイルスをホルマリンで不活性化させて使用する場合（Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ，ａｌ．，ＤＡＯ，３６（１）：７３〜７５，１９９９）以外には、遺伝子を利用したイリドウイルスワクチンの開発についての報告がいまだにないと確認された。
これにより、本発明者らは、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために有効に利用され得る遺伝子及び蛋白質を発見し、前記遺伝子を含む組み換えベクター、及び前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を製造し、これを不活性化させて組み換え不活性化ワクチンを製造することによって本発明を完成した。
Thailand is one of the high-class fish species, and its demand is high, and it is cultivated in Asian countries including Japan, Korea, China and so on. In Japan and Korea, the preference for sashimi is high, and the consumption of cultured fish is increasing, and the aquaculture industry greatly contributes to the national economy, especially as the number of exclusive protected water areas increases. Its importance is increasing. In particular, South Korea is surrounded on three sides by the sea, and the east coast, south coast, west coast, and Jeju Island area maintain water quality and water temperature suitable for fish farming, and thorough management of diseases, etc. If this is the case, the possibility of the development of Thai aquaculture is very high. However, mass mortality due to viral diseases has become a major problem in Thai farming.
Every year, viral diseases caused by infection with iridovirus cause tens of millions of Thais to die, and once such a viral disease occurs, treatment is not only very difficult. The economic loss is large, and the fishery fishermen in the fishing village area have been affected by a huge economic impact, and it has also had a negative effect on securing fish stocks.
There are four types of iridoviruses, such as genus Iridovirus, genus Chloririvirus, genus Ranavirus, and genus Lymphocystivus, such as genus Lymphocystivus. Infectious iridoviruses include the genus Ranavirus and the genus Rimfoxtyvirus. Among these, the iridovirus that induces massive moribund of fish is an iridovirus of the genus Ranavirus.
Iridoviruses that infect kidney, spleen, nerve cells or fish immunity-related cells such as Thais, sea bass, Japanese flounder and yellowtail and cause massive moribund of those infected fish will not occur in Korea until 1997 However, in the summer of 1998, large-scale drowning of sea bream in a confined farm on the south coast began to occur (Sohn et al. J. Fish Path, 13 (2): 121-127, 2000). Has caused considerable economic damage to farmed fishermen.
The development of a fish iridovirus vaccine is performed by grinding and filtering fish tissue infected with iridovirus, inoculating GF (Grant Fin) cells, and then inactivating the cultured virus with formalin. In other cases (Nakajima et al., DAO, 36 (1): 73-75, 1999), it has been confirmed that there are still no reports on the development of iridovirus vaccines using genes.
Thus, the present inventors have discovered a gene and protein that can be effectively used for the production of a preventive vaccine against iridovirus, and a recombinant vector containing the gene, and a transformant transformed with the recombinant vector. And inactivated it to produce a recombinant inactivated vaccine.
本発明は、既存の魚類イリドウイルスの不活性化ワクチンの短所である高いウイルス不活性化ワクチンの製造コスト及び、ウイルス継代によるウイルス濃度の減少によるワクチン製造用のイリドウイルス感染魚類組織の確保という問題を解決し、韓国型ＲＢＩＶ分離株であるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１をはじめとする、ＲＢＩＶに対する免疫反応の誘発能力に優れたＲＢＩＶに対する予防ワクチンを提供することを目的とする。
また、本発明は、前記のようなＲＢＩＶに対する予防ワクチンの製造のために利用されうるイリドウイルスの遺伝子及び蛋白質、前記蛋白質から由来したペプチド、前記遺伝子を含む組み換えベクター、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体及びそれから製造されたワクチンを提供することを目的とする。
The present invention relates to the production cost of a high virus inactivation vaccine, which is a disadvantage of the existing fish iridovirus inactivation vaccine, and to securing an iridovirus-infected fish tissue for vaccine production by reducing the virus concentration by virus passage. An object of the present invention is to provide a preventive vaccine for RBIV that solves the problem and has an excellent ability to induce an immune response to RBIV, including RBIV-KOR-TY1, which is a Korean-type RBIV isolate.
The present invention also provides an iridovirus gene and protein that can be used for the production of a preventive vaccine against RBIV as described above, a peptide derived from the protein, a recombinant vector containing the gene, and a recombinant vector transformed with the recombinant vector. It is an object of the present invention to provide a transformant and a vaccine produced therefrom.
本発明は、イリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードして、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために利用され得る韓国型イシダイイリドウイルスであるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子を提供する。
また、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれによりコードされる免疫原性蛋白質ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ蛋白質を提供する。
また、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をクローニングするために利用されるプライマ対を提供する。
また、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子を増幅させて得る方法を提供する。
また、本発明は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれを含む組み換え発現ベクターを提供する。
また、本発明は、前記ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
また、本発明は、前記形質転換された宿主細胞から、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子によりそれぞれコードされる組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを生産する方法を提供する。さらに具体的に、本発明は、前記形質転換された宿主細胞から前記組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを生産するに当たって、発現誘導剤の濃度及び処理時間などを最適化することによって前記組み換え蛋白質を量産する方法を提供する。
また、本発明は、前記形質転換された宿主細胞から生産された組み換え蛋白質ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを提供する。
また、本発明は、前述した本発明の形質転換された宿主細胞を不活性化させて、不活性化ワクチンを製造する方法、及びこれにより製造された不活性化ワクチンを提供する。
また、本発明は、前記の形質転換された宿主細胞を不活性化させて製造した、不活性化ワクチンを利用して魚類を免疫させる方法を提供する。
また、本発明は、前記の本発明の不活性化ワクチンを含むキットを提供する。
また、本発明は、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために利用され得るポリペプチドの断片を提供する。
The present invention relates to ORFs A, B, C, D of RBIV-KOR-TY1, which is a Korean-type idiidaylid virus that encodes an immunogenic protein of iridovirus and can be used for the production of a preventive vaccine against iridovirus. E, F and G genes are provided.
The present invention also relates to the immunogenic proteins ORF A, B, C, D, E encoded by each of the ORF A, B, C, D, E, F and G genes of RBIV-KOR-TY1 of the present invention. , F and G proteins are provided.
The present invention also provides a primer pair used for cloning ORF A, B, C, D, E, F and G genes of RBIV-KOR-TY1 of the present invention.
In addition, the present invention provides a method obtained by amplifying ORF A, B, C, D, E, F and G genes of RBIV-KOR-TY1 of the present invention.
The present invention also provides a recombinant expression vector comprising each of the RBIV-KOR-TY1 ORF A, B, C, D, E, F and G genes.
The present invention also provides a host cell transformed with an expression vector containing each of the RBIV-KOR-TY1 ORF A, B, C, D, E, F and G genes.
The present invention also provides recombinant proteins A, B, C, D encoded by ORF A, B, C, D, E, F and G genes of RBIV-KOR-TY1, respectively, from the transformed host cell. , E, F and G are provided. More specifically, in the present invention, in producing the recombinant proteins A, B, C, D, E, F, and G from the transformed host cell, the concentration and treatment time of the expression inducer are optimized. To provide a method for mass production of the recombinant protein.
The present invention also provides recombinant proteins ORF A, B, C, D, E, F, and G produced from the transformed host cell.
The present invention also provides a method for producing an inactivated vaccine by inactivating the above-described transformed host cells of the present invention, and an inactivated vaccine produced thereby.
The present invention also provides a method for immunizing fish using an inactivated vaccine produced by inactivating the transformed host cells.
The present invention also provides a kit comprising the inactivated vaccine of the present invention.
The present invention also provides polypeptide fragments that can be utilized for the production of prophylactic vaccines against iridoviruses.
本発明によれば、は、ＲＢＩＶに対するワクチンの製造に利用され得るＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の免疫原性蛋白質をコードする遺伝子、これによってコードされる免疫原性蛋白質、これから由来したペプチド、前記遺伝子を含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを含む形質転換体、前記形質転換体を利用して製造された不活性化ワクチンを提供することによって、イリドウイルスに対するワクチンの効果が優秀であり、かつ安価なイリドウイルスワクチンを提供することができる。 According to the present invention, there is provided a gene encoding an immunogenic protein of RBIV-KOR-TY1 that can be used for production of a vaccine against RBIV, an immunogenic protein encoded thereby, a peptide derived therefrom, A recombinant vector containing the recombinant vector, a transformant containing the recombinant vector, and an inactivated vaccine produced using the transformant, thereby providing an excellent vaccine effect against the iridovirus and an inexpensive iridovirus A vaccine can be provided.
