JP2008519056A - 特定の[1,4]ジアゼピノ[6,7,1−ij]キノリン誘導体の代謝物ならびにそれらの調製および使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
各RnおよびRn'(この場合、nは、1から8である)について:
各RnおよびRn'は、独立して、水素、ヒドロキシ、CH3C(O)−O、−OSO3H、もしくは−O−Gであり;または
Rnおよびその対応するRn'(この場合、nは、2、3、4、6、7もしくは8である)は、それらが結合している炭素と一緒になって、C=Oを形成し;または
Rnとその対応するRn+1と(この場合、nは、1、2、3、4、5もしくは7である)が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、各対応するRn'およびR(n+1)'は、独立して、水素、ヒドロキシ、CH3C(O)−O、−OSO3H、もしくは−O−Gであり;
Gは、式:
式中、記号*をつけた窒素は、場合によりN−オキシドを形成し;
X−Yは、CH=N、CH=N(O)、CH2N(O)、C(O)NH、またはCR9HNR10であり;
R9は、水素、ヒドロキシ、または−OSO3Hであり;
R10は、水素、アセチル、−SO3H、−G、または−C(O)−OGであり;
Zは、水素、ヒドロキシ、−OSO3H、または−O−Gであり;但し、
Zが、ヒドロキシであるときには、(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10のうちの1つは、水素でないこと;または(b)X−Yが、CR9HNR10であることを条件とし;ならびに、
X−Yが、CHR9NR10であるときには、Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10のうちの少なくとも1つは、Hでないことをさらなる条件とする]
の化合物を含む。
化合物6a:
とDCDQ:
前記脱離基L1およびL2を除去して化合物M6を形成すること
を含む。
カルボン酸2:
得られたアシルアジドを、イソシアネート3:
前記加熱段階の結果物を、化合物5を生じさせるために十分な条件下、2,3,4−トリアセチル−1−ヒドロキシグルクロン酸エステル4:
によって調製される方法を提供する。一部の実施形態において、この反応工程は塩基、好ましくはEt3Nの存在化で行われる。
式(I):
各RnおよびRn'(この場合、nは、1から8である)について:
各RnおよびRn'は、独立して、水素、ヒドロキシ、CH3C(O)−O、−OSO3H、もしくは−O−Gであり;または
Rnおよびその対応するRn'(この場合、nは、2、3、4、6、7もしくは8である)は、それらが結合している炭素と一緒になって、C=Oを形成し;または
Rnとその対応するRn+1と(この場合、nは、1、2、3、4、5もしくは7である)が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、各対応するRn'およびR(n+1)'は、独立して、水素、ヒドロキシ、CH3C(O)−O、−OSO3H、もしくは−O−Gであり;
記号*をつけた窒素は、場合によりN−オキシドを形成し;
Gは、式:
X−Yは、CH=N、CH=N(O)、CH2N(O)、C(O)NH、またはCR9HNR10であり;
R9は、水素、ヒドロキシ、または−OSO3Hであり;
R10は、水素、アセチル、−SO3H、−G、または−C(O)−OGであり;
Zは、水素、ヒドロキシ、−OSO3H、または−O−Gであり;但し、
Zが、ヒドロキシであるときには、(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10のうちの1つは、水素でないこと;または(b)X−Yが、CR9HNR10であることを条件とし;
X−Yが、CHR9NR10であるときには、Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10のうちの少なくとも1つは、Hでないことをさらなる条件とする]
の化合物に関する。
R9およびR10が、各々、Hであり;
R7およびR8のうちの少なくとも1つが、−OHであり;
R6が、−OHであり;
R3およびR4のうちの少なくとも1つが、−OHであり;または
R1、R5、R6、R7およびZのうちの少なくとも1つが、−OHである
ものが挙げられる。
他の実施形態において、本発明は、X−YがCR9HNR10であり、R10がアセチルである、式Iのヒドロキシ化合物を提供する。こうしたヒドロキシ化合物の一部の好ましい例としては、式中、
R7およびR8のうちの少なくとも1つが、−OHである;
ものが挙げられる。
他の実施形態において、本発明は、X−YがC=Nである、式Iのヒドロキシ化合物を提供する。一部の好ましい実施形態において、R1からR6のうちの少なくとも1つは、−OHである。他の好ましい実施形態において、R2からR4のうちの少なくとも1つは、−OHである。
治療方法
医薬組成物
DCDQの放射標識バージョン、[14C]DCDQを使用することにより、DCDQの代謝をインビトロおよびインビボモデルで個々に調査した。この試験により、いくつかの代謝経路およびいくつかの有意な代謝物が判明した。これらの試験は、下の実験セクションでさらに詳細に説明する。
モノアリルエステル2を調製するために、ジフェン酸無水物を出発材料として選択し、触媒の存在下、過剰のアリルアルコールで処理した。適する触媒としては、Et3N、ヒューニッヒ塩基、ピリジン、アミン、NaOH、LiOH、KPH、および他の無機塩基が挙げられる。化合物2について定量収率を達成することができる。
NMRスペクトルは、Varian Inova 300を用い、300MHz(1Hおよび13C)で記録し、化学シフトは、TMS内部標準に対するppmで同定した。分析的および分取TLCは、EM Scienceから入手したSilica Gel 60 F−254プレコーティングプレートを用いて行った。254nmのUVまたは10%KMnO4水溶液指示薬を使用して、化合物を可視化した。HPLC分析は、PDA(モデル2996)UV検出器を装備したWaters Alliance 2695 HPLC装置を用いて判定した。質量スペクトルは、Finnigan質量分析装置を用いて記録した。
1.HPLC装置:Waters 2690
サンプル調製:2〜3滴の反応混合物を2mLのアセトニトリルに添加し、よく振盪して溶液にし、HPLC分析に付す。
HPLC条件:
カラム:Alltima C18 3μm 7×53mm
カラム温度:25℃
移動相:溶媒A=1900mL H2O、100mL CH3CN、1mL H3PO4;
溶媒B=1900mL CH3CN、100mL H2O、1mL H3PO4;
移動相
A:CHCl3:MeOH:H2O(8:2:0.2)
B:CHCl3:MeOH:H2O(7:3:0.5)
カラム量による勾配(CV、120mL/CV)
2(CV):A 100%
5(CV):A 100%→B 100%
3(CV):B 100%
サンプル負荷:8mLの移動相Aに1.2gの粗製M6を溶解し、サンプレットに注入する。
流量:40mL/分
UV:254nm
画分:12mL/画分、合計96の画分
DCDQは、強力な5−HT2C作動薬であり、抗精神病活性を予測するいくつかの動物モデルにおいて有効であり、非定型抗精神病薬プロフィールを有する。これらのモデルにおけるDCDQの挙動プロフィールは、錐体外路副作用が少ない、非定型抗精神病薬様活性と一致した。5−HT2C作動薬DCDQは、統合失調症に関連した気分障害または認知障害を治療する際にも有効であり得る。
[14C]DCDQの代謝は、性別を越えてプールされた雄および雌CD−1マウス、Sprague Dawleyラット、ビーグル犬およびヒト肝臓ミクロソーム由来のミクロソームならびに凍結保存された男性ヒト肝細胞とのインキュベーションにより調査した。ヒト肝臓ミクロソームを使用して、主要酸化代謝物M1およびカルバモイルグルクロニドM6の形成についてのKm値は、それぞれ、10.8および56.1μMであった。
本試験は、肝臓ミクロソームおよびヒト肝細胞におけるDCDQのインビトロ生体内変換を調査するものであった。シトクロムP450およびUDP−グルクロノシルトランスフェラーゼ依存性経路を試験し、DCDQ代謝物をLC/MSにより特性付けした。
材料
塩酸[14C]DCDQ(Lot L25073−42)は、Wyeth Researchの標識合成グループ(ニューヨーク州、パールリバー)が合成した。[14C]DCDQの放射化学的純度は、98.9%であり、化学的純度は、UV検出により99.9%であった。[14C]DCDQの比放射能は、塩酸塩として222.9μCi/mgであった。[14C]DCDQの化学構造を、14C標識の位置とともに示す。98.6%の化学的純度を有する非標識塩酸DCDQ(Lot PB3312)は、Wyeth Research(ニューヨーク州、パールリバー)が合成した。別の指示がない限り、DCDQまたは[14C]DCDQに言及するときには、その塩酸塩と考える。
マウス、ラット、イヌおよびヒトの肝臓ミクロソームと[14C]DCDQのインキュベーション
[14C]DCDQをインキュベーション中の非放射標識DCDQと混合した(1:3または1:5)。ミクロソームインキュベーションは、0.5mLの0.1Mリン酸カリウムバッファ、pH7.4中でインキュベートした[14C]DCDQ、塩化マグネシウム(10mM)および肝臓ミクロソームから成るものであった。水中の[14C]DCDQ(20μL)を、バッファ、塩化マグネシウム溶液およびミクロソームが入っているインキュベーション管に添加した。混合後、それらの管を、振盪水浴中、37℃で、2分間、プレインキュベートした。UDPGAまたはNADPH再生系の添加により、反応を開始させた。UDPGAを、水中20mM溶液の50μLアリコートとしてインキュベーションに添加して、2mMの最終濃度を得た。NADPH再生系(30μL)をインキュベーションに添加して、CYP450媒介代謝を評価した。このNADPH再生系は、グルコース−6−ホスフェート(2mg/mL)、グルコース−6−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(0.8単位/mL)およびMADP+(2mg/mL)から成るものであった。対照インキュベーションは、同じ条件下でだが、NADPH再生系、UDPGAまたはミクロソームを用いずに行った。すべてのインキュベーションは、二重重複で行った。0.5mL氷冷メタノールの添加により、インキュベーションを停止させた。サンプルをボルテックス混合した。変性したタンパク質を、4300rpmおよび4℃で10分間の遠心分離(モデルT21超遠心分離機、Sorvall)によって分離した。タンパク質ペレットを0.5mLのメタノールで抽出した。上清をサンプルごとに併せ、混合し、Zymark TurboVap LVエバポレーター(マサチューセッツ州、ホプキントンのCaliper Life Sciences)において窒素流下、約0.3mLの量に蒸発させた。その濃縮サンプルを遠心分離し、アリコートをラジオアッセイし、HPLCにより分析した。この方法によって、反応混合物から平均92.1%の放射能を回収した。
