KR100279302B1 - 티로신인산화효소의sh2영역에결합하는어댑터단백질유전자의선별방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 티로신 인산화효소의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법 및 그를 이용하여 선별된 Src 패밀리 티로신 인산화효소의 일종으로 T-세포의 활성화를 조절하는 신호전달경로에 관여하는 p56lck의 SH2영역에 결합하는 신규한 어댑터 단백질 유전자와 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명자들은 마우스 p56lck의 활성화된 인산화효소영역 및 SH2영역과 효모 GAL4의 DNA 결합영역 간의 융합단백질을 발현하는 벡터로 형질전환된 효모를 작제하고, 전기 형질전환된 효모를 이용하여, 마우스 T-세포 cDNA 라이브러리로부터 p56lck의 SH2영역과 결합하는 어댑터 단백질 즉, Lad(p56lck-binding adaptor protein)를 발현하는 유전자를 선별하고, 전기 유전자의 염기서열과 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한 결과, Lad가 신규한 단백질임을 확인하였다. 이와 같이, 본 발명의 티로신 인산화효소의 SH 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자를 선별하는 방법은 p56lck이외의 다른 Src 패밀리 티로신 인산화효소(p59fyn, Blk, Yes, Lyn, Yrk, Hck, Fgr 및 Abl) 또는 Tec 패밀리 티로신 인산화효소 등의 SH2영역에 결합하는 어댑터 단백질을 발현하는 유전자를 선별하는데 있어 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 티로신 인산화효소의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 티로신 인산화효소의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법 및 그를 이용하여 선별된 Src 패밀리 티로신 인산화효소의 일종으로 T-세포의 활성화를 조절하는 신호전달경로에 관여하는 p56lck의 SH2영역에 결합하는 신규한 어댑터 단백질 유전자와 그로부터 유추되는 아미노산 서열에 관한 것이다.
T 세포의 활성화 시에 p56lck, p59fyn및 ZAP-70을 포함하는 세포막 기부의 인산화효소들은 한 무리를 이루어, 인터루킨-2 유전자의 발현을 유도하는 복합적인 일단의 신호들을 매개한다. 특히, T-세포 특이적 Src 패밀리 티로신 인산화효소인 p56lck는 T-세포의 발달, 활성화 및 증식을 조절하는 신호전달 경로에서 매우 중요한 역할을 수행한다. p56lck의 이러한 여러가지 기능은 p56lck와 다양한 세포내 신호전달 단백질들 간의 단백질-단백질 상호작용을 통하여 이루어지는 것으로 보인다. 지금까지 밝혀진 바에 의하면, p56lck는 CD4/CD8 공동수용체(coreceptor)와 결합하며, Ras/MAPK 경로, PLC-γ 경로 및 인터루킨-2 유전자의 발현 등에 필수적인 것으로 알려져 있다. 또한, p56lck의 인산화효소 활성이 T-세포의 활성화에 중요하지만, 주로 SH2 영역(Src homology 2 domain)에 의하여 매개되는 p56lck의 인산화효소 활성-비의존적 기능도 독자적으로 T-세포의 활성화에 기여하는 것으로 알려져 있다. 그러나, T 세포의 활성화에서 p56lck의 중요성에도 불구하고, p56lck가 작용하는 기작은 아직까지 명확하게 밝혀진 바가 없다. 다만, p56lck가 CD4/CD8과 결합되면, p56lck의 인산화효소 활성이 T-세포 수용체의 ζ 사슬을 인산화킴으로써, 다른 인산화효소인 ZAP-70이 결합할 부위를 제공한다는 한 가지 모델이 제시된 바 있다. 한편, p56lck의 SH2 영역에는 ZAP-70, CD45 및 Sam68 등이 결합하는 것으로 밝혀졌지만, 이러한 사실만으로는 p56lck의 SH2영역이 T 세포의 활성화에서 어떠한 작용을 하는가를 충분히 설명할 수 없다. 본 발명자들은 p56lck의 SH2영역의 역할 및 작용기작을 규명하기 위해서는 SH2영역과 결합하는 신호전달물질들의 발견이 우선되어야 할 것으로 판단하였다.
이에, 본 발명자들은 T-세포의 활성화에 기여하는 p56lck의 SH2영역과 결합하는 신호전달 단백질을 발견하고자 예의 연구노력한 결과, p56lck의 SH2 영역의 인산화펩티드 결합 특이성이 p56lck의 인산화효소 활성 영역의 기질 특이성과 중복된다는 사실에 기초하여, 효모 GAL4의 DNA 결합영역과 p56lck의 SH2영역 및 활성화된 인산화효소영역이 융합된 단백질과 효모 GAL4의 전사활성화영역과 마우스 T-세포 cDNA 라이브러리가 코딩하는 단백질이 융합된 단백질을 동시에 발현하는 티로신 인산화-의존적 효모 하이브리드를 작제하고, 전기 효모 하이브리드를 이용한 티로신 인산화효소의 SH2영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법으로 p56lck의 SH2영역에 결합하는 신규한 어댑터 단백질 유전자를 성공적으로 선별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 티로신 인산화효소의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전기 방법을 이용하여 Src 패밀리 티로신 인산화효소의 일종으로 T-세포의 활성화를 조절하는 신호전달경로에 관여하는 p56lck의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전기 p56lck의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법에 의하여 선별된 p56lck의 SH2영역에 결합하는 신규한 어댑터 단백질인 Lad(p56lck-binding adaptor protein)의 유전자 서열 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
도 1a는 효모 하이브리드가 발현하는 재조합 단백질들을 나타내는 모식도이다.
도 1b는 Lad와 p56lckSH2 영역간의 결합 특이성을 보여주는 β-갈락토시다아제 염색 결과를 나타내는 표이다.
도 1c는 Lad와 p56lckSH2 영역간의 상호작용이 티로신 인산화-의존적임을 보여주는 β-갈락토시다아제 염색 결과를 나타내는 표이다.
도 1d는 p56lck이외의 다른 Src 패밀리 티로신 인산화효소(p60src또는 p59fyn)에 대한 Lad의 결합친화도를 보여주는 β-갈락토시다아제 염색 결과를 나타내는 표이다.
도 2a는 Lad cDNA의 전체 염기서열 및 전기 염기서열로부터 유추되는 아미노산 서열을 나타내는 그림이다.
도 2b는 Lad의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 2c는 Lad SH2영역의 아미노산 서열과 다른 신호전달 단백질들에서 발견되는 SH2영역들의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 그림이다.
도 2d는 Lad에 대한 조직별 노던 블랏팅 사진이다.
