KR100940111B1 - Vaccine Composition for Irido Virus Infectious Diseases and the Method Thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수득한 후, 이를 β-프로피오락톤으로 불활성화시켜 제조한 백신조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a vaccine composition for iridovirus infection and a method for preparing the same, and more particularly to a vaccine composition prepared by obtaining internal organ tissue of fish infected with iridovirus and then inactivating it with β-propiolactone. And it relates to a manufacturing method thereof.
본 발명에 따른 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신조성물은 면역효과가 우수하면서도 해산어 뿐만 아니라 담수어종에 대해서도 적용가능한 장점이 있으며, 이리도바이러스 감염어의 조직 내에 고농도로 축적되어 있는 이리도바이러스 비리온(virion) 자체를 불활성화시켜 제조됨을 특징으로 하기 때문에 세포배양에 따른 높은 제작비용을 생략하게 하여 매우 경제적이다. Vaccine composition against iridovirus infection according to the present invention has an excellent immune effect and has the advantage of being applicable to not only marine fish but also freshwater fish species, and iridovirus virion accumulated in high concentrations in tissues of iridovirus infected fish. Because it is manufactured by inactivating itself, it is very economical to omit the high production cost according to the cell culture.
이리도 바이러스, 백신, 메갈로사이티바이러스 속, 베타-프로피오락톤 Irido Virus, Vaccine, Megalocytivirus Genus, Beta-propiolactone
Description
본 발명은 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수득한 후, 이를 β-프로피오락톤으로 불활성화시켜 제조한 백신조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a vaccine composition for iridovirus infection and a method for preparing the same, and more particularly to a vaccine composition prepared by obtaining internal organ tissue of fish infected with iridovirus and then inactivating it with β-propiolactone. And it relates to a manufacturing method thereof.
이리도바이러스는 돔류를 비롯한 30 가지 이상의 해산어종을 감염시키는 것으로 알려져 있는데, 치어부터 성어까지 전 시기에 걸쳐서 발병할 수 있다. 이리도 바이러스에 의한 어류의 질병 발생은 국내 수산양식 현장에서 매년 심각한 경제적 손실을 입히고 있으며, 발병 시 치료가 매우 어려운 것으로 알려져 그 피해는 더욱 증폭되고 있다. 한편, 최근에는 담수 관상어에서도 이리도 바이러스에 의한 감염문제가 보고되고 있다. Iridoviruses are known to infect more than 30 species of marine fish, including domes, which can occur from all ages to young fish. The occurrence of fish disease caused by the virus has caused severe economic losses every year in the domestic aquaculture field, and it is known that it is very difficult to treat the disease, and the damage is further amplified. On the other hand, in recent years, there have been reports of infections caused by viruses even in freshwater ornamental fish.
이러한 이리도 바이러스에는 크게 이리도바이러스 속 (Iridovirus genus), 클로르이리도바이러스 속 (Chloriridovirus genus), 라나바이러스 속 (Ranavirus genus), 림포시스티바이러스 속 (Lymphocystivirus genus) 및 메갈로사이티바이러스 속 (Megalocytivirus genus) 등 5가지 속이 존재하는데, 이 중 척추동물을 감염시키는 이리도 바이러스로는 라나바이러스 속, 림포시스티바이러스 속 및 메갈로사이티바이러스 속이 있다. 이 중 메갈로사이티바이러스 속은 주요 양식 어류 및 관상어 모두에서 대량 폐사를 유발시키는 것으로 알려져 있어, 메갈로사이티바이러스 속의 이리도바이러스에 대한 어류용 백신 개발이 시급히 요구되고 있다. Such iridoviruses include Iridovirus genus, Chloriridovirus genus, Ranavirus genus, Lymphocystivirus genus and Megalocytivirus genus. There are five genera, among which the iridoviruses infecting vertebrates include the genus Lanavirus, the genus Lymphocytivirus and the genus Megalocivirus. Among them, the megalocytivirus genus is known to cause massive mortality in both the main cultured fish and the ornamental fish, and therefore, there is an urgent need for the development of a fish vaccine against the iridovirus of the megalocitivirus genus.
이에 어류의 이리도 바이러스 백신에 대한 연구가 진행된 결과, GF (grunt fin) 세포에 이리도바이러스를 접종한 후, 감염된 세포 배양액을 포르말린으로 불활성화시켜 사용한 예가 있었다 (Nakajima, K. et al., Fish Pathol ., 32:205, 1997). 그러나 상기 포르말린 불활성화 백신은 FBS (fetal bovine serum)와 같은 고가의 시약, 고가의 장비 및 장치, 매우 숙련된 인력, 및 대형 무균시설의 설치를 사용하여야 하는 대량 세포 배양 방법이 필요하였다. As a result of research on the iridovirus vaccine of fish, there was an example of inoculating idovirus to GF (grunt fin) cells and inactivating the infected cell culture with formalin (Nakajima, K. et al., Fish Pathol . , 32: 205, 1997). However, the formalin inactivated vaccines required mass cell culture methods that required the use of expensive reagents such as fetal bovine serum (FBS), expensive equipment and devices, highly skilled personnel, and installation of large aseptic facilities.
한편, 기존의 이리도바이러스 불활성화 백신 제조방법의 경우, 필수적으로 이리도 바이러스의 세포배양과정을 포함하고 있는데, 이러한 세포 배양법 사용에 대해 구체적인 분석을 실시한 보고에 의하면, 세포 배양의 계대 과정이 되풀이될수록 이리도 바이러스의 농도가 감소한다고 하였다 (Nakajima, K. et al., Fish Pathol., 29:29, 1994; Chou, H.Y. et al., Fish Pathol ., 33:201, 1998). 이러한 연구결과는 세포 배양에 의한 바이러스를 항원으로 사용하는 이리도바이러스 백신제조에서 일정하게 높은 수준의 이리도바이러스의 농도를 유지하는데 상당한 어려 움이 있음을 제시하는 것이며, 이러한 특성은 다양한 세포주를 사용한 세포배양에서 공통적으로 발생하는 것이라는 것이 학계의 통설로 받아들여지고 있다. 한국공개특허 2001-98698호는 혼합 불활성화 백신에 대한 것으로, 종래의 방법과 같이 이리도 바이러스를 GF 세포에 접종한 후 배양하여 그 배양액을 사용하는 것으로 역시 상기와 동일한 문제점이 있다. 또한, 연속배양에 의한 백신의 생산은 이루어지지 않고, 단순히 대형 용기(vessel)를 사용하는 배치식(batch type)의 배양이 이루어지고 있어 그 효율성은 낮은 편이다. 이로 인하여 적기에 필요한 대량의 백신공급이 쉽게 이루어지지 않고, 제작된 백신의 가격도 높은 단점이 있었다. On the other hand, the conventional method for producing an inactivated vaccine for iridoviruses essentially includes the cell culture process of Irido virus. According to a report that carried out a detailed analysis on the use of such a cell culture method, as the passage of cell culture is repeated, The concentration of virus was reported to be reduced (Nakajima, K. et al., Fish Pathol. , 29:29, 1994; Chou, HY et al., Fish Pathol ., 33: 201, 1998). These findings suggest that there is considerable difficulty in maintaining a consistently high level of iridovirus in the production of iridovirus vaccines using virus as an antigen by cell culture. It is a common affair of the academia that something that happens in common in the world. Korean Patent Laid-Open No. 2001-98698 relates to a mixed inactivating vaccine, and inoculates idoviruses into GF cells as in the conventional method, and then cultures the same to use the culture solution. In addition, the vaccine is not produced by continuous culture, but batch type cultivation using a large vessel is performed, and the efficiency thereof is low. Because of this, the timely supply of a large number of vaccines required is not easily achieved, and the price of the produced vaccines has a high disadvantage.
이에, 본 발명자들은 기존의 GF 세포를 사용한 이리도바이러스 불활성화 백신의 단점인 높은 제작비용과 세포배양의 계대 과정에 따른 바이러스의 농도 감소 문제를 해결하고, 백신효과가 우수하며 경제적으로 효율적인 이리도 바이러스 백신의 제조방법을 제공하고자 예의노력한 결과, 이리도 바이러스에 감염된 폐사어의 내부 장기 조직을 불활성화시켜 백신을 제조하여, 이의 면역효과가 우수하며 양식 해산어뿐만 아니라 관상용 담수어 등 넓은 범위의 어종에 대하여 면역효과를 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the present inventors solve the problem of high production cost, which is a disadvantage of the iridovirus inactivating vaccine using the existing GF cells, and the concentration reduction of the virus according to the passage of the cell culture, the vaccine effect is excellent and economically efficient iridovirus vaccine As a result of intensive efforts to provide a method for producing a vaccine, the vaccine is prepared by inactivating the internal organ tissues of Iori virus infected lung fish, and its immunity is excellent. It was confirmed that having a, to complete the present invention.
본 발명의 주된 목적은 면역효과가 우수하면서도 해산어 뿐만 아니라 담수어종에 대하여도 적용가능한 이리도 바이러스 감염증의 백신 조성물을 제공하는 데 있다.It is a main object of the present invention to provide a vaccine composition of iridovirus infection which is excellent in immunity and applicable to not only marine fish but also freshwater fish species.