凍結保存ヒト肝細胞が入っているバイアルを、穏やかに振盪しながら、氷がほとんど溶けるまで、37℃の水浴の中で解凍した。それらのバイアルを水浴から取り出し、完全に解凍するまで、30〜60秒間、室温で穏やかな振盪し続けた。各バイアルからの肝細胞浮遊液を、氷上の予冷した50mLビーカーに、直ちに移した。各ビーカーに、12mLの氷冷肝細胞浮遊培地を、細胞が固まらないように手で時々、穏やかに振盪しながら、1分かけて1滴ずつ添加した。それらの細胞浮遊液を15mL管に移し、100gの力で3分間、4℃で遠心分離した(モデルT21超遠心分離機、Sorvall)。上清を捨て、ペレットを4mLの氷冷肝細胞培養基に再び浮遊させた。それらの細胞浮遊液は、約3.1×106個の生存可能肝細胞/mLを含有していた。平均生存率は、トリパンブルー排除および血球計算器を用いて判定して、76.0%であった。
細胞浮遊液を12ウエルプレートに1ウエル当たり1.0mLで分配した。インキュベーションは、2人のドナー由来のプールされた肝細胞を用いて行った。水中の[14C]DCDQを肝細胞浮遊液に10または50μMの最終濃度で添加した。インキュベーションは、5% CO2を供給したインキュベーターにおいて、37℃で4時間、行った。インキュベーション終了時、各ウエルへの200μL冷メタノールの添加により、反応を停止させた。各ウエルの収容物を15mL遠心管に移し、30秒間、超音波処理した。6mLメタノールとボルテックス混合し、その後、遠心分離した後、上清を清浄な試験管に移し、TurboVapエバポレーターにおいて約0.5mLに蒸発させた。残留物をHPLCおよびLC/MSによって分析した。
内臓オートサンプラーを有するWaters model 2690 HPLC system(マサチューセッツ州、ミルフォードのWaters Corp.)を分析に使用した。分離は、フィルター(4×2mm)カートリッジに連結したPhenomenex Luna C18(2)カラム(2×150mm、5μm)(カリフォルニア州、トランスのPhenomenex)を用いて遂行した。250nmをモニターするように設定した可変波長UV検出器、および250μL LQTRフローセルを有するFlo−One β Model A525放射能フロー検出器(Perkin Elmer)をデータ収集に使用した。Ultima Flow M シンチレーション液の流量は、5:1のシンチレーションカクテルの移動相に対する混合比をもたらす、1mL/分であった。オートサンプラー内のサンプルチャンバーは、4℃で維持し、一方、カラムは、約20℃の周囲温度であった。移動相は、10mM酢酸アンモニウム、pH4.5(A)およびメタノール(B)からなり、0.2mL/分で送液した。線形勾配条件は、次のとおりであった:
オートサンプラーおよびダイオードアレイUV検出器を備えたAgilent Model 1100 HPLCシステム(カリフォルニア州、パロアルトのAgilent Technologies)をLC/MS分析に使用した。UV検出器は、200から400nmをモニターするようにに設定した。選択したLC/MS分析について、固体シンチレーションフローセルを装備したβ−Ram model 3放射能フロー検出器(フロリダ州、テンパのIN/US Systems Inc.)を使用してラジオクロマトグラムを得た。分離は、上で説明したものと同じ条件下でPhenomenex Luna C18(2)カラム(2×150mm、5μm)を用いて遂行した。
Flo−One分析用ソフトウェア(Perkin Elmer、バージョン3.6)を利用して、放射能ピークを積分した。コンピュータープログラムMicrosoft Excell(登録商標)97を使用して、平均および標準偏差を算出し、スチューデントt検定を行った。Micromass MassLynxソフトウェア(Waters、バージョン4.0)をLC/MSデータの収集および解析に利用した。
ヒト肝臓ミクロソームでのKm値の決定
ヒト肝臓ミクロソームについて、[14C]DCDQからの代謝物形成についての初期速度条件およびKm値を決定した。時間依存性試験において、主要酸化代謝物(M1、M2、M3およびM4)のNADPH依存形成は、20分間、直線的であり、カルバモイルグルクロニド(M6)の形成は、10分間、直線的であった(データは示さない)。タンパク質依存性試験において、酸化代謝およびカルバモイルグルクロニド形成は、0.5mg/mLミクロソームタンパク質まで、直線的であった。ヒト肝臓ミクロソームにおける主要酸化代謝物M1およびカルバモイルグルクロニドM6の形成についてのKm値は、それぞれ、10.8および56.1μMであった。ヒト肝臓ミクロソームにおける代謝物M2、M3およびM4の形成についてのKm値は、8.9から13.8μMの範囲であった。ヒト肝臓ミクロソームにおける代謝物M5形成についてのKm値は、36.2μMであった。
ミクロソームインキュベーションに関する種間比較のための、P450媒介およびUGT媒介代謝についてのDCDQ濃度は、それぞれ、12および56μMであり、これらがおおよそのKm値であった。NADPH再生系の存在下、4つのヒドロキシ代謝物(M1、M2、M3およびM4)がヒトミクロソームで検出された。代謝物M1は、他の種では検出されなかった。代謝物M2およびM3は、イヌおよびラットで観察された。代謝物M4もラットにおいては検出されたが、マウスおよびイヌでは検出されなかった。マウスは、他の種ほど広範な代謝を有さないようであり、M2は、マウス肝臓ミクロソームで検出された唯一の代謝物であった。DCDQイミンのN−オキシド(M5)は、イヌおよびヒトで検出されたが、マウスおよびラットではされなかった。他の3つのピーク(P1、P2およびDCDQイミンP3)も、ミクロソームインキュベーションにおいて観察された。P1、P2およびP3の形成は、NADPH依存性ではなかった。これらの生成物は、ミクロソームを伴わない対照インキュベーションでは形成されなかった(データは示さない)ので、それらの形成は、P450以外の酵素によって触媒され得る。
DCDQをヒト肝細胞とともにインキュベートしたとき、50μM DCDQ濃度では、カルバモイルグルクロニド(M6)が最も顕著な代謝物であった。50μM DCDQ濃度では酸化代謝物も観察されたが、カルバモイルグルクロニドほど豊富ではなかった。10μM DCDQとヒト肝細胞を含有するインキュベーションは、カルバモイルグルクロニドのものに近いレベルで酸化代謝物を生産した。ヒトミクロソームインキュベーションにおいて形成された代謝物に加えて、別の代謝物(M7)が検出された。ミクロソーム中で形成されたDCDQイミン(P3)も、肝細胞インキュベーションにおいて観察された。
DCDQおよびその代謝物についてのLC/MSおよびLC/MS/MS分析により、質量スペクトルを得た。これらの化合物の構造的特徴を表6にまとめる。
DCDQ代謝に関して種間差が観察された。酸化生成物は、肝ミクロソームインキュベーションにおけるDCDQについての主要代謝経路であった。DCDQのいくつかのヒドロキシ代謝物(M1、M2、M3およびM4)が、NADPHの存在下、ヒト肝臓ミクロソームで検出された(図1)。代謝物M2およびM3は、イヌおよびラット肝臓ミクロソームでも観察された。マウスは、他の種ほど広範な代謝を有さず、M2が、マウス肝臓ミクロソームで検出された唯一の代謝物であった。DCDQイミンのN−オキシド(M5)は、イヌおよびヒトについてのミクロソームインキュベーションにおいて検出されたが、マウスおよびラット肝臓ミクロソームではされなかった。UDPGAの存在下、DCDQのカルバモイルグルクロニド(M6)がイヌおよびヒトで検出されたが、マウスまたはラットではされなかった。ヒドロキシ代謝物の形成は、NADPHとUDPGA、両方の存在下でのヒト肝臓ミクロソームでの主要代謝経路であり、一方、カルバモイルグルクロニドM6は、50μM DCDQ濃度でのヒト肝細胞における主要代謝物であった。P450以外の酵素系も、DCDQイミン(P3)および他の生成物(P1およびP2)の形成によりDCDQ代謝に寄与し得る。生成物P1、P2およびP3の形成は、NADPH依存性ではなかった。それらは、肝臓ミクロソームおよび肝細胞とのすべてのインキュベーション中に一般に存在したので、さらなる調査が必要である。ミクロソームインキュベーションにおいて、マウス、ラットおよびイヌについては性別差が観察されたかった。
梗概
本試験は、単回経口投与(5mg/kg)後の雄および雌Sprague−Dawleyラットにおける[14C]DCDQのインビボ代謝を調査したものである。雄ラットからは投与後2、4、8および24時間の時点で、雌ラットからは投与後2および8時間の時点で、血液、血漿および脳を採取した。投与後0〜8および8〜24時間間隔で、雄ラットから尿および糞便を回収した。
様々なマスバランス試験は、投与放射能の平均64.3%が尿において回収されたことで、尿がラットにおける主要排泄経路であることを示した。肝臓ミクロソームでのインビボ試験は、酸化代謝物がラットにおけるDCDQの主要代謝経路であることを示した。(Iwasaki K, Shiraga T, Tada K, Noda K, Noguchi H, Age- and sex- related changes in amine sulphoconjugation in Sprague-Dawley strain rats. Comparison with phenol and alcohol sulphoconjugations. Xenobiotica. 1986; 16: 717-723)。本試験は、単回5mg/kg経口投与後のラットにおける[14C]DCDQの代謝を調査したものである。
材料
塩酸[14C]DCDQは、上で検討したインビトロ試験において説明したように、Wyeth Researchの標識合成グループ(ニューヨーク州、パールリバー)が合成した。Ultima Goldシンチレーションカクテル、Ultima Floシンチレーションカクテル、Permafluor E+シンチレーションカクテルおよびCarbo−Sorb E二酸化炭素吸収剤は、Perkin Elmer(マサチューセッツ州、ウェルズリー)から購入した。Polysorbate 80は、Mallinckrodt Baker(ニュージャージー州、フィリップスバーグ)から入手し、メチルセルロースは、Sigma−Aldrich(ウィスコンシン州、ミルウォーキー)から入手したものであった。抽出のためおよびクロマトグラフ分析のために使用した溶媒は、EMD Chemicals(ニュージャージー州、ギブスタウン)からのHPLCまたはACS試薬グレードのものであった。
薬物投与および検体収集
薬物の調製、動物への投与、および検体収集は、ペンシルバニア州、カレッジビルのWyeth Researchで行った。投与用賦形剤は、水中2%(w/w) Tween 80および0.5%メチルセルロースを含有した。投与当日、[14C]DCDQ(12.2mg)および非標識DCDQ(36.5mg)をその賦形剤に溶解して、約2mg/mLの最終濃度にした。