以下、添付した図面を参照して、本発明を詳細に説明する。
本発明の第１態様によって、本発明は、イリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードして、イリドウイルスに対する予防ワクチンの製造のために利用され得る韓国型ＲＢＩＶであるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１から分離したＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子、及びそれらの配列相同体を提供する。
本発明者らは、韓国型ＲＢＩＶであるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の場合、ウイルスを構成する蛋白質数が１１８個以上であり、ゲノムＤＮＡのサイズが１１２,０８０ｂｐであって、現在まで報告された魚類イリドウイルスとは異なるということが確認され、前記ゲノムＤＮＡの配列を決定し、これを、コンピュータプログラムを利用して分析して、１１８個の可能なＯＲＦを確認した。そして、これらのＯＲＦから推論されたアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを利用してＧｅｎＢａｎｋのデータベースと比較・分析した結果、機能が公知の蛋白質と高い相同性を有する２９個のＯＲＦ及び、公知の配列と相同性を有していない３１個のＯＲＦを確認した（Ｄｏ ｅｔ，ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：３５１〜３６３，２００４：参考として全体が本願に統合される）。これらのの塩基配列の情報は、アクセッション番号第ＡＹ５３２６０６号としてＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録された。
前記のようなＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡの配列及びＯＲＦ情報に基づいて、本発明者らは、イリドウイルスの免疫原性蛋白質をコードして、イリドウイルスに対するワクチンの製造に有効なイリドウイルスの遺伝子を発見するために、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の１１８個のＯＲＦのうち、第一に、ウイルスの外側に存在して、魚類の免疫反応を誘導する可能性の高い構造蛋白質、第二に、細胞の表面に発現される蛋白質であって、ウイルスが増殖して生きている細胞と隣接する正常細胞とを堅く結合させる役割を行う蛋白質、第三に、ウイルスが感染された細胞でイリドウイルス蛋白質が合成されるとき、宿主細胞の外膜に存在する可能性の高いイリドウイルス蛋白質の遺伝子を発見することにした。
このために、前記１１８個のＯＲＦの塩基配列をアミノ酸配列に転写して、現在まで米国生物学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋに登録されたアミノ酸配列と比較・分析して、前記の３つの条件を満足する７個の遺伝子を選別して、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧと命名し、これらを本発明のイリドウイルスに対するワクチンの製造のために利用した。
前記のような分析を通じて選別された本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ遺伝子は、配列目録の配列番号１の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｂ遺伝子は、配列番号２の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｃ遺伝子は、配列番号３の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｄ遺伝子は、配列番号４の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｅ遺伝子は、配列番号５の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｆ遺伝子は、配列番号６の塩基配列を有し、ＯＲＦ Ｇ遺伝子は、配列番号７の塩基配列を有する。
一方、前記配列番号１、２、３、４、５、６または７の塩基配列で１以上の塩基置換、欠失、挿入及び／または付加されるか、または前記配列番号１、２、３、４、５、６または７の塩基配列と厳しいハイブリッド化の条件下でハイブリッド化する、前記配列番号１、２、３、４、５、６、または７の塩基配列と７０％以上の配列相同性を有する配列相同体も本発明に含まれる。
ハイブリッド化のための条件は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ．Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９））に開示されており、例えば、５×ＳＳＣ，５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１％のＳＤＳ，２５℃〜６８℃で数時間ないし一夜などの条件を利用できる。このとき、混成化温度は、さらに好ましくは、４５℃〜６８℃（ホルムアミドなし）、または３０℃〜４２℃（５０％のホルムアミド）が利用され、洗浄条件は、０.２×ＳＳＣ、４６℃〜６８℃を利用できる。
当業者であれば塩の濃度及び温度などの混成化条件を調節して、本発明のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子の塩基配列に対して、一定％以上の配列相同性を有するＤＮＡの 塩基配列を得ることができ、このようにして得られた配列相同体は、本発明の範囲に含まれる。
すなわち、本発明は、前記配列番号１、２、３、４、５、６、または７の塩基配列に対して７０％以上、好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子の配列相同体を含む。
本発明の第２態様によって、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子によってそれぞれコードされるイリドウイルスの免疫原性蛋白質であるＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ蛋白質及びこれらの配列相同体を提供する。
本発明のＯＲＦ Ａ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ａ蛋白質は、３７８個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４０,７３１.４８Ｄａであり、配列番号８のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、マンダリンフィッシュから由来したイリドウイルスであるＩＳＫＮＶのアミノ酸輸送子蛋白質と９５％以上のアミノ酸配列の相同性を有して、アミノ酸輸送子の機能を行うと推定される。
ＯＲＦ Ｂ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｂ蛋白質は、４５３個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４９,４７６.７９Ｄａであり、配列番号９のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＲＳＩＶ（Ｒｅｄ Ｓｅａ Ｂｒｅａｍ Ｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ）の主要カプシド蛋白質と９９％のアミノ酸配列の相同性を有して、主要カプシド蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｃ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｃ蛋白質は、５１５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、５７,０２６.９６Ｄａであり、配列番号１０のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＩＳＫＮＶの配列と８５％以上の配列相同性を有して、ＩｇＭ重鎖蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｄ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｄ蛋白質は、８０５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、８７,３３２Ｄａであり、配列番号１１のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＲＳＩＶのラミニン結合蛋白質の配列と９０％以上の配列相同性を有して、ラミニン結合蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｅ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｅ蛋白質は、２７５個のアミノ酸からなり、推定分子量は、３０,３３８.７４Ｄａであり、配列番号１２のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、７０％以上の高い配列相同性を有する配列が発見されず、蛋白質の機能性モチーフの検索結果、ミリスチル化された膜蛋白質と推定される。
ＯＲＦ Ｆ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｆ蛋白質は、２５８個のアミノ酸からなり、推定分子量は、２９,２７２.７０Ｄａであり、配列番号１３のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、相同性を有する配列が発見されなかった。
ＯＲＦ Ｇ遺伝子によりコードされるＯＲＦ Ｇ蛋白質は、４５４個のアミノ酸からなり、推定分子量は、４９,９７３.５６Ｄａであり、配列番号１４のアミノ酸配列を有する。ＧｅｎＢａｎｋの公知の配列データベースとの配列相同性を比較した結果、ＩＳＫＮＶの配列と９０％以上の配列相同性を有して、アンキリン反復配列（ＡＮＫＹＲＩＮ ＲＥＰＥＡＴＳ）と推定される。
また、本発明は、前記配列番号８ないし配列番号１４のアミノ酸配列で、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／または付加されるが、前記配列に７０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、イリドウイルスの免疫原性を有する蛋白質を含む。
好ましくは、本発明は、前記配列番号８ないし配列番号１４のアミノ酸配列に７０％以上、より好ましくは、８０％以上、さらに好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を有し、イリドウイルスの免疫原性を有する蛋白質を含む。
本発明の第３態様によって、本発明は、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧＤＮＡを得るために、これらの遺伝子をＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ（重合酵素の連鎖反応）により増幅させるために利用されるプライマ対を提供する。
前述したように、本発明者らは、イリドウイルスに対するワクチンの製造に利用され得るものとして選択されたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅させるために、各遺伝子のためのプライマ対を考案した。
前記プライマ対は、増幅されたＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をクローニングさせる発現ベクター内の制限酵素の部位を考慮して、両末端で適切な制限酵素の部位を有するように考案される。
本発明の好ましいプライマ対は、本発明で利用される好ましい発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）内の制限酵素の部位を考慮して、順方向プライマは、Ｎｈｅ Ｉの切断部位を有するように、そして、逆方向プライマは、Ｈｉｎｄ IIIの切断部位を有するように考案される。
しかし、本発明のプライマ対は、前記の切断部位以外に、ベクターｐＥＴ２８ａ内に存在する他の制限酵素の部位に相応する切断部位を有するように考案され、このようなプライマ対も本発明に含まれる。
また、本発明の前記ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子は、ｐＥＴ２８ａ以外の後述するような多様な発現ベクター内へクローニングされ得るので、このような多様なベクター内の制限酵素の切断部位に相応する多様な切断部位を有するように考案され、このようなプライマ対も本発明に含まれる。
ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のそれぞれのための好ましいプライマ対の塩基配列は、次の通りである：
ＯＲＦ Ａ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＧＴＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＴＧＴ ３’（配列番号１５）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＡＴＡ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ３’（配列番号１６）
ＯＲＦ Ｂ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＧＴ Ｇ ３’（配列番号１７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＴＧＣ ３’（配列番号１８）
ＯＲＦ Ｃ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＣＧＴ ＧＧＧ ＴＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＴＡＡ ３’（配列番号１９）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＴ ＡＣＧ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＴＧ ３’（配列番号２０）
ＯＲＦ Ｄ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＧ ＧＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ３’（配列番号２１）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＴＴＡ ＣＣＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ３’（配列番号２２）
ＯＲＦ Ｅ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡ ＡＴＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＴＡ ３’（配列番号２３）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ３’（配列番号２４）
ＯＲＦ Ｆ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＴＡＣ ＣＧＧ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＡＴＡ ３’（配列番号２５）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ３’（配列番号２６）
ＯＲＦ Ｇ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴＡ ＣＡＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ３’（配列番号２７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＧ ３’（配列番号２８）
また、前記の各遺伝子のためのプライマ対の配列またはその一部を含み、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子のＰＣＲ増幅に利用され得るプライマ対も本発明に含まれる。
本発明のプライマは、オリゴヌクレオチド合成器により合成して利用でき、このようなオリゴヌクレオチドの合成方法などは、当業界に公知されて利用されており、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）やＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）のような文献に開示されている。
本発明の第４態様によって、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用して、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を得る方法を提供する。
本発明の方法は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の全体ゲノムＤＮＡを鋳型として、前記本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用してＰＣＲを行い、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを増幅させる工程、及び増幅された各遺伝子を分離する工程を含む。
本発明の方法に利用されるウイルスゲノムＤＮＡの分離、ＰＣＲ及び増幅された遺伝子の分離方法などは、当業界に公知されて利用されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）のような文献に開示されている。
簡単に要約すると、ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、鋳型としてウイルスの全体ゲノムＤＮＡと適切な重合酵素及びプライマ対でＰＣＲ反応物を形成し、これをＰＣＲ反応器で変性、アニール化及び延長反応させることによって行われる。
本発明の方法で有効な重合酵素は、ＥＸ Ｔａｑ重合酵素であるが、必ずしもこれに制限されるものではなく、変性、アニール化及び延長反応のための適した反応温度及び反応時間は、当業者ならば容易に決定して利用できる。好ましくは、本発明の方法の変性反応は、９４℃で４５秒間行われ、アニール化反応は、６０℃で４５秒間行われ、延長反応は、７２℃で４５秒間行われる。
このように増幅されたＤＮＡを適切な制限酵素、好ましくは、Ｎｈｅ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIで処理し、アガロースゲルで電気泳動して増幅されたＤＮＡバンドを確認し、これからＤＮＡを精製することによって、発現ベクターにクローニングされる各遺伝子が得られる。
このような本発明の方法により得られたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子は、組み換えＯＲＦ ＡないしＧ蛋白質の生成に利用される組み換え発現ベクターの製造に利用され得る。
本発明の第５態様によって、本発明は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを含む組み換え発現ベクターを提供する。
本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を挿入して組み換え発現ベクターを製造するためのベクターは、遺伝子の配列がベクター内に挿入された後、このベクターが宿主内に感染して、宿主細胞内で所望の遺伝子を発現し、所望の蛋白質を生産できる発現用ベクターであれば、何れも利用できる。このような発現ベクターは、１以上の選択性マーカー、プロモータ配列などを含み、発現ベクターの例としては、ｐＥＴ２８ｃ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＥＴ２８ａなどがあるが、必ずしもこれらに限定されるものではなく、このうち、原核細胞用の発現ベクターが本発明に好ましく、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、 米国）が特に好ましい。
プラスミドなどのベクターに本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを挿入する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１.５３（１９８９）に記載されている。