본 발명의 다른 목적은 경제적인 상기 이리도 바이러스 백신 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide an economical method for preparing a virus vaccine composition.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:In order to achieve the above object, the present invention provides a method for preparing a vaccine composition against iridovirus infection comprising the following steps:
(a) 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수득하는 단계; 및(a) obtaining internal organ tissue of fish infected with Irido virus; And
(b) 상기 수득된 이리도 바이러스 함유 조직을 β-프로피오락톤으로 처리하여 상기 이리도 바이러스를 불활성화시켜 백신 조성물을 제조하는 단계.(b) treating the obtained iridovirus-containing tissue with β-propiolactone to inactivate the iridovirus to prepare a vaccine composition.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 메갈로사이티바이러스 속일 수 있다.In the present invention, the virus may be a genus megalocytivirus.
본 발명에 있어서, 상기 내부 장기 조직은 폐사어의 비장 또는 신장조직인 것임을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the internal organ tissue may be characterized in that the spleen or kidney tissue of lung death.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 수득된 이리도 바이러스 함유 조직을 마쇄한 후 원심분리하여 얻은 상등액을 β-프로피오락톤으로 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 바람직하게는 상기 β-프로피오락톤은 0.1~1.0%(v/v) 의 농도로 처리할 수 있다. In the present invention, the step (b) may be characterized in that the supernatant obtained by centrifugation after grinding the obtained Irido virus-containing tissue is treated with β-propiolactone. In this case, the β-propiolactone may be preferably treated at a concentration of 0.1 to 1.0% (v / v).
본 발명에 있어서, 상기 어류는 참돔, 붉돔, 돌돔, 강담돔, 점농어, 조피볼락, 방어, 잿방어, 넙치 및 가자미로 구성된 군에서 선택된 해산어임을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the fish may be characterized in that the sea fish selected from the group consisting of red sea bream, red sea bream, stone sea bream, river bream, spotted sea bass, skinball rock, defense, sputum, flounder and flounder.
본 발명에 있어서, 또한 상기 어류는 펄구라미, 드워프구라미, 블루구라미, 실버구라미, 엔젤피쉬, 구피 및 몰리로 구성된 군에서 선택된 담수 관상어임을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the fish may also be characterized in that the freshwater ornamental fish selected from the group consisting of pearl gills, dwarf gills, blue gills, silver gills, angelfish, guppy and Molly.
본 발명은 또한, 메갈로사이티바이러스 속에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 원료로 하는 것을 특징으로 하는 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 조성물을 제공한다. The present invention also provides a vaccine composition against iridovirus infection, which is based on internal organ tissues of fish infected with megalocytivirus.
본 발명은 이리도바이러스 감염어의 조직 내에 고농도로 축적되어 있는 이리도바이러스 비리온(virion) 자체를 불활성화시키기 때문에 세포배양에 따른 높은 제작비용을 생략함으로서 경제적인 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. The present invention eliminates the high production cost according to cell culture because it inactivates the iridovirus virion itself, which is accumulated at high concentrations in the tissues of iridovirus infected fish, and thus provides an economical method for producing a vaccine against iridovirus infection. It is effective to provide.
본 발명은 또한, 이리도바이러스 감염증에 대한 면역효과가 우수하면서도 해산어 뿐만 아니라 담수어종에 대해서도 적용가능한 어류의 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물을 제공하는 효과가 있다. The present invention is also effective in providing a vaccine composition against iridovirus infection of fish which is excellent in immunity against iridovirus infection and applicable to freshwater fish species as well as marine fish.
본 발명은 일 관점에서, 다음의 단계를 포함하는 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신 조성물의 제조방법에 관한 것이다:In one aspect, the present invention relates to a method for preparing a vaccine composition for iridovirus infection comprising the following steps:
(a) 이리도 바이러스에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 수집하는 단계; 및(a) collecting internal organ tissue of fish infected with Irido virus; And
(b) 상기 수득된 이리도 바이러스 함유 조직을 β-프로피오락톤으로 처리하여 상기 이리도 바이러스를 불활성화시켜 백신 조성물을 제조하는 단계.(b) treating the obtained iridovirus-containing tissue with β-propiolactone to inactivate the iridovirus to prepare a vaccine composition.
본 발명에 있어서, 상기 바이러스는 메갈로사이티바이러스 속일 수 있다.In the present invention, the virus may be a genus megalocytivirus.
이리도 바이러스 중 메갈로사이티바이러스 속은 MCP 유전자의 염기서열 특성에 따라 3개의 소그룹(subgroups)으로 분류되고, 주요 양식어류 및 관상어를 감염시켜 대량 폐사를 유발하는 것으로 알려져 있다. Among the genomegalovirus virus, megalocytiviruses are classified into three subgroups according to the nucleotide sequence characteristics of the MCP gene, and are known to cause major deaths by infecting major farmed fish and ornamental fish.
본 발명에 있어서, 상기 내부 장기 조직은 폐사어의 비장 또는 신장조직인 것임을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the internal organ tissue may be characterized in that the spleen or kidney tissue of lung death.
본 발명의 백신 제조 원료로 사용하는 내부 장기 조직은 폐기처분하는 이리도바이러스에 감염된 어류로부터 비장, 신장 등과 같은 내부 장기 자체를 분리 채취하여 사용할 수 있는데, 이러한 감염조직에 이리도바이러스가 고밀도로 존재하고 있음을 리얼타임 PCR(Real-time PCR) 기법을 사용하여 확인하였다.Internal organ tissue used as a vaccine manufacturing material of the present invention can be used to separate the internal organ itself, such as spleen, kidney, etc., from fish infected with discarded iridovirus. Was identified using a real-time PCR technique.
이리도바이러스에 감염된 어류는 비장과 신장 조직의 비대가 특징적인 증상으로 나타내고 있어, 경제적인 관점에서도 본 발명의 방법에 의하여 백신을 제조하 는 경우 감염 어류 한 마리로부터 수천 마리분 이상의 어류에 사용할 수 있는 백신 제조가 가능하다. 현재 양식 현장에서는 이리도바이러스에 감염된 어류 혹은 폐사한 어류를 전량 폐기하고 있으므로, 이러한 폐사어의 백신 제조 원료로서의 재활용은 폐자원의 재활용으로서 의미가 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 어류에 대한 효능뿐 아니라 저렴한 제작 경비로 인해 더욱 높은 경쟁력을 가질 수 있다.Fish infected with iridovirus are characterized by hypertrophy of the spleen and kidney tissue, and from an economic point of view, when a vaccine is produced by the method of the present invention, a vaccine that can be used for more than a thousand fish from one infected fish Manufacturing is possible. Since fish farms infected with iridovirus or dead fish are currently being discarded at the farm site, the recycling of waste fish as a vaccine raw material is meaningful as the recycling of waste resources. The vaccine composition according to the present invention may have a higher competitiveness due to the low production cost as well as the efficacy on fish.
본 발명에 있어서, 또한 상기 (b)단계는 상기 바이러스의 불활성화 처리 전, 상기 수집된 조직을 마쇄한 후 원심분리하여 상등액을 얻는 단계를 더 거친 후, 상등액에 불활성화 처리하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the step (b) is further characterized in that before the inactivation treatment of the virus, after grinding the collected tissue and further centrifuged to obtain a supernatant, the supernatant is inactivated. Can be.
본 발명에 있어서, 상기 (b)단계의 불활성화는 다양한 처리방법에 의하여 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 β-프로피오락톤을 처리하여 불활성화시키며, 바람직하게는 0.1~1.0%(v/v)의 농도로 처리한다. 이때, β-프로피오락톤 처리 후, 이를 불활성화시키기 위해서 37℃에서 1~3시간 반응시킨다. In the present invention, the inactivation of step (b) can be made by various treatment methods, but preferably inactivated by treating β-propiolactone, preferably 0.1 to 1.0% (v / v) Treat at a concentration of At this time, after β-propiolactone treatment, it is reacted for 1 to 3 hours at 37 ℃ to inactivate it.
발암성이 강한 포르말린과 같은 위해물질 첨가 백신이 투여된 양식어류가 그대로 사람의 식탁에 오르는 것은 잠재적인 식품 안전성 문제가 될 수도 있음에 반하여, β-프로피오락톤은 그 자체를 불활성화시킬 수 있는 매우 안전한 방법이다. While it may be a potential food safety issue, farmed fish that have been given a high-risk carcinogenic vaccine, such as formalin, could be a potential food safety issue, while β-propiolactone can inactivate itself. It's a very safe way.
본 발명에 있어서, 상기 어류는 참돔, 붉돔, 돌돔, 강담돔, 점농어, 조피볼락, 방어, 잿방어, 넙치 및 가자미로 구성된 군에서 선택된 해산어임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉 이리도바이러스 감염증을 나타내는 해산어류로부터 내부 장기 조직을 분리하여 이용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다. 다만, 바람직하게는 상기 어류로는 돌돔을 사용할 수 있다.In the present invention, the fish may be characterized in that it is a marine fish selected from the group consisting of red snapper, red snapper, stone dome, gangdam dome, spot bass, lizard rock, defense, sputum, flounder and flounder, but is not limited thereto. That is, it will be apparent to those skilled in the art that internal organ tissues can be separated and used from marine fish that exhibit iridovirus infection. However, preferably, the fish may use a stone dome.