도 2e는 시험관 내에서 발현된 Lad와 세포내에서 발현된 Lad에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 3a는 시험관 내에서 Lad가 Lck SH2K와 결합할 수 있음을 보여주는 Lad에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 3b는 활성화된 Jurkat T-세포에서 p56lck가 Lad와 결합하고 있음을 보여주는 p56lck에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 3c는 활성화된 EL4 T-세포에서 p56lck가 Lad와 결합하고 있음을 보여주는 p56lck에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 3d는 활성화된 EL4 T-세포에서 Lad가 p56lck와 결합하고 있음을 보여주는 Lad에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 4a는 활성화된 EL4 T-세포에서 Lad의 티로신 잔기가 인산화되어 있음을 보여주는 인산화티로신에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 4b는 Lad가 p56lck에 의하여 인산화됨을 보여주는 시험관내 인산화실험 결과를 나타내는 인산화티로신에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 4c는 Lad와 p56lck의 동시발현이 세포내 단백질들의 티로신 인산화를 유발함을 보여주는 인산화티로신에 대한 웨스턴 블랏팅 사진이다.
도 5는 Lad가 인터루킨-2 프로모터에 의하여 유도되는 유전자 전사에 요구 됨을 보여주는 루시퍼라아제 활성분석 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은 p56lck의 SH2영역의 인산화펩티드 결합 특이성이 p56lck의 인산화효소영역의 기질 특이성과 중복된다는 사실에 기초하여, p56lck의 SH2영역 및 인산화효소 영역을 포함하는 단백질과 cDNA 라이브러리가 코딩하는 단백질을 동시에 발현하는 효모 하이브리드를 작제하면, 전기 cDNA 라이브러리로부터 p56lck의 SH2영역에 결합하는 신호전달 단백질 유전자를 용이하게 선별할 수 있을 것으로 예상하고, 56lck의 인산화효소영역이 항상 활성을 띠도록 고안된 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 p56lck의 SH2영역 및 활성화된 인산화효소영역을 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자를 제조한 다음, 전기 유전자를 효모 GAL4의 DNA 결합영역을 발현하는 벡터에 클로닝하였다. 이어서, 전기 벡터로 효모를 형질전환시키고, 효모 GAL4의 전사활성화영역을 발현하는 벡터에 삽입된 마우스 T-세포 cDNA 라이브러리로 전기 형질전환된 효모를 추가로 형질전환시킨 다음, β-갈락토시다아제 염색을 실시하는 방법으로 마우스 T-세포 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 티로신 인산화-의존적 방식으로 p56lck의 SH2 영역에 결합하는 단백질을 발현하는 클론들을 발견하였다. 각 클론으로부터 분리된 cDNA 절편들의 부분적인 염기서열을 분석한 결과, 모두 일곱 개의 클론이 공통적으로 동일한 단백질을 코딩하고 있음을 확인하고, 전기 단백질을 'Lad(p56lck-binding adaptor protein)'라 명명하였다. 또한, 여러가지 대조 플라스미드들로 형질전환된 효모 하이브리드를 작제하고, 이를 이용하여 Lad와 p56lck의 결합특성을 분석한 결과, Lad는 p56lck의 SH2영역에 특이적으로 직접 결합하고; 이러한 결합은 티로신 인산화-의존적이며; p56lck의 SH2영역과 인산화효소영역 간의 공조작용이 요구되고; Lad가 p56lck이외의 다른 Src 패밀리 티로신 인산화효소의 SH2영역과도 상호작용할 가능성이 있음을 확인하였다.
이어서, 본 발명자들은 전기 Lad cDNA절편을 프로브로 사용하여, λgt10 마우스 비장 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 약 1.6kb 크기의 Lad cDNA를 분리한 다음, 염기서열 분석과 5'-RACE(rapid amplification of cDNA ends) 방법으로 Lad 유전자의 전체 전사해독틀(open reading frame)을 밝혀내고, 이로부터 Lad의 전체 아미노산 서열을 유추하였다. 그 결과, Lad는 총 366개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 신호전달 단백질들에서 발견되는 몇 가지 특징적인 모티프들을 포함하고 있는 신규한 단백질임이 확인되었다.
본 발명자들은 전기 Lad cDNA로부터 시험관내 해독(in vitro translation)으로 Lad를 합성한 다음, 시험관 내에서 발현된 Lad와 T-세포 내에서 발현된 Lad에 대하여 각각 웨스턴 블랏팅을 실시하였는데, 그 결과 시험관내 해독 혼합물과 T-세포 추출물에서 동일한 사이즈의 밴드가 검출됨으로써, 예상한 Lad의 전사해독틀이 신빙성이 있음이 확인되었다.
한편, 조직별 노던 블랏팅 결과, 비장과 폐에서 각각 1.7kb mRNA와 4.4 kb mRNA가 검출되었는데, 1.7kb mRNA의 사이즈는 Lad cDNA의 사이즈와 일치하는 반면, 4.4 kb mRNA의 정체는 분명치 않다. 폐에서 Lad가 발현된다는 사실은 Lad가 T-세포에서 p56lck-의존적 신호전달을 매개할 뿐만 아니라, 폐세포에서 p60src-의존적 신호전달을 매개할 가능성도 있음을 제시하였다.
본 발명자들은 T-세포의 활성화에 따른 Lad-p56lck의 작용기작을 규명하고자 인위적으로 활성화를 유도하거나 유도하지 않은 T-세포 용해물(lysate)을 사용하여, Lad 또는 p56lck에 대한 면역침전과 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 그 결과, 활성화된 T-세포에서 Lad와 p56lck가 함께 결합되어 있음이 확인되었다. 또한, 전기 세포 용해물에 대하여 항-티로신 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과, 활성화된 T-세포에서 Lad의 티로신 잔기가 인산화되어 있음이 확인되었고; 정제된 Lad 단백질과 p56lck를 이용한 시험관내 인산화 실험 결과, Lad의 인산화는 p56lck에 의한 것임이 확인되었으며; Lad와 인산화효소가 활성화되어 있는 p56lck를 함께 발현시킨 COS-1 세포 용해물에 대하여 항-티로신 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과, 전반적으로 세포내 단백질들의 인산화가 증가한 것을 확인하였다. 한편, Jurkat T-세포에서 Lad를 센스 또는 안티센스 방향으로 과다 발현시키고, 인터루킨-2 프로모터에 의하여 발현이 유도되는 루시퍼라아제의 활성을 조사한 결과, Lad를 센스 방향으로 발현시킨 경우, T-세포를 자극하지 않아도 루시퍼라아제 활성크게 증가하는 반면, Lad를 안티센스 방향으로 발현시킨 경우, T-세포를 자극하더라도 루시퍼라아제 활성이 매우 저하됨을 확인하였다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 p56lck의 SH2영역의 인산화펩티드 결합 특이성이 p56lck의 인산화효소영역의 기질 특이성과 중복된다는 사실에 기초하여, p56lck의 SH2영역 및 인산화효소영역(즉, p56lck의 아미노산 123에서 아미노산 509까지)을 포함하는 단백질과 cDNA 라이브러리가 코딩하는 단백질을 동시에 발현하는 효모 하이브리드를 작제하면, 전기 cDNA 라이브러리로부터 p56lck의 SH2영역에 결합하는 신호전달 단백질 유전자를 용이하게 선별할 수 있을 것으로 예상하였다.
