JP2008520641A

JP2008520641A - 腫瘍細胞で形成されるｍ−ｐ５３／ｐ６３、ｍ−ｐ５３／ｐ７３およびｍ−ｐ５３／各イソ型タンパク質複合体を分解可能なペプチドおよび薬理学分野におけるその使用

Info

Publication number: JP2008520641A
Application number: JP2007542144A
Authority: JP
Inventors: ブランディノ，ジョヴァンニ; シトロ，ジェンナロ; ヴェルディナ，アレッサンドラ; ガラティ，ロッセラ，マリア
Original assignee: イスティトゥートフィシオテラピシオスピタリエリ
Priority date: 2004-11-19
Filing date: 2005-11-14
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2025-11-14
Also published as: DE602005006607D1; US20090181418A1; US7939624B2; WO2006054138A1; JP4664984B2; EP1812467B1; IL183045A; IL183045A0; ATE394421T1; ITMI20042227A1; EP1812467A1

Abstract

本発明は腫瘍細胞の核で形成されるm-p53／p63、m-p53／p73およびm-p53／p-イソ型タンパク質複合体において、変異p53タンパク質（以降m-p53という）とp63タンパク質、p73タンパク質およびそれらに関連するイソ型タンパク質との間（以降p63、p73およびp-イソ型という）の相互作用を破壊可能なペプチド群の同定を目的とする。また、本発明はin vitro腫瘍細胞系に存在する前記タンパク質複合体を分解させる方法に関する。本発明はさらに、ヒト腫瘍治療用の薬剤組成物の調製への前記ペプチドの使用に関する。

Description

本発明は、腫瘍細胞の核内に形成されるm-p53／p63、m-p53／p73およびm-p53／各イソ型タンパク質複合体における、変異p53タンパク質（以降、m- p53という）並びにp63、p73および各イソ型タンパク質（以降p63、p73およびp-イソ型という）間の相互作用を破壊可能なペプチド群の同定を目的とする。また、本発明はin vitro腫瘍細胞系に存在する前記タンパク質複合体を分解させる方法に関する。さらに、本発明は、ヒト腫瘍治療用の薬剤組成物の調製への前記ペプチドの使用に関する。

p53タンパク質群には、p53、p63、p73およびそれらの各イソ型タンパク質が含まれることが知られている。これらのタンパク質はいずれも、細胞増殖停止（アポトーシス）、分化および老化を誘導することで、腫瘍抑制過程に関与している。

腫瘍細胞系においては、m-p53、p73およびp63タンパク質並びにそれらの各イソ型タンパク質が関与する、m-p53／73およびm-p53／p63タンパク質複合体の存在が知られている。こうした複合体の形成はp73、p63およびそれらの各イソ型の転写活性やアポトーシス活性を阻害する。つまり、p73、p63および関連するイソ型の抗腫瘍活性を弱め、無効化させる。

その後、m-p53タンパク質の72番目の残基がp73との結合を決定することも示された。

以降、m-p53とp73との相互作用に関与する領域について研究が進められてきた。研究の結果、m-p53とp73との2つの接触面はm-p53の「コア領域」であり、かつp73のDNAとの特異的な結合領域であることがわかった。

m-p53の「コア領域」とは、ヒト腫瘍でみられる変異の90%が存在する、分子内の一部分を指す。これらの変異の結果、m-p53はもはやDNAに特異的に結合することができなくなる。この特異的結合は、野生の構成（野生型）で同じp53タンパク質（以降p53という）が特異的に行う抗腫瘍活性化に必要とされる作用である。

実際、p53は、変異がない場合には（つまり野生の構成である場合には）、腫瘍抑制活性を示す。逆に、p53に変異がある場合、変異の90%がコア領域に存在し、p53は腫瘍サプレッサーとしての活性を失って（機能消失）、別の機能を得ることになり（機能獲得）、細胞の形質転換および形質転換細胞の維持を促す。

m-p53のコア領域はタンパク質-タンパク質相互作用の基盤であり、そのことがいくつかのm-p53腫瘍特性を説明しうる。

m-p53とp73、p63またはそれらのイソ型とが結合しm-p53／p73、m-p53／p63またはm-p53／p-イソ型複合体を形成することにより、標的遺伝子の調節領域上、すなわちp73およびp63の抗腫瘍活性のメディエーター遺伝子上の、p73、p63またはp-イソ型の正しいポジショニングが阻害される。