본 발명에 있어서, 또한 상기 어류는 펄구라미, 드워프구라미, 블루구라미, 실버구라미, 엔젤피쉬, 구피 및 몰리로 구성된 군에서 선택된 담수 관상어임을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 즉, 이리도바이러스 감염증을 나타내는 관상어류로부터 내부 장기 조직을 분리하여 이용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명할 것이다. In the present invention, the fish may also be characterized in that it is a freshwater ornamental fish selected from the group consisting of pearl gills, dwarf gills, blue gills, silver gills, angelfish, guppy and molle, but is not limited thereto. That is, it will be apparent to those skilled in the art that internal organ tissues can be separated and used from coronary fishes showing iridovirus infection.
본 발명은 또 다른 관점에서, 메갈로사이티바이러스 속에 감염된 어류의 내부 장기 조직을 원료로 하는 것을 특징으로 하는 이리도바이러스 감염증에 대한 백신 조성물에 관한 것이다. In still another aspect, the present invention relates to a vaccine composition for iridovirus infection, characterized in that the internal organ tissue of the fish infected with megalocytivirus is used as a raw material.
본 발명에 따른 백신 조성물의 효과를 증가시키기 위한 보조제로서, 면역조성제(adjuvant)를 첨가혼합할 수 있다. 예를 들면, 광물유, 식물유, 알루미늄하이드록사이드, 인산알루미늄, 실리카, 무라밀디펩티드 유도체 등을 첨가, 혼합하여 사용할 수 있다. As an adjuvant for increasing the effect of the vaccine composition according to the present invention, an adjuvant may be admixed. For example, mineral oil, vegetable oil, aluminum hydroxide, aluminum phosphate, silica, a Muramil dipeptide derivative, etc. can be added and mixed and used.
본 발명에 따른 백신 조성물을 이용한 어류의 면역은 백신 조성물을 복강 또는 근육 내 접종, 피하 접종, 침투법 및 경구투여하는 등의 방법을 이용할 수 있다. 면역화할 경우에는 바람직하게는 백신 조성물은 어류 마리당 감염조직의 양이 0.1~1mg으로 포함되도록 사용하는 것이 바람직하다. Immunization of fish using the vaccine composition according to the present invention may use methods such as intraperitoneal or intramuscular inoculation, subcutaneous inoculation, infiltration and oral administration. In the case of immunization, the vaccine composition is preferably used so that the amount of infected tissue per fish is included in the amount of 0.1 to 1 mg.
본 발명에 따른 백신 조성물은 해산어와 담수관상어 양자 모두에 대한 이리도 바이러스 감염증의 예방에 매우 효과적이며, 해산어 유래 이리도 바이러스와 담수관상어 유래 이리도 바이러스 양자 모두에 대해 높은 면역 효과를 유도할 수 있다. The vaccine composition according to the present invention is very effective for the prevention of iridovirus infections against both marine fish and freshwater sharks, and can induce a high immune effect against both marine fish-derived irido virus and freshwater shark-like idovirus.
<< 실시예Example >>
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.
실시예Example 1. 백신 제조를 위한 시료의 선정 1. Selection of Samples for Vaccine Preparation
1-1. 이리도 바이러스의 1-1. Here's the virus 감염여부Infection 확인 Confirm
전형적인 이리도 바이러스 감염증상은 행동이 둔해지고, 심한 빈혈, 아가미의 점상출혈, 그리고 비장과 신장의 비대화가 특히 두드러지게 나타난다. Giemsa 용액으로 염색 시, 조직병리학적으로 비장, 신장, 간, 그리고 아가미 등의 조직에서 대형화된 비즈 세포(bead cells)들을 관찰할 수가 있다. Typical iridovirus infections are particularly slow in behavior, with severe anemia, bleeding from gills, and hypertrophy of the spleen and kidneys. When stained with Giemsa solution, histopathologically, the enlarged bead cells can be observed in tissues such as spleen, kidney, liver and gills.
이러한 전형적인 이리도 바이러스의 감염증상을 보이는 경상남도 남해안의 가두리 양식장의 돌돔, 거제도 양식장의 넙치, 부산의 관상어 도매상에서 담수관상 어인 펄구라미의 비장과 신장 조직을 적출하여 -70℃에서 사용 전까지 보관하였다. The spleen and kidney tissues of freshwater tube fish, perilla fish, were harvested at -70 ° C from the rock dome of the caged fish farm, the flounder of the Geojedo farm, and the wholesale fish fish of pearl gurami in Busan, South Korea.
그 후, 각 감염어의 비장 조직으로부터 전체 DNA를 분리한 후, PCR을 실시하여 이리도 바이러스의 감염 여부를 확인하였다. PCR에 사용된 프라이머는 이리도 바이러스의 MCP 유전자의 염기서열 전체가 포함되도록 고안한 것으로 다음의 서열과 같다.Thereafter, the whole DNA was isolated from the spleen tissue of each infected fish, and then PCR was performed to confirm whether the virus was infected. Primers used for PCR were designed to include the entire base sequence of the MCP gene of the virus, such as the following sequence.
센스 프라이머 5'-GAGAGACCCCAACACGAC-3' (서열번호 1)Sense primer 5'-GAGAGACCCCAACACGAC-3 '(SEQ ID NO: 1)
안티센스 프라이머 5'-ACCTGGTGGCTCCAGTGC-3' (서열번호 2)Antisense primer 5'-ACCTGGTGGCTCCAGTGC-3 '(SEQ ID NO: 2)
상기 프라이머로 증폭시킨 각 PCR 산물은 프랩-A-유전자 DNA 분리 키트 (Prep-A-Gene DNA purification kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정제하였고, 정제된 DNA는 TOPO-TA Cloning Kit (Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 클로닝 한 후, Big Dye Terminator Cycle DNA Sequencing Kit (ABI PRISM PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 염기서열을 밝혔다. 그리고, 각 감염어의 비장조직에서 분리한 DNA의 염기서열은 Clustal W 프로그램과 MEGA2 프로그램 (Version 2.1. Department of Biology, Arizona State University, Tempe, AZ, USA)을 사용하여 계통적 분석을 실시하였다. Each PCR product amplified with the primer was purified using a Prep-A-Gene DNA purification kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), and the purified DNA was TOPO- After cloning using a TA Cloning Kit (Invitrogen Co., Carlsbad, Calif., USA), the sequence was revealed using a Big Dye Terminator Cycle DNA Sequencing Kit (ABI PRISM PE Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA). DNA sequences isolated from spleen tissue of each infected fish were analyzed systematically using Clustal W program and MEGA2 program (Version 2.1. Department of Biology, Arizona State University, Tempe, AZ, USA).
계통적 분석은 상기와 같이 각 감염어의 비장조직에서 분리한 MCP 유전자 부위 DNA 염기서열을 NCBI의 BLAST에 입력하여 기 보고된 염기서열 중 가장 유사한 것을 찾아서 서로 비교함으로써 이루어졌으며, 그 결과 상기 어류의 감염조직으로 부터 분리한 바이러스는 이리도바이러스 중 어류에서 질병을 일으키는 메갈로사이티바이러스 속 (genus Megalocytivirus)으로 확인되었다. 분석결과는 다음과 같다. The systematic analysis was performed by inputting the DNA sequence of the MCP gene region isolated from the spleen tissue of each infected fish into the BLAST of NCBI, and searching for the most similar nucleotide sequences previously reported and comparing them with each other. The virus isolated from tissues has been identified as genus Megalocytivirus, which causes disease in fish. The analysis results are as follows.
먼저, 상기 전형적인 이리도 바이러스의 감염증상을 보이는 경상남도 남해안의 가두리 양식장 돌돔의 이리도 바이러스는 RB-1, 거제도 양식장 넙치의 이리도 바이러스는 OF-1, 부산의 관상어 도매상에서 구입한 담수관상어인 펄구라미의 이리도 바이러스는 PG-1라 명명하였다. First, the Irido virus of the caged sea bream farmed in the south coast of Gyeongsangnam-do showing the symptoms of the typical Irido virus is RB-1, the Irido virus of Geoje farmed flounder, OF-1, and Irido of Perangura, a freshwater pipe shark purchased from the wholesale fish wholesaler in Busan. The virus was named PG-1.
<표 1>은 상기 바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1을 GenBank에 등록된 여러 메갈로사이티바이러스의 MCP 유전자 부위 DNA 염기서열과 비교하여 상동성(%)을 표시한 것이다.<Table 1> shows the homology (%) by comparing the virus RB-1, PG-1 and OF-1 with the MCP gene region DNA sequence of several megalocitiviruses registered in GenBank.