이에, 본 발명자들은 PCR로 p56lck의 SH2영역 및 인산화효소 영역을 포함하며, 전기 인산화효소 영역은 티로신505잔기가 페닐알라닌505으로 교체되어 항상 활성을 가지도록 조작된 단백질(SH2K(F505))을 발현하는 유전자를 합성한 다음, 전기 유전자를 효모 GAL4의 DNA 결합영역(GAL4 BD) 유전자를 포함하는 pGBT9 벡터에 클로닝하여, SH2K(F505)와 GAL4 BD 간의 융합단백질을 발현하는 벡터를 제조하고, 전기 벡터를 'Lck SH2K(F505)'라 명명하였다. 그런 다음, 전기 벡터로 효모를 형질전환시키고, 전기 형질전환된 효모를 'Saccharomyces cerevisiaeHF7C·SH2K'라 명명하고, 이를 1998년 4월 21일자로 한국종균협회부설 한국미생물보존센타(KCCM, 서울 서대문구 신촌동 134)에 기탁번호 'KCCM-10126'으로 기탁하였다. 이어서, 전기 효모를 효모 GAL4의 전사활성화영역(GAL4 AD)을 발현하는 pACT 벡터에 삽입된 마우스 T-세포 cDNA 라이브러리로 추가로 형질전환시켜, SH2K(F505)와 GAL4 BD의 융합단백질 및 T-세포 cDNA 라이브러리가 코딩하는 단백질과 GAL4 AD의 융합단백질이 동시에 발현되는 효모 하이브리드를 작제하였다.
전기 효모 하이브리드는 다음과 같은 원리에 의하여 티로신 인산화-의존적 방식으로 β-갈락토시다아제 활성을 가지게 되므로, 전기 효모 하이브리드를 이용하면 스크리닝하고자 하는 cDNA 라이브러리로부터 p56lck의 SH2영역에 결합하는 단백질 유전자를 용이하게 선별할 수 있을 것으로 예상하였다: 즉, 전기 효모 하이브리드에서 발현된 SH2K(F505)의 인산화효소 활성은 함께 주입된 T-세포 cDNA 라이브러리로부터 발현되는 SH2영역-결합단백질을 인산화시키고, 인산화된 결합단백질은 인산화된 티로신을 통하여 SH2K(F505)의 SH2영역과 결합하게 된다. 그 결과, 전기 두 개의 융합단백질이 서로 한 단위를 이루게 됨으로써, GAL4의 DNA 결합영역과 GAL4의 전사활성화영역이 동시에 작용하는 것이 가능하게 되고, 이는 GAL4에 의하여 활성화되는 유전자 즉, 효모 β-갈락토시다아제 유전자의 발현을 촉진시키는 결과를 초래하여, β-갈락토시다아제 염색시 양성신호를 주게 된다.
β-갈락토시다아제 염색 방법을 이용한 스크리닝 결과, 모두 69개의 클론이 티로신 인산화-의존적 방식으로 p56lck의 SH2 영역에 결합하는 것으로 확인되었다. 각 클론으로부터 분리된 cDNA 절편들의 부분적인 염기서열을 분석한 결과, 모두 일곱 개의 클론이 공통적으로 동일한 단백질을 코딩하고 있음을 확인하고, 전기 단백질을 'Lad(p56lck-binding adaptor protein)'라 명명하였다.
이어서, 일련의 대조실험들을 통하여 다음과 같은 Lad의 p56lck에 대한 결합특이성을 규명하였다: 첫째, 상기 두 가지 융합단백질에서 Lad와 SH2K(F505)의 위치를 교환하는 교환실험을 통하여, Lad가 p56lck의 SH2영역에 결합한다는 사실을 재확인하였다; 둘째, Lad를 SH2K(F505) 또는 다른 단백질들(GAL4 BD, P53, HBV-X 또는 ZAP70의 SH2영역)과 함께 발현시킨 결과, Lad는 SH2K(F505)와 특이적으로 상호작용하고, 다른 단백질들과는 반응하지 않았다; 셋째, Lad를 야생형 SH2K(Y505)와 함께 발현시킨 결과, Lad의 SH2K(Y505)에 대한 결합력은 SH2K(F505)에 대한 결합력에 비하여 현저히 감소하므로, Lad와 p56lck의 SH2영역 간의 결합은 티로신 인산화-의존적임이 확인되었다; 넷째, p56lck의 SH2 영역(SH2) 또는 인산화효소 영역(K(F505)) 중 어느 하나만을 발현시킨 결과, SH2영역 또는 인산화효소 영역 단독으로는 Lad와 상호작용하지 않았다; 다섯째, 인산화티로신에 결합할 수 없는 SH2영역 변이종(A273)이나 촉매활성이 없는 인산화효소 영역 변이종(K154)을 발현시킨 결과, 이들 두 가지 변이종은 모두 Lad에 결합하지 못하는 것으로 확인되었다.
또한, p60src와 p59fyn등의 다른 Src 패밀리 티로신 인산화효소들이 Lad에 결합할 수 있는지 여부를 조사하였는데, p60src는 p56lck와 비슷한 결합강도로 Lad와 결합하였으나, p59fyn은 매우 약하게 결합하였다. 이러한 결과는 p60src의 SH2영역이 인산화펩티드 결합 특이성 면에서 p56lck와 유사한 특성을 가지고 있다는 이전의 보고들을 고려할 때, Lad가 p56lck이외의 다른 Src 패밀리 티로신 인산화효소들과도 상호작용할 가능성을 제시하였다.
이어서, 본 발명자들은 전기 Lad cDNA 절편을 프로브로 사용하여, 마우스 비장 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 약 1.6kb 크기의 Lad cDNA를 분리한 다음, 염기서열을 분석 및 마우스 비장 5'스트레치(stretch) cDNA 주형을 사용하는 5'-RACE 방법으로 Lad의 전체 전사해독틀을 규명하고, 이로부터 Lad의 전체 아미노산 서열을 유추하였다. 그 결과, Lad는 총 366개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 신호전달 단백질들에서 발견되는 몇 가지 특징적인 모티프들을 포함하고 있는 신규한 단백질임이 확인되었다. 즉, Lad의 아미노 말단은 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 것으로 알려진 CC-CC 클래스 징크-핑거(zinc-finger) 모티프를 포함하고 있고; Lad의 중앙부위는 βD5 위치의 아미노산이 티로신 또는 페닐알라닌인 1b 클래스에 속하는 SH2 영역을 포함하고 있는데, 이 영역은 GAPn, Csk, Grb2 및 Src의 SH2 영역과 25 내지 35%에 달하는 높은 상동성을 가지고 있으며; Lad의 프롤린-풍부 모티프는 LckBP1, HS1, SH3P7 및 SH3P8에서 발견되는 클래스 II 코택틴(cortactin) SH3 영역에 의하여 선호되는 컨센서스 서열(consensus sequence) 즉, +PPΨPXKP(+:염기성 아미노산, Ψ: 소수성 아미노산)와 정확하게 일치하고; Lad의 카르복시 말단은 네개의 잠재적인 인산화티로신 부위들 즉, NPXpY292, VY275TSP, IY292QEP 및 IY317AEV 모티프를 포함하고 있는데, 이들은 이미 인산화티로신 결합영역(예를 들면, 인산화효소의 SH2영역)에 대한 리간드 또는 인산화효소의 기질서열로서 잘 알려져 있는 모티프들이다. Lad의 이러한 서열특성은 Lad가 단백질-단백질 상호작용에 필수적인 여러가지 영역들을 포함하고 있는 어댑터 단백질임을 제시하였다.