本発明で利用された組み換え発現ベクターの製造を簡単に要約すると、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを、前記の本発明のオリゴヌクレオチドプライマ対を利用してＰＣＲにより増幅させた後、それらの遺伝子及び発現ベクターを同じ制限酵素で分解処理し、前記遺伝子のそれぞれを適切なリガーゼ、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを利用して発現ベクターにライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させることによって、ＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれのための組み換え発現ベクターＡないしＧを製造する。
本発明の組み換え発現ベクターの一例として、ＯＲＦ Ｂ遺伝子を含むベクターｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｂが図１に示されている。
このように製造された組み換え発現ベクターＡないしＧを、宿主細胞の形質転換に利用できる。
本発明の第６態様によって、本発明は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれを含む組み換え発現ベクターＡないしＧで形質転換された宿主細胞ＡないしＧを提供する。
本発明に利用され得る宿主細胞としては、本発明の組み換え発現ベクターに適しており、形質転換され得る細胞であれば可能であり、当業界で一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ菌株などが利用され得るが、必ずしもこれに限定されるものではない。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ ２１等）が宿主細胞として本発明に利用される。
本発明の組み換えベクターＡないしＧを宿主細胞に導入する方法は、例えば、燐酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧなどの化学的処理による方法のような当業界に公知された方法を利用でき、これらの方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１.５３（１９８９）などの文献に開示されている。
好ましくは、燐酸カルシウム法が本発明で利用され、簡単に要約すると、宿主細胞と組み換え発現ベクターとを混合して、氷で３０分間反応させた後、４２℃で９０秒間処理して熱衝撃を加え、次いで、氷で９０秒間放置する。次いで、形質転換体を３７℃で約１時間培養した後、抗生剤の入っているプレートに塗抹して培養した後、組み換え発現ベクターを含む形質転換体を選別する。
本発明の第７態様によって、本発明は、前記形質転換された宿主細胞Ａないし宿主細胞Ｇを適切な栄養培地で培養する工程を含んで、前記形質転換された宿主細胞Ａないし宿主細胞Ｇから本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを量産する方法を提供する。
形質転換された宿主細胞から組み換え蛋白質の生産は、一般的に、宿主細胞の成長に必要な炭素源などの栄養供給源を含有した栄養培地で、組み換え蛋白質の生産に適した培養条件下で形質転換された宿主細胞を培養することによって行われる。
本発明の方法において、形質転換体の培養のための栄養培地は、Ｅ．ｃｏｌｉのような、本発明に利用された宿主細胞によって選択される。Ｅ．ｃｏｌｉの場合、ＬＢ培地などが一般的に利用される。
本発明の方法において、形質転換体のための培養条件は、本発明の組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧが量産されるように選択されねばならないところ、本発明者らは、発現誘導剤であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）の濃度、処理時間及び抗生剤の濃度を異ならせて発現程度を調べ、本発明の組み換え蛋白質の量産のための適した培養条件を確認した。
その結果、本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧを量産するための形質転換された宿主細胞ＡないしＧの適した培養条件は、形質転換体の培養物のＯＤ６００値が０.６になったとき、ＩＰＴＧ ０.５ｍＭないし２０ｍＭを処理した後に４時間以上培養すると確認された。好ましくは、最適の培養条件は、ＩＰＴＧの１ｍＭ〜１０ｍＭを処理した後、４〜６時間培養すると確認された。しかし、このような範囲を多少逸脱した培養条件も、本発明の組み換え蛋白質の量産を誘導すれば、本発明に利用可能であり、本発明に含まれる。
本発明の第８態様によって、本発明は、前述したような本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧの培養により生産された組み換え蛋白質ＡないしＧを提供する。
前述したように、形質転換宿主細胞を適した培養条件下で培養した後、その培養物から所望の組み換え蛋白質を分離及び精製することによって、所望の組み換え蛋白質が得られる。
形質転換細胞の培養物から組み換え蛋白質を分離及び精製する方法は、当業界では公知のものであり、簡略に説明すると、細胞培養物の遠心分離により形質転換細胞を集め、これを滅菌ＰＢＳのような適当な緩衝液に懸濁した後、超音波処理のような方法で細胞を破壊し、遠心分離して宿主細胞の内容物を得た後、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過、等電点クロマトグラフィのような公知の方法により所望の蛋白質を分離及び精製できる。
前記のような分離及び精製により得られた本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧは、魚類を兔役させるためのワクチンの製造に利用され得る。
本発明の第９態様によって、本発明は、本発明の組み換え発現ベクターＡないしＧでそれぞれ形質転換されて、本発明の組み換え蛋白質ＡないしＧをそれぞれ量産する形質転換宿主細胞ＡないしＧを不活性化させて、不活性化ワクチンＡないしＧを製造する方法、及び前記方法により製造された不活性化ワクチンＡないしＧを提供する。また、本発明は、不活性化ワクチンＡないしＧのうち、少なくとも２つを含むワクチンの組み合わせを提供する。
本発明の不活性化ワクチンの製造方法は、本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを不活性化剤で処理して、宿主細胞の感染可能性を除去する工程を含む。
不活性化ワクチンの製造方法は、当業界では公知のものであり、好ましくは、本発明方法は、本発明の形質転換宿主細胞を培養して組み換え蛋白質を発現させる工程、及び前記形質転換宿主細胞の培養物を不活性化剤で処理する工程を含む。さらに好ましくは、本発明の方法は、本発明の形質転換宿主細胞を培養して組み換え蛋白質を発現させる工程、宿主細胞培養物の遠心分離により細胞ペレットを得る工程、及び前記ペレットの懸濁液に不活性化剤を処理する工程を含む。
一般的な不活性化剤としては、例えば、ホルマリン、グルタルジアルデヒド、β−プロピオンラクトンなどがあり、ワクチン原液の製造以前または製造以後に添加・混合して使用する。ホルマリンを使用する場合、その添加量は、約０.０００４〜０.７％（ｖ／ｖ）であり、不活性化温度は、約２℃〜３７℃であり、不活性化時間は、約２日〜１８０日である。
本発明の不活性化ワクチンの製造方法のために、前述したような任意の公知の不活性化剤を利用して、本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを処理でき、好ましくは、ホルマリンを利用する。本発明の方法において好ましいホルマリンの添加量は、０.１％〜０.７％（ｖ／ｖ）であり、さらに好ましくは、０.５％である。本発明の方法において好ましい不活性化剤の処理時間は、３日以上であり、さらに好ましくは、３日である。本発明の方法において好ましい不活性化処理の温度は、４℃である。
前記のような本発明の方法によって、不活性化剤で本発明の形質転換宿主細胞ＡないしＧを処理することによって、本発明の組み換え不活性化ワクチンＡないしＧが得られる。
このようにして得られた本発明の組み換え不活性化ワクチンＡないしＧは、イシダイをはじめとする魚類を兔役させるために、単独で、または多様な組み合わせで利用され得る。
本発明で使用できる不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２つを含み、好ましくは、不活性化ワクチンＢとＣとの組み合わせ、不活性化ワクチンＢとＤとの組み合わせ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥの組み合わせ、及び不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧの組み合わせが挙げられ、このような組み合わせは、形質転換体により生産される組み換え蛋白質の機能を考慮して、組み換え蛋白質Ｂを基本とし、これに類似した機能を行う蛋白質を添加する方式で組み合わせたものであって、前記例示された４つの組み合わせ以外に、他の多様な組み合わせも本発明のワクチンの組み合わせに含まれる。さらに好ましくは、本発明の不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧの組み合わせである。
前記のような本発明の不活性化ワクチンＡないしＧは、魚類を兔役させるための投与量の２倍の濃度でイシダイ稚魚に投与してその斃死率を観察した結果、イシダイ稚魚の斃死が全く発生せず、その安全性が確認された。
本発明の第１０態様によって、本発明は、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧ、またはそれらの組み合わせを魚類に投与することを含む、魚類を免疫させる方法を提供する。
本発明の不活性化ワクチンにより兔役させ得る魚類は、タイ類、スズキ、ヒラメ及びブリなどを含み、このうちタイ類が好ましく、特に、イシダイが好ましい。
本発明の不活性化ワクチンを利用して魚類を免疫させる方法は、本発明のワクチンを、腹腔内、筋肉内、または皮下接種または浸透法、敬具投与などを利用して魚類に投与する工程を含む。好ましくは、本発明の不活性化ワクチンは、筋肉内注射により投与される。
本発明の免疫方法に利用され得る本発明の不活性化ワクチンの組み合わせは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも何れか１つを含み、好ましくは、不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２つを含み、さらに好ましくは、不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含み、最も好ましくは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含む。
本発明の不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも２以上を利用して魚類を免疫させる場合、前記２以上の不活性化ワクチンは、混合された後に魚類に投与されることが好ましい。
魚類を兔役させるとき、本発明の不活性化ワクチンの投与量は、組み換え蛋白質量が魚類の重量１ｋｇ当り２００μｇの（２００μｇの組み換え蛋白質／ｋｇ体重）濃度となるように、一回投与当り０.０１ｍｌないし０.５ｍｌを投与することが好ましい。
一方、本発明の第１１態様によって、本発明は、本発明の前記不活性化ワクチンを含むキットを提供する。
本発明のキットは、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧのうち少なくとも何れか１つを含み、好ましくは、２以上の不活性化ワクチンを含む。好ましくは、本発明のキットは、不活性化ワクチンＢとＣ、不活性化ワクチンＢとＤ、不活性化ワクチンＡ、Ｂ、及びＥ、または不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含み、最も好ましくは、本発明のキットは、不活性化ワクチンＢ、Ｆ及びＧを含む。
本発明のキットには、キットに含まれた不活性化ワクチンの投与についての説明書が含まれ得る。
本発明のキット内に含まれる不活性化ワクチンが２以上である場合、本発明の不活性化ワクチンＡないしＧは、あらかじめ混合された形態でキットに含まれてもよく、または、キット内のそれぞれの容器に個別的に含まれてもよい。不活性化ワクチンがそれぞれ別途の容器に含まれた場合、ユーザは、キット内の使用説明書によってそれぞれの不活性化ワクチンを混合して使用できる。
本発明の第１２態様によって、本発明は、本発明のＯＲＦ ＡないしＧ蛋白質のアミノ酸配列の一部を有し、イリドウイルスの免疫原性を有するペプチドを提供する。
本発明のペプチドは、本発明のＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＤ、Ｆ及びＧ遺伝子によりコードされる６個のアミノ酸配列を分析して、第一に、抗原性が高く、第二に、表面に露出されており、第三に、親水性などの３つを満足させる部分を選別することによって得られた。
本発明のペプチドは、天然または合成であってもよく、合成ペプチドは、ペプチド合成器などを利用して合成できる。
本発明によって、本発明の各ＯＲＦ蛋白質のために選択されたペプチド配列は、次の通りである：
ＯＲＦ Ａ：ＡＷＰＬＦＤＤＲＭＲＶＤＱＣＲＢＩ（配列番号２９）
ＯＲＦ Ｂ：ＴＬＱＳＨＫＱＬＹＳＤＹＲＴＥＣ（配列番号３０）
ＡＰＰＤＲＤＤＤＲＷＴＶＰＴＧＣＲＢＩＶ（配列番号３１）
ＯＲＦ Ｃ：ＰＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＣ（配列番号３２）
ＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＹＣ（配列番号３３）
ＯＲＦ Ｄ：ＱＶＤＲＳＧＡＫＶＰＳＥＡＰＣ（配列番号３４）
ＣＡＭＲＳＲＤＰＬＹＤＫＶＫ（配列番号３５）
ＯＲＦ Ｆ：ＹＡＲＡＲＧＳＴＨＩＲＲＱＫＶＣＲＢＩＶ（配列番号３６）
ＯＲＦ Ｇ：ＣＳＰＥＴＲＮＳＮＦＫＨＳＶＴＹ（配列番号３７）
ＤＭＳＨＩＴＫＥＭＡＬＮＴＫＱＨＴＣＲＢＩＶ（配列番号３８）
このような本発明のペプチドは、優れた免疫原性を有して、イリドウイルスに対するワクチンの製造に有効に利用され得る。
以下で、実施例を参考にして、本発明をさらに詳細に説明し、下記の実施例は、単に例示の目的として開示されるものであり、本発明の範囲を制限しようとするものではない。
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
According to the first aspect of the present invention, the present invention was isolated from RBIV-KOR-TY1, which is a Korean RBIV that encodes an immunogenic protein of iridovirus and can be used for the production of a preventive vaccine against iridovirus. RBIV-KOR-TY1 ORF A, B, C, D, E, F and G genes and their sequence homologues are provided.
In the case of RBIV-KOR-TY1, which is a Korean type RBIV, the present inventors have 118 or more proteins constituting the virus, and the size of the genomic DNA is 112,080 bp. It was confirmed that it was different from the iridovirus, and the genomic DNA was sequenced and analyzed using a computer program to identify 118 possible ORFs. As a result of comparing and analyzing the amino acid sequences inferred from these ORFs with the GenBank database using the BLAST program, 29 ORFs having high homology with known proteins and the known sequences Thirty-one ORFs having no homology were identified (Do et al., Virology, 325: 351-363, 2004: all incorporated herein by reference). Information on these base sequences was registered with NCBI GenBank as Accession No. AY532606.
Based on the genomic DNA sequence and ORF information of RBIV-KOR-TY1 as described above, the present inventors encode an immunogenic protein of iridovirus and are effective in the production of a vaccine against iridovirus. Among the 118 ORFs of RBIV-KOR-TY1, firstly, a structural protein that exists outside the virus and is likely to induce a fish immune response, and secondly , A protein expressed on the surface of a cell that plays a role in tightly binding a living cell and an adjacent normal cell by proliferating the virus, and third, an iridovirus in a virus-infected cell When the protein was synthesized, I decided to discover a gene for an iridovirus protein that is likely to be present in the outer membrane of the host cell.
For this purpose, the nucleotide sequence of the 118 ORFs is transcribed into an amino acid sequence, and compared with the amino acid sequence registered in the GenBank of the National Center for Biological Information (NCBI) up to now, the above three conditions Seven genes satisfying the above were selected and named ORF A, B, C, D, E, F and G, and these were used for the production of a vaccine against the iridovirus of the present invention.
The RBIV-KOR-TY1 ORF A gene of the present invention selected through the above analysis has the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the ORF B gene has the base sequence of SEQ ID NO: 2. The ORF C gene has the base sequence of SEQ ID NO: 3, the ORF D gene has the base sequence of SEQ ID NO: 4, the ORF E gene has the base sequence of SEQ ID NO: 5, and the ORF F gene is The ORF G gene has the base sequence of SEQ ID NO: 7.
On the other hand, one or more base substitutions, deletions, insertions and / or additions in the base sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 or SEQ ID NO: 1, 2, 3, More than 70% sequence homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7 that hybridizes with the nucleotide sequence of 4, 5, 6 or 7 under severe hybridization conditions Sequence homologues having are also included in the present invention.