血漿(20μL)および尿(50μL)アリコートを放射能濃度について分析した。用量、血漿および尿の放射能判定は、シンチレーション液として10mLのUltima Goldを使用して、Tri−Carb Model 3100 TR/LL液体シンチレーションカウンター(LSC)(Perkin Elmer)で行った。
投与前および投与後溶液のアリコートを水中25%メタノールで希釈し、上で説明したように放射能濃度について分析した。10μLの希釈溶液中の約100,000 DPMをHPLCにより放射化学的純度および化学的純度について分析した。その投与懸濁液の比放射能を判定するために、非放射標識DCDQをメタノールに溶解し、水中25%メタノールで希釈し、HPLCによって同時に分析して、標準曲線を作成した。希釈投与溶液のアリコート(10μL)をHPLCカラムに注入し、UV検出後1分間隔で画分を回収した。各画分における放射能を判定した。放射能のバックグラウンドレベルを得るために、ブランク注入からの画分も回収した。
血漿サンプルをHPLCにより代謝物プロフィールについて分析した。1.5mL血漿アリコートを3.0mLメタノールと混合し、約10分間、氷の上に置き、その後、遠心分離した。上清を清浄な試験管に移した。タンパク質ペレットを3.0mLメタノールで1回抽出した。各サンプルの沈殿および抽出からの上清をプールし、混合し、Zymark TurboVap LV(マサチューセッツ州、ホプキントンのCaliper Life Scicences)において窒素下、22℃で約0.3mLに蒸発させた。その濃縮抽出物を遠心分離し、上清量を測定し、10μLアリコートを二重重複で放射能について分析することにより、抽出効率を決定した。上清のアリコート(50〜200μL)を、放射能フロー検出器を備えたHPLCによって分析した。LC/MSによっても血漿抽出物を分析した。
糞便ホモジネートを代謝物プロフィールについて分析した。糞便ホモジネートの1グラムのアリコートを2mLメタノールと混合し、約10分間、氷の上に置き、遠心分離した。上清を清浄な試験管に移した。残留物を2mLの水:メタノール(3:7)混合物で3回抽出した。各サンプルの上清を併せ、約1mLに蒸発させ、遠心分離した。上清の10μLのアリコートを放射能について分析することにより、抽出効率を決定した。放射能フロー検出器を備えたHPLCにより、上清のアリコート(50〜200μL)をプロファイリングのために分析した。サンプルをLC/MSにより分析して、放射能ピークの特性付けもした。
脳ホモジネートを代謝物プロフィールについて分析した。脳ホモジネートの1グラムのアリコートを等量のメタノールと混合し、約10分間、氷の上に置き、遠心分離した。上清を清浄な試験管に移した。残留物を1mLメタノールで3回抽出した。各サンプルの上清を併せ、約0.5mLに蒸発させ、遠心分離した。上清の10μLのアリコートを放射能について分析することにより、抽出効率を決定した。放射能フロー検出器を備えたHPLCにより、上清のアリコート(100〜200μL)をプロファイリングのために分析した。サンプルをLC/MSによって分析して、放射能ピークの特性付けも行った。
内臓オートサンプラー内臓を有するWaters model 2690 HPLC system(マサチューセッツ州、ミルフォードのWaters Corp.)を分析に使用した。分離は、Phenomenex Luna C18(2)カラム(150×2.0mm、5μm)(カリフォルニア州、トランスのPhenomenex)を用いて遂行した。オートサンプラー内のサンプルチャンバーは、4℃で維持し、一方、カラムは、約20℃の周囲温度であった。上で説明した、250nmをモニターするように設定した可変波長UV検出器およびFlo−One β Model A525放射能フロー検出器をデータ収集に使用した。HPLC移動相は、10mM酢酸アンモニウム、pH4.5(A)およびメタノール(B)からなり、0.2mL/分で送液した。クロマトグラフ条件Aを用量分析に用い、一方、条件Bを尿および血漿、脳および糞便抽出物の分析に用いた。
オートサンプラーおよびダイオードアレイUV検出器を具備するAgilent Model 1100 HPLC system(デラウェア州、ウィルミントンのAgilent Technologies)を、血漿および尿サンプルのLC/MS分析に使用した。UV検出器は、200から400nmをモニターするように設定した。選択したLC/MS分析については、固体シンチラントフローセルを装備したβ−Ram model 3放射能フロー検出器(フロリダ州、タンパのIN/US Systems Inc.)を使用してラジオクロマトグラムを得た。これには、内臓オートサンプラーと、210〜350nmに設定したモデル996ダイオードアレイUV検出器とが装備されていた。HPLCフローをRadiomatic model 150TRフローシンチレーションアナライザー(Perkin Elmer)と質量分析装置の間で分割した。他のHPLC条件は、上で説明した条件Bと同じであった。
Flo−One分析用ソフトウェア(Packard、バージョン3.6)を利用して、放射能ピークを積分した。コンピュータープログラムMicrosoft Excell(登録商標)97を使用して、平均および標準偏差を算出し、スチューデントt検定を行った。Micromass MassLynxソフトウェア(Waters、バージョン4.0)をLC/MSデータの収集および解析に利用した。
用量分析
投与溶液中の[14C]DCDQの放射化学的純度および推定化学的純度は、それぞれ、99.0±0.3%および99.6±0.1%であった。投与前アリコートと投与後アリコートは、同じ純度を有した。投与溶液中の[14C]DCDQの比放射能は、塩酸塩として48.2μCi/mgであった。平均薬物濃度は、塩酸塩として2.48mg/mL、または遊離塩基として2.14mg/mLであった。投与したDCDQの実際の用量は、遊離塩基として5.2から5.4mg/kg、または塩酸塩として6.1から6.3mg/kgの範囲であった。
[14C]DCDQの単回経口投与後の血液および血漿中の放射能濃度を表11にまとめる。
尿は、主要排泄経路であり、放射能投与量の66.7±5.0%が、投与後最初の24時間、32.5%が、0〜8時間、および34.2%が、8〜24時間の尿サンプルにおいて回収された。主要血漿代謝物の大部分が、尿中でも検出された(表15)。雄ラット由来の尿における主要代謝物としては、ヒドロキシDCDQ代謝物(M1、M2、M3およびM4)、ケトDCDQ(M7)およびヒドロキシDCDQグルクロニド(M9)が挙げられた(表15)。0〜24時間の尿における個々の代謝物は、投与用量の約2から16%に相当し(表16)、一方、DCDQは、その用量の1%未満に相当した。0〜8時間の回収物と8〜24時間の回収物についての代謝物分布は似ていた。
糞便中排泄は、雄ラットについて投与後最初の24時間に回収された投与放射能の21.1±2.1%を占めた。8〜24時間糞便サンプルについての抽出効率は、64.3%であり、一方、放射能の平均89.5%が、対照糞便ホモジネート中での[14C]DCDQのインキュベーションから抽出された。ヒドロキシDCDQ代謝物(M3およびM4)、ヒドロキシDCDQスルフェート(M8)、ヒドロキシDCDQグルクロニド(M9)およびアセチル化ヒドロキシDCDQ(M11)は、8〜24時間糞便抽出物における主要代謝物であり、親薬物は極微量しか検出されなかった。代謝物プロフィールは、0〜8時間糞便サンプルからは、低放射能のため(投与放射能の0.1%未満)、得なかった。37℃で24時間の糞便ホモジネート中での[14C]DCDQのインキュベーションは、検出可能な分解を示さなかった。
脳組織には、放射能の平均84.5%が抽出された。脳内放射能濃度は、投与後8時間までは血漿より高く、DCDQは、ラットの脳における主薬物関連成分であった。DCDQは、投与後2、4および8時間の時点で雄ラットについては脳抽出物における放射能の平均で90より高い%、および雌ラットについては投与後2および8時間の時点で94より高い%を占めた(表17)。雄および雌のラットの脳における平均放射能濃度は、類似しており、2時間(雄および雌について、それぞれ、5.1および6.4μg当量/g)から8時間(雄および雌について、それぞれ、3.2および2.8μg当量/g)でわずかに減少しただけであった。24時間まで、脳内濃度は、雄ラットについては平均0.04μg当量/gで、血漿中より低かった。投与後2時間と8時間の間の平均脳対血漿中放射能比は、雄ラットについては6.9から8.2、および雌ラットについては8.7から9.6であり、雄ラットについては24時間の時点で0.8に減少した。雄ラットと雌ラットの間に、脳内放射能含有率および脳対血漿中放射能比に関して有意な差は無かった。脳対血症中DCDQ比は、放射能比よりずっと高かった(表17)。平均脳対血漿中DCDQ比は、時間または性別とは無関係に、49.9と56.1の間であった。ほんの少量の代謝物M7、M10およびM11が、雄および雌のラットの脳において検出され、各代謝物は、脳内放射能の平均4.5%未満に相当した。2つのさらなる少量代謝物(M1およびM3)が雄のラットの脳において観察された。投与後8時間までに、大部分の代謝物が、検出できなくなり、DCDQのみが観察された。
DCDQおよびその代謝物についてのLC/MSおよびLC/MS/MS分析により、質量スペクトルを得た。これらの化合物の構造的特徴を表18にまとめる。DCDQおよびその代謝物の質量スペクトルの特性付けは、本明細書中で説明する他の試験からの特性付けに伴って、以下で検討する。
DCDQは、単回経口5mg/kg投与後、ラットにおいて広範囲にわたって代謝され、酸化代謝が、その主要代謝経路であった。DCDQは、投与後2時間と8時間の間で血漿中放射能の平均13%から20%、ならびに投与後0〜8および8〜24時間での全尿中放射能の2%未満に相当した。血漿において観察された代謝物としては、ヒドロキシDCDQ代謝物(M1、M2、M3、M4およびM10)、ケトDCDQ(M7)、ならびに第II相代謝物、例えば、DCDQスルファメート(M12)、ジ−デヒドロDCDQスルファメート(M14)、ヒドロキシDCDQスルフェート(M8およびM13)、ヒドロキシDCDQグルクロニド(M9)およびアセチル化ヒドロキシDCDQ(M11)が挙げられた(図1)。血漿における放射能の分布率は、投与後2および4時間の時点より8時間の時点でのほうが有意に低かった代謝物M8を除き、時間の経過とともに有意には変化しなかった。血漿代謝物プロフィールは、雄ラットと雌ラットの間での差を示さなかった。ヒドロキシDCDQ代謝物(M1、M2およびM3)、ケトDCDQ(M7)およびヒドロキシDCDQグルクロニド(M9)が、雄ラット血漿における主要代謝物であった一方で、ヒドロキシDCDQ代謝物(M3)、ヒドロキシDCDQスルフェート(M8)、ヒドロキシDCDQグルクロニド(M9)およびDCDQスルファメート(M12)が、雌ラットにおける主要代謝物であった。主な性別差は、スルフェートまたはスルファメートの形成にあった。アルコールおよび脂環式アミンに対するスルホトランスフェラーゼ活性は、雄ラットおけるより雌ラットにおけるほうが顕著に高いと報告されていたので、これらの性別差は予測ができた。(Nariomi Y, Niwa T, Shiraga T, Iwasaki K, Noda K. Isolation and characterization of an alicyclic amine N-sulfotransferase from female rat liver. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 1994; 7: 1008-1011)。