본 발명자들은 전기 Lad cDNA를 이용하여 Lad를 시험관내 해독(in vitro translation)으로 합성한 다음, 시험관내에서 발현된 Lad와 T-세포내에서 발현된 Lad에 대하여 각각 웨스턴 블랏팅을 실시하였는데, 그 결과 시험관내 해독 혼합물과 T-세포 추출물에서 동일한 사이즈의 밴드가 검출됨으로써, 예상한 Lad의 전사해독틀이 신빙성이 있음이 확인되었다.
한편, 멀티플 티슈 노던(MTN)TM블랏 킷트(Clontech, U.S.A.)와 Lad cDNA 프로브를 사용하여 Lad에 대한 조직별 노던 블랏팅을 실시한 결과, 비장과 폐에서 각각 1.7kb mRNA와 4.4 kb mRNA가 검출되었는데, 1.7kb mRNA의 사이즈는 Lad cDNA의 사이즈와 일치하는 반면, 4.4 kb mRNA의 정체는 분명하지가 않다. 그러나, 폐에서 Lad가 발현된다는 사실은, p60src의 SH2영역이 Lad와 결합할 수 있다는 사실과 연결시켜 생각해 볼 때, Lad가 T-세포에서 p56lck-의존적 신호전달을 매개할 뿐만 아니라, 폐세포에서 p60src-의존적 신호전달을 매개할 가능성도 있음을 제시하였다.
본 발명자들은 T-세포의 활성화에 따른 Lad-p56lck의 작용기작을 규명하고자, 다음과 같은 방법으로 인위적으로 활성화를 유도하거나 유도하지 않은 T-세포 용해물을 사용하여, Lad 또는 p56lck(이하, 'Lck'라 약함)에 대한 면역침전과 웨스턴 블랏팅을 실시하였다: 먼저, Lad에 대한 웨스턴 블랏팅을 실시하기 위하여, Lad의 카르복시 말단을 포함하는 GST 융합단백질(GST-LadC)과 p56lck의 SH2영역을 포함하는 GST 융합단백질(GST-Lck SH2)을 제조한 다음, 이를 이용하여 항-LadC 항체 및 항-Lck 항체를 각각 제조하고, 전기 항체를 Lad또는 Lck에 대한 웨스턴 블랏팅에 사용하였다. Lad가 p56lck에 직접적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, GST-Lck SH2 융합단백질이 결합되어 있는 글루타치온-세파로오스 4B 비드를 항-CD3 항체와 항-CD4 항체로 자극하거나 자극하지 않은 Jurkat T-세포의 용해물(lysate)과 함께 반응시키고, 침전된 단백질에 대하여 항-LadC 항체로 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과, 활성화된 T-세포에서 대부분의 Lad가 GST-Lck SH2 융합단백질 서로 결합되어 있음을 확인하였다. 이어서, Lad와 p56lck의 상호작용을 면역침전법으로 분석하였는데, Jurkat T-세포에서 CD3/CD4 교차결합(crosslinking)을 유발하거나 또는, 마우스 EL4 T-세포에 PHA와 PMA를 동시에 처리한 경우에 항-LadC 항체-세파로오스 비드를 이용하여 Lad를 T-세포 용해물로부터 면역침전시키면, Lad 면역침전물에서 p56lck가 함께 검출되는 것을 확인하였다. 역으로, PHA 및 PMA 처리에 의하여 활성화된 마우스 EL4 T-세포 용해물에 대하여, 항-Lck 항체-세파로오스 비드를 이용하여 p56lck를 면역침전시키면, Lck 면역침전물에서 Lad가 함께 검출되는 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 Lad가 T-세포 활성화-의존적 방식으로 p56lck의 SH2 영역에 직접적으로 결합함을 제시하였다.
한편, Lad를 PHA와 PMA처리에 의하여 활성화되었거나 그렇지 않은 EL4 T-세포 용해물로부터 면역침전시킨 다음, 항-인산화티로신 단일항체로 웨스턴 블랏팅을 실시하여, Lad의 인산화 상태를 분석한 결과, 활성화된 T-세포에서 Lad의 티로신 잔기가 인산화되어 있음이 확인되었고; 정제된 Lad 단백질과 p56lck를 이용한 시험관내 인산화 실험 결과, Lad의 인산화는 p56lck에 의하여 일어나는 것임이 확인되었으며; Lad와 Lck SH2K(F505)를 함께 발현시킨 COS-1 세포 용해물에 대하여 항-인산화티로신 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과, 전반적으로 세포내 단백질들의 인산화가 증가한 것을 확인하였다.
본 발명자들은 T-세포의 활성화에서 Lad의 기능적 중요성을 규명하기 위하여, 인터루킨 프로모터에 의하여 유도되는 루시퍼라아제 발현 벡터(pGL3/IL-2-Luc)와 안티-센스 또는 센스 방향 Lad 발현벡터(pcDNA/Lad anti-sense 또는 pcDNA/Lad sense)를 제조하였다. pGL3/IL-2-Luc와 pcDNA/Lad anti-sense(또는 pcDNA/Lad sense)로 Jurkat T-세포를 전이시켜, Lad를 센스 또는 안티-센스 방향으로 과다 발현시키고, 인터루킨-2 프로모터에 의하여 발현이 유도되는 루시퍼라아제의 활성을 조사한 결과, Lad를 센스 방향으로 발현시킨 경우, T-세포를 자극하지 않아도 루시퍼라아제 활성크게 증가하는 반면, Lad를 안티-센스 방향으로 발현시킨 경우, T-세포를 자극하더라도 루시퍼라아제 활성이 대조군에 비하여 매우 저하됨을 확인하였다.