<표 1> 이리도 바이러스의 MCP (major capsid protein) 유전자 비교 분석 <Table 1> Comparative analysis of major capsid protein (MCP) genes of Irido virus
1, RB-1; 2, RFIV-KOR-TY (AY532614); 3, RSIV-KOR-TY (AY532612); 4, RBIV-KOR-YS (AY532610); 5, RBIV-KOR-GJ (AY532609); 6, RBIV-KOR-TY3 (AY532607); 7, RBIV-KOR-TY1 (AY532606); 8, RBIV CNU-1 (AY849393); 9, OFIV (DQ198145); 10, RSIV (AY310918); 11, RBIV CNU-2 (AY849394); 12, RBIV-KOR-TY4 (AY532608); 13, OSGIV (AY894343); 14, RBIV-KOR-TY2 (AY533035); 15, SBIV-KOR-TY (AY532613); 16, SBIV (AY310917); 17, GSDIV (AY285746); 18, LYCIV (AY779031); 19, RSIV Ehime-1 (AB080362); 20, ISKNV (AF371960); 21, DGIV (AY989901); 22, MCIV (AY936203); 23, PG-1; 24, DGIV (AY285744); 25, ALIV (AB109368); 26, RBIV-KOR-CS (AY532611); 27, TRBV (AY590687); 28, FLIV-EJ (AY633987); 29, OFIV (AY661546); 30, FLIV-JJ (AY633988); 31, TBIV (AB166788); 32, OF-1.1, RB-1; 2, RFIV-KOR-TY (AY532614); 3, RSIV-KOR-TY (AY532612); 4, RBIV-KOR-YS (AY532610); 5, RBIV-KOR-GJ (AY532609); 6, RBIV-KOR-TY3 (AY532607); 7, RBIV-KOR-TY1 (AY532606); 8, RBIV CNU-1 (AY849393); 9, OFIV (DQ198145); 10, RSIV (AY310918); 11, RBIV CNU-2 (AY849394); 12, RBIV-KOR-TY4 (AY532608); 13, OSGIV (AY894343); 14, RBIV-KOR-TY2 (AY533035); 15, SBIV-KOR-TY (AY532613); 16, SBIV (AY310917); 17, GSDIV (AY285746); 18, LYCIV (AY779031); 19, RSIV Ehime-1 (AB080362); 20, ISKNV (AF371960); 21, DGIV (AY989901); 22, MCIV (AY936203); 23, PG-1; 24, DGIV (AY285744); 25, ALIV (AB109368); 26, RBIV-KOR-CS (AY532611); 27, TRBV (AY590687); 28, FLIV-EJ (AY633987); 29, OFIV (AY661546); 30, FLIV-JJ (AY633988); 31, TBIV (AB166788); 32, OF-1.
메갈로사이티바이러스 속은 MCP 유전자의 염기서열 특성에 따라 3개의 소그룹(subgroups)으로 분류되는데, 상기 바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1은 각각 메갈로사이티바이러스의 소그룹 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ에 속하는 것으로 밝혀졌다. The megalocytivirus genus is divided into three subgroups according to the nucleotide sequence characteristics of the MCP gene, and the viruses RB-1, PG-1 and OF-1 are divided into the subgroups I, II and III of megalocytivirus, respectively. It turns out to belong.
도 1은 메갈로사이티바이러스 속의 분류학적 계통 관계를 표시하고 있으며, 상기 <표 1>의 결과와 일치한다. Figure 1 shows the taxonomic lineage of the genus Megalocytiviruses, which is consistent with the results in Table 1 above.
상기의 분석 결과는, 상기 이리도바이러스 감염증상을 보이는 어류의 내장조직의 바이러스는 공지된 메갈로사이티바이러스 속 바이러스와 유전적으로 99% 이상의 유사성을 가지고 있으며, 이것은 공지된 메갈로사이티바이러스 속 바이러스를 사용하는 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것을 의미한다.As a result of the analysis, the virus of the visceral tissue of fish showing the symptoms of iridovirus infection has a genetic similarity of more than 99% with the known megalovirus virus genus, which uses a known megalovirus virus genus Even if it means that the same result can be obtained.
1-2: 분리된 1-2: separated 이리도바이러스에Iridovirus 의한 어종별 폐사율 분석 Mortality analysis by fish species
상기 실시예 1-1에서 확보한 메갈로사이티바이러스의 어류에 대한 병원성을 확인하기 위해 인위감염 실험을 실시하였으며, 그 방법은 다음과 같다. In order to confirm the pathogenicity of the fish of megalocytivirus obtained in Example 1-1, an artificial infection experiment was performed, and the method is as follows.
해산어인 돌돔 (치어, 성어), 참돔 (치어, 성어), 점농어, 조피볼락, 넙치, 감성돔을 남해안 양식장에서 구입하였고, 담수관상어인 펄구라미, 드워프구라미, 엔젤피쉬를 부산의 관상어 도매상에서 구입하였다. 해산어는 250ℓ 수조에 담수어는 40ℓ 수조에 각각 어종별로 넣은 후 수온이 25±1℃가 되도록 하여 2주일간 순치시켰다. 각 어종은 PCR 방법을 이용하여 이리도 바이러스 미감염을 확인한 후, 각각 15마리씩 복강주사를 통해 아래와 같은 방법으로 공격 실험하였다. Sea fish, sea bream (fish), sea bream (fish), sea bass, sea bass, flounder, and black sea bream were purchased from the southern coastal farm, and freshwater sharks such as pearl gurami, dwarf gurami, and angel fish were purchased from the wholesalers of ornamental fish in Busan. . Sea fish was placed in 250 L water tank and fresh fish in 40 L water tank for each species. Each fish species was identified as iridovirus uninfected using PCR, and then 15 animals were each challenged by the following method through intraperitoneal injection.
상기 실시예 1-1의 각 감염어의 비장 조직에 PBS 완충액을 첨가하여 마쇄한 후, 그 조직 마쇄액을 공격 실험에서 접종액으로 사용하였다. 바이러스 접종액은 0.45 ㎛ 필터에 통과시킨 후, 어체중 1㎏당 감염조직 10㎍에 해당하는 조직 분쇄물을 복강 내에 0.1㎖씩 주사하였고, 대조군으로서 PBS를 각 어종에 대해 0.1㎖씩 복강 내 주사하였다. PBS buffer solution was added to the spleen tissue of each infected fish of Example 1-1 and ground, and the tissue ground solution was used as the inoculum in the challenge experiment. The virus inoculum was passed through a 0.45 μm filter, and then 0.1 ml of the tissue pulverization corresponding to 10 µg of infected tissue per kg of body weight was injected intraperitoneally, and 0.1 ml of PBS was injected for each fish species as a control. It was.
그 후, 수온 25±1℃의 격리된 수조에서 사육하면서 25일간 폐사를 관찰하였고, 폐사어의 이리도 바이러스 감염 유무는 다음과 같은 두 가지 방법을 사용하여 판별하였다. 첫 번째는 폐사어의 비장 조직에서 전체 DNA를 분리 후 PCR 방법을 사용하였고, 두 번째는 광학현미경을 사용하여 비장 조직 내에서의 대형화된 비즈 세포(bead cells)의 출현을 관찰하는 방법을 사용하였다. Thereafter, mortality was observed for 25 days while breeding in an isolated tank at 25 ± 1 ° C., and the presence or absence of iridovirus infection in the lung was determined using the following two methods. The first method was used to isolate whole DNA from spleen tissue of lung fish, and the second method was to observe the appearance of enlarged bead cells in spleen tissue using an optical microscope.
<표 2> 이리도바이러스에 의한 어종별 폐사율<Table 2> Mortality by Fish Species by Irido Virus
그 결과, <표 2>에 나타난 바와 같이, 메갈로사이티바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1은 돌돔 치어와 성어에서 모두 100%의 누적폐사율을 나타내었다. 또한, 참돔, 점농어, 조피볼락, 넙치, 펄구라미, 드워프구라미의 6 어종에 대해서는 40~87%의 폐사율을 보였고, 그 중 참돔에서 가장 높은 폐사율이 나타났다. As a result, as shown in <Table 2>, megalocytiviruses RB-1, PG-1 and OF-1 showed 100% cumulative mortality in both sea bream and adult fish. In addition, mortality of 40 to 87% was observed for six species of red snapper, spotted sea bass, sea bass rockfish, flounder, perogrami, and dwarf grami.
엔젤피쉬는 0~13%로 매우 낮은 폐사율을 나타내었고, 감성돔의 경우에는 세 가지 바이러스에 대해 단 한 마리의 폐사도 없었다. 모든 대조군(PBS)에서는 폐사가 없었으며, PCR과 현미경적 관찰을 통한 이리도 바이러스 질병 검사에서 대조군을 제외한 전 폐사 어에서 양성 반응을 나타내었으며, 모든 폐 사어가 이리도 바이러스 감염에 의해 폐사했다는 것을 확인하였다. Angelfish had a very low mortality rate of 0-13%, and there was no single mortality for the three viruses in black sea bream. There was no mortality in all control groups (PBS), and erythritis virus disease test by PCR and microscopic observation showed positive responses in all mortals except the control group. .
상기의 결과는 해산어에서 분리한 메갈로사이티바이러스 RB-1 및 OF-1과 담수어에서 분리한 메갈로사이티바이러스 PG-1은 실험에 사용한 대부분의 해산어와 담수어종에 대해 높은 병원성을 가졌으며, 모두 광범위한 숙주 감염성을 가진다는 것을 의미한다.The results showed that megalocitiviruses RB-1 and OF-1 isolated from marine fish and megalocitivirus PG-1 isolated from freshwater fish were highly pathogenic to most marine and freshwater fish species. All mean that they have a wide range of host infectivity.