梗概
本試験は、腸溶コーティングカプセルでの14.1から16.7mg/kgの塩酸[14C]DCDQの単回投与後の4匹の雄ビーグル犬において[14C]DCDQの代謝を調査したものである。血漿サンプルは、投与後2、4、8、24および48時間の時点で回収した。糞便および尿は、投与後0〜8、8〜24および24〜48時間間隔で回収した。サンプルを放射能含有率および代謝物プロフィールについて分析した。
マスバランス試験は、ラットの尿には経口用量の平均64.3%が排泄され、一方、腸溶コーティングカプセルの投与後のイヌの尿においてその用量の32.7%が回収されたことを示した。NADPHおよびUDPGAの存在下でイヌ肝臓ミクロソームとともにインキュベートしたとき、[14C]DCDQは、いくつかの酸化代謝物およびカルバモイルグルクロニドに変換された。前の代謝試験ラットは、DCDQが広範囲にわたって代謝され、酸化代謝がラットにおける主要経路であることを示した。本試験は、イヌへの単回経口カプセル投与後の[14C]DCDQの代謝を調査したものである。
材料
塩酸[14C]DCDQは、上のインビボ試験において説明したように、Wyeth Researchの標識合成グループ(ニューヨーク州、パールリバー)が合成した。Ultima Goldシンチレーションカクテル、Ultima Floシンチレーションカクテル、Permafluor E+シンチレーションカクテルおよびCarbo−Sorb E二酸化炭素吸収剤は、Perkin Elmer(マサチューセッツ州、ウェルズリー)から購入した。EDTAは、Sigma−Aldrich(ウィスコンシン州、ミルウォーキー)から入手した。抽出のためおよびクロマトグラフ分析のために使用した溶媒は、EMD Chemicals(ニュージャージー州、ギブスタウン)からのHPLCまたはACS試薬グレードのものであった。
カプセル作製および分析
約11mgの塩酸[14C]DCDQおよび940mgの非標識塩酸DCDQをメタノールに溶解し、その後、窒素流下で蒸発乾固させた。カプセル(#2)には動物の体重に従って正確な量(126.7〜138.1mg)の混合原薬を充填した。その後、それらの充填ゼラチンカプセルを手作業で腸溶コーティングした。
4匹の雄ビーグル犬は、投与時点で7.6から9.8kgの体重であり、研究施設内コロニー由来のものであった。[14C]DCDQが塩酸塩として入っている1つの腸溶コーティングカプセルを各イヌに与えた。投与の2時間前に動物に給餌し、Purina dog chowおよび水を適宜供給し、代謝ケージに個々に収容した。
血漿の50μLおよび尿の100〜200μLのアリコートを放射能濃度について分析した。用量、血漿および尿の放射能濃度は、シンチレーション液として5〜10mLのUltima Goldを使用して、Tri−Carb Model 3100 TR/LL LSCで行った。
血漿サンプルをHPLCにより代謝物プロフィールについて分析した。血漿のアリコートを0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含有する冷メタノールの2回量と混合し、約2分間、氷の上に置き、その後、遠心分離した。上清液を清浄な試験管に移し、Zymark TurboVap LV(マサチューセッツ州、ホプキントンのCaliper Life Sciences)において窒素下、22℃で蒸発させて、約0.3mLの量にした。残留物を遠心分離し、上清量を測定し、20μLアリコートを二重重複で放射能について分析することにより抽出効率を決定した。上清の200μLアリコートをHPLCカラムに注入し、流出液を20秒間隔で96ウエル Lumaplate(Perkin Elmer)に回収した。それらのプレートを40℃のオーブンで一晩乾燥させ、TopCountによって分析した。血漿抽出物は、LC/MSによっても分析した。
糞便ホモジネートを代謝物プロフィールについて分析した。糞便ホモジネートの1グラムのアリコートを2mLメタノールと混合し、約10分間、氷の上に置き、遠心分離した。上清を清浄な試験管に移した。残留物を、2mLの水:メタノール(3:7)混合物で3回抽出した。各サンプル由来の上清を併せ、約1mLに蒸発させ、遠心分離した。抽出効率は、上清の10μLのアリコートを放射能について分析することにより決定した。上清のアリコート(50〜200μL)を、放射能フロー検出器を備えたHPLCによって、代謝物プロフィールについて分析した。LC/MSによってサンプルを分析して、放射能ピークの特性付けも行った。
内臓オートサンプラーを有するWaters model 2690 HPLC system(マサチューセッツ州、ミルフォードのWaters Corp.)を分析に使用した。分離は、Phenomenex Luna C18(2)カラム(150×2.0mm、5μm)(カリフォルニア州、トランスのPhenomenex)を用いて遂行した。オートサンプラーのサンプルチャンバーは、4℃で維持し、一方、カラムは、約20℃の周囲温度であった。250nmをモニターするように設定した可変波長UV検出器およびFlo−One β Model A525放射能検出器をデータ収集に使用した。HPLC移動相は、10mM酢酸アンモニウム、pH4.5(A)およびアセトニトリル(B)からなり、0.2mL/分で送液した。クロマトグラフ条件Aを用量分析に用い、一方、条件Bを尿および血漿、脳および糞便抽出物の分析に用いた。
オートサンプラーおよびダイオードアレイUV検出器を具備するAgilent Model 1100 HPLC system(カリフォルニア州、パトアルトのAgilent Technologies)を、LC/MS分析に使用した。UV検出器は、200から400nmをモニターするように設定した。選択したLC/MS分析については、固体シンチラントフローセルを装備したβ−Ram model 3放射能フロー検出器(フロリダ州、タンパのIN/US Systems Inc.)を使用してラジオクロマトグラムを得た。LC条件は、上に記載の条件Bと同じであった。
Flo−One分析用ソフトウェア(Perkin Elmer、バージョン3.6)を利用して、放射能ピークを積分した。DataFlo Software Utility(Perkin Elmer,beta バージョン0.55)を使用して、Flo−One AnalysisソフトウェアにおけるプロセッシングのためにTopCount NXTマイクロプレートカウンターからのASCIIファイルをCR形式に変換した。コンピュータープログラムMicrosoft Excell(登録商標)97を使用して、平均および標準偏差を算出し、スチューデントt検定を行った。Micromass MassLynxソフトウェア(Waters、バージョン4.0)をLC/MSデータの収集および解析に用いた。
カプセル内容の分析
カプセルに充填した[14C]DCDQは、約98.9%の平均放射化学的純度および99%より高い化学的純度(紫外線検出による)を有した。カプセル内の[14C]DCDQの比活性は、塩酸塩として2.18μCi/mgであった。投与した実際のDCDQ用量は、遊離塩基として12.2から14.4mg/kgの範囲であった。
[14C]DCDQの単回カプセル投与後の血液および血漿中の放射能濃度を表21にまとめる。
糞便中排泄は、尿中排泄より多かったとはいえ、尿が、イヌにおけるDCDQの主要排泄経路であった。非常に多数の代謝物が、尿において検出された。DCDQは、すべての時点について尿中放射能の平均11%未満に相当した(表25)。主要代謝物としては、ヒドロキシDCDQ代謝物(M2およびM3)、N−オキシドDCDQ(M5)、ヒドロキシDCDQのイミン(M15)、ヒドロキシDCDQスルフェート(M16)、ジアゼピニルDCDQカルボン酸(M17)、ヒドロキシDCDQグルクロニド(M9)およびDCDQのカルバモイルグルクロニド(M6)が挙げられた(図1)。
糞便中放射能の平均70.2%が、抽出されたが、ブランク糞便ホモジネートでは、その放射能の平均88.2%が、[14C]DCDQのインキュベーションから抽出された。糞便抽出物において、DCDQは主要放射性成分であり、全放射能の54.4%から96.7%に相当した。糞便において検出された代謝物としては、ヒドロキシDCDQ(M2、M3およびM19)、ケトDCDQ(M18)および特性付けされていないピーク(M20)が挙げられた。最も豊富な代謝物M18は、糞便抽出物における全放射能の16.4%以下に相当した。ヒドロキシDCDQのグルクロニド(M9)およびDCDQのカルバモイルグルクロニド(M6)は、糞便では検出されなかった。37℃で24時間の糞便ホモジネート中での[14C]DCDQのインキュベーションは、明らか分解を示さなかった(データは示さない)。
DCDQおよびその代謝物についてのLC/MSおよびLC/MS/MS分析により、質量スペクトルを得た。これらの化合物の構造的特徴を表26に要約する。本明細書に記載の各試験からのDCDQおよびその代謝物の質量スペクトルの特性付けは、以下でさらに検討する。
投与後2、4および8時間の時点で4から1640ng当量/mLの範囲にわたる大きな個体間変動が、血漿中放射能濃度において観察された。データは、投与後最初の24時間に観察された放射能の排泄に関する変動と一致した。投与後最初の24時間、尿中排泄は、投与放射能の0から25%まで様々であり、一方、糞便抽出物は、0から23%の範囲にわたった。最高血漿中放射能濃度は、投与後4時間の時点での濃度が最高であったイヌ2を除き、24時間の時点で発生した。この変動性は、一部のイヌではDCDQの遅い、持続性の吸収、およびことによると腸溶コーティングカプセルと関係があり得る。イヌについての平均血液対血漿中放射能比は、投与後2時間と8時間の間のラットについての約1:1と比較して、約0.72であった。これは、イヌの血液細胞へのDCDQおよびその代謝物の取り込みがラットのものより少ないことを示している。
上の試験で同定したDCDQおよびその代謝物についてのLC/MSおよびLC/MS/MS分析により、質量スペクトルを得た。それらの各試験からのDCDQおよびその代謝物の質量スペクトルの特性付けを、以下で検討する。