상기 결과들을 종합해 볼 때, T-세포가 자극을 받으면 p56lck가 활성화되어 Lad를 인산화시키고, 인산화된 Lad는 p56lck의 SH2영역에 결합하여, 다양한 신호전달 단백질들을 불러모으는 어댑터 단백질로서 작용함으로써, p56lck-의존적 신호전달을 증폭시키며, 그 결과 인터루킨-2 유전자의 발현이 초래되는 것으로 추측되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 지닌 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 티로신 인산화-의존적 효모 하이브리드의 제조
먼저, PCR로 마우스 p56lck의 SH2영역 및 인산화효소 영역을 포함하며, 전기 인산화효소 영역은 티로신505잔기가 페닐알라닌505으로 교체되어 항상 활성을 가지도록 조작된 단백질(SH2K(F505))을 발현하는 cDNA 절편을 합성한 다음, 전기 cDNA 절편을 효모 GAL4의 DNA 결합영역(GAL4 BD)을 발현하는 pGBT9 벡터(Clontech, U.S.A.)에 클로닝하여, 'Lck SH2K(F505)' 벡터를 제조하였다. 이어서, 전기 Lck SH2K(F505) 벡터로 효모(Clontech, U.S.A.)를 형질전환시키고, 전기 형질전환된 효모를 'Saccharomyces cerevisiaeHF7C·SH2K'라 명명하고, 이를 1998년 4월 21일자로 한국종균협회부설 한국미생물보존센타(KCCM, 서울 서대문구 신촌동 134)에 기탁번호 'KCCM-10126'으로 기탁하였다. 전기 형질전환된 효모를 효모 GAL4의 전사활성화영역(GAL4 AD)을 발현하는 플라스미드 벡터인 pACT(Clontech, U.S.A.)에 삽입되어 있는 마우스 T-세포 림프종 cDNA 라이브러리(Clontech, U.S.A.) 유전자로 리튬 아세테이트 방법에 따라 추가로 형질전환시켜, SH2K(F505)와 GAL4 BD의 융합단백질 및 T-세포 cDNA 라이브러리가 코딩하는 단백질과 GAL4 AD의 융합단백질이 동시에 발현되는 효모 하이브리드를 작제하였다.
실시예 2: Lad의 선별
전기 실시예 1로부터 수득한 총 2×106개의 효모 하이브리드 중에서 75개의 클론이 히스티딘이 없는 조건에서도 성장하였으며, 2시간 이내에 β-갈락토시다아제 염색을 관찰할 수 있었는데, 이러한 결과는 75개의 클론에서 발현되는 단백질들이 SH2K(F505)와 티로신 인산화-의존적 방식으로 결합할 가능성을 암시하였다. 이어, 전기 75개의 양성 클론들 중에서 티로신 인산화-비의존적 방식으로 SH2K(F505)에 결합하는 위양성(false-positive) 클론들을 제거하기 위하여, 각 양성클론으로부터 cDNA 라이브러리 플라스미드를 분리한 다음, 이를 대조 플라스미드 즉, SH2영역(Lck SH2) 또는 인산화효소 영역(Lck K(F505))중 어느 하나만을 코딩하는 플라스미드와 함께 다시 효모에 주입하고 발현시켰다. 그 결과, 75개 중 69개의 클론들이 cDNA 라이브러리 플라스미드와 Lck SH2로 형질전환된 경우 및 cDNA 라이브러리 플라스미드와 Lck K(F505)로 형질전환된 경우의 두 가지 경우에 모두 음성반응을 보임으로써, 총 69개의 클론에서 발현되는 단백질들이 SH2K(F505)와 티로신 인산화-의존적 방식으로 결합하고 있음이 확인되었다. 따라서, 이들을 최종적으로 선택하여 부분적으로 염기서열을 결정하였는데, 그 결과 모두 일곱 개의 클론이 동일한 단백질의 일부분을 코딩하는 것을 확인하고, 전기 단백질을 'Lad(p56lck-binding adaptor protein)'라 명명하였다.
실시예 3: Lad의 p56lck에 대한 결합 특이성
이어서, 본 발명자들은 Lad의 p56lck에 대한 결합 특이성을 보다 자세히 규명하고자 다음과 같은 일련의 대조 실험들을 수행하였다: 첫째, Lad가 p56lck의 SH2영역에 결합한다는 것을 다시 한번 확인하기 위하여, Lad와 GAL4 BD의 융합단백질을 발현하는 플라스미드와 SH2K(F505)와 GAL4 AD의 융합단백질을 발현하는 플라스미드를 제조하고, 이들로 형질전환된 효모 하이브리드에 대하여 실시예 1과 동일한 방법으로 β-갈락토시다아제 염색을 실시하였다. 그 결과, 양성신호가 관찰되었는데, 이러한 결과는 Lad가 p56lck의 SH2영역에 직접적으로 결합함을 제시하였다; 둘째, Lad의 p56lck의 SH2영역에 대한 결합 특이성을 확인하기 위하여, Lad와 SH2K(F505) 이외의 다른 단백질들(즉, GAL4 BD, p53 단백질, HBV-X 또는 ZAP70의 SH2영역)을 동시에 발현하는 효모 하이브리드에 대하여 상기와 동일한 방법으로 β-갈락토시다아제 염색을 실시하였다. 그 결과, 모든 경우에 음성신호가 관찰되었는데, 이러한 결과는 Lad가 p56lck의 SH2영역과 특이적으로 결합함을 제시하였다(참조: 도 1b); 셋째, p56lck의 SH2영역과 Lad의 결합 특성을 확인하기 위하여, Lad와 야생형(즉, 인산화효소 영역이 할성화되어 있지 않은) SH2K(Y505)를 동시에 발현하는 효모 하이브리드에 대하여 상기와 동일한 방법으로 β-갈락토시다아제 염색을 실시하였다. 그 결과, SH2K(F505)를 발현하는 경우에 비하여, β-갈락토시다아제 활성이 현저히 감소한 것으로 나타났는데, 이러한 결과는 Lad와 p56lck의 SH2영역간의 결합에는 인산화효소 활성이 요구됨을 제시하였다(참조: 도 1c); 넷째, Lad와 더불어 p56lck의 SH2영역(SH2) 또는 인산화효소영역(K(F505)) 중 어느 하나만을 발현하는 효모 하이브리드에 대하여 상기와 동일한 방법으로 β-갈락토시다아제 염색을 실시하였다. 그 결과, 두 가지 경우 모두 음성신호가 관찰되었는데, 이러한 결과는 p56lck와 Lad간의 상호작용에 p56lck의 SH2영역 또는 인산화효소영역이 개별적으로 작용하는 것이 아니라, SH2영역과 인산화효소영역이 공조작용하고 있음을 제시하였다(참조: 도 1c); 다섯째, Lad와 더불어 인산화티로신에 결합하지 못하는 SH2영역 변이종(SH2K(A273/F505)) 또는 촉매활성이 결여된 인산화효소영역 변이종(SH2K(K154/F505))을 발현하는 효모 하이브리드에 대하여 상기와 동일한 방법으로 β-갈락토시다아제 염색을 실시하였다. 그 결과, 두 가지 경우 모두 음성신호가 관찰되었는데, 이러한 결과는 p56lck와 Lad간의 상호작용에 티로신 인산화가 필수적임을 제시하였다(참조: 도 1c); 여섯째, p60src와 p59fyn등의 다른 Src-패밀리 티로신 인산화효소들이 Lad에 결합할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, Lad와 p60src의 SH2영역 및 활성화된 인산화효소영역을 포함하는 단백질 (Src SH2K(F527))을 동시에 발현하는 효모 하이브리드와, Lad와 p59fyn의 SH2영역 및 활성화된 인산화효소영역을 포함하는 단백질(Fyn SH2K(F528))을 동시에 발현하는 효모 하이브리드에 대하여 상기와 동일한 방법으로 β-갈락토시다아제 염색을 실시하였다. 그 결과, Src SH2K(F527)의 경우에는 Lck SH2K(F505)와 비슷한 정도의 양성신호가 관찰된 반면, Fyn SH2K(F528)의 경우에는 양성이긴 하지만 매우 약한 신호가 관찰되었는데, 이러한 결과는 p60src의 SH2영역이 인산화-펩티드 결합 특이성 면에서 p56lck와 유사한 특성을 가지고 있다는 이전의 보고들을 고려할 때, Lad가 p56lck이외의 다른 Src 패밀리 티로신 인산화효소들과도 상호작용할 가능성을 제시하였다(참조: 도 1d).