1-3: 감염 조직 내 이리도 바이러스 1-3: Irido virus in infected tissue particleparticle 의 농도 분석 Concentration analysis
본 발명의 백신 제작에 사용할 원료를 효과적으로 선택하기 위하여, 감염 조직(비장, 신장)에서 가장 많은 이리도 바이러스를 포함하는 어종을 판별하였다. 양식장에서 이리도바이러스에 의한 피해가 특히 많은 돌돔, 참돔, 점농어, 조피볼락, 넙치와 담수관상어인 펄구라미, 드워프구라미 등을 대상으로 조사하였으며 그 방법은 아래와 같다. 돌돔 (체중 200 ± 28g), 참돔 (체중 500 ± 42g), 점농어 (체중 400 ± 37g), 조피볼락 (체중 30 ± 4g), 넙치 (체중 200 ± 29g), 펄구라미 (체중 4 ± 1g), 드워프구라미 (체중 4 ± 1g) 등 7 어종에 대해 복강 내 주사를 통해 메갈로사이티바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1로 각각 감염시켰고, 죽기 직전 상태의 감염어 10마리씩으로부터 비장과 신장을 분리하여 무게를 측정하였다. In order to effectively select the raw materials to be used for the vaccine production of the present invention, fish species containing the most iridovirus were determined in infected tissues (spleen, kidney). In the farm, iridovirus, especially sea bream, red snapper, spotted sea bass, sea bass rockfish, flounder, and freshwater sharks such as pearl gurami and dwarf gurami, were investigated. Sea bream (weight 200 ± 28g), red snapper (weight 500 ± 42g), spotted sea bass (weight 400 ± 37g), sea bass rock (weight 30 ± 4g), flounder (weight 200 ± 29g), pearlfish (weight 4 ± 1g), Seven fish species, including dwarf gummy (body weight 4 ± 1 g), were infected with megalocytiviruses RB-1, PG-1 and OF-1 via intraperitoneal injection, respectively, and spleen and kidneys from 10 infected animals immediately before death. The weight was measured by separating.
감염어의 비장과 신장 1㎎으로부터 전체 DNA를 분리하여 리얼-타임 PCR(real-time PCR) 분석에 사용하였다. 각 10마리씩의 어종에 대해 분석하였으며, 바이러스 카피 수(viral copy numbers) / ㎎ (비장 또는 신장 조직) 값은 10마리에 대한 평균값으로 구하였다. Total DNA was isolated from spleen and
Real-time PCR 분석은 Rotor-Gene 6000 (Corbett Research)을 사용하여 아래와 같은 방법으로 실시하였다. Real-time PCR 반응을 위해서 1×EvaGreen dye, 1×PCR buffer (10mM Tris-HCl, pH 8.3, 50mM KCl), 2.5 mM MgCl2, 0.3 mM dNTPs, 각각의 0.5 pM primer, 2.5 U Taq DNA polymerase 그리고 1㎕ 전체 DNA를 PCR tube에 첨가하여 최종 20㎕의 반응액이 되도록 하였고, 유전자 증폭 반응 조건은 다음과 같이 하였다: 94℃에서 10분간 1 사이클; 94℃에서 10초, 52℃에서 15초, 72℃에서 20초간 40사이클. 표준곡선(Standard curve)을 위한 플라스미드 DNA(plasmid DNA)의 양을 측정한 결과 5.0×109 copies / ㎕로 나타났다. Real-time PCR analysis was performed using the Rotor-Gene 6000 (Corbett Research) as follows. For real-time PCR reactions, 1 × EvaGreen dye, 1 × PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl), 2.5 mM MgCl 2 , 0.3 mM dNTPs, 0.5 pM primer, 2.5 U Taq DNA polymerase, and 1 [mu] l total DNA was added to the PCR tube to the final 20 [mu] l reaction solution. Gene amplification reaction conditions were as follows: 1 cycle at 94 DEG C for 10 minutes; 40 cycles of 10 seconds at 94 ° C., 15 seconds at 52 ° C., and 20 seconds at 72 ° C. The amount of plasmid DNA for the standard curve was determined to be 5.0 × 10 9 copies / μl.
감염 어종 별 비장 내에서의 바이러스 카피 수(viral copy numbers) 결과는 <표 3>, <표 4> 및 <표 5>와 같다.The results of viral copy numbers in the spleen of infected fish species are shown in Tables 3, 4 and 5, respectively.
<표 3> 메갈로사이티바이러스 RB-1에 감염된 어류의 비장 또는 신장 조직 내 바이러스 카피 수(viral copy numbers) 비교Table 3 Comparison of viral copy numbers in spleen or kidney tissue of fish infected with megalocytivirus RB-1
<표 4> 메갈로사이티바이러스 OF-1에 감염된 어류의 비장과 신장 조직 내 바이러스 카피 수(viral copy numbers) 비교Table 4 Comparison of viral copy numbers in spleen and kidney tissue of fish infected with megalocytivirus OF-1
<표 5> 메갈로사이티바이러스 PG-1에 감염된 어류의 비장과 신장 조직 내 바이러스 카피 수(viral copy numbers) 비교Table 5 Comparison of viral copy numbers in spleen and kidney tissue of fish infected with megalocytivirus PG-1
그 결과, 메갈로사이티바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1에 따른 바이러스 카피 수는 큰 변화를 보이지 않았다. 그러나 어종에 따라서는 바이러스 카피 수의 유의적인 차이가 나타났으며, 동일한 감염 조직량 (1㎎)에서 가장 많은 이리도 바이러스를 포함하고 있었던 어종은 돌돔으로 나타났다. 그러므로 소량의 감염조직에서 충분한 양의 이리도 바이러스를 포함하고 있는 돌돔을 본 발명의 백신 제작을 위한 원료로 선정하였다. As a result, the number of virus copies according to megalocytiviruses RB-1, PG-1 and OF-1 did not change significantly. However, there was a significant difference in the number of virus copies depending on the species, and the species containing the largest number of iridoviruses in the same amount of infected tissue (1 mg) was found as rockfish. Therefore, sea bream containing a sufficient amount of iridovirus in a small amount of infected tissue was selected as a raw material for the vaccine production of the present invention.
실시예Example 2. 이리도 바이러스 감염증에 대한 불활성화 백신의 제조 2. Preparation of Inactivated Vaccines Against Irido Virus Infection
2-1: 백신 제조를 위한 시료2-1: Sample for Vaccine Preparation
상기 실시예 1-1의 메갈로사이티바이러스 RB-1에 감염된 돌돔의 비장과 신장 조직을 백신 제조를 위한 시료로 사용하였으며, 불활성화 과정 전까지의 처리 방법은 다음과 같다. The spleen and kidney tissue of the sea bream infected with megalocytivirus RB-1 of Example 1-1 were used as samples for vaccine preparation, and the treatment method before inactivation was as follows.
상기 실시예 1-1의 메갈로사이티바이러스 RB-1에 감염된 돌돔으로부터 비장과 신장 조직을 적출하여 10 ㎎/㎖ 농도가 되도록 PBS (phosphate-buffered saline) 완충액을 첨가하여 마쇄하였다. 마쇄액은 300×g, 5분간 원심분리하여 상등액을 취하였고, 그 상등액을 다시 2600×g, 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 그 상등액을 백신 제조를 위한 시료로 사용하였다. Spleen and kidney tissues were extracted from the stone dome infected with megalocytivirus RB-1 of Example 1-1 and pulverized by adding PBS (phosphate-buffered saline) buffer to a concentration of 10 mg / ml. The supernatant was centrifuged at 300 × g for 5 minutes to take a supernatant, and the supernatant was again centrifuged at 2600 × g for 10 minutes to take a supernatant, and the supernatant was used as a sample for vaccine preparation.
다만, 본 발명에서는 이미 메갈로사이티바이러스에 감염된 돌돔을 구입하여 이의 비장과 신장 조직을 백신 제조를 위한 시료로 사용하였으나, 상기 실시예 1-1의 계통분석결과와 같이 본 실시예에서 사용한 바이러스는 이미 공지된 메갈로사이티바이러스 속의 바이러스이다. 이에 실시예 1-1에 제시된 타 메갈로사이티바이러 스 및 다른 속의 이리도바이러스를 어류에 인위적으로 감염시킨 후, 감염된 어류의 감염조직을 사용하는 경우에도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다. However, in the present invention, already purchased a sea bream infected with megalocytivirus and used the spleen and kidney tissue as a sample for vaccine production, the virus used in this example as shown in the results of the system analysis of Example 1-1 It is a virus of the genus Megalocytivirus already known. Therefore, after artificially infecting fish with other megalovirus viruses and other genus iridoviruses shown in Example 1-1, the same result can be obtained even when using infected tissues of infected fish. It will be apparent to those skilled in the art.
2-2: 불활성화 방법2-2: Deactivation Method
본 발명의 불활성화 백신을 제조하기 위하여 세 가지의 다른 처리 방법을 각각 사용하였고, 그 방법은 다음과 같다.Three different treatment methods were used to prepare the inactivated vaccine of the present invention, respectively.
(a) β-프로피오락톤 처리(a) β-propiolactone treatment
상기 실시예 2-1에서 얻은 시료에 β-프로피오락톤을 최종농도 0.01%, 0.1%, 1%(V/V)가 되도록 각각 혼합하여 4℃에서 5시간 반응시켜서 바이러스를 불활성화시킨 후, 다시 37℃에서 2시간 정치하여 β-프로피오락톤을 불활성화시켰다.After the β-propiolactone was mixed to the final concentration of 0.01%, 0.1%, and 1% (V / V) to the sample obtained in Example 2-1, respectively, and reacted at 4 ° C for 5 hours to inactivate the virus, It left still at 37 degreeC for 2 hours and inactivated (beta) -propiolactone.