代謝物との比較のために、DCDQ標準物質の質量スペクトル特性を検査した。DCDQのLC/MSスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、[M+H]+が、m/z 229で観察された。衝突誘発開裂(CID)から得られたDCDQのm/z 229質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキーム(フラグメンテーションスキーム案)は、分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンおよびエチリデン−メチル−アミンの喪失によって、それぞれ、m/z 200、186および171のプロダクトイオンが生成されたことを示した。前記分子イオンからのプロペン基の喪失により、m/z 187のフラグメントが生成され、メチレンアミンおよびエチリデンアミンのさらなる喪失により、m/z 158および144のフラグメントが生成された。シクロペンチル−メチレンアミン基の喪失により、m/z 132のフラグメントイオンが生成された。
M1についての[M+H]+は、m/z 245で観察された。M1のm/z 245質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する16Daの増加を示した。その分子からのプロペンの喪失により、m/z 203のフラグメントが生成され、これは、DCDQのm/z 187の対応するイオンより16Da高かった。m/z 171および186のフラグメントイオンは、DCDQのプロダクトイオンスペクトルの場合と同じであった。これは、示したような分子のジアゼパン部分においてヒドロキシル化が発生したことを示していた。そのため、M1は、ヒドロキシDCDQであると考えた。
M2についての[M+H]+は、m/z 245で観察された。M2のm/z 245質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する16Daの増加を示した。その分子からのプロペンの喪失により、m/z 203のフラグメントが生成され、これは、DCDQのm/z 187の対応するイオンより16Da高かった。これは、シクロペンタン環が生体内変換部位でないことを示していた。m/z 132のフラグメントイオンは、DCDQについてと同じであった。これは、ジアゼパン部分が生体内変換部位でないことを示していた。m/z 169および184のフラグメントイオンは、それぞれ、m/z 171および186のDCDQについての対応するイオンより、2Da低かった。これは、ヒドロキシル化の結果としてのピリジン環からのH2Oの喪失を示していた。そのため、M2は、ヒドロキシDCDQであると考えた。
M3についての[M+H]+は、m/z 245で観察された。M3のm/z 245質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する16Daの増加を示していた。エチリデンアミンの喪失により、m/z 202のフラグメントが生成され、これは、SAX−187についてのm/z 186の対応するイオンより16Da高かった。m/z 158および144のフラグメントイオンは、DCDQのプロダクトイオンスペクトルの場合と同じであった。これは、示したような分子のシクロペンタン部分においてヒドロキシル化が発生したことを示していた。そのため、M3は、ヒドロキシDCDQであると考えた。
M4についての[M+H]+は、m/z 245で観察された。M4のm/z 245質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する16Daの増加を示していた。その分子イオンからのH2Oの喪失により、m/z 227のフラグメントが生成された。DCDQについてのm/z 144のプロダクトイオンも観察された。これは、示したような分子のシクロペンタン部分においてヒドロキシル化が発生したことを示しており、これは、DCDQについてのm/z 186の対応するイオンからのエチリデンアミンおよびH2Oの喪失により生成された、m/z 184プロダクトの存在とも一致する。このイオンについて測定された正確な質量は、184.1120Daであった。これは、C13H14Nについての理論質量の3.6ppmの範囲内であった。そのため、M4は、ヒドロキシDCDQであると考えた。
M5についての[M+H]+は、m/z 243で観察された。M5について測定された正確な質量は、243.1478Daであり、これは、C15H19N2Oについての理論質量の7.9ppmの範囲内であった。これは、DCDQについての分子式と比較して1個の酸素の追加および2個の水素原子の喪失に相当する。m/z 130のフラグメントイオンは、DCDQについての対応するイオンより2Da低く、これは、イミン形成を示唆していた。移動相においてH2Oの代わりにD2Oを用いたLC/MSにより、M5には交換可能なプロトンが存在しないことが確認された。これは、M5がN−オキシドであることを示していた。そのため、M5は、DCDQイミンのN−オキシドであると考えた。
M6についての[M+H]+は、m/z 449で観察された。M6のm/z 449質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからの176Daの減少によって、m/z 273のフラグメントが生成されたことを示し、これは、M5がグルクロニドコンジュゲートであること示していた。m/z 273からの44Daのさらなる減少によりm/z 229が生成され、これは、DCDQについての分子イオンでもあった。そのため、M6は、DCDQのカルバモイルグルクロニドであると考えた。
M7についての[M+H]+は、m/z 243で観察された。M7のm/z 243質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンの喪失によって、m/z 214および200のプロダクトイオンが生成されたことを示し、これらは、DCDQについての、m/z 200および186の対応するイオンよりそれぞれ14Da大きかった。これは、DCDQからの1個の酸素原子の追加および2個の水素原子の喪失を示唆していた。m/z 132、144および158のプロダクトイオンは、DCDQと同じであり、これは、生体内変換がピリジンおよびシクロペンタン環で発生したことを示していた。移動相においてH2Oの代わりにD2Oを用いるLC/MSにより、M7には交換可能なプロトンが1つだけあることが確認され、これは、ジアゼパン環におけるNH基由来のものであった。そのため、M7は、ケトDCDQであると考えた。
M8についての[M+H]+は、m/z 325で観察された。M8のm/z 325質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのプロペンの喪失によってm/z 283のプロダクトイオンが生成されたことを示し、これは、生体内変換がシクロペンタン環上で発生しなかったことを示していた。m/z 283のプロダクトイオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンの喪失、ならびにその後のスルフェート基の喪失により、m/z 158および144のプロダクトイオンが、それぞれ、生成された。その分子イオンからのエチリデンアミンの喪失により、m/z 282のプロダクトイオンが生成され、その後のスルホネート基およびH2Oの喪失により、m/z 202および184のプロダクトイオンが、それぞれ、生成された。m/z 132のフラグメントイオンは、DCDQについてと同じであり、これは、そのジアゼパン部分が、生体内変換部位でないことを示していた。そのため、M8は、ヒドロキシDCDQのスルフェートコンジュゲートであると考えた。
M9についての[M+H]+は、m/z 421で観察された。M9のm/z 421質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからの176Daの減少によってm/z 245のフラグメントイオンが生成されたことを示し、これは、ヒドロキシDCDQのグルクロニド化を示していた。エチリデンアミンおよびグルクロン酸の喪失によって、DCDQについてのm/z 186の対応するイオンより16Da高いm/z 202のフラグメントが生成された。m/z 187のフラグメントイオンは、生体内変換がシクロペンタン環において発生したことを示唆していた。そのため、M9は、ヒドロキシDCDQのグルクロニドであると考えた。
M10についての[M+H]+は、m/z 245で観察された。M10のm/z 245質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する16Daの増加を示していた。m/z 171および186のフラグメントイオンは、DCDQのプロダクトイオンスペクトルの場合と同じであり、これは、示したような分子のジアゼパン部分においてヒドロキシル化が発生したことを示していた。そのため、M10は、ヒドロキシDCDQであると考えた。
M11についての[M+H]+は、m/z 287で観察された。M11のm/z 287質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのH2Oの喪失によってm/z 269のフラグメントイオンが生成されたことを示した。42Daのさらなる減少によって、アセチル化を示すm/z 227が生成された。m/z 171および186のフラグメントイオンは、DCDQのプロダクトイオンスペクトルの場合と同じであり、これは、生体内変換が、示したような分子のジアゼパン部分において発生したことを示していた。そのため、M11は、アセチル化ヒドロキシDCDQであると考えた。
M12についての[M+H]+は、m/z 309で観察された。M12のm/z 309質量スペクトルのプロダクトイオンは、80Daの減少により、DCDQの分子イオンであるm/z 229のプロダクトイオンが生成されたことを示した。これは、硫酸化を示していた。メチレンアミン、エチリデンアミンのさらなる喪失によって、DCDQについてと同じであるm/z 200および186のプロダクトイオンが生成された。そのため、M12は、DCDQのN−スフェートであると考えた。
M13についての[M+H]+は、m/z 325で観察された。M13のm/z 325質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、[M+H]+からの80Daの減少によって、DCDQについての[M+H]+より16Da大きいm/z 245が生じたことを示していた。これは、M13がヒドロキシDCDQのスルフェートコンジュゲートであることを示していた。そのため、M13は、ヒドロキシDCDQのスフェートコンジュゲートであると考えた。
M14についての[M+H]+は、m/z 305で観察された。M14のm/z 305質量スペクトルのプロダクトイオン、m/z 225質量スペクトルのプロダクトイオン、およびM14についての提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからの80Daの減少によって、m/z 255のイオンが、生成されたことを示し、これは、M14がスルフェートであることを示していた。エチリデンアミンおよびエチリデン−メチル−アミンのさらなる喪失によって、m/z 186および171のDCDQについての対応するイオンよりそれぞれ4Da小さい182および167のプロダクトイオンが、それぞれ、生成された。これは、シクロペンタン基の代謝を示していた。そのため、M14は、ジ−デヒドロDCDQのスフェートコンジュゲートであると考えた。