실시예 4: Lad cDNA의 클로닝
상기 실시예 2로부터 수득한 일곱 개의 Lad 클론들 중 하나로부터 Lad cDNA 절편을 분리한 다음, 이를 프로브로 사용하여 λgt10에 삽입되어 있는 마우스 비장 cDNA 라이브러리(Clontech, U.S.A.)를 스크리닝하였다. 그 결과, 세 개의 독립적인 클론들을 분리하고, 이로부터 약 1.6kb 크기의 Lad cDNA를 분리하였다. 그런 다음, 염기서열 분석과 마우스 비장 5'-스트레치(stretch) cDNA 주형(Clontech, U.S.A.)을 사용한 5'-RACE 방법으로 Lad의 전체 전사해독틀(open reading frame)을 규명하고, 이로부터 Lad의 전체 아미노산 서열을 유추하였다(참조: 도 2a). 그 결과, Lad는 366개 아미노산으로 구성되어 있으며, 신호전달 단백질들에서 발견되는 몇가지 특징적인 모티프들을 포함하고 있는 신규한 단백질임이 확인되었다(참조: 도 2b). 즉, Lad의 아미노 말단은 CC-CC 클래스 징크-핑거(zinc-finger) 모티프를 포함하고 있는데, ZPR1과 EGF 수용체 세포질 영역간의 결합과 같은 예에서도 볼 수 있듯이, 몇몇 징크-핑거 모티프가 단백질-단백질 상호작용을 매개한다는 사실을 고려할 때, Lad의 CC-CC 모티프는 단백질-단백질 상호작용 영역으로서 작용할 가능성이 있는 것으로 파악되었다. 또한, Lad의 중앙 부위는 βD5 위치의 아미노산이 티로신 또는 페닐알라닌인 1b 클래스에 속하는 SH2 영역을 포함하고 있는데, 이 영역은 GAPn, Csk, Grb2 및 Src의 SH2 영역과 25 내지 35%에 달하는 높은 상동성을 가지고 있다(참조: 도 2c). 더우기, Lad의 프롤린이 풍부한(proline-rich) 모티프의 아미노산 서열은 LckBP1, HS1, SH3P7 및 SH3P8에서 발견되는 클래스 II 코택틴(cortactin) SH3 영역에 의하여 선호되는 컨센서스 서열(consensus sequence) 즉, +PPΨPXKP(+:염기성 아미노산, Ψ: 소수성 아미노산)와 정확하게 일치하였다. 한편, Lad의 카르복시 말단은 네 개의 잠재적인 인산화티로신 부위들 즉, NPXpY292, VY275TSP, IY292QEP 및 IY317AEV 모티프를 포함하고 있는데(참조: 도 2a 및 도 2b), NPXpY292 모티프는 인산화티로신 결합영역(PTB)에 대한 리간드로 알려져 있고; VY275TSP와 IY292QEP 모티프는 [V/I]YxxP 모티프의 일종으로서 Crk 어댑터 단백질, PLCγ1 및 c-Ab1 인산화효소의 SH2 영역에 의해서 선호되는 모티프로 알려져 있으며; IY317AEV 모티프는 p56lck인산화효소에 의해서 선호되는 기질서열인 동시에, 그의 인산화된 형태는 p56lck의 SH2 영역에 의해서 선호되는 결합 모티프기도 하다. 전반적으로, Lad의 이러한 서열특성은 Lad가 단백질-단백질 상호작용에 필수적인 여러가지 영역들을 포함하고 있는 어댑터 단백질이라는 사실을 뒷받침하는 것으로 볼 수 있었다.
실시예 5: Lad cDNA를 이용한 노던 블랏팅
본 발명자들은 멀티플 티슈 노던(MTN)TM블랏 킷트(Clontech, U.S.A.)와 Lad cDNA 프로브를 사용하여 Lad에 대한 조직별 노던 블랏팅을 실시하였다. 그 결과, 비장과 폐에서 각각 특이적으로 발현되는 1.7 kb와 4.4 kb의 mRNA가 검출되었는데(참조: 도 2d), 1.7kb mRNA의 사이즈는 cDNA의 사이즈와 일치하지만, 4.4kb mRNA의 정체는 분명하지가 않다. 폐에서 Lad의 mRNA가 검출된다는 사실은, p60src의 SH2영역이 Lad와 결합한다는 관찰결과(참조: 도 1d)를 고려할 때, Lad가 T-세포에서 p56lck-의존적 신호전달을 매개할 뿐만 아니라, 폐세포에서 p60src-의존적 신호전달을 매개할 수도 있음을 시사하였다.
실시예 6: 항-Lad 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅
미합중국종균협회(ATCC)로부터 입수한 Jurkat T-세포(ATCC No. TIB152)와 EL4 T-세포(ATCC No. TIB39)는 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 5mM β-머캅토에탄올 및 항생제를 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양하고, Cos-1 세포(ATCC No. CRL-1650)는 10% 우태아혈청과 항생제를 포함하는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 세포의 활성화는 다음과 같은 방법으로 수행되었다: Jurkat T-세포는 OKT3(항-CD3 항체)와 OKT 4(항-CD4 항체)를 이용하여 CD3와 CD4를 교차결합시킴으로써 활성화시키거나, 또는 10ug/ml의 PHA를 처리함으로써 활성화시켰다; EL4 T-세포는 0.5% 우태아혈청에서 20시간 동안 배양한 다음, 10ug/ml의 PHA와 5ng/ml의 PMA를 동시에 처리하여 활성화시켰다.
한편, p56lck의 SH2영역(아미노산 123에서 아미노산 225까지)의 GST-융합단백질(GST-Lck SH2(F505)) 또는 Lad의 카르복시 말단(아미노산 208 에서 아미노산 366)의 GST-융합단백질(GST-LadC) 발현벡터는, p56lck의 SH2영역 또는 Lad의 카르복시 말단을 코딩하는 유전자 절편을 PCR로 증폭한 다음, 각각 pGEX-KG(Pharmacia, U.S.A.) 벡터의 EcoRI 또는 BamHI/EcoRI 위치에 삽입하여 제작되었다. p56lck에 대한 항체(항-Lck 항체)는 트랜스덕션 래버러토리사(Transduction Laboratory, U.S.A.)로부터 입수하거나, p56lck의 SH3영역 및 SH2영역(아미노산 66에서 아미노산 224까지)을 포함하는 GST-융합 단백질로 토끼를 면역화시켜 제조되었으며, Lad의 카르복시 말단 또는 GST에 대한 복합세포군(polyclonal) 항체(항-LadC 항체 또는 항-GST 항체)는 토끼를 GST와 Lad의 카르복시 말단(아미노산 208에서 아미노산 366까지)의 융합단백질(GST-LadC) 또는 GST로 각각 면역화시켜 제조되었다.