(b) 포르말린 처리(b) formalin treatment
상기 실시예 2-1에서 얻은 시료에 포르말린을 최종농도 0.1%, 1%(V/V)가 되도록 각각 혼합하여 4℃에서 10일간 반응시켜서 바이러스를 불활성화시켰다.Formalin was mixed with the sample obtained in Example 2-1 to have a final concentration of 0.1% and 1% (V / V), respectively, and reacted at 4 ° C for 10 days to inactivate the virus.
(c) 열처리(c) heat treatment
고열처리 (180℃) 방법으로 불활성화시키기 위해서 용기를 제작하였고, 지름 0.3mm의 스테인레스 관을 코일(coil) 형태로 약 5㎖ 용량이 되도록 하여 양끝으로 스크류 마개를 끼울 수 있도록 하였다. 스테인레스 관에 상기 실시예 2-1에서 얻은 시료를 넣고 온도 조절이 가능한 기름 속에 스테인레스 관을 넣음으로써 고열처리 (180℃)시켰다. 시료는 60℃ 1분, 100℃ 1분, 180℃ 10초간 각각 열처리하여 불활성화시켰고, 60℃와 100℃ 반응시에는 동일 용기에 시료를 넣어 가열시킨 물에 중탕시킴으로써 불활성화시켰다. 열처리시킨 시료는 얼음 위로 옮겨서 빠르게 식혔다.The container was made to inactivate by high heat treatment (180 ° C.), and a stainless steel tube with a diameter of 0.3 mm was about 5 ml in the form of a coil so that the screw cap could be fitted at both ends. The sample obtained in Example 2-1 was placed in a stainless steel tube and subjected to high heat treatment (180 ° C.) by placing the stainless steel tube in oil having temperature control. The samples were inactivated by heat treatment at 60 ° C. for 1 minute, 100 ° C. for 1 minute, and 180 ° C. for 10 seconds, respectively. During the reaction with 60 ° C. and 100 ° C., the samples were inactivated by placing the sample in the same container and hot watering it. The heat treated sample was transferred to ice and cooled rapidly.
2-3: 바이러스의 불활성화 확인2-3: Confirm Inactivation of Virus
상기 과정을 거친 시료가 완전히 불활성화되었는지 확인하기 위해서 상기와 같이 불활성화 처리된 각 시료의 0.1㎖를 돌돔 (체중 5 ± 2g) 20마리에 복강 내 주사하였으며, 대조군으로서 불활성화시키지 않은 시료 0.1㎖를 주사하여 6주간 폐사를 관찰하였다. In order to confirm that the sample passed through the above procedure was completely inactivated, 0.1 ml of each inactivated sample was intraperitoneally injected into 20 sea breams (5 ± 2 g), and 0.1 ml of the sample was not inactivated as a control. The mortality was observed for 6 weeks by injection.
<표 6> 불활성화 백신 주사에 의한 돌돔의 폐사율Table 6: Mortality rate of sea bream by inactivated vaccination
그 결과, <표 6>에 나타난 바와 같이, 불활성화시키지 않은 시료를 주사한 대조군은 2주일 이내에 100% 폐사하였다. 또한, β-프로피오락톤을 0.01% 처리한 실험군에서는 80% 폐사하였으나, 0.1%와 1% 처리시에는 폐사가 전혀 발생하지 않아 완전히 불활성화된 것을 확인하였다. 포르말린을 0.1% 처리시에는 폐사가 발생하지 않았지만, 1% 처리시에는 주사 후 1일 이내에 100% 폐사하였다. 그러나, 별도로 1%의 포르말린만을 주사한 대조군의 경우에도 100% 폐사하는 것으로 나타났으며, 이에 1%의 포르말린으로 불활성화시킨 백신은 이물질로서 첨가된 포르말린 자체의 어류 맹독성으로 인한 폐사였음을 확인하였다. As a result, as shown in Table 6, the control group injected with the non-inactivated sample died 100% within 2 weeks. In addition, the experimental group treated with 0.01% β-propiolactone was 80% mortality, but when 0.1% and 1% treatment did not cause any mortality was confirmed that completely inactivated. No mortality occurred in 0.1% treatment of formalin, but 100% death within 1 day of injection in 1% treatment. However, the control group injected with only 1% formalin showed 100% mortality. Therefore, the vaccine inactivated with 1% formalin was confirmed to be dead due to the toxicity of fish of formalin itself. .
한편, 열처리 시, 60℃ 1분 처리한 실험군에서는 90% 폐사하였지만, 100℃ 1분, 180℃ 10초간 처리한 실험군에서는 폐사가 나타나지 않았다. 즉, β-프로피오락톤 0.1% 이상, 포르말린 0.1% 이상 그리고 열처리 100℃ 1분 이상, 180℃ 10초 이상 등의 조건하에서 시료가 완전히 불활성화된 것을 확인하였다. On the other hand, 90% of the deaths occurred in the experimental group treated at 60 ° C. for 1 minute during heat treatment, but no death occurred in the experimental group treated at 100 ° C. for 1 minute and 180 ° C. for 10 seconds. That is, it was confirmed that the sample was completely inactivated under conditions such as 0.1% or more of β-propiolactone, 0.1% or more of formalin and 100 ° C or more of heat treatment for 1 minute or more, and 180 ° C or 10 seconds or more.
실시예Example 3. 백신의 제조방법과 농도에 따른 어종별 효과 3. Effect of Fish Species by Vaccine Manufacturing Method and Concentration
상기 실시예 2에서 제조된 불활성화 백신의 처리방법과 농도에 따른 백신의 효능을 돌돔과 참돔을 대상으로 다음과 같이 실험하였다.The efficacy of the vaccine according to the treatment method and the concentration of the inactivated vaccine prepared in Example 2 was tested as follows on dolphins and red snapper.
PCR 방법을 사용하여 이리도바이러스에 감염되지 않은 것을 확인한 돌돔 (5±2g)과 참돔 (7±3g)을 실험군 당 20마리씩 40ℓ 수조에 수용하였고, 상기 실시예 2에서 제조된 불활성화 백신을 어류의 복강 내에 0.1㎖씩 주사했을 때 투여되는 감염 조직의 양이 1㎎이 되도록 PBS 완충액에 희석하여 각각 주사한 후 25℃에서 사육하였다. 또한, 백신의 농도에 따른 효능을 분석하기 위하여, 어류 1 마리당 투여되는 감염 조직의 양을 0.1㎎이 되도록 PBS 완충액에 희석하여 0.1㎖씩 복강 내에 각각 주사한 후 25℃에서 사육하였다. 대조군으로서는 PBS 완충액을 0.1㎖씩 주사하였고, 백신 처리한 실험군과 동일한 방법으로 사육하였다. The sea bream (5 ± 2g) and red snapper (7 ± 3g), which were confirmed not to be infected with the iridovirus using the PCR method, were housed in a 40L tank of 20 animals per experimental group, and the inactivated vaccine prepared in Example 2 When injected 0.1 ml intraperitoneally, the amount of infected tissue to be administered was diluted to PBS buffer so that the amount of 1 mg each was injected and reared at 25 ℃. In addition, in order to analyze the efficacy according to the concentration of the vaccine, the amount of infected tissue to be administered per fish was diluted in PBS buffer solution to 0.1 mg each was injected intraperitoneally by 0.1ml and then reared at 25 ℃. As a control group, 0.1 ml of PBS buffer was injected and bred in the same manner as the experimental group vaccinated.
그로부터 2주일 후, 상기 실시예 1에서 분리한 메갈로사이티바이러스 RB-1을 각 실험군과 대조군에 상기 실시예 1의 1-2와 동일한 방법으로 복강주사를 통해 직접 감염시켰고, 감염시킨 어류는 30일간 사육하면서 폐사율을 조사하였다. Two weeks later, megalocytivirus RB-1 isolated in Example 1 was directly infected by each group and control group by intraperitoneal injection in the same manner as in Example 1-2, and the infected fish was 30 Mortality was examined during daily breeding.
<표 7>은 그 실험 결과를 표시하며, <표 7> 상의 RPS(relative percent survival)는 다음과 같은 식을 기초로 산출하였다. <Table 7> shows the experimental results, and the relative percent survival (RPS) in <Table 7> was calculated based on the following equation.
RPS = [(대조군 폐사율 - 실험군 폐사율)] / 대조고 폐사율 × 100RPS = [(Control Mortality-Experimental Mortality)] / Control Mortality × 100
<표 7> 본 발명의 불활성화 백신을 면역시킨 후 이리도 바이러스로 감염시킨 어류의 폐사율 Table 7 Mortality of fish infected with iridovirus after immunization of the inactivated vaccine of the present invention
*: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리 * : Amount of infected tissue contained in the vaccine (mg) / horse
조사결과, <표 7>에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 백신조성물을 돌돔에 복강 내 투여한 경우, 높은 효과를 나타내지는 않았다. 즉, 포르말린 처리와 열처리 방법으로 제작한 백신은 대조군과 마찬가지로 모두 100%의 누적폐사율을 보였다. 그러나, β-프로피오락톤 불활성화 백신의 경우, 0.1㎎의 감염조직을 사용한 실험군에서는 모두 폐사하였지만 1㎎의 감염조직을 사용한 실험군에서는 20~25%의 RPS를 나타내어 다른 불활성화 백신과는 차이를 보였으며, β-프로피오락톤의 농도를 0.1%와 1%로 다르게 처리한 실험군 사이에서 유의적인 차이점은 나타나지 않았다. As a result, as shown in Table 7, the vaccine composition according to the present invention did not show a high effect when intraperitoneally administered to the rock dome. That is, the vaccine prepared by formalin treatment and heat treatment showed 100% cumulative mortality as in the control. However, in case of β-propiolactone inactivated vaccine, all of them died in the experimental group using 0.1 mg of infected tissue, but the experimental group using 1 mg of infected tissue showed RPS of 20-25%, which is different from other inactivated vaccines. There was no significant difference between the groups treated with different concentrations of β-propiolactone at 0.1% and 1%.