The conditions for hybridization are described in, for example, Current Protocols in Molecular Biology Vol. 1 (John Wiley and Sons, Inc.) and Molecular Cloning 2nd. Ed. (Sambrook et al. (1989)), and conditions such as 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 1% SDS, 25 ° C. to 68 ° C. for several hours to overnight can be used. At this time, the hybridization temperature is more preferably 45 ° C. to 68 ° C. (no formamide) or 30 ° C. to 42 ° C. (50% formamide), and the washing conditions are 0.2 × SSC, 46 ° C. ˜68 ° C. can be used.
Those skilled in the art can adjust the hybridization conditions such as salt concentration and temperature to obtain a DNA base sequence having a certain sequence homology to the base sequence of the ORF A to G gene of the present invention. Sequence homologues thus obtained are within the scope of the present invention.
That is, the present invention is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably, with respect to the base sequence of SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7. Includes sequence homologues of ORF A to G genes of RBIV-KOR-TY1 having a sequence homology of 95% or more.
According to a second aspect of the present invention, the present invention is an immunogenic protein of iridovirus encoded by ORF A, B, C, D, E, F and G genes of RBIV-KOR-TY1 of the present invention, respectively. ORF A, B, C, D, E, F and G proteins and their sequence homologues are provided.
The ORF A protein encoded by the ORF A gene of the present invention consists of 378 amino acids, has an estimated molecular weight of 40,731.48 Da, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. As a result of comparing the sequence homology with the known sequence database of GenBank, it has 95% or more amino acid sequence homology with the ISKNV amino acid transporter protein derived from mandarin fish, Presumed to perform the function.
The ORF B protein encoded by the ORF B gene consists of 453 amino acids, has an estimated molecular weight of 49,476.79 Da, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9. As a result of comparing the sequence homology with a known GenBank sequence database, it is estimated to be a major capsid protein having 99% amino acid sequence homology with the major capsid protein of RSIV (Red Sea Iridovirus).
The ORF C protein encoded by the ORF C gene consists of 515 amino acids, has an estimated molecular weight of 57,026.96 Da, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10. As a result of comparing the sequence homology with a known GenBank sequence database, it is estimated to be an IgM heavy chain protein having a sequence homology of 85% or more with the ISKNV sequence.
The ORF D protein encoded by the ORF D gene consists of 805 amino acids, has an estimated molecular weight of 87,332 Da, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11. As a result of comparing the sequence homology with a known GenBank sequence database, it is estimated to be a laminin-binding protein having a sequence homology of 90% or more with the sequence of RSIV laminin-binding protein.
The ORF E protein encoded by the ORF E gene consists of 275 amino acids, has an estimated molecular weight of 30,338.74 Da, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12. As a result of comparing the sequence homology with a known GenBank sequence database, a sequence having a high sequence homology of 70% or more was not found, and the protein functional motif search result was estimated to be a myristylated membrane protein. The
The ORF F protein encoded by the ORF F gene consists of 258 amino acids, has an estimated molecular weight of 29,272.70 Da, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13. As a result of comparing the sequence homology with the known GenBank sequence database, no sequence having homology was found.
The ORF G protein encoded by the ORF G gene consists of 454 amino acids, has an estimated molecular weight of 49,973.56 Da, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14. As a result of comparing the sequence homology with GenBank's known sequence database, it is estimated that the sequence has 90% or more sequence homology with that of ISKNV and is an ankyrin repeat sequence (ANKYRIN REPEATS).
In the present invention, one or more amino acid substitutions, deletions, insertions and / or additions are made in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 14, but the sequence has 70% or more sequence homology. It includes a protein having an amino acid sequence and having immunogenicity of an iridovirus.
Preferably, the present invention has a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 to SEQ ID NO: 14. And a protein having the immunogenicity of an iridovirus.
According to the third aspect of the present invention, in order to obtain the RBIV-KOR-TY1 ORF A to GDNA of the present invention, these genes are obtained from the genomic DNA of RBIV-KOR-TY1 by PCR (polymerase linkage). The primer pair utilized to amplify by (reaction) is provided.
As described above, the present inventors have selected ORF A, B, C, D, E, F and G genes of RBIV-KOR-TY1 selected as those that can be used for the production of a vaccine against iridovirus. In order to amplify from, a primer pair for each gene was devised.
The primer pair has appropriate restriction enzyme sites at both ends, taking into account the restriction enzyme sites in the expression vector that clone the amplified ORF A, B, C, D, E, F and G genes. It is devised as follows.
The preferred primer pair of the present invention considers the restriction enzyme site in the preferred expression vector pET28a (Novagen, USA) utilized in the present invention so that the forward primer has a Nhe I cleavage site, and The reverse primer is devised to have a Hind III cleavage site.
However, the primer pair of the present invention is devised to have a cleavage site corresponding to the site of other restriction enzymes present in the vector pET28a in addition to the above-mentioned cleavage sites, and such a primer pair is also included in the present invention. It is.
Further, since the ORF A, B, C, D, E, F and G genes of the present invention can be cloned into various expression vectors as described later other than pET28a, the limitations within such various vectors. It is devised to have various cleavage sites corresponding to the enzyme cleavage sites, and such primer pairs are also included in the present invention.
Preferred primer pair base sequences for each of the ORF A, B, C, D, E, F and G genes are as follows:
ORF A: Forward primer-5 ′ GCT AGC ATG GCA CCG TGT GTA
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT TTA ATA CCC CTG TAA
ORF B: Forward primer-5 ′ GCT AGC ATG TCT GCA ATC
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT TTA CAG GAT AGG
ORF C: Forward primer-5 ′ GCT AGC TAC CGT GGG TAA
ORF D: Forward primer-5 ′ GCT AGC TCA CCC ACG GTG TCA
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT TAC TCG TTA CCG
ORF E:
ORF F:
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT CTG TAG GAT CCG
ORF G: Forward primer-5 ′ GCT AGC ATG CAT GTA CAT
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT CTA CGT CTT ATC
Also included in the present invention is a primer pair that contains the sequence of a primer pair for each of the above genes or a part thereof and can be used for PCR amplification of ORF A, B, C, D, E, F, and G genes. .
The primer of the present invention can be synthesized and used by an oligonucleotide synthesizer, and a method for synthesizing such an oligonucleotide is known in the art and used, for example, see Current Protocols in Molecular Biology Vol. 1 (John Wiley and Sons, Inc.), Sambrook, J, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989).
According to a fourth aspect of the present invention, the present invention provides a method for obtaining the ORF A to G gene of RBIV-KOR-TY1 using the oligonucleotide primer pair of the present invention.
In the method of the present invention, PCR is performed using the oligonucleotide primer pair of the present invention, using the whole genomic DNA of RBIV-KOR-TY1 as a template, and each of the ORF A to G genes of RBIV-KOR-TY1 is amplified. And a step of separating each amplified gene.
Isolation of viral genomic DNA, PCR, and isolation of amplified genes used in the method of the present invention are known and used in the art. For example, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989).
In short, gene amplification by PCR involves forming a PCR reaction with the entire genomic DNA of the virus as a template and the appropriate polymerase and primer pairs, which are then denatured, annealed and extended in a PCR reactor. Is done by.
The polymerization enzyme effective in the method of the present invention is EX Taq polymerization enzyme, but is not necessarily limited thereto. Suitable reaction temperatures and reaction times for denaturation, annealing, and extension reactions are known to those skilled in the art. If so, it can be easily determined and used. Preferably, the modification reaction of the method of the present invention is performed at 94 ° C. for 45 seconds, the annealing reaction is performed at 60 ° C. for 45 seconds, and the extension reaction is performed at 72 ° C. for 45 seconds.
The DNA amplified in this manner is treated with an appropriate restriction enzyme, preferably Nhe I and Hind III, electrophoresed on an agarose gel to confirm the amplified DNA band, and the DNA is purified therefrom, thereby expressing the DNA. Each gene cloned into the vector is obtained.
The RBIV-KOR-TY1 ORF A to G gene obtained by the method of the present invention can be used for the production of a recombinant expression vector used for the production of recombinant ORF A to G protein.
According to a fifth aspect of the present invention, the present invention provides a recombinant expression vector comprising each of the RBIV-KOR-TY1 ORF A to G genes.
The vector for producing the recombinant expression vector by inserting the ORF A or G gene of RBIV-KOR-TY1 of the present invention is the method in which the vector is inserted into the vector and then the vector is infected into the host. Any expression vector that can express a desired gene in a host cell and produce a desired protein can be used. Such expression vectors include one or more selectable markers, promoter sequences, etc., and examples of expression vectors include, but are not necessarily limited to, pET28c, pGEX-4T-1, pET28a, and the like. Of these, expression vectors for prokaryotic cells are preferred in the present invention, and pET28a (Novagen, USA) is particularly preferred.
Methods for inserting each of the RBIV-KOR-TY1 ORF A to G genes of the present invention into vectors such as plasmids are described in, for example, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratories. 1.53 (1989).
Briefly summarizing the production of the recombinant expression vectors utilized in the present invention, each of the RBIV-KOR-TY1 ORF A to G genes was amplified by PCR using the oligonucleotide primer pair of the present invention described above. Thereafter, the genes and the expression vector are digested with the same restriction enzymes, and each of the genes is ligated to the expression vector using an appropriate ligase, for example, T4 DNA ligase, so that ORF A to G Recombinant expression vectors A to G for each of the genes are produced.
As an example of the recombinant expression vector of the present invention, a vector pET28a / RBIV-KOR-TY1-B containing the ORF B gene is shown in FIG.
The recombinant expression vectors A to G thus produced can be used for host cell transformation.
According to a sixth aspect of the present invention, the present invention provides host cells A to G transformed with recombinant expression vectors A to G each containing ORF A to G genes of RBIV-KOR-TY1.
Any host cell that can be used in the present invention is suitable for the recombinant expression vector of the present invention and can be transformed. Although E. coli strains can be used, the present invention is not necessarily limited thereto. Preferably, E.I. E. coli (M15, JM109, BL21 etc.) is used in the present invention as a host cell.
As a method for introducing the recombinant vector A to G of the present invention into a host cell, for example, a method known in the art such as a calcium phosphate method, an electroporation method, a method by chemical treatment such as PEG can be used, These methods are disclosed in documents such as Sambrook, J et al., Molecular Cloning, A Laboratory, Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1.53 (1989).
Preferably, the calcium phosphate method is utilized in the present invention and briefly summarized: a host cell and a recombinant expression vector are mixed and reacted with ice for 30 minutes, followed by treatment at 42 ° C. for 90 seconds to effect thermal shock. Add, then leave on ice for 90 seconds. Next, the transformant is cultured at 37 ° C. for about 1 hour, smeared on a plate containing an antibiotic and cultured, and then a transformant containing the recombinant expression vector is selected.
According to a seventh aspect of the present invention, the present invention includes a step of culturing the transformed host cell A to host cell G in a suitable nutrient medium, and the transformed host cell A to host cell G is transformed from the transformed host cell A to host cell G. Provided is a method for mass-producing the RBIV-KOR-TY1 recombinant proteins A, B, C, D, E, F and G of the present invention.
Recombinant protein production from transformed host cells is typically performed in a nutrient medium containing a nutrient source, such as a carbon source, necessary for the growth of the host cell, under culture conditions suitable for the production of the recombinant protein. This is done by culturing the transformed host cell.
In the method of the present invention, the nutrient medium for culturing the transformant is E. coli. Selected by the host cell utilized in the present invention, such as E. coli. E. In the case of E. coli, LB medium or the like is generally used.
In the method of the present invention, the culture conditions for the transformant must be selected so that the recombinant proteins A, B, C, D, E, F and G of the present invention are mass-produced. Examines the degree of expression by varying the concentration of IPTG (isoprophylthio-β-D-galactoside), the treatment time, and the concentration of antibiotics, which is an expression inducer, and suitable culture conditions for mass production of the recombinant protein of the present invention It was confirmed.