このp73およびp63のポジショニングの失敗または非効率化については、DNAとの特異的結合面がm-p53／p73およびm-p53／p63タンパク質複合体の形成に関与していることから説明できる。腫瘍細胞において、m-p53の半減期パラメータは、野生型p53の同パラメータ（6〜20分）に対し、顕著な延長を示す（2〜24時間の増加）。このような半減期延長は、p73の半減期についても顕著である。

したがって、m-p53が与える発ガン活性を無効化する必要がある。特に、m-p53のp73またはp63との結合能・封鎖能を阻害することにより、p73およびp63の遊離数の増大・増加を図る必要がある。p73およびp63の遊離数の増加により、同じp73およびp63タンパク質による抗腫瘍活性が上昇する。

さらに、腫瘍形成、維持、従来の化学療法への反応における、m-p53／p73、m-p53／p63およびm-p53／各イソ型タンパク質複合体の役割を明らかにする必要性もある。

実際には、前記複合体の形成を阻害させ、腫瘍の化学療法反応に対する効果および影響を測定しうる実験手法の作成は難しい。

本発明の主な目的は、m-p53／p73、m-p53／p63およびm-p53／p-イソ型タンパク質複合体を分解させることにより各複合体と相互作用しうる、研究の結果明らかとなった特定のペプチドを選択することである。タンパク質複合体の分解により、以下の2つの効果を得ることができる。すなわち、第一に、抗腫瘍活性を有するp63、p73およびそれらのイソ型タンパク質の遊離数の増加に関する効果、そして第二に、m-p53と使用するペプチドとの間に安定した結合が形成されることによる、複合体から分離されたm-p53の無効化に関する効果である。

本出願人は、p73のp53との相互作用面がp73-DNAに特異的に結合する領域に相当することが明らかになったため、p73-DNAに特異的に結合する領域の全配列に相当するペプチドの中から、あるペプチド群を選択した。

選択されたペプチドは、タンパク質複合体を形成する際、m-p53との相互作用においてp73、p63およびそれらのイソ型と競合可能である。これらのペプチドは、p73の表面にはあるが、m-p53の表面にはないものの中から選択された。

なお、m-p53の表面にあるペプチドは、タンパク質複合体と相互作用しうるペプチドである。このペプチドはp73、p63およびそれらのイソ型と結合するので、こうした相互作用により、m-p53が分離されることになる。

その結果として、遊離されたm-p53が発ガン作用を増大させてしまう。

逆に、本出願人は、p73には点変異が起こらずその構造をそのまま維持できるため、p73の接触面からペプチドを選択した。

これらのペプチドは、p73タンパク質がm-p53と結合する際に関わる最小かつ十分な領域をもつペプチドから選択された。

p73タンパク質は4つの領域を形成する636のアミノ酸（以降aaと示す）から構成されている。

N末端領域は、1〜54番目のアミノ酸からなる転写活性化領域を指す。

中心領域は、131〜310番目のアミノ酸からなるDNAとの特異的結合領域を指す。

C末端ドメインと呼ばれる領域には、345〜390番目のアミノ酸からなるオリゴマー形成ドメインが含まれる。

端部と呼ばれる領域は、390〜636番目のアミノ酸で形成され、その機能は未だ完全には知られていない。

DNAとの特異的結合領域である中心領域全体をカバーするために、13個のペプチドを含む群を設計した。これらのペプチドにより、最小の領域、すなわちm-p53との結合に直接関わっている最少のアミノ酸配列（aa）が同定できた。

本出願人は、以下からなる群からペプチドを選択した：
1） FQQSSTAKSATW
2） PLLKKLYCQI
3） CPIQIKVSTPPP
4） IRAMPVYKKAEH
5） VVKRCPNHE
6） GQRDFNEGQSAPA
7） IRVEGNNLS
8） DDPVTGRQSVVV
9） GQVGTEFTTIL
10） MNCNSSCVGGMNRR
11） IIITLEMRDGQ
12） RRSFEGRICAC
13） DRKADEDHYR

ペプチドの長さはその薬理的機能に応じて設定された。実際、アミノ酸8〜10個分の長さを有するペプチドは、細胞膜を通過することができ、同ペプチドを核内の作用部位に到達させることが可能となる。