전기에서 배양된 EL4 T-세포를 TNE 완충액(50mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% NP-40, 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 25ug/ml 아프로티닌(aprotinin), 1mM PMSF, 25ug/ml 루펩틴(leupeptin), 1mg/ml 소혈청알부민)을 이용하여 0℃에서 1시간 동안 용해(lysis)시켰다. 그런 다음, 전기에서 제조된 항-LadC 항체를 이용하여 전기 EL4 T-세포 용해물에 대하여 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과, Lad의 분자량이 계산상으로는 40kDa임에도 불구하고, 시험관내 해독(in vitro translation)이나 EL4 T-세포에서 발현되는 Lad의 실제 분자량은 45kDa인 것으로 밝혀졌다(참조: 도 2e). 도 2e에서, 시험관내 해독 혼합물과 T-세포 추출물에서 동일한 사이즈의 밴드가 검출되었다는 사실은 예상한 Lad의 전사해독틀이 신빙성이 있음을 보여주었다.
실시예 7: Lad와 P56lck의 세포내/시험관내 상호작용: 웨스턴 블랏팅과 면역침전
본 발명자들은 Lad가 p56lck의SH2영역에 직접적으로 결합하는지 여부를 확인하기 위하여, 우선 p56lck의 SH2영역(아미노산 123에서 224까지) 또는 Lad의 카르복시 말단(아미노산 208에서 366까지)을 포함하는 GST 융합단백질(GST-Lck SH2 또는 GST-LadC)을 대장균에서 발현시킨 다음, 정(Joung) 등의 방법(참조: Joung, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:5778-5782(1995))에 따라 정제하였다. 그런 다음, 전기에서 수득한 GST-Lck SH2 융합단백질 또는 GST 단백질이 결합되어 있는 세파로오스 4B 비드 10ug을 항-CD3 항체 및 항-CD4 항체로 자극하거나 자극하지 않은 Jurkat T-세포 용해물(lysates)에 가하고, 4℃에서 한시간 동안 반응시켰다. 전기 반응혼합물을 충분히 세척한 다음, 항-LadC 항체를 이용하여 웨스턴블랏팅을 실시하였다(참조: 도 3a). 그 결과, GST-Lck SH2 융합단백질이 Lad를 침전시키는 것이 관찰되었으며, 이로부터 Lad와 p56lckSH2영역이 직접적으로 결합함을 알 수 있었다. 또한, 침전된 Lad의 양은 CD3/CD4 교차결합(cross-linking)에 의한 T-세포의 활성화시에 약 3배 정도 증가하는 것이 관찰되었다.
이어서, 본 발명자들은 Lad와 p56lck의 생체내 상호작용을 면역침전법(immunoprecipitation)으로 분석하였다. 즉, CD3/CD4 교차결합을 유발하거나 유발하지 않은 Jurkat T-세포 용해물로부터 전기 항-LadC 항체가 결합되어 있는 세파로오스 4B 비드를 이용하여 Lad를 면역침전시켰다. 그런 다음, 전기 면역침전물을 10% SDS-PAGE로 전기영동하고, 항-Lck 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 그 결과, Lad 면역침전물에서 p56lck가 함께 검출되는 것이 확인되었다(참조: 도 3b). 또한, PHA(Sigma, U.S.A.)와 PMA(Sigma, U.S.A.)를 처리함으로써 활성화되었거나 그렇지 않은 EL4 T-세포 용해물을 이용하여, 전기와 동일한 방법으로 Lad를 면역침전키고, p56lck에 대한 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 그 결과, 전기와 마찬가지로 Lad 면역침전물에서 p56lck가 함께 검출되는 것이 확인되었다(참조: 도 3c). 한편, 이와 반대로 PHA와 PMA를 처리함으로써 활성화되었거나 그렇지 않은 EL4 T-세포 용해물을 이용하여 항-Lck 항체가 결합되어 있는 세파로오스 4B 비드를 이용하여 p56lck를 면역침전시키고, 항 Lad 항체로 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과, 예상한 바대로 p56lck면역침전물에서 Lad가 검출되는 것이 확인되었다(참조: 도 3d). 이러한 결과들은 Lad가 T-세포 활성화-의존적 방식으로 p56lck의 SH2영역과 직접적으로 결합함을 제시해주었다.
실시예 8: Lad의 인산화 분석
Lad가 네 개의 잠재적인 티로신 인산화 부위를 포함하고 있는 것으로 밝혀졌으므로, 본 발명자들은 PHA와 PMA 처리에 의하여 활성화되었거나 그렇지 않은 EL4 T-세포 용해물로부터 Lad를 면역침전시킨 다음, 항-인산화티로신 단일항체(4G10, Upstate Biotechnology, U.S.A.)로 면역블랏팅을 실시하여, T-세포의 자극에 따른 Lad의 인산화 상태를 분석하였다. 그 결과, T-세포의 자극시에, Lad의 티로신 잔기가 인산화됨이 확인되었다(참조: 도 4a). 이어서, Lad가 p56lck에 의하여 인산화되는지 여부를 확인하기 위하여, 전기 정제된 GST-LadC 융합단백질 또는 GST 단백질을 인산화효소 완충액(50mM Tris, pH 7.5, 1mM DTT, 10mM MnCl2, 50mM NaCl) 중에서 100uM γATP를 처리하거나 처리하지 않고, 정제된 p56lck(Upstate Biotechnology, U.S.A.) 20유니트를 가한 다음, 30℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서, 전기 반응혼합물을 SDS-PAGE로 전기영동한 다음, 항-인산화티로신 항체 또는 항-GST 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다(참조: 도 4b). 그 결과, GST-LadC의 티로신 잔기가 인산화되어 있음이 관찰되었으며, 이러한 결과로부터 Lad가 p56lck의 인산화효소 활성의 직접적인 기질임이 확인되었다.
한편, Lad와 p56lck가 기능적으로 짝을 이루고 있는지 여부를 확인하기 위하여, COS-1 세포를 DEAE-덱스트란 방법으로 Lad 발현벡터(pcDNAI/Lad)와 Lck SH2K(F505) 발현벡터로 동시에 형질전환시켜, Lad를 p56lckSH2K의 야생형(Y505) 또는 F505형과 함께 발현시키고, 항-인산화티로신 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 실시함으로써, 세포내 단백질들의 티로신 인산화 패턴을 분석하였다(참조: 도 4c). 그 결과, Lad를 p56lckSH2K(F505)와 함께 발현시켰을 때, 전반적으로 세포내 단백질들의 티로신 잔기의 인산화가 증가하는 것이 확인되었다.이러한 결과들은 T-세포가 자극을 받았을 때, 활성화된 p56lck가 Lad를 인산화시키고, 인산화된 Lad는 다양한 신호전달 단백질들을 불러모으는 어댑터 단백질로서 작용하여, p56lck-의존적 신호전달을 증폭시킴을 제시하였다.