As a result, suitable culture conditions for the transformed host cells A to G for mass production of the recombinant proteins A to G of the present invention are as follows. When the OD600 value of the transformant culture becomes 0.6, It was confirmed that the cells were cultured for 4 hours or longer after treatment with 0.5 to 20 mM IPTG. Preferably, the optimal culture conditions were confirmed to be 4-6 hours after treatment with 1-10 mM IPTG. However, culture conditions slightly deviating from such a range can be used in the present invention if they induce mass production of the recombinant protein of the present invention, and are included in the present invention.
According to an eighth aspect of the present invention, the present invention provides recombinant proteins A to G produced by culturing the transformed host cells A to G of the present invention as described above.
As described above, the desired recombinant protein can be obtained by culturing the transformed host cell under suitable culture conditions and then separating and purifying the desired recombinant protein from the culture.
Methods for separating and purifying recombinant proteins from transformed cell cultures are well known in the art. Briefly, transformed cells are collected by centrifuging the cell culture and are treated as sterile PBS. After suspending in an appropriate buffer, the cells are disrupted by a method such as sonication, and the contents of the host cells are obtained by centrifugation, followed by affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, etc. The desired protein can be separated and purified by a known method such as electric point chromatography.
The recombinant proteins A to G of the present invention obtained by the separation and purification as described above can be used for the production of vaccines for fish.
According to the ninth aspect of the present invention, the present invention provides inactivation of transformed host cells A to G which are respectively transformed with the recombinant expression vectors A to G of the present invention and mass-produce the recombinant proteins A to G of the present invention, respectively. To provide an inactivated vaccine A to G, and an inactivated vaccine A to G produced by the method. The present invention also provides a vaccine combination comprising at least two of inactivated vaccines A to G.
The method for producing an inactivated vaccine of the present invention comprises a step of treating the transformed host cells A to G of the present invention with an inactivating agent to remove the host cell infectivity.
Methods for producing inactivated vaccines are known in the art, and preferably the method of the present invention comprises the steps of culturing the transformed host cell of the present invention to express the recombinant protein, and said transformed host cell. Treating the culture with a deactivator. More preferably, the method of the present invention comprises a step of culturing the transformed host cell of the present invention to express a recombinant protein, a step of obtaining a cell pellet by centrifugation of the host cell culture, and a suspension of said pellet. Treating the deactivator.
Common inactivating agents include, for example, formalin, glutardialdehyde, β-propionlactone, etc., which are added and mixed before or after production of a vaccine stock solution. When formalin is used, the amount added is about 0.0004 to 0.7% (v / v), the inactivation temperature is about 2 ° C. to 37 ° C., and the inactivation time is about 2 days to 180 days.
For the production method of the inactivated vaccine of the present invention, any of the known inactivation agents as described above can be used to treat the transformed host cells A to G of the present invention. Use. In the method of the present invention, the amount of formalin added is preferably 0.1% to 0.7% (v / v), more preferably 0.5%. In the method of the present invention, the treatment time of the inactivating agent is preferably 3 days or more, more preferably 3 days. In the method of the present invention, a preferable deactivation temperature is 4 ° C.
By treating the transformed host cells A to G of the present invention with an inactivating agent by the method of the present invention as described above, the recombinant inactivated vaccines A to G of the present invention can be obtained.
The thus obtained recombinant inactivated vaccines A to G of the present invention can be used singly or in various combinations in order to make fish such as sea bream.
Combinations of inactivated vaccines that can be used in the present invention include at least two of inactivated vaccines A to G, preferably a combination of inactivated vaccines B and C, inactivated vaccines B and D, Combinations, inactivated vaccines A, B and E, and inactivated vaccines B, F and G, such combinations taking into account the function of the recombinant protein produced by the transformants In addition, the recombinant protein B is used as a basis, and a combination of a method for adding a protein having a function similar to the recombinant protein B is used, and in addition to the four combinations exemplified above, various other combinations can be used for the vaccine of the present invention. Included in the combination. More preferably, the combination of inactivated vaccines of the present invention is a combination of inactivated vaccines B, F and G.
As described above, the inactivated vaccines A to G of the present invention were administered to juvenile Ishidai at a concentration twice as much as the dose for allowing fish to be used as a result of observing the mortality rate. It did not occur at all, and its safety was confirmed.
According to a tenth aspect of the present invention, the present invention provides a method for immunizing fish comprising administering the inactivated vaccines A to G of the present invention, or a combination thereof, to the fish.
Examples of fish that can be used in combination with the inactivated vaccine of the present invention include Thais, sea bass, Japanese flounder and yellowtail, among which Thais are preferred, and particularly, sea bream is preferred.
The method of immunizing fish using the inactivated vaccine of the present invention comprises a step of administering the vaccine of the present invention to fish using intraperitoneal, intramuscular, or subcutaneous inoculation or osmotic method, sincere administration, etc. Including. Preferably, the inactivated vaccine of the present invention is administered by intramuscular injection.
The inactivated vaccine combination of the present invention that can be used in the immunization method of the present invention includes at least one of inactivated vaccines A to G, and preferably at least one of inactivated vaccines A to G. Two, more preferably including inactivated vaccines B and C, inactivated vaccines B and D, inactivated vaccines A, B and E, or inactivated vaccines B, F and G, most preferably Includes inactivated vaccines B, F and G.
When immunizing fish using at least two or more of the inactivated vaccines A to G of the present invention, the two or more inactivated vaccines are preferably administered to fish after being mixed.
When a fish is used as a role, the dose of the inactivated vaccine of the present invention is 0 per dose so that the amount of recombinant protein is 200 μg / kg of fish weight (200 μg of recombinant protein / kg body weight). It is preferred to administer 0.01 ml to 0.5 ml.
Meanwhile, according to an eleventh aspect of the present invention, the present invention provides a kit comprising the inactivated vaccine of the present invention.
The kit of the present invention contains at least one of the inactivated vaccines A to G of the present invention, and preferably contains two or more inactivated vaccines. Preferably, the kit of the invention comprises inactivated vaccines B and C, inactivated vaccines B and D, inactivated vaccines A, B and E, or inactivated vaccines B, F and G, most Preferably, the kit of the present invention comprises inactivated vaccines B, F and G.
The kit of the present invention may include instructions for administration of the inactivated vaccine included in the kit.
When two or more inactivated vaccines are included in the kit of the present invention, the inactivated vaccines A to G of the present invention may be included in the kit in a premixed form, or It may be included individually in each container. When the inactivated vaccine is contained in a separate container, the user can mix and use each inactivated vaccine according to the instruction manual in the kit.
According to a twelfth aspect of the present invention, the present invention provides a peptide having a part of the amino acid sequence of the ORF A to G protein of the present invention and having immunogenicity of iridovirus.
The peptide of the present invention was analyzed by analyzing the six amino acid sequences encoded by the ORF A to D, F and G genes of RBIV-KOR-TY1 of the present invention. The surface was exposed, and thirdly, it was obtained by selecting a portion satisfying three such as hydrophilicity.
The peptide of the present invention may be natural or synthetic, and the synthetic peptide can be synthesized using a peptide synthesizer or the like.
According to the present invention, the peptide sequences selected for each ORF protein of the present invention are as follows:
ORF A: AWPLFDDRMRVDQCRBI (SEQ ID NO: 29)
ORF B: TLQSHKQLYSDYRTEC (SEQ ID NO: 30)
APPDRDDDRWTVPTGCRBIV (SEQ ID NO: 31)
ORF C: PTEPEPEEEPEEEEDEC (SEQ ID NO: 32)
TEPEPEEPEEEEDEYC (SEQ ID NO: 33)
ORF D: QVDRSGAKVPEAPC (SEQ ID NO: 34)
CAMRSRDPLYDKVK (SEQ ID NO: 35)
ORF F: YARARGSTHIRQRQVCRBIV (SEQ ID NO: 36)
ORF G: CSPESTRNSNFKHSVTY (SEQ ID NO: 37)
DMSHITKEMALNTKQHTCRBIV (SEQ ID NO: 38)
Such a peptide of the present invention has excellent immunogenicity and can be effectively used for the production of a vaccine against iridovirus.
In the following, the present invention will be described in more detail with reference to examples, which are disclosed for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.
実施例１： ＲＢＩＶ−ＴＹのゲノムＤＮＡ配列の決定及び配列の分析
１）ウイルスＤＮＡの分離
本発明に利用されたウイルスサンプルは、韓国の慶尚南道の統營で養殖されたイシダイから得られた。ＧＦ細胞を１０％のウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されたＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）培地で成長させた。ＧＦ細胞の感染によりウイルスストックを増幅させた。細胞変性効果を表す感染された細胞を収集して、−２０℃で凍結させた。凍結された細胞を解凍させ、４℃で１０分間３５００ｘｇで遠心分離して細胞カスを除去し、無細胞上澄液を４℃で３０分間３００００ｘｇで遠心分離した。ウイルス沈殿物をＴＮＥ緩衝液（０.０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０，０.１ＭのＮａＣｌ、０.００１ＭのＥＤＴＡ）で懸濁させ、ＤＮａｓｅ Ｉ及びＲＮａｓｅ Ａで３７℃で１５分間恒温処理した。前記ウイルスをＳＷ４０ Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）で４℃で２時間、６００００ｘｇで２０〜５０％（ｗ／ｗ）のスクロース勾配で遠心分離して精製した。ウイルスバンドを除去してＰＢＳ緩衝液で希釈し、ビリオンペレットを４℃で６００００ｘｇで１時間遠心分離した後に収集した。ビリオンを０.５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ及び０.５％のＳＤＳで、５５℃で３時間恒温処理してウイルスＤＮＡを抽出した。前記ＤＮＡをフェノールクロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ．Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９））。
２）ウイルスＤＮＡのＰＣＲ増幅及びＤＮＡ配列の決定
ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の全体ゲノムＤＮＡを増幅させるために、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲのためのプライマは、ＩＳＫＮＶのＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースのヌクレオヌクレオチド配列から考案した。重複される１２０個以上のＰＣＲプライマ対を考案して、平均ＰＣＲ生成物を１０００ないし１２００ｂｐの長さにした。鋳型は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡであった。遺伝子増幅反応の条件は、次の通りであった：９４℃で５分間１サイクル；９２℃で３０秒、６０℃で１分、及び７２℃で１分間３５サイクル；及び７２℃で５分間１サイクル。ＰＣＲプライマ対によって、アニール化の温度には少しずつの変化があった。増幅されたＰＣＲ生成物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、自動配列分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，米国）で配列を決定した。
３）ＤＮＡの配列分析
前記で得られたゲノムＤＮＡ配列及びこれから推論されたアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴプログラムを利用してＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬデータベースと比較した。ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｉｃｄｓ Ｒｅｓ．２２，４６７３〜４６８０，１９９４）を利用して配列し、次いで、ＴｒｅｅＶｉｅｗ（Ｐａｇｅ，Ｒ．Ｄ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１２，３５７〜３５８，１９９６）で系統図を構成した。ＯＲＦは、メチオニンコドンから始まって、５０個以上のコドンから構成され、さらに大きなＯＲＦ内に位置しないことを基準として同定した。その結果、１１８個のＯＲＦが同定され、そのうち２９個は、公知の配列と高い相同性を有し、３１個は、相同性を有する配列を確認することができなかった（Ｄｏｅｔ，ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３２５：３５１〜３６３，２００４；参考として全体が本願に統合される）。これから得られたヌクレオヌクレオチド配列データは、アクセッション番号ＡＹ５３２６０６としてＧｅｎＢａｎｋに登録された。
Example 1: Determination of RBIV-TY genomic DNA sequence and sequence analysis 1) Isolation of viral DNA The virus sample used in the present invention was obtained from a sea bream cultivated under the command of Gyeongsangnam-do, Korea. It was. GF cells were grown in BME (Basal Medium Eagle) medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 IU / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin. Viral stocks were amplified by infection of GF cells. Infected cells exhibiting a cytopathic effect were collected and frozen at -20 ° C. The frozen cells were thawed and centrifuged at 3500 × g for 10 minutes at 4 ° C. to remove cell debris, and the cell-free supernatant was centrifuged at 30000 × g for 30 minutes at 4 ° C. The virus precipitate was suspended in TNE buffer (0.01 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 M NaCl, 0.001 M EDTA) and incubated with DNase I and RNase A at 37 ° C. for 15 minutes. . The virus was purified by centrifuging with SW40 Ti rotor (Beckman) at 4 ° C. for 2 hours at 60000 × g with a 20-50% (w / w) sucrose gradient. The virus band was removed and diluted with PBS buffer, and the virion pellet was collected after centrifugation at 60000 xg for 1 hour at 4 ° C. The virion was incubated with 0.5 mg / ml proteinase K and 0.5% SDS at 55 ° C. for 3 hours to extract viral DNA. The DNA was extracted with phenol chloroform and ethanol precipitated (Molecular Cloning 2nd. Ed. (Sambrook et al. (1989)).