참돔의 경우 돌돔에서 보다 매우 높은 면역 효과를 나타내었다. 그 중 β-프로피오락톤 불활성화 백신을 사용한 실험군에서 특히 높은 효과를 나타내었는데, 감염조직의 양 1㎎이 포함된 β-프로피오락톤 불활성화 백신 실험군에서는 87~93%의 높은 RPS 수치를 보였으며, 감염조직의 양 0.1㎎이 포함된 백신 실험군에서도 87%로 높게 나타났다. 감염조직 1㎎이 포함된 포르말린 및 열처리 불활성화 백신 실험군은 53~67%의 RPS 수치를 나타내었고, 1/10의 감염조직의 양 (0.1㎎)이 포함된 경우 RPS 수치가 27~33%로 감소하였다. In the case of red snapper, the sea bream showed a much higher immune effect. Among them, the experimental group using β-propiolactone inactivated vaccine showed a particularly high effect. In the experimental group of β-propiolactone inactivated vaccine containing 1 mg of infected tissue, the RPS level was 87-93%. In the vaccine group containing 0.1 mg of infected tissue, the percentage was high (87%). The experimental group of formalin and heat-inactivated vaccine containing 1 mg of infected tissue showed an RPS value of 53-67%, and the RPS was 27-33% when the amount of 1/10 of infected tissue (0.1 mg) was included. Decreased.
한편, 참돔의 대조군에서는 75%의 누적폐사율을 나타내었지만, 돌돔 대조군의 경우 100%의 누적폐사율을 보여 이리도 바이러스의 병원성이 어종에 따라 다른 것을 확인하였다. On the other hand, the control of the sea bream showed 75% cumulative mortality, but the control of the sea bream showed 100% cumulative mortality.
상기의 실험결과는 포르말린이나 열처리 방법에 의한 불활성화 방법과 달리 본 발명에 따른 조건으로 β-프로피오락톤을 사용하여 항원을 불활성화시킨 경우 타 불활성화 방법에 의해 면역효과를 보이지 않은 어종에 대해서도 면역효과를 나타냄을 보이는 것으로서, 이리도 바이러스 감염증에 대한 백신조성물에 대하여 불활성화 방법으로서 β-프로피오락톤을 이용하는 것이 가장 우수한 면역효과를 가져옴을 의미한다. The results of the experiment are different from the inactivation method by formalin or heat treatment method, even when the antigen is inactivated using β-propiolactone under the conditions according to the present invention. As it shows an immune effect, it means that β-propiolactone is used as an inactivation method for the vaccine composition against viral infection.
한편, 모든 실험군에서 감염조직의 양 1㎎이 포함된 백신이 0.1㎎이 포함된 백신에 비해 높은 면역 효과를 보인바, 감염조직의 양은 1mg 이상 10mg 이하의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. On the other hand, the vaccine containing the amount of 1 mg of infected tissue in all the experimental group showed a higher immune effect than the vaccine containing 0.1 mg, the amount of the infected tissue is preferably contained in the amount of more than 1mg 10mg.
이에 이후의 실험에서는 모두 감염조직 1㎎이 포함된 백신을 사용하였으며, 바이러스의 완전한 불활성화를 확인한 최소한의 시간과 최소량의 첨가물 처리 방법인 0.1% β-프로피오락톤 처리, 0.1% 포르말린 처리, 그리고 180℃ 10초 열처리 등의 방법을 이후의 실험에 사용하였다. In all subsequent experiments, a vaccine containing 1 mg of infected tissue was used. The minimum time and minimum amount of additive treatment method, 0.1% β-propiolactone treatment, 0.1% formalin treatment, Methods such as heat treatment at 180 ° C. for 10 seconds were used in subsequent experiments.
실시예Example 4. 백신의 종류, 대상 어종, 면역기간, 면역경로 및 바이러스 타입에 따른 백신의 효과 4. Effect of vaccine according to vaccine type, target fish species, duration of immunity, immunological route and virus type
상기 실시예 3에서 백신의 제조방법과 농도에 따른 백신의 효과를 분석하였으며, 세 가지 제조방법 중 β-프로피오락톤을 처리하였을 때, 그리고 감염조직 1㎎이 포함된 백신을 투여했을 때 가장 높은 면역 효과가 나타나는 것을 확인하였다.In Example 3, the effect of the vaccine according to the preparation method and concentration of the vaccine was analyzed. Among the three preparation methods, the highest treatment was obtained when β-propiolactone was treated and when a vaccine containing 1 mg of infected tissue was administered. It was confirmed that an immune effect appeared.
동일 농도 (1㎎)의 백신을 사용하여 백신의 종류, 대상어종, 면역기간, 면역경로 그리고 이리도 바이러스 타입을 달리하였을 때의 백신의 효능을 항목별로 각 각 실험하였고, 그 방법은 다음과 같다. Using the same concentration (1mg) of the vaccine, the vaccine's efficacy in different types of vaccine, fish species, duration of immunity, immune route, and even virus type were tested by category, and the method was as follows.
실험 어종은 이리도바이러스에 감염되지 않은 것으로 확인된 해산어 (돌돔; 5±2g, 참돔; 7±3g)와 담수어 (펄구라미; 3±1g)를 사용하였고, 실험군 당 20마리씩 40ℓ 수조에 수용하였다. Experimental fish species used marine fish (dolme; 5 ± 2g, red snapper; 7 ± 3g) and freshwater fish (Pulgurami; 3 ± 1g), which were confirmed to be not infected with Iridovirus, were housed in a 40-l tank with 20 animals per experimental group. .
상기 실시예 3에서 제조된 불활성화 백신을 0.1㎖씩 복강 또는 근육 내에 각각 주사한 후 25℃에서 사육하였고, 대조군으로서 PBS 완충액을 0.1㎖씩 동일한 방법으로 주사하였다. 0.1 ml of the inactivated vaccine prepared in Example 3 was injected intraperitoneally or intramuscularly, respectively, and raised at 25 ° C., and 0.1 ml of PBS buffer was injected in the same manner as a control.
이러한 면역처리 후 2주와 4주 경과 시점에 메갈로사이티바이러스 속의 세 가지 소그룹을 대표하는 실시예 1에서 분리한 메갈로사이티바이러스 RB-1, PG-1 및 OF-1을 복강 내에 주사하여 감염시켰다. 감염시킨 어류는 20일간 사육하면서 폐사율을 조사하였고, RPS를 산출하였다. Two and four weeks after the immunization, megalocytiviruses RB-1, PG-1, and OF-1 isolated from Example 1 representing three subgroups of the genus megalocytivirus were infected by intraperitoneal injection. I was. Infected fish were examined for mortality by raising for 20 days and yielded RPS.
실험에 따른 결과는 다음의 <표 8>, <표 9> 및 <표 10>과 같다.The results according to the experiment are shown in the following <Table 8>, <Table 9> and <Table 10>.
<표 8> 불활성화 백신으로 면역시킨 후 이리도 바이러스로 감염시킨 참돔의 폐사율Table 8 Mortality of red snapper infected with iridovirus after immunization with inactivated vaccine
*: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리 * : Amount of infected tissue contained in the vaccine (mg) / horse
<표 9> 불활성화 백신으로 면역시킨 후 이리도 바이러스로 감염시킨 펄구라 미의 폐사율Table 9 Mortality of Perigurami infected with Irido Virus after Immunization with Inactivated Vaccine
*: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리 * : Amount of infected tissue contained in the vaccine (mg) / horse
<표 10> 불활성화 백신으로 면역시킨 후 이리도 바이러스로 감염시킨 돌돔의 폐사율Table 10 Mortality rates of sea bream infected with iridovirus after immunization with inactivated vaccine
*: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리 * : Amount of infected tissue contained in the vaccine (mg) / horse
실험결과, 상기 <표 8> 및 <표 9>에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 세 Ⅰ가지 이리도 바이러스 불활성화 백신은 해산어인 참돔과 담수어인 펄구라미 모두에서 면역시킨 후 2주째와 4주째의 공격 실험에서 대조군에 비해 높은 생존률을 보여 이리도 바이러스 감염에 대하여서 예방 효과가 탁월하다는 것을 증명하였다. 또한, 복강 내와 근육 내의 각각 다른 백신 투여 경로에 따른 유의미한 차이는 나타나지 않았고, 세 가지 백신 중, β-프로피오락톤 불활성화 백신은 다른 두 백신에 비해 3 어종 모두에서 높은 예방 효과를 보였다.As a result of the experiment, as shown in Tables 8 and 9, the three iridovirus inactivated vaccines prepared in Example 3 were immunized in both sea bream, sea-bream and freshwater fish, and two weeks after 4 weeks. The weekly challenge experiment showed a higher survival rate compared to the control group, demonstrating excellent preventive effect against virus infection. In addition, there was no significant difference between different routes of administration of vaccines in the abdominal cavity and muscles. Among the three vaccines, β-propiolactone inactivated vaccine showed higher prophylactic effect in all three fish species than the other two vaccines.