M15についての[M+H]+は、m/z 245で観察された。M15のm/z 245質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、m/z 187のフラグメントイオンが、DCDQについてのm/z 171の対応するイオンより16Da大きいことを示し、これは、シクロペンタンまたはピリジン環のヒドロキシル化を示していた。m/z 130のフラグメントイオンは、DCDQについての対応するイオンより2Da小さく、これは、イミンの形成を示していた。移動相においてH2Oの代わりにD2Oを用いたLC/MSにより、M15には交換可能なプロトンが1つだけあることが確認された。そのため、M15は、ヒドロキシDCDQイミンであると考えた。
M16についての[M+H]+は、m/z 325で観察された。M13のm/z 325質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子からの80Daの減少によって、硫酸化を示すm/z 245のプロダクトイオンが生成されたことを示した。その分子イオンからのプロペンの喪失によって、m/z 283のプロダクトイオンが生成され、これは、生体内変換が、シクロペンタン環上で発生しなかったことを示していた。エチリデンアミンの喪失によって、m/z 282のプロダクトイオンが生成され、その後のスルフェート基およびH2Oの喪失によって、それぞれ、m/z 202および184のプロダクトイオンが生成された。DCDQについての132の対応するイオンより16Da大きいm/z 148のプロダクトイオン、およびm/z 282プロダクトイオンは、ヒドロシル化が、示したような分子のベンジル基において発生したことを示していた。そのため、M16は、ヒドロキシDCDQのスルフェートコンジュゲートであると考えた。
M17についての[M+H]+は、m/z 257で観察された。[M+H]+の測定された正確な質量は、257.1929Daであり、これは、C15H17N2O2についての理論質量の0.8ppmの範囲内であった。これは、DCDQの分子式と比較して、2個の酸素原子の追加および4個の水素原子の喪失に相当した。その分子イオンからの44Daの減少によって、m/z 213のフラグメントが生成された。このフラグメントの測定された正確な質量は、213.1376Daであり、これは、C14H17N2についての理論質量の7.6ppmの範囲内であった。これによって、44の減少がCO2の中和喪失によることが確認され、それは、M17が、カルボン酸であることを示していた。m/z 213からのシクロペンテン、ペンタン、プロペンおよびHCNのさらなる喪失によって、それぞれ、m/z 145、171および186のフラグメントが生成された。m/z 130のプロダクトイオンは、DCDQについてのm/z 132の対応するイオンより2Da小さく、これは、イミンの形成を示していた。移動相においてH2Oの代わりにD2Oを用いたLC/MSにより、カルボン酸基由来のものである交換可能なプロトンがM17には1つだけあることが確認された。そのため、M17は、ベンゾ−ジアゼピニル−シクロペンタンカルボン酸(ジアゼピニルDCDQカルボン酸)であると考えた。
M18についての[M+H]+は、m/z 243で観察された。M18のm/z 243質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのプロペンおよびエチリデンアミン基の喪失によって、m/z 158のプロダクトイオンが生成されたことを示した。その分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンの喪失によって、DCDQについてのm/z 200および186の対応するイオンよりそれぞれ14Da大きい、m/z 214および200のプロダクトイオンが生成された。これは、DCDQからの1個の酸素原子の追加および2個の水素原子の喪失を示唆していた。DCDQについてのm/z 132の対応するイオンより14Da大きいm/z 146のプロダクトイオン、およびm/z 200プロダクトイオンは、ベンジル基上で変性が発生したことを示していた。移動相においてH2Oの代わりにD2Oを用いたLC/MSにより、ジアゼパン環におけるNH基由来のものである交換可能なプロトンがM14には1つだけあることが確認された。そのため、M18は、ケトDCDQであると考えた。
M19についての[M+H]+は、m/z 245で観察された。M19のm/z 245質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、モノヒドロキシル化を示唆する16Daの増加を示した。m/z 216、202および187のプロダクトイオンは、DCDQについてのm/z 200、186および171の対応するイオンよりそれぞれ16Da大きく、これは、ジアゼパン基が、変性部位でないことを示していた。その分子イオンからのプロペンの喪失によって、m/z 203のフラグメントが生成され、メチレンアミンおよびエチリデンアミンのさらなる喪失によって、m/z 174および160のフラグメントイオンが生成された。これらは、DCDQについての対応するイオンより16Da大きく、これは、ヒドロキシル化が、ベンゼン基またはピリジン基のいずれかで発生することを示していた。そのため、M19は、ヒドロキシDCDQであると考えた。
P3についての[M+H]+は、m/z 227で観察された。P3のm/z 227質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、P3についての分子量がDCDQより2Da小さいことを示し、これは、二重結合の形成を示唆していた。m/z 130のフラグメントイオンは、DCDQについての対応するイオンより2Da小さく、これは、イミンの形成を示唆していた。そのため、P3は、DCDQイミンであると考えた。
梗概
この試験は、代謝物単離のためのラットの尿を入手するため、およびDCDQの選択された代謝物についてのより詳細な構造の同定を達成するために設計した。3匹の雄ラットおよび3匹の雌ラットにDCDQの単回50mg/kg用量を与えた。0〜12および12〜24時間間隔で尿を採取した。DCDQ代謝物M7(ケトDCDQ)、M9(ヒドロキシDCDQグルクロニド)およびM13(ヒドロキシDCDQスルフェート)を、尿から、二段階セミ分取HPLC法により、NMRスペクトル分析には十分な低マイクログラム量で単離した。MSおよびNMRスペクトル分析に基づき、M7およびM13についての代謝部位は、17位17であった。M9の代謝部位は、13位であった。
NADPHおよびUDPGAの存在下でラット肝臓ミクロソームとともにインキュベートしたとき、[14C]DCDQは、いくつかの酸化代謝物に変換された。前の、ラットでの代謝試験は、DCDQが、広範囲にわたって代謝されること、および酸化代謝が、ラットいおける主要代謝経路であることを示した。ヒドロキシDCDQのスルフェートおよびグルクロニドをはじめとする第2相代謝物もラットにおいて検出された。本試験は、代謝物単離のためのラットの尿を入手するため、およびDCDQの選択された代謝物についてのより詳細な構造の同定を達成するために設計した。
材料
塩酸DCDQは、上で説明したように、Wyeth Researchが合成した。Polysorbate 80は、Mallinckrodt Baker(ニュージャージー州、フィリップスバーグ)から入手し、メチルセルロースは、Sigma−Aldrich(ウィスコンシン州、ミルウォーキー)から入手したものであった。抽出のためおよびクロマトグラフ分析のために使用した溶媒は、EMD Chemicals(ニュージャージー州、ギブスタウン)からのHPLCまたはACS試薬グレードのものであった。重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO−d6)は、Cambridge Isotope Laboratories(マサチューセッツ州、アンドーヴァー)から購入した。NMR管(3mm)は、Wilmad Glass Co.(ニュージャージー州、ブエナ)から購入した。
薬物投与および検体収集
薬物の調製、動物への投与、および検体収集は、ペンシルバニア州、カレッジビルのWyeth Researchで行った。投与用賦形剤は、水中2%(v/v) Tween 80および0.5%(v/v)メチルセルロースを含有した。投与当日、非標識DCDQ(205.7mg)をその賦形剤に溶解して、約10mg/mLの最終濃度にした。
ラット尿サンプルをLC/MSにより分析して、代謝物単離のために使用するラット尿サンプル中に存在するDCDQ代謝物を特性付けした。LC/MS分析に使用したHPLCシステムは、バイナリーポンプ、オートサンプラーおよびダイオードアレイUV検出器を装備したAgilent Model 1100 HPLC system(カリフォルニア州、パロアルトのAgilent Technologies)であった。オートサンプラー温度は、10℃に設定した。UV検出器は、190から400nmをモニターするように設定した。分離は、Supelco Discovery C18カラム(250×2.1mm×5μm)を用いて遂行した。カラム温度は、20℃であった。使用した移動相勾配プログラムは、下に記載するとおりであった。
移動相A:水中10mM酢酸アンモニウム、pH4.5
移動相B:メタノール
代謝物単離に使用したHPLCシステムは、Waters Prep LC 4000ポンプ、サンプル注入のためのWaters 2767 Sample Manager、Waters 996ダイオードアレイUV検出器、およびGilson FC204 フラクションコレクター(ウィスコンシン州、ミドルトンのGilson,Inc.)から成るものであった。UV検出器は、210〜450nmをモニターするように設定した。フラクションコレクターは、1分間隔で画分を回収するように設定した。HPLC移動相勾配は、流量が4.7mL/分であったことを除き、LC/MS分析について上で説明したとおりであった。移動相は、HPLC条件ごとに以下で説明するとおりであった。画分回収中、質量スペクトル分析は行わなかった。
HPLC条件1
カラム:Supelco Discovery C18セミ分取カラム(250×10mm、5μm)(ペンシルバニア州、ベルフォンテのSupelco)。
移動相A:水中10mM酢酸アンモニウム、pH4.5
移動相B:メタノール。
HPLC条件2
カラム:Zorbax SB−CNセミ分取カラム(250×9.4mm、5μm)(Agilent Technologies)
移動相A:水中0.02%トリフルオロ酢酸
移動相B:メタノール中0.02%トリフルオロ酢酸