2) PCR amplification of viral DNA and determination of DNA sequence PCR was performed to amplify the entire genomic DNA of RBIV-KOR-TY1. Primers for PCR were devised from the nucleonucleotide sequences of the ISKNV GenBank / EMBL database. Over 120 PCR primer pairs were devised to make the average PCR product 1000-1200 bp long. The template was genomic DNA of RBIV-KOR-TY1. The conditions for the gene amplification reaction were as follows: 1 cycle at 94 ° C. for 5 minutes; 35 cycles at 92 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute; and 72 ° C. for 5
3) DNA sequence analysis The genomic DNA sequence obtained above and the amino acid sequence deduced therefrom were compared with the GenBank / EMBL database using the BLAST program. Sequencing using CLUSTALW (Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680, 1994), then TreeView (Page, RD, Comput. Appl. Biosci. 12, 357-358, 1996). ) Constitutes a system diagram. The ORF was identified on the basis of starting with a methionine codon and consisting of more than 50 codons and not located within a larger ORF. As a result, 118 ORFs were identified, 29 of which had high homology with known sequences, and 31 could not confirm homologous sequences (Doet, al. Virology). 325: 351-363, 2004; the whole is hereby incorporated by reference). The nucleonucleotide sequence data obtained from this was registered in GenBank as accession number AY532606.
実施例２：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ遺伝子の選別
実施例１でＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノム配列の分析結果から得たＯＲＦデータに基づいて、ＯＲＦ分析プログラム（ＤＮＡｓｉｓＭＡＸ、Ｈｉｔａｃｈｉ、日本）を利用して、１１８個のＯＲＦのうち、ワクチン製造に利用可能な７個の遺伝子を選別して、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧと命名した。
前記のような分析により選別された本発明の前記ＯＲＦ Ａ遺伝子は、配列番号１の塩基配列（１,１３７個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｂ遺伝子は、配列番号２の塩基配列（１,３６２個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｃ遺伝子は、配列番号３の塩基配列（１,５４８個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｄ遺伝子は、配列番号４の塩基配列（２,４１８個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｅ遺伝子は、配列番号５の塩基配列（８２８個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｆ遺伝子は、配列番号６の塩基配列（７７７個の塩基対）を有し、ＯＲＦ Ｇ遺伝子は、配列番号７の塩基配列（１,３６５個の塩基対）を有する。
Example 2: ORF of RBIV-KOR-TY1 Selection of A, B, C, D, E, F, and G genes Based on ORF data obtained from the analysis result of the genomic sequence of RBIV-KOR-TY1 in Example 1 Using the ORF analysis program (DNAsisMAX, Hitachi, Japan), out of 118 ORFs, 7 genes available for vaccine production were selected and ORFs A, B, C, D, E, Named F and G.
The ORF A gene of the present invention selected by the analysis as described above has the base sequence of SEQ ID NO: 1 (1,137 base pairs), and the ORF B gene has the base sequence of SEQ ID NO: 2 (1 , 362 base pairs), the ORFC C gene has the base sequence of SEQ ID NO: 3 (1,548 base pairs), and the ORF D gene has the base sequence of SEQ ID NO: 4 (2,418). ORF E gene has the base sequence of SEQ ID NO: 5 (828 base pairs), and ORF F gene has the base sequence of SEQ ID NO: 6 (777 base pairs). The ORF G gene has the base sequence of SEQ ID NO: 7 (1,365 base pairs).
実施例３：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡの分離
実施例２で選択されたＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を増幅させるために、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡを次の通りに分離した。
ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１に感染したイシダイを収集して解剖した後、脾臓、腎臓及び脳を摘出して、ウシ胎仔血清が添加されていないＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）培地を摘出組織総重量の１０倍にして添加して、組織磨砕器で磨砕した後、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を１Ｘにして添加して、４℃で１０時間放置した後、穴のサイズが０.２２μｍである滅菌された濾過フィルタを利用して、組織磨砕液を無菌的に濾過した。
濾過液をＧＦ細胞に１／５００に希釈して添加し、２５℃で５日間培養して、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１培養液及びウイルスに感染されたＧＦ細胞で、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１ゲノムＤＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ＰＣＲ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、ドイツ）を利用して分離した。また、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１に感染したイシダイの脾臓、腎臓、脳組織で、前記のゲノムＤＮＡ分離キットを利用してＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡを分離した。
Example 3 Isolation of RBIV-KOR-TY1 Genomic DNA In order to amplify the ORF A to G genes selected in Example 2, RBIV-KOR-TY1 genomic DNA was isolated as follows.
After collecting and dissecting rainbow trout infected with RBIV-KOR-TY1, the spleen, kidney and brain were removed, and an EMEM (Eagle's minimum essential medium) medium without added fetal calf serum was removed. After adding 10 times as much as the above and grinding with a tissue grinder, Antibiotic-Antilytic (Invitrogen corporation) was added at 1 × and left at 4 ° C. for 10 hours, and then the hole size was 0.22 μm. The tissue attrition fluid was aseptically filtered using a sterile filtration filter.
The filtrate was diluted 1/500 to the GF cells, cultured at 25 ° C. for 5 days, and the RBIV-KOR-TY1 genomic DNA was added to the RBIV-KOR-TY1 culture solution and virus-infected GF cells. Isolation was performed using the High Pure Genome DNA PCR Preparation Kit (Roche, Germany). In addition, the genomic DNA of RBIV-KOR-TY1 was isolated from the spleen, kidney, and brain tissues of rainbow trout infected with RBIV-KOR-TY1 using the genomic DNA isolation kit.
実施例４：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子の増幅
選別されたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子を増幅させるために、ＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子に対するＰＣＲプライマを製作した。
まず、ＯＲＦ Ａ遺伝子を増幅するために、Ｎｈｅ Ｉの切断部位を有する順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＧＴＡ ＣＴＡ ＣＡＧ ＴＧＴ ３’（配列番号１５）とＨｉｎｄ IIIの切断部位を有する逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＡＴＡ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＡＡ ＴＴＧ ＴＡＴ ＴＴＴ ３’（配列番号１６）とを合成して、ＰＣＲ反応のために使用した。
次いで、実施例３で分離したＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のゲノムＤＮＡに０.５ＵのＥＸ Ｔａｑ−重合酵素（Ｔａｋａｒａ、日本）、及び１０ｐｍｏｌｅの前記プライマ（配列番号１５＋配列番号１６）対を添加し、高速熱純化器（Ｆａｓｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ；ＭＪｒｅａｃｈｅｒ、米国）を使用して９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で４５秒の順にＤＮＡ増幅を３０回行った。
前記のように増幅されたＤＮＡ生成物を制限酵素Ｎｈｅ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIで処理して、ゲル電気泳動させた後にＤＮＡを分離することによって、次の工程でベクターへのクローニングに利用されるＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ遺伝子を得た。
ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子も、下記のようなＰＣＲプライマ対をそれぞれ利用して、前記と同じ実験過程によって増幅させて各遺伝子を得た。各遺伝子のために利用されたプライマ対の塩基配列は、次の通りである：
ＯＲＦ Ｂ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＣＡ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＧＴ Ｇ ３’（配列番号１７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＴＡ ＣＡＧ ＧＡＴＡＧＧ ＧＡＡ ＧＣＣ ＴＧＣ ３’（配列番号１８）
ＯＲＦ Ｃ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＣＧＴ ＧＧＧＴＡＡ ＧＧＣ ＡＧＧ ＴＡＡ ３’（配列番号１９）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＴＡＣＧ ＧＣＴ ＡＣＴ ＡＴＧ ３’（配列番号２０）
ＯＲＦ Ｄ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＧＧＴＧ ＴＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ３’（配列番号２１）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＡＣ ＴＣＧ ＴＴＡＣＣＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＣＧＡ ３’（配列番号２２）
ＯＲＦ Ｅ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＣＡＡＴＡ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＧＡ ＴＡ ３’（配列番号２３）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＣＣ ＴＴＴ ＧＣＡＧＡＡ ＴＡＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＧＡＡ ３’（配列番号２４）
ＯＲＦ Ｆ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＴＡＣ ＴＡＣ ＣＧＧＧＡＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＡＴＡ ３’（配列番号２５）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＡＧ ＧＡＴＣＣＧ ＴＴＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ３’（配列番号２６）
ＯＲＦ Ｇ：順方向プライマ−５’ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＴＧ ＣＡＴ ＧＴＡＣＡＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＧＴＴ ３’（配列番号２７）
逆方向プライマ−５’ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＡ ＣＧＴ ＣＴＴＡＴＣ ＡＧＣ ＴＣＡ ＴＣＧ ３’（配列番号２８）
Example 4: RBIV-KOR-TY1 ORF A, B, C, D, E, F and G Amplification of RBIV-KOR-TY1 ORF A, B, C, D, E, F and G In order to amplify the genes, PCR primers for ORF A, B, C, D, E, F and G genes were made.
First, in order to amplify the ORF A gene, a
Next, 0.5 U of EX Taq-polymerase (Takara, Japan) and 10 pmoles of the primer (SEQ ID NO: 15 + SEQ ID NO: 16) pair were added to the genomic DNA of RBIV-KOR-TY1 separated in Example 3, DNA amplification was performed 30 times in the order of 94 ° C. for 45 seconds, 60 ° C. for 45 seconds, and 72 ° C. for 45 seconds using a fast thermal purifier (Fast Thermal Cycler; MJreacher, USA).
By treating the amplified DNA product with the restriction enzymes Nhe I and Hind III and separating the DNA after gel electrophoresis, the RBIV − used for cloning into the vector in the next step is used. The ORF A gene of KOR-TY1 was obtained.