상기 백신은 메갈로사이티바이러스 속 바이러스 소그룹 Ⅰ인 RB-1을 사용하여 제작한 백신으로서, 상기 표 8 내지 10의 결과는 메갈로사이티바이러스 RB-1을 사용하여 제작한 백신이 메갈로사이티바이러스 RB-1뿐만 아니라, 어류 이리도 바이러스의 다른 소그룹인 메갈로사이티바이러스 OF-1와 PG-1에 대해서도 교차 면역반응을 나타냄을 의미한다. The vaccine is a vaccine produced using RB-1, a subgroup I of megalocytivirus virus, and the results of Tables 8 to 10 indicate that the vaccine prepared using megalocitivirus RB-1 is megalocitivirus RB. In addition to -1, this means that fish iridia also cross-react to other subgroups of the virus, megalocytivirus OF-1 and PG-1.
한편, 표 10에 나타난 바와 같이, 돌돔의 경우 실시예 3과 마찬가지로 β-프로피오락톤 불활성화 백신에서 20~30% RPS를 보였지만, 나머지 두 백신에서는 효과를 나타내지 않았다.On the other hand, as shown in Table 10, as shown in Example 3 for the sea bream showed a 20-30% RPS in the β-propiolactone inactivated vaccine, but did not show the effect in the other two vaccines.
실시예Example 5. 백신의 5. The vaccine 부스팅Boosting (( boostingboosting ) 효과) effect
상기 실시예 3에서 제조된 세 가지 불활성화 백신의 효과를 더욱 증대시키는 방법을 찾기 위해서, 부스팅(boosting) 효과를 실험하였고, 그 방법은 다음과 같다.In order to find a method for further increasing the effect of the three inactivated vaccines prepared in Example 3, the boosting effect was tested, and the method is as follows.
상기 실시예 4와 동일하게 돌돔 (5±2g), 참돔 (7±3g), 펄구라미 (3±1g)를 실험군 당 20마리씩 40ℓ 수조에 수용한 후, 상기 실시예 3에서 제조한 세 가지 불활성화 백신을 0.1㎖씩 복강 내에 각각 주사한 후 25℃에서 사육하였고, 대조군은 PBS 완충액을 0.1㎖씩 동일한 방법으로 주사하였다. In the same manner as in Example 4, after storing 20 sea bream (5 ± 2g), red snapper (7 ± 3g), pergurami (3 ± 1g) in a 40L tank of 20 animals per experimental group, three fires prepared in Example 3 Activated vaccines were injected intraperitoneally by 0.1ml each and bred at 25 ° C. The control group was injected by 0.1ml PBS buffer in the same manner.
이러한 면역처리 후 4주 경과 시점에 각각의 실험군과 대조군에 대해 한 번 더 동일한 방법으로 면역시켰으며, 다시 2주 경과 시점에 상기 실시예 1-1의 메갈로사이티바이러스 RB-1을 복강 내에 주사하여 감염시켰다. 감염시킨 어류는 20일간 사육하면서 폐사율을 조사하였고, RPS를 산출하였다. At 4 weeks after this immunization, each group was immunized once more in the same manner for each experimental group and control group, and at 2 weeks later, the megalocytivirus RB-1 of Example 1-1 was injected intraperitoneally. Infection. Infected fish were examined for mortality by raising for 20 days and yielded RPS.
<표 11> 불활성화 백신으로 2회 연속 복강 내 면역시킨 후 이리도 바이러스고 감염시킨 어류의 폐사율Table 11 Mortality of fish infected with iridovirus after two consecutive intraperitoneal immunizations with inactivated vaccine
a: 백신에 포함된 감염 조직의 양 (㎎) / 마리 a : amount of infected tissue contained in the vaccine (mg) / horse
b: 0.1% β-프로피오락톤 b : 0.1% β-propiolactone
c: 0.1% 포르말린 c : 0.1% formalin
d: 열처리 180℃ 10초 d : heat treatment at 180 ° C. for 10 seconds
그 결과, <표 11>에 나타난 바와 같이, 포르말린과 열처리 불활성화 백신에서는 상기 실시예 4의 표 8 내지 10과 대비하였을 때, 유의적인 변화가 나타나지 않았다. 그러나 β-프로피오락톤 불활성화 백신을 돌돔에 면역시킨 경우, 1회 면역 시에는 25%의 RPS를 나타내었지만 2회 면역시에는 40%의 RPS를 나타내어 백신의 효과가 증대되었음을 확인하였다. As a result, as shown in Table 11, the formalin and the heat treatment inactivated vaccine did not show a significant change when compared with Tables 8 to 10 of Example 4. However, when the β-propiolactone inactivated vaccine was immunized with rock dome, it showed 25% RPS in one immunization but 40% RPS in two immunizations.
실시예Example 6: 경제성 분석 6: economic analysis
상기 표 3은 이리도바이러스에 감염된 돌돔의 비장과 신장 조직 1㎎에는 약 2.7×108의 바이러스 카피 수(viral copy numbers)가 있음을 나타냈으며, 상기 실시예 5의 결과는 본 발명의 열처리 불활성화 백신은 감염된 비장과 신장 조직 1㎎에 해당하는 양을 접종시에 백신의 높은 효과를 보임을 나타내었다. Table 3 shows that 1 mg of spleen and kidney tissue infected with iridovirus had viral copy numbers of about 2.7 × 10 8 , and the results of Example 5 showed inactivation of the heat treatment of the present invention. The vaccine showed a high effect of the vaccine upon inoculation with an amount corresponding to 1 mg of infected spleen and kidney tissue.
<표 12> 이리도 바이러스에 감염된 돌돔 한 마리로부터 제조 가능한 백신의 양Table 12 Amount of Vaccine Produced from a Rockfish Dome Infected with Irido Virus
<표 12>는 이리도 바이러스에 감염된 돌돔 한 마리로부터 제조 가능한 백신의 양을 표시하는 것으로, 백신의 원료로서 감염어의 비장과 신장을 모두 사용하며, 신장 (㎎)은 두신 전부를 취한 값이다. <Table 12> shows the amount of vaccine that can be prepared from a single sea bream infected with Irido virus, using both spleen and kidney of infected fish as the raw material of vaccine, and kidney (mg) is the value of both heads.
이리도 바이러스에 감염된 돌돔은 감염되지 않은 돌돔에 비해 비장과 신장의 비대 증상이 매우 높게 나타났으며, 약 200g 무게의 돌돔 한 마리는 이리도 바이러 스 감염시에 비장과 신장 무게를 합한 값이 1,373±408㎎으로 나타났다. 이것은 이리도 바이러스에 감염된 돌돔 (200g) 한 마리로부터 약 1,373마리의 어류에 접종할 수 있는 백신을 제작할 수 있다는 것을 보여준다. Irido virus infected sea bream showed higher spleen and kidney hypertrophy than uninfected sea bream, and about 200 grams of sea bream weighed 1,373 ± 408 mg. This shows that a vaccine can be produced that can inoculate approximately 1,373 fish from a single sea bream (200 g) infected with Irido virus.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those skilled in the art, such a specific description is only a preferred embodiment, which is not limited by the scope of the present invention Will be obvious. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
도 1은 이리도 바이러스인 메갈로사이티바이러스 속의 분류학적 계통 관계도이다.Figure 1 is a taxonomic diagram of the genus Megalocytivirus genus Irivirus.
<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Vaccine Composition for Irido Virus Infectious Diseases and the Method Thereof <130> P07-B228 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR sense primer that amplifies MCP gene <400> 1 gagagacccc aacacgac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR antisense primer that amplifies MCP gene <400> 2 acctggtggc tccagtgc 18 <110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Vaccine Composition for Irido Virus Infectious Diseases and the Method Thereof <130> P07-B228 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR sense primer that amplifies MCP gene <400> 1 gagagacccc aacacgac 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR antisense primer that amplifies MCP gene <400> 2 acctggtggc tccagtgc 18
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Families Citing this family (1)
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09176043A (en) * | 1995-09-23 | 1997-07-08 | Norin Suisansyo Suisanchiyou Youshiyoku Kenkyusho | Vaccine and diagnostic agent for iridovirus infectious disease for fish and production of the same and the like |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09176043A (en) * | 1995-09-23 | 1997-07-08 | Norin Suisansyo Suisanchiyou Youshiyoku Kenkyusho | Vaccine and diagnostic agent for iridovirus infectious disease for fish and production of the same and the like |
| JP2007197454A (en) | 1995-09-23 | 2007-08-09 | Fisheries Research Agency | Vaccine and diagnostic agent for iridovirus infection of fish, and method for producing those |
| KR100701672B1 (en) | 2004-12-10 | 2007-04-03 | 대한민국 | Genes of a korean isolate rbiv and a vaccine against rbiv |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101677231B1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-11-30 | 제주대학교 산학협력단 | Enhanced Production of Megalocytivirus Using Serum Free Medium |
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