실시예 9: 루시퍼라아제 활성측정
T-세포의 활성화에서 Lad의 기능적 중요성을 보다 자세히 규명하기 위하여, 본 발명자들은 Lad를 Jurkat T-세포에서 센스 또는 안티-센스 방향으로 과다발현시키고, 인터루킨-2 프로모터에 의하여 유도되는 리포터(즉, 루시퍼라아제)의 활성을 조사하였다(참조: 도 5). 먼저, PCR로 증폭된 야생형 및 F505형 p56lck유전자 절편과 센스 방향 및 안티-센스 방향 Lad 유전자 절편을 각각 pcDNAI/Amp(Invitrogen, U.S.A) 벡터의 EcoRI/XhoI 위치로 삽입하여, 야생형 및 F505형 p56lck의 포유동물 발현벡터와 센스 방향 및 안티-센스 방향 Lad의 포유동물 발현벡터들을 제작하였다. 한편, 인터루킨-2 유전자를 pGL3-Basic(Promega, U.S.A.) 벡터의 HindIII 위치에 서브클로닝하여, 인터루킨-2 프로모터(인터루킨-2 유전자의 전사시작 위치로부터 548bp 위쪽까지의 영역을 포함함)에 의하여 유도되는 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 pGL3/IL-2-Luc 플라스미드를 제작하였다. 그런 다음, 5×106Jurkat T-세포를 수퍼팩트TM(SuperfectTM, Quigen, U.S.A.)를 사용하여, 5ug pGL3/IL-2-Luc 플라스미드와 5ug pcDNAI/Lad 안티-센스 플라스미드 또는 5ug pGL3/IL-2-Luc 플라스미드와 5ug pcDNAI/Lad 센스 플라스미드로 전이시켰다. 이어서, 세포를 24시간 동안 배양한 다음, PHA를 10ug/ml의 농도로 처리하고, 4시간 동안 배양하여 세포를 활성화시키고, 수확하였다. 그런 다음, 루미노미터(Berthold luminometer LB953, Berthold, Germany)로 루시퍼라아제 활성을 측정하였다(참조: 도 5). 그 결과, PHA로 자극한 조건하에서 안티-센스 방향으로 Lad를 과다발현시킨 경우에는 루시퍼라아제 활성이 70%정도 감소한 반면, PHA로 자극하지 않은 조건하에서 센스 방향으로 Lad를 과다발현시킨 경우에는 루시퍼라아제 활성이 10배 증가하였다. 반면, PHA로 자극한 조건하에서, Lad의 과다발현은 단지 최저 효과만을 보이는 것으로 미루어 보아, 이 조건하에서 신호전달 경로의 몇몇 인자들은 이미 거의 포화상태에 이른 것으로 판단된다. 이러한 결과들은, Lad가 인터루킨-2 유전자의 발현을 초래하는 T-세포 신호전달 경로에 필수적인 요소로서 작용함을 제시하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 티로신 인산화-의존적 효모 하이브리드를 이용하는 티로신 인산화효소의 SH 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법을 제공한다. 본 발명의 티로신 인산화효소의 SH 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법을 이용하면, cDNA 라이브러리로부터 티로신 인산화효소의 SH2 영역과 상호작용하는 어댑터 단백질을 발현하는 유전자를 용이하게 선별할 수 있다. 이에, 본 발명자들은 마우스 p56lck의 활성화된 인산화효소영역 및 SH2영역과 효모 GAL4의 DNA 결합영역 간의 융합단백질을 발현하는 벡터로 형질전환된 효모를 이용하여, p56lck의 SH2영역과 결합하는 어댑터 단백질 즉, Lad(p56lck-binding adaptor protein)를 발현하는 유전자를 선별하고, 전기 유전자의 염기서열과 이로부터 유추되는 아미노산 서열을 분석한 결과, Lad가 신규한 단백질임을 확인하였다. 이와 같이, 본 발명의 티로신 인산화효소의 SH 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자를 선별하는 방법은 p56lck이외의 다른 Src 패밀리 티로신 인산화효소(p59fyn, Blk, Yes, Lyn, Yrk, Hck, Fgr 및 Abl) 또는 Tec 패밀리 티로신 인산화효소 등의 SH2영역에 결합하는 어댑터 단백질을 발현하는 유전자를 선별하는데 있어 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Claims (7)
- 효모 GAL4의 DNA 결합영역(GAL4 BD)과 티로신 인산화효소의 SH2영역 및 활성화된 인산화효소영역이 융합된 단백질을 발현하는 벡터로 효모를 형질전환시키고, 전기 형질전환된 효모를 효모 GAL4의 전사활성화영역(GAL4 AD)을 발현하는 벡터에 삽입된 cDNA 라이브러리로 추가로 형질전환시켜 티로신 인산화-의존적 효모 하이브리드를 작제하는 단계를 포함하는 티로신 인산화효소의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법.
- 제 1항에 있어서,티로신 인산화 효소는 Src 패밀리 티로신 인산화효소 또는 Tec 패밀리 티로신 인산화효소인 것을 특징으로 하는티로신 인산화효소의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법.
- 제 2항에 있어서,Src 패밀리 티로신 인산화효소는 p56lck,p59fyn, Blk, Yes, Lyn, Yrk, Hck, Fgr 및 Abl로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는티로신 인산화효소의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법.
- 제 1항에 있어서,효모 GAL4의 DNA 결합영역(GAL4 BD)과 티로신 인산화효소의 SH2영역 및 활성화된 인산화효소영역이 융합된 단백질을 발현하는 벡터로 형질전환된 효모는Saccharomyces cerevisiaeHF7C·SH2K(KCCM-10126)인 것을 특징으로 하는티로신 인산화효소의 SH2 영역에 결합하는 어댑터 단백질 유전자의 선별방법.
- 효모 GAL4의 DNA 결합영역(GAL4 BD)과 p56lck의 SH2영역 및 활성화된 인산화효소영역이 융합된 단백질을 발현하는 벡터 Lck SH2K(F505)로 형질전환된Saccharomyces cerevisiaeHF7C·SH2K(KCCM-10126)를 효모 GAL4의 전사활성화영역(GAL4 AD)을 발현하는 벡터에 삽입된 마우스 T-세포 cDNA 라이브러리로 추가로 형질전환시켜 티로신 인산화-의존적 효모 하이브리드를 작제하는 단계를 포함하는 p56lck의 SH2영역에 결합하는 어댑터 단백질(Lad: p56lck-binding adaptor protein) 유전자를 선별하는 방법.
- 제 5항의 방법에 의하여 선별된 다음과 같은 염기서열을 가지는 p56lck의 SH2영역에 결합하는 어댑터 단백질(Lad: p56lck-binding adaptor protein) 유전자:
- 제 6항에 개시된 유전자 서열로부터 유추되는 다음과 같은 p56lck의 SH2영역에 결합하는 어댑터 단백질(Lad: p56lck-binding adaptor protein)의 아미노산 서열:
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