The ORF B, C, D, E, F and G genes of RBIV-KOR-TY1 were also amplified by the same experimental process as described above using the PCR primer pairs as described below to obtain each gene. The base sequence of the primer pair utilized for each gene is as follows:
ORF B: Forward primer-5 ′ GCT AGC ATG TCT GCA ATC
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT TTA CAG GATAGG
ORF C:
ORF D: Forward Primer-5 ′ GCT AGC TCA CCC ACGGTG TCA
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT TAC TCG TTACCG
ORF E:
ORF F:
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT CTG TAG GATCCG
ORF G: Forward primer-5 ′ GCT AGC ATG CAT GTACAT
Reverse Primer-5 ′ AAG CTT CTA CGT CTTATC
実施例５：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子を含む組み換え発現ベクターの製作
前記実施例４でＰＣＲ結果から得られたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子を、それぞれ原核細胞発現用ベクターであるｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）にクローニングして組み換え発現ベクターを製造した。製造過程は、次の通りである。
まず、前記実施例４で増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素Ｎｈｅ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIで切断して、各遺伝子生成物を得た。また、本発明の各遺伝子をクローニングする発現ベクターを準備するために、ｐＥＴ２８ａベクターをＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞で形質転換した後、カナマイシン５０μｇ／ｍｌが添加されたＬＢブロスに接種して３７℃で培養した後、プラスミドを大量で抽出した。抽出したプラスミド１ｍｇにＮｈｅ Ｉ制限酵素（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）及び反応緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ）を添加して、３７℃で１時間反応させてプラスミドを切断した。次いで、Ｎｈｅ Ｉで切断したｐＥＴ２８ａベクターにＨｉｎｄ III制限酵素及び反応緩衝溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＮａＣｌ）を添加して、３７℃で１時間反応させてプラスミドを切断した。次いで、制限酵素Ｎｈｅ Ｉ及びＨｉｎｄ IIIで切断されたｐＥＴ２８ａベクターと各遺伝子とを１：１の割合で混合した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）１ｕｎｉｔ及び反応緩衝溶液（６６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.６）、６.６ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＤＴＴ、６６μＭのＡＴＰ）を添加して、３７℃で３０分間反応させて、遺伝子をベクターのＮｈｅ Ｉ−Ｈｉｎｄ IIIの位置に挿入することによって、組み換え発現ベクターを製造した。
このようにして得られたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子のそれぞれが挿入された組み換え発現ベクターＡないしＧを、Ｔ７プロモータープライマを利用して自動塩基配列読取器（Ａｐｐｌｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｉｃｓ、米国）により、挿入されたＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子が良好にクローニングされたことが確認することができた。
本実施例により得られた組み換え発現ベクターの一例として、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ｂ遺伝子を含有した組み換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｂが図１に示されている。
組み換え発現ベクターｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ａ、ｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｃ、ｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｄ、ｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｅ、ｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｆ及びｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ｇは、図１のｐＥＴ２８ａ／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−ＢでＯＲＦ Ｂ遺伝子の部分がそれぞれＯＲＦ Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ遺伝子に置換される。
Example 5: Production of ORF of RBIV-KOR-TY1 Production of recombinant expression vector containing A, B, C, D, E, F and G genes ORF of RBIV-KOR-TY1 obtained from PCR results in Example 4 above A to G genes were each cloned into pET28a (Novagen, USA), a prokaryotic expression vector, to produce a recombinant expression vector. The manufacturing process is as follows.
First, the PCR product amplified in Example 4 was cleaved with the restriction enzyme Nhe I-Hind III to obtain each gene product. In order to prepare an expression vector for cloning each gene of the present invention, the pET28a vector was transformed into E. coli. After transformation with E. coli JM109 competent cells, the cells were inoculated into LB broth supplemented with 50 μg / ml kanamycin and cultured at 37 ° C., and then the plasmid was extracted in large quantities. Nhe I restriction enzyme (invitrogen, USA) and reaction buffer solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM MgCl 2 , 50 mM KCl) were added to 1 mg of the extracted plasmid and reacted at 37 ° C. for 1 hour. To cut the plasmid. Subsequently, Hind III restriction enzyme and a reaction buffer solution (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl 2 , 50 mM NaCl) were added to the pET28a vector cleaved with Nhe I, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. To cut the plasmid. Subsequently, the pET28a vector cleaved with restriction enzymes Nhe I and Hind III and each gene were mixed at a ratio of 1: 1, and then T4 DNA ligase (Invitrogen, USA) 1 unit and a reaction buffer solution (66 mM Tris-HCl ( by adding pH 7.6), 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 66 μM ATP), reacting at 37 ° C. for 30 minutes, and inserting the gene into the Nhe I-Hind III position of the vector A recombinant expression vector was produced.
The thus obtained recombinant expression vectors A to G into which ORF A to G genes of RBIV-KOR-TY1 were inserted were automatically sequenced using a T7 promoter primer (Applied Biosystems, USA). This confirmed that the ORF A to G gene of the inserted RBIV-KOR-TY1 was successfully cloned.
As an example of the recombinant expression vector obtained in this example, a recombinant expression vector pET28a / RBIV-KOR-TY1-B containing the ORF B gene of RBIV-KOR-TY1 is shown in FIG.
Recombinant expression vectors pET28a / RBIV-KOR-TY1-A, pET28a / RBIV-KOR-TY1-C, pET28a / RBIV-KOR-TY1-D, pET28a / RBIV-KOR-TY1-E, pET28a / RBIV-KOR-TY1 -F and pET28a / RBIV-KOR-TY1-G are pET28a / RBIV-KOR-TY1-B in FIG. 1 and the ORF B gene is replaced with ORF A, C, D, E, F, and G genes, respectively. Is done.
実施例６：組み換え発現ベクターによる宿主細胞の形質転換
実施例５で製作された組み換え発現ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ、日本）と混ぜて氷（４℃）で３０分間反応させた後、４２℃で１分３０秒間反応させて再び氷（４℃）で１分３０秒間放置した。
その結果から得られた組み換え発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを安定化させるために、８００μｌのＳＯＣ培地（２％のトリプトン、０.５％の酵母抽出物、０.０５％のＮａＣｌ）を入れて３７℃で１時間反応させた。
安定化された形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンが添加されたＬＢプレートに１００μｌを分注して広げた後、３７℃で１５時間培養して、各遺伝子に対する形質転換体を３０個ずつ選別した。
Example 6: Transformation of host cell with recombinant expression vector The recombinant expression vector prepared in Example 5 was transformed into E. coli . After mixing with E. coli JM109 (TAKARA, Japan) and reacting with ice (4 ° C.) for 30 minutes, the mixture was reacted at 42 ° C. for 1 minute and 30 seconds and again left on ice (4 ° C.) for 1 minute and 30 seconds.
E. coli transformed with the recombinant expression vector obtained from the results. In order to stabilize E. coli, 800 μl of SOC medium (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.05% NaCl) was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
100 μl of the stabilized transformant was spread on an LB plate supplemented with 50 μg / ml kanamycin, and then cultured at 37 ° C. for 15 hours to select 30 transformants for each gene. did.
実施例７：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１の組み換え蛋白質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ蛋白質の発現
実施例６で得た形質転換された宿主細胞でクローニングされたＯＲＦ ＡないしＧ遺伝子から、ＯＲＦ ＡないしＧ蛋白質を大量で発現させるための形質転換体の培養条件を最適化するために、発現誘導剤であるＩＰＴＧの濃度、処理時間及び抗生剤の濃度を異ならせて発現程度を調べた。
１）ＩＰＴＧ濃度及び処理経時による発現誘導
実施例６の方法で得られた大腸菌ＢＬ ２１（ＤＥ３）／ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１−Ａ形質転換体を、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンが入っている３ｍＬのＬＢ培地で１０時間培養した後に１／１００に希釈して、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンが入っているＬＢ培地１００ｍＬに接種して３７℃で培養した。
ＯＤ６００値が０.６になったとき、ＩＰＴＧを多様な濃度で添加して蛋白質の発現を誘導した。添加したＩＰＴＧの濃度は、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭであり、ＩＰＴＧ処理をしてから４時間後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析によって組み換え蛋白質Ａの発現程度を測定した。
一方、ＩＰＴＧ処理経時による組み換え蛋白質の発現様相を調べるために、１ｍＭのＩＰＴＧを添加した培養物及び添加していない培養物で、添加する直前（０時間）、添加後２時間、４時間、６時間、８時間での組み換え蛋白質の発現様相を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって調べた。
誘導された組み換え蛋白質の発現量を調べるために利用されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析方法は、次の通りである。各試料から１ｍＬずつ採取した後、１４,０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した後に上澄液を捨て、５００μｌの滅菌ＰＢＳでペレットを再懸濁させた。懸濁試料が入っている１.５ｍＬのチューブを氷に保管しつつ、超音波処理して細胞を破砕し、このとき、１５秒間超音波処理し、１０秒間冷却する過程を３回繰り返した。破砕した試料を１４,０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄液１００μｌを採取して２Ｘ ＳＤＳ−試料緩衝液（２Ｘ ＳＤＳサンプルバッファー）１００ μｌと混合して、１００℃で１０分間沸かした。これを再び１４,０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、２０μｌを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにローディングした。５０〜１５０Ｖで約２時間分離した後、クマシー染色液（０.１％のクマシーブルーＲ２５０、４２％の酢酸、４２％のメチルアルコール）で３０分間染色し、脱色液Ｉ（５％の酢酸、７.５％のメチルアルコール）で１時間脱色した。その結果から得たポリアクリルアミドゲルの写真が図２及び図３に示されている。
図２に示すように、１ｍＭのＩＰＴＧを処理したレーン２ないし５では、組み換え蛋白質が大量で発現され、処理時間が長くなるほど発現量が多くなることが確認できる。一方、ＩＰＴＧを処理していないレーン６ないし１０では、組み換え蛋白質が大量で発現されていないことが確認できる。
また、図３に示すように、１ｍＭないし２０ｍＭのＩＰＴＧ処理時、組み換え蛋白質が多量で発現され、特に、１０ｍＭのＩＰＴＧ処理時（レーン５）、または１ｍＭのＩＰＴＧ及び１００μｇのカナマイシン処理時（レーン７）にさらに多量で発現されることが確認できる。
Example 7: Expression of recombinant proteins A, B, C, D, E, F and G of RBIV-KOR-TY1 From the ORF A to G gene cloned in the transformed host cell obtained in Example 6 In order to optimize the culture conditions of transformants for expressing a large amount of ORF A or G protein, the expression level was examined by varying the concentration of IPTG, treatment time, and antibiotics as an expression inducer. It was.
1) Expression induction by IPTG concentration and treatment time-lapse E. coli BL21 (DE3) / RBIV-KOR-TY1-A transformant obtained by the method of Example 6 was treated with 3 mL LB containing 50 mg / mL kanamycin. After culturing in the medium for 10 hours, it was diluted to 1/100, inoculated into 100 mL of LB medium containing 50 mg / mL kanamycin, and cultured at 37 ° C.
When the OD600 value reached 0.6, IPTG was added at various concentrations to induce protein expression. The concentration of the added IPTG was 1 mM, 5 mM, 10 mM, and 20 mM, and the expression level of the recombinant protein A was measured by SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)
On the other hand, in order to investigate the expression pattern of the recombinant protein over time with the IPTG treatment, in the culture added with 1 mM IPTG and the culture not added, immediately before the addition (0 hour), 2 hours after the addition, 4 hours, 6 The expression pattern of the recombinant protein at 8 hours was examined by SDS-PAGE analysis.
The SDS-PAGE analysis method used for examining the expression level of the induced recombinant protein is as follows. After taking 1 mL from each sample, the supernatant was discarded after centrifugation at 14,000 rpm for 30 seconds, and the pellet was resuspended with 500 μl of sterile PBS. While the 1.5 mL tube containing the suspended sample was stored on ice, the cells were sonicated to disrupt the cells. At this time, the process of sonicating for 15 seconds and cooling for 10 seconds was repeated three times. The crushed sample was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes, 100 μl of the supernatant was collected, mixed with 100 μl of 2 × SDS-sample buffer (2 × SDS sample buffer), and boiled at 100 ° C. for 10 minutes. This was again centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes, and 20 μl was loaded onto a 10% SDS-PAGE gel. After separation at 50 to 150 V for about 2 hours, staining with Coomassie staining solution (0.1% Coomassie blue R250, 42% acetic acid, 42% methyl alcohol) for 30 minutes, decolorizing solution I (5% acetic acid, 7.5% methyl alcohol) for 1 hour. The photograph of the polyacrylamide gel obtained from the result is shown in FIG.2 and FIG.3.