本発明のペプチドは細胞膜および核膜を通過する必要がある。

これらのペプチドについて共沈実験による評価を行った。このような実験から、in vivo腫瘍細胞系におけるタンパク質複合体の存在を確認することができる。

共沈実験
本発明のペプチドがm-p53とp73との相互作用を破壊する能力を評価するため、細胞モデルとして、p73および特定形状のm-p53（p53-HIS 175）を十分量内在するSKBr3（ヒト乳ガン）細胞を用いて共沈実験を行った。

m-p53に存在するH 175変異は、発ガン活性機能を獲得させる作用をもち、m-p53とp73との結合において主要な役割を担うことが知られている。

まず初めに、13個のペプチドを単一プールで評価した。SKBr3細胞由来の溶解物をペプチドプールとともに培養した。

上述したSKBr3溶解物を特定のp73タンパク質用抗体で免疫沈降し、特異的にp53変異タンパク質の存在を示す抗体を用いたウェスタンブロット法により解析した。

この結果から、すべてのペプチドがm-p53／p73 、m-p53／p63およびm-p53／各イソ型タンパク質複合体の相互作用を効果的に弱められることが明らかになった。

p73タンパク質とm-p53タンパク質との相互作用に関わる、もしくは相互作用を担う最小領域を同定する目的で、前記13個のペプチドを3つのサブセットに分けた。

3つのサブセットに分類する際に従ったロジックは、p73の特異的結合領域を位置的にN-末端、中心、C-末端という3つのサブドメインに分けるというものである。

これら3つのサブセットについても共沈法により評価した。

本実験の最後に、中心サブドメインに相当するサブセットがm-p53／p73 タンパク質複合体を分解できることが明らかになった。

このようなサブセットには、5） VVKRCPNHE、6） GQRDFNEGQSAPA、7） IRVEGNNLS、8） DDPVTGRQSVVVを含む群から選択される複数のペプチドが含まれる。

前記ペプチドは、ヒト腫瘍タンパク質p73の、すなわちp53様転写因子のDNA結合ドメイン領域においてmt-p53／p63および／またはmt-p53／p73の二量体の形成を阻害できる（NiceProt View of Swiss-Prot: O15350）。

5）、6）、7）および8）と番号付けされた選択されたペプチドは、アミノ酸組成（酸性、塩基性、疎水性および極性アミノ酸からなる）についても、分子量についても互いに類似しており、これら4つのいずれも、9〜13個のアミノ酸により形成されている。詳細は以下の通りである。

ペプチド番号5）：VVKRCPNHE、MW = 1081.26、pI = 8.20。このペプチドはp73タンパク質の190〜198番目の配列に相当する。
9個のアミノ酸で形成されるペプチドであり、うち3つ（VVP）は疎水性、3つは塩基性（KRH）、1つは酸性（E）、2つは極性（CN）である。

ペプチド番号6）：GQRDFNEGQSAPA、MW = 1376.4、pI = 4.37。このペプチドは、p73タンパク質の200〜211番目の配列に相当するが、合成上の理由で２番目にQが添加されている。
13個のアミノ酸で形成されるペプチドであり、うち4つ（FAPA）は疎水性、1つは塩基性（R）、2つは酸性（DE）、6つは極性（GQNGQS）である。

ペプチド番号7）：IRVEGNNLS、MW = 1000.1、pI = 6.00。このペプチドはp73タンパク質の215〜223番目の配列に相当する。
9個のアミノ酸で形成されるペプチドであり、うち3つ（IVL）は疎水性、1つは塩基性（R）、1つは酸性（E）、4つは極性（GNNS）である。

ペプチド番号8）：DDPVTGRQSVVV、MW = 1271.3、pI = 4.21。このペプチドはp73タンパク質の227〜238番目の配列に相当する。
12個のアミノ酸で形成されるペプチドであり、うち5つ（PVVVV）は疎水性、1つは塩基性（R）、2つは酸性（DD）、4つは極性（TGQS）である。

本発明のペプチドはいずれも、共沈実験において、mt-p53／p63結合および／またはmt-p53／p73結合を阻害することができる。

これらの実験から得られたデータを図1にまとめた。図中A）はp73タンパク質のDNAに対応する結合ドメイン、B）は本発明の目的である合成ペプチド、C）はウェスタンブロット実験の結果である。