NMRスペクトル分析のために、単離されたDCDQ代謝物M7、M9およびM13のサンプルを、各々、150μLの100% DMSO−d6に溶解し、窒素ガス雰囲気下で個別の3mm NMR管に移した。Nalorac 5mm z勾配インダイレクト検出プローブ(Varian)を装備したVarian Inova 500 MHz NMR スペクトロメーター(カリフォルニア州、パロアルト)を用いて、一次元(1D)プロトンNMRおよび二次元(2D)NMR(COSY、ROESY)データを収集した。
ThermoFinnigan Xcaliburソフトウェア(バージョン1.3)を使用して、LC/MSシステムを制御し、LC/MSデータを解析した。画分回収に用いたHPLC装置の制御には、Micromass MassLynxソフトウェア(バージョン4.0)を使用した。VNMRプログラム(バージョン6.1C、Varian)を使用して、NMRスペクトルデータを収集し、処理し、表示した。
LC/MSおよびNMRスペクトル分析によるDCDQ代謝物の特性付け
この試験では、DCDQ代謝物M7、M9およびM13を、より詳細な構造特性付けのためのNMRスペクトル分析を行うために十分な量で単離した。この報告書で提示するM7(ケトDCDQ)、M9(ヒドロキシDCDQグルクロニド)およびM13(ヒドロキシDCDQスルフェート)についての構造の同定が、以前の報告書で提示されたものに取って代わることになる。DCDQ、M7、M9およびM13の構造を、それらのNMRナンバリングスキームとともに、図5にまとめる。質量よびNMRスペクトル分析によるM7、M9およびM13の同定を、以下で検討する。
代謝物との比較のために、DCDQ標準物質の質量スペクトルおよびNMR特性を検査した。DCDQのLC/MSスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、[M+H]+が、m/z 229で観察された。衝突誘発開裂(CID)から得られたDCDQのm/z 229質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのメチレンアミンおよびエチリデンアミンの喪失によって、それぞれ、m/z 200および186のプロダクトイオンが生成されたことを示した。その分子イオンからのプロピル基の喪失により、m/z 187が生成され、エチリデンアミンのさらなる喪失により、m/z 144が生成された。シクロペンチル−メチレンアミン基の喪失により、m/z 132プロダクトイオンが生成された。
表29は、DCDQについての1H NMR化学シフトデータをまとめたものである。これらのデータを、単離された代謝物との比較に使用した。
M7についての[M+H]+は、m/z 243で観察された。M7のm/z 243質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンの喪失によって、DCDQについてのm/z 200および186の対応するイオンよりそれぞれ14Da大きいm/z 214および200のプロダクトイオンが、それぞれ生成されたことを示した。これは、DCDQからの1個の酸素原子の追加および2個の水素原子の喪失を示唆していた。m/z 132、144および158のプロダクトイオンは、DCDQについてと同じであり、これは、生体内変換がシクロペンタン環で発生したことを示していた。
M9についての[M+H]+は、m/z 421で観察された。M9のm/z 421質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、その分子イオンからの176Daの減少によって、DCDQ分子より16Da大きいm/z 245が生成されたことを示し、これは、ヒドロキシDCDQのグルクロニド化を示していた。[M+H]+からのエチリデンアミンの喪失によって、m/z 378が生じた。これは、変わっていないエチレンアミン部分を示していた。m/z 378からのグルクロン酸(176Da)の喪失によって、DCDQについてのm/z 186の対応するイオンより16Da高いm/z 202が生じた。これによって、代謝部位としてのシクロペンタン環の3つのメチレン基が削除された。m/z 203のプロダクトイオンは、DCDQについての187の対応するイオンより16Da大きかった。これらのデータは、代謝部位としてのベンジルまたはテトラヒドロピリジン基のいずれかと一致した。
M13についての[M+H]+は、m/z 325で観察された。M13のm/z 325質量スペクトルのプロダクトイオン、およびその提案フラグメンテーションスキームは、[M+H]+からの80Daの減少によって、DCDQについての[M+H]+より16Da大きいm/z 245が生じたことを示した。これは、M13がヒドロキシDCDQのスルフェートコンジュゲートであることを示していた。その分子からのエチリデンアミンの喪失により、m/z 282が生じた。DCDQについても観察された、m/z 144および132におけるプロダクトイオンの存在は、シクロペンタン環の3つのメチレン位置のうちの1つが、代謝部位であることを示していた。
本試験は、代謝物単離のためのラットの尿を入手するため、およびDCDQの選択された代謝物についてのより詳細な構造の同定を達成するために設計した。3匹の雄ラットおよび3匹の雌ラットに、DCDQの単回50mg/kg用量を与えた。0〜12および12〜24時間間隔で尿を回収した。NMRスペクトル分析に十分な低マイクログラム量での二段階セミ分取HPLC法により、尿からDCDQ代謝物M7(ケトDCDQ)、M9(ヒドロキシルDCDQグルクロニド)およびM13(ヒドロキシルDCDQスルフェート)を単離した。MSおよびNMRスペクトル分析に基づき、M7およびM13についての代謝部位は、17位17であった。M9についての代謝部位は、13位であった。この試験によって同定したM7、M9およびN13についての構造の同定により、上で検討したラットインビボ試験のものをさらに洗練した。
様々な投薬量でのDCDQの単回または複数回経口用量を施した健常なヒト被験者の血漿および尿におけるDCDQの代謝物プロフィールを判定した。加えて、選択したサンプルにおける主要DCDQ代謝物(M6、カルバモイルグルクロニド)の相対濃度を決定した。
方法
98.6%の化学的純度を有する塩酸DCDQは、Wyeth Research(ニューヨーク州、パールリバー)が合成した。DCDQカルバモイルグルクロニドは、Wyeth ResearchのChemical Development(カナダ、モントリオール)が合成したものであり、95.5%の純度を有した。内部標準(d8−DCDQ、lot L27347−140−A)は、Wyeth ResearchのRadiosynthesis group(ニューヨーク州、パールリバー)が合成した。報告重水素分布は、d0〜d5 0%、d6 0.1%、d7 2.7%、およびd8 97.1%であった。抽出およびクロマトグラフ分析のために使用した溶媒は、EMD Chemicals(ニュージャージー州、ギブスタウン)からのHPLCまたはACS試薬グレードのものであった。
薬物投与および検体収集
薬物投与および検体収集は、健常な被験者ならびに統合失調症および統合失調感情障害を有する被験者に経口投与されたDCDQの安全性、許容度、薬物動態および薬力学についての無作為化、二重盲検、プラシーボ対照、漸増単回用量試験で行った。検体は、代謝プロフィールについて、およびカルバモイルグルクロニド(M6)のDCDQに対する比率についての分析まで、約−70℃で保管した。
25mg複数回漸増用量試験においてDCDQに中等度および高度に暴露された2人の被験者を、代謝プロフィールについてLC/MSによっても分析した。被験者9および41から第1日および第14日に採取した8時間血漿サンプルを、以下に説明するように処理し、分析した。代謝プロフィールについて分析したサンプルには内部標準を添加しなかった。
3つのLC/MSシステムをこの作業に使用した。LC/MSシステム1は、代謝物の特性付けのための血漿および尿サンプルの分析に用いた。LC/MSシステム2は、尿におけるDCDQ代謝物の特性付けのための追加MS/MSデータを得るために用いた。LC/MSシステム3は、血漿および尿サンプルにおける代謝物M6(DCDQカルバモイルグルクロニド)のセミ分取分析のために用いた。
LC/MSシステム1は、代謝物の特性付けのための血漿および尿サンプルの分析に用いた。このLC/MSシステムとともに使用したHPLC装置は、オートサンプラー、バイナリーポンプおよびダイオードアレイUV検出器を具備するAgilent Model 1100 HPLCシステム(カリフォルニア州、パロアルトのAgilent Technologies)から成るものであった。UV検出器は、210から350nmをモニターするように設定した。HPLC移動相は、10mM酢酸アンモニウム、pH4.5(A)およびメタノール(B)からなり、0.2mL/分で送液した。線形移動相勾配(HPLC勾配1)を下に示す。LC/MSサンプル分析中、6分までの初期フローは質量分析装置からそらし、その後、代謝物を評価した。
LC/MSシステム2は、尿におけるDCDQ代謝物の特性付けのための追加MS/MSデータを得るために用いた。LC/MSシステム2とともに使用したHPLC装置は、Waters model 2695 HPLC system(マサチューセッツ州、ミルフォードのWaters Corp.)から成るものであった。これは、内臓オートサンプラーおよびモデル996ダイオードアレイUV検出器を装備していた。UV検出器は、210から400nmをモニターするように設定した。HPLCカラム、移動相、流量、質量分析装置からのフローアレイの分流、および勾配は、LC/MSシステム1について上で説明したとおりであった。カラム温度は、25℃であった。
MSシステム3は、血漿および尿サンプルにおける代謝物M6(DCDQカルバモイルグルクロニド)のセミ分取分析のために用いた。このLC/MSシステムのためのHPLC装置は、Surveyor MSポンプおよびオートサンプラーを具備するThermo Surveyor HPLC(カリフォルニア州、サンホゼのThermo Electron Corp.)から成るものであった。分離は、5マイクロメートル Phenomenex Luna C18(2)カラム、150×2mm(カリフォルニア州、トランスのPhenomenex)を用いて遂行した。オートサンプラーおよびカラム温度は、それぞれ、5℃および40℃に設定した。HPLC移動相は、10mM酢酸アンモニウム(A)およびメタノール(B)からなり、0.2mL/分で送液した。線形移動相勾配(HPLC勾配2)を下に示す。LC/MSサンプル分析中、3分までの初期フローは質量分析装置からそらし、その後、代謝物を評価した。
コンピュータープログラムMicrosoft Excell(登録商標)97を用いて、平均および標準偏差を算出し、スチューデントt−検定を行った。LC/MSデータの収集および分析には、Xcalibur(バージョン1.3)およびMassLynxソフトウェア(バージョン4.0)を用いた。M6の内部標準に対するピーク面積比を、血漿サンプルにおけるM6の定量に用いた。
代謝物プロフィールおよび血漿中M6濃度