As shown in FIG. 2, in
In addition, as shown in FIG. 3, the recombinant protein is expressed in a large amount when treated with 1 mM to 20 mM IPTG, particularly when treated with 10 mM IPTG (lane 5) or treated with 1 mM IPTG and 100 μg kanamycin (
実施例８：組み換え不活性化ワクチンの製造
前記実施例６で得た形質転換体を利用してワクチンを製造するために、前記形質転換体を不活性化させた。その不活性化過程は、次の通りである。
ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＯＲＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ遺伝子をそれぞれ含有した形質転換菌株ＡないしＧを、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンが入っているＬＢ培地で３７℃で１０時間培養した後に１／１００に希釈して、５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンが入っているＬＢ培地１,０００ｍＬに接種して３７℃で培養した。ＯＤ６００値が０.６になったとき、ＩＰＴＧを１ｍＭの濃度で添加して３７℃で５時間培養した後、５,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後に上澄液を捨て、１００ｍＬの滅菌ＰＢＳでペレットを再懸濁した。懸濁試料にホルマリン（３７％のホルムアルデヒド溶液）を総体積の０.５％にして添加して、形質転換体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを４℃で３日間不活性化させた。
不活性化された懸濁試料を５,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後に上澄液を捨て、ペレットを１００ｍＬの滅菌ＰＢＳで再懸濁し、遠心分離する過程を３回繰り返した。蛋白質の濃度を２０μｇ／ｍＬにして滅菌ＰＢＳを添加し、これに１００ｕｎｉｔ／ｍＬのペニシリンＧ、１００μｇ ／ｍＬのストレプトマイシンを添加して４℃で保管した。
Example 8: Production of recombinant inactivated vaccine In order to produce a vaccine using the transformant obtained in Example 6, the transformant was inactivated. The inactivation process is as follows.
RBIV-KOR-TY1 ORF A, B, C, D, E, F and G genes respectively containing transformed strains A to G were cultured at 37 ° C. for 10 hours in LB medium containing 50 mg / mL kanamycin. After culturing, the mixture was diluted to 1/100, inoculated into 1,000 mL of LB medium containing 50 mg / mL kanamycin, and cultured at 37 ° C. When the OD600 value reached 0.6, IPTG was added at a concentration of 1 mM and incubated at 37 ° C. for 5 hours. After centrifugation at 5,000 rpm for 30 minutes, the supernatant was discarded, and 100 mL of sterile PBS was used. The pellet was resuspended. Formalin (37% formaldehyde solution) is added to the suspension sample to 0.5% of the total volume, and transformants A, B, C, D, E, F and G are inactive at 4 ° C. for 3 days. Made it.
The inactivated suspension sample was centrifuged at 5,000 rpm for 30 minutes, then the supernatant was discarded, and the pellet was resuspended in 100 mL of sterile PBS and centrifuged three times. Sterile PBS was added at a protein concentration of 20 μg / mL, 100 units / mL penicillin G and 100 μg / mL streptomycin were added thereto, and the mixture was stored at 4 ° C.
実施例９：組み換え不活性化ワクチンの安全性の試験
前記実施例８で製造した組み換え不活性化ワクチンの安全性実験のために、イシダイ稚魚（体重；９±１ｇ）を３００Ｌの水槽に２０尾ずつ収容した後、各組み換えワクチンを４０μｇ ／ｍＬの濃度に調製して、実際のワクチン処理濃度の２倍の濃度でイシダイ稚魚の背筋肉の付近に注射して自然水温で飼育しつつ、ワクチンによるイシダイ稚魚の斃死如何を１５日間観察した。その結果、本発明の組み換えワクチンの処理による斃死は全く発生せず、組み換えワクチンの安全性を確保した。
実施例１０：組み換え不活性化ワクチンの効能確認
本発明の組み換え不活性化ワクチンの効能を確認するために、実施例８で製造された組み換え不活性化ワクチンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧを４つの組み合わせで混ぜて実験した。
試験区１は、組み換え不活性化ワクチンＡ、Ｂ及びＥを混合し、試験区２は、ＢとＣとを混合し、試験区３は、ＢとＤとを混合し、試験区４は、Ｂ、Ｆ及びＧを混合し、滅菌ＰＢＳと抗生剤とを混合して処理した試験区を対照区として調製した。前記のような４つの組み合わせは、Ｂ蛋白質を基本とし、これに類似した機能を行う蛋白質を添加する方式で組み合わせた。
ワクチンの効能確認の実験は、以下のように実施した。
ＲＢＩＶが感染していないと確認されたイシダイ稚魚を３００ＬのＦＲＰ水槽に収容して、前記で調製した試験用ワクチン４つを０.１ｍｌずつ背筋肉の部位に注射して、１５日間ワクチンの効果が表れるように自然水温で飼育した。ワクチン処理されたイシダイに、ＧＦ細胞で培養したＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１菌株を１０４ ＴＣＩＤ５０／ｍＬの濃度で感染させた。ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１に感染されたイシダイを飼育しつつ、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１による斃死率を調査及び分析した、
その結果は、図４に示すように、対照区に比べてワクチン試験区１ないし４は、ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１に対する防御効果を有して、イシダイ斃死を遅延させ、特に、試験区４の場合、蓄積された致死率が、一ケ月後にも３０％に至らず、優れたワクチンの効果を提供することが確認できた。
Example 10: Confirmation of efficacy of recombinant inactivated vaccine In order to confirm the efficacy of the recombinant inactivated vaccine of the present invention, the recombinant inactivated vaccine A, B, C, D, E, produced in Example 8 Experiments were conducted by mixing F and G in four combinations.
The experiment for confirming the efficacy of the vaccine was performed as follows.
The larvae that were confirmed not to be infected with RBIV were placed in a 300 L FRP water tank, and 0.1 ml each of the four test vaccines prepared above was injected into the back muscle region, and the effect of the vaccine for 15 days. It was raised at natural water temperature so that Vaccine-treated sea bream was infected with RBIV-KOR-TY1 strain cultured in GF cells at a concentration of 10 4 TCID 50 / mL. The mortality rate due to RBIV-KOR-TY1 was investigated and analyzed while rearing the rainbow trout infected with RBIV-KOR-TY1.
As a result, as shown in FIG. 4, the
実施例１１：ＲＢＩＶ−ＫＯＲ−ＴＹ１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧペプチドの分析及び合成
本発明の６個のＯＲＦ ＡないしＤ及びＦとＧ遺伝子によりコードされるアミノ酸の配列を分析して、第一に、抗原性が高く、第二に、表面に露出されており、第三に、親水性の特性などの３つを満足させる部分を選択して、ワクチン用ペプチドとして合成した。
各ＯＲＦ蛋白質のために合成されたペプチドの配列は次の通りであり、ペプチドの合成は、（株）ペプトロン（韓国）に依頼して行われた。
ＯＲＦ Ａ：ＡＷＰＬＦＤＤＲＭＲＶＤＱＣＲＢＩ（配列番号：２９）
ＯＲＦ Ｂ：ＴＬＱＳＨＫＱＬＹＳＴＥＣ（配列番号：３０）
ＡＰＰＤＲＤＤＤＲＷＴＶＰＴＧＣＲＢＩＶ（配列番号：３１）
ＯＲＦ Ｃ：ＰＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＣ（配列番号：３２）
ＴＥＰＥＰＥＥＰＥＥＥＥＤＥＹＣ（配列番号：３３）
ＯＲＦ Ｄ：ＱＶＤＲＳＧＡＫＶＰＳＥＡＰＣ（配列番号：３４）
ＣＡＭＲＳＲＤＰＬＹＤＫＶＫ（配列番号：３５）
ＯＲＦ Ｆ：ＹＡＲＡＲＧＳＴＨＩＲＲＱＫＶＣＲＢＩＶ（配列番号：３６）
ＯＲＦ Ｇ：ＣＳＰＥＴＲＮＳＮＦＫＨＳＶＴＹ（配列番号：３７）
ＤＭＳＨＩＴＫＥＭＡＬＮＴＫＱＨＴＣＲＢＩＶ（配列番号：３８）
Example 11: Analysis and synthesis of A, B, C, D, F and G peptides of RBIV-KOR-TY1 Analysis of the sequence of amino acids encoded by the six ORFs A to D and F and G genes of the present invention First, the antigenicity is high, second, the surface is exposed, and third, the three parts satisfying the hydrophilic properties and the like are selected and synthesized as a vaccine peptide. .
The sequences of peptides synthesized for each ORF protein were as follows, and the peptide synthesis was performed by requesting Peptron Co., Ltd. (Korea).
ORF A: AWPLFDDRMRVDQCRBI (SEQ ID NO: 29)
ORF B: TLQSHKQLYSTEC (SEQ ID NO: 30)
APPDRDDDRWTVPTGCRBIV (SEQ ID NO: 31)
ORF C: PTEPEPEEEPEEEDEC (SEQ ID NO: 32)
TEPEPEEPEEEEDEYC (SEQ ID NO: 33)
ORF D: QVDRSGAKVPEAPC (SEQ ID NO: 34)
CAMRSRDPLYDKVK (SEQ ID NO: 35)
ORF F: YARRGSTHIRQRQVCRBIV (SEQ ID NO: 36)
ORF G: CSPESTRNSNFKHSVTY (SEQ ID NO: 37)
DMSHITKEMALNTKQHTCRBIV (SEQ ID NO: 38)
Claims (55)
A peptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 29 to SEQ ID NO: 38 and having immunogenicity of iridovirus.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107974434A (en) * | 2017-06-23 | 2018-05-01 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | A kind of infectious spleen and kidney necrosis virus inactivated vaccine Effective Antigens content assaying method and kit |
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Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09176043A (en) * | 1995-09-23 | 1997-07-08 | Norin Suisansyo Suisanchiyou Youshiyoku Kenkyusho | Vaccine and diagnostic agent for iridovirus infectious disease for fish and production of the same and the like |
| JP2002003400A (en) * | 2000-04-18 | 2002-01-09 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | Mixed inactivated vaccine against iridovirus infection, streptococcus infection, and their complication in fishes |
| JP2002101885A (en) * | 2000-09-27 | 2002-04-09 | National Research Institute Of Aquaculture | Dna encoding protein related to virus neutralization/ phylaxis of crysphrys major ylide virus |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3125041B2 (en) * | 1995-08-15 | 2001-01-15 | 農林水産省水産庁養殖研究所長 | Rapid Diagnosis of Marine Fish Iridovirus Infection Using Monoclonal Antibodies |
| US5780448A (en) * | 1995-11-07 | 1998-07-14 | Ottawa Civic Hospital Loeb Research | DNA-based vaccination of fish |
| JP2000279055A (en) * | 1999-03-31 | 2000-10-10 | Nippon Suisan Kaisha Ltd | Red sea bream with anti-iridovirus character and method for breeding/culturing the same |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09176043A (en) * | 1995-09-23 | 1997-07-08 | Norin Suisansyo Suisanchiyou Youshiyoku Kenkyusho | Vaccine and diagnostic agent for iridovirus infectious disease for fish and production of the same and the like |
| JP2002003400A (en) * | 2000-04-18 | 2002-01-09 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | Mixed inactivated vaccine against iridovirus infection, streptococcus infection, and their complication in fishes |
| JP2002101885A (en) * | 2000-09-27 | 2002-04-09 | National Research Institute Of Aquaculture | Dna encoding protein related to virus neutralization/ phylaxis of crysphrys major ylide virus |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107974434A (en) * | 2017-06-23 | 2018-05-01 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | A kind of infectious spleen and kidney necrosis virus inactivated vaccine Effective Antigens content assaying method and kit |
| CN107974434B (en) * | 2017-06-23 | 2021-06-11 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | Method and kit for measuring content of effective antigen of infectious spleen and kidney necrosis virus inactivated vaccine |
| CN111733283A (en) * | 2020-04-28 | 2020-10-02 | 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 | Triple fluorescence PCR detection kit for infectious spleen and kidney necrosis virus, largemouth black bass virus and mandarin fish rhabdovirus |
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