図1C）において、1列目はm-p53タンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロット解析した際のSKBr3細胞由来の全細胞溶解物を示している。この解析によりSKBr3細胞内にこのようなタンパク質が十分量内在していることが明らかになった。２列目はp73タンパク質に特異的な抗体により免疫沈降した際のSKBr3細胞由来の全細胞溶解物を示している。続いて、この試料は、m-p53タンパク質に特異的な抗体を用いることにより、ウェスタンブロット解析される。この解析は、このような細胞内で、p73タンパク質とm-p53タンパク質との間に相互作用が十分に内在していることを示している。3列目はペプチドプールにインキュベート後、p73タンパク質に特異的な抗体により免疫沈降した際のSKBr3細胞由来の全細胞溶解物を示している。次に、この試料はm-p53タンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロット解析される。この解析は、ペプチドの存在下において、コントロール試料（2列目）に対してp53タンパク質が明らかに増加していることを示している。このことから、m-p53タンパク質およびp73に特異的な抗体と相互作用するという前記ペプチドの能力が確認できる。4列目は、p73タンパク質に特異的な抗体と13個のペプチドを含むペプチドプールからなる混合物により免疫沈降を行った際のSKBr3細胞由来の全細胞溶解物を示している。次に、この試料について、m-p53タンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロット解析を行う。この解析は、p73抗原結合部位を覆うことによりp73タンパク質抗体を飽和させるという前記ペプチドの能力を示している。

鎖の形成にFmoc法を利用し、Pioneer Peptide Synthesis Systemの固相でペプチド合成を行った。この方法では、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）基によりアミノα基（N^α）が一時的に保護される。Fmoc基は不安定な塩基であり、20％ピペリジンのN,N-ジメチルホルムアミド溶液のほか、第２級アミンにより迅速に除去できる。ペプチド鎖は、固定材に結合しておりブロック化されていないアミノ酸のN末端基が、活性化された次のアミノ酸のC末端カルボキシ基と反応し、アミド結合することにより形成される。カルボキシ基が活性化されるとカルボキシル化された炭素の周囲の電子密度が変わり、固定材上で形成される鎖のN末端に求核添加される。多くの化学的活性剤があり、さまざまな要因により選択されるが、今回は、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）を用いた。N末端基の非ブロック化プロセス、カルボキシ基の活性化および次のアミノ酸との結合形成は、目的のペプチドが完成するまで繰り返される。合成終了時に、ペプチドを固定材から離し、トリフルオロ酢酸／アニソール／メルカプトエタノール混合液で脱保護化し、冷エーテルで沈殿して遠心分離により回収する。その後、得られたペプチドについて、pH3で水とアセトニトリルのリニアグラジエントを用いてSephasil C8カラムによるHPLC（高速液体クロマトグラフィー）精製を行う。得られたサンプルを分注して、6N塩酸により108℃で少なくとも24時間加水分解反応を行い、蛍光検出器により分析してHPLCで適切なアミノ酸組成が得られたことを確認する。

図１A）はp73タンパク質のDNAに対応する結合ドメイン、B）は本発明の目的である合成ペプチド、C）はウェスタンブロット実験の結果を示している。

Claims

腫瘍細胞の核内で形成されるm-p53／p63、m-p53／p73および m-p53／p-イソ型タンパク質複合体を分解させることができるFQQSSTAKSATW、PLLKKLYCQI、CPIQIKVSTPPP、IRAMPVYKKAEH、VVKRCPNHE、GQRDFNEGQSAPA、IRVEGNNLS、DDPVTGRQSVVV、GQVGTEFTTIL、MNCNSSCVGGMNRR、IIITLEMRDGQ、RRSFEGRICAおよびDRKADEDHYRを含む群から選択される、腫瘍サプレッサー用ペプチド。
VVKRCPNHE、GQRDFNEGQSAPA、IRVEGNNLSおよびDDPVTGRQSVVVを含む群から選択される、請求項1に記載のペプチド。
ヒト腫瘍治療用の抗腫瘍剤調製への、請求項1または2に記載のペプチドの使用。
細胞レベルで前記ヒト腫瘍にm-p53／p63、m-p53／p73および／またはm-p53／p-イソ型タンパク質複合体がみられる、請求項3に記載の使用。
前記腫瘍が肺腫瘍である、請求項4に記載の使用。
m-p53／p63、m-p53／p73 および／またはm-p53／p-イソ型タンパク質複合体を分解させる方法であって、前記複合体がin vitroでヒト腫瘍の腫瘍細胞の核内で形成されており、
−m-p53／p63、m-p53／p73および／またはm-p53／p-イソ型タンパク質複合体を含有する腫瘍細胞系を、培養液に準備する工程；
−請求項1または2に記載のペプチドのうち少なくとも１種を前記培養液に添加する工程；
−ペプチド処理細胞を溶解、共沈させる工程；
−前記タンパク質複合体が分解されたことを確認する工程
を含む方法。