DCDQおよび8つのDCDQ代謝物をヒト血漿において同定した(表33)。DCDQカルバモイルグルクロニド(M6)は、単回用量試験と複数回用量試験の両方におけるすべての用量グループにおいて、血漿中の主薬物関連成分であった。DCDQイミンN−オキシド(M5)、不変DCDQ、DCDQイミン(P3)ならびに極微量のヒドロキシルDCDQ、ヒドロキシルDCDQイミン、ヒドロキシルDCDQグルクロニド(M9)およびケトDCDQグルクロニド(M22)も血漿において観察された。分析したすべてのサンプルにおける代謝物プロフィールは、性質的に類似していた。
血漿M6濃度は、投与量の増加とともに増加し、大きな個体間変動が観察された(表34)。分析した3つの時点のうち、M6濃度は、投与後6時間の時点で最も高く、投与後12および24時間の時点では時間の経過とともに減少していた。M6血漿中濃度のDCDQ血漿中濃度に対する比も、投与後6時間の時点で最も高く、一般に、時間の経過とともに低下した。投与後6時間の時点での平均比は、35.4から76.6の範囲であった。絶食被験者と300mgのDCDQを受けた摂食被験者の間でのM6濃度およびM6対DCDQ比に関して統計学的に有意な差はなかった。
DCDQおよびいくつかのDCDQ代謝物を尿において同定した。DCDQカルバモイルグルクロニド(M6)は、血漿の場合同様、尿における主薬物関連成分であった。不変DCDQ、DCDQ N−オキシドグルクロニド(M40)、ヒドロキシルDCDQグルクロニド(M38)、ヒドロキシルDCDQカルバモイルグルクロニド(M37)ならびに極微量のDCDQイミン(P3)、ヒドロキシルDCDQ(M1およびM32)、ヒドロキシルDCDQイミン(M29)、ケトDCDQグルクロニド(M22)、ヒドロキシルDCDQグルクロニド(M9)、ヒドロキシルDCDQカルバモイルグルクロニド(M33、M36およびM39)、DCDQイミングルクロニド(M34)およびジヒドロキシルDCDQイミングルクロニド(M35)も尿において観察された。
カルバモイルグルクロニド(M6)は、親薬物よりずっと高い濃度で尿中に存在した(表35)。平均M6対DCDQ比は、84から1018の範囲にわたり、大きな変動が観察された。これらの比は、500mg投薬グループにおけるほうが他の用量グループにおけるより低いようであった。
DCDQ基準標準物質の質量スペクトル特性を、代謝物との比較のために検査した。DCDQのLC/MSスペクトルにおいて、プロトン化分子イオン、[M+H]+が、m/z 229で観察された。[M+H]+からのNH3の喪失により、m/z 212が生じた。その分子イオンからのメチレンアミン、エチリデンアミンおよびプロピリデンアミンの喪失により、それぞれ、m/z 200、186および171のプロダクトイオンが生成された。その分子イオンからのプロペン基の喪失により、m/z 187が生成され、メチレンアミンおよびエチリデンアミンのさらなる喪失によって、m/z 158および144が生じた。[M+H]+からのシクロプロペンの喪失により、m/z 161が生じた。シクロペンチル−メチレンアミン基の喪失により、m/z 132のプロダクトイオンが生成された。
代謝物M5は、m/z 243の[M+H]+を生じさせ、これは、DCDQより14Da大きく、P3より16Da大きかった。これらのデータは、M5が、ケトDCDQ代謝物、ヒドロキシルDCDQイミンまたはDCDQイミンN−オキシドであることを示唆していた。[M+H]+からのNH3およびH2Oの喪失により、それぞれ、m/z 226および225が生じ、これは、酸素原子の追加と一致した。その分子イオンからのメチレンアミンの喪失によって、酸素の追加、および2つの水素の喪失による二重結合の存在と一致するm/z 213が生成されると考えた。m/z 130のプロダクトイオンはP3についても観察され、DCDQについてのm/z 132の対応するイオンより2Da小さかった。これらのデータは、M5もイミン基を含有することを示しており、これにより、考慮すべきものからケトDCDQがはずれた。M5のHPLC保持時間は、DCDQよりも、P3(DCDQイミン)よりも長く、これは、インビトロ代謝試験1においても観察され、N−オキシド化と一致した。そのため、M5をDCDQイミンN−オキシドと同定した。
M6についての[M+H]+は、m/z 449で観察され、これは、DCDQより220Da大きかった。その分子イオンからの176Daの減少により、m/z 273が生成され、これは、M6が、グルクロニドであることを示していた。m/z 273からの44Daのさらなる減少によりm/z 229が生じ、これは、DCDQについての分子イオンでもあった。m/z 212および186のプロダクトイオンは、DCDQについても観察され、これは、M6がDCDQのコンジュゲートであることと一致した。それゆえ、M6をDCDQのカルバモイルグルクロニドと同定した。
M38についての[M+H]+は、m/z 421で観察され、これは、DCDQより192Da大きかった。[M+H]+からのNH3の喪失によりm/z 404が生じ、これは、ジアゼパン環上の不変アミノ基を示唆していた。その分子イオンからの176Daの減少によってm/z 245が生成され、これは、ヒドロキシルDCDQ代謝物についての分子イオンでもあった。m/z 245からのNH3およびH2Oの喪失によって、それぞれ、m/z 228および227が生成された。これらのデータは、M38が、ヒドロキシルDCDQのグルクロニドであることを示していた。m/z 362のプロダクトイオンは、DCDQについてのm/z 186の対応するイオンより176Da大きく、これは、キノリン−シクロペンタン部分のグルクロニド化を示していた。m/z 362および269のプロダクトイオンは、グルクロン酸部分を含み、フラグメンテーションスキームに示したように、ジアゼピン、キノリンおよびシクロペンタン環のフラグメンテーションの結果であったと考えた。これらのデータは、キノリン窒素のグルクロニド化およびジアゼパン環のヒドロキシル化と一致した。そのため、M38をヒドロキシルDCDQグルクロニドと同定した。
M40についての[M+H]+は、m/z 421で観察され、これは、DCDQより192Da大きかった。[M+H]+からのH2Oの喪失によりm/z 403が生じた。[M+H]+からの見掛けのNH3の喪失は観察されず、これは、ジアゼパン環上の変性アミノ基を示唆していた。その分子イオンからの176Daの減少によりm/z 245が生成され、これは、ヒドロキシルDCDQ代謝物についての分子イオンでもあった。しかし、M40についてのm/z 245の相対強度は、代謝物M38について観察されたものより弱かった。m/z 245からの酸素原子の喪失によって、DCDQについての分子イオンでもあるm/z 229が生じた。代謝物M38について観察されたようなm/z 245ではなく、イオントラップ質量スペクトルにおける基本ピークとしてのm/z 229の存在との組み合わせで、これらのデータは、N−オキシドの存在を示していた。m/z 228、227、212および210それぞれのプロダクトイオンは、フラグメンテーションスキームに示したように、m/z 245および229からのH2OおよびNH3の喪失によって生成された。M40のHPLC保持時間は、M38より長く、これは、M40がN−オキシドであることとも一致した。m/z 200および186のプロダクトイオンは、DCDQについても観察され、M40についての対応するN−オキシドプロダクトイオンからの酸素原子の喪失の結果であると考えた。m/z 360および271のプロダクトイオンは、グルクロン酸部分を含み、フラグメンテーションスキームに示したようにジアゼピン、キノリンおよびシクロペンタン環のフラグメンテーションの結果であったと考えた。これらのデータは、ジアゼピン環のアミノ基のグルクロニド化およびキノリン窒素のN−オキシド化と一致した。そのため、M40は、DCDQ N−オキシドグルクロニドであると考えた。
DCDQは、人間において代謝された。DCDQカルバモイルグルクロニド(M6)は、血漿と尿の両方における主薬物関連成分であった。DCDQイミンN−オキシド(M5)、不変DCDQ、DCDQイミン(P3)が、血漿において観察された他の主要薬物関連成分であった。不変DCDQ、DCDQ N−オキシドグルクロニド(M40)、ヒドロキシルDCDQグルクロニド(M38)、ヒドロキシルDCDQカルバモイルグルクロニド(M37)は、尿に排泄された。
血漿中M6濃度は、投薬量の増加とともに増加し、大きな個体間変動が観察された。M6濃度は、投与後6から24時間まで経時的に減少した。M6血漿中濃度のDCDQ血漿中濃度に対する比率は、投与後12および24時間の時点より6時間の時点のほうが高かった。投与後6時間の時点での平均比は、35.4から76.6の範囲であった。対照的に、ずっと低い量のM6が、前のインビトロおよびインビボ試験では検出された。絶食被験者と300mgのDCDQを受けた摂食被験者との間にM6濃度およびM6対DCDQ比に関して統計的に有意な差はなかった。尿における平均M6対DCDQ比は、84から1018の範囲にわたった。要約すると、DCDQは、健常なヒト被験者において第I相および第II相代謝を受け、カルバモイルグルクロニド化が、その主要代謝経路であった。動物試験とは対照的に、カルバモイルグルクロニド(M6)の形成が、ヒトにおける主要代謝経路であり、M6が、ヒト血漿および尿における主薬物関連代謝物であった。
Claims (109)
- 式I:
各RnおよびRn'(この場合、nは、1から8である)について:
各RnおよびRn'は、独立して、水素、ヒドロキシ、CH3C(O)−O、−OSO3H、もしくは−O−Gであり;または
Rnおよびその対応するRn'(この場合、nは、2、3、4、6、7もしくは8である)は、それらが結合している炭素と一緒になって、C=Oを形成し;または
Rnとその対応するRn+1と(この場合、nは、1、2、3、4、5もしくは7である)が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、各対応するRn'およびR(n+1)'は、独立して、水素、ヒドロキシ、CH3C(O)−O、−OSO3H、もしくは−O−Gであり;
Gは、式:
式中、記号*をつけた窒素は、場合によりN−オキシドを形成し;
X−Yは、CH=N、CH=N(O)、CH2N(O)、C(O)NH、またはCR9HNR10であり;
R9は、水素、ヒドロキシ、または−OSO3Hであり;
R10は、水素、アセチル、−SO3H、−G、または−C(O)−OGであり;
Zは、水素、ヒドロキシ、−OSO3H、または−O−Gであり;但し、
Zが、ヒドロキシであるときには、(a)R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10のうちの1つは、水素でないこと;または(b)X−Yが、CR9HNR10であることを条件とし;ならびに、
X−Yが、CHR9NR10であるときには、Z、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、およびR10のうちの少なくとも1つは、Hでないことをさらなる条件とする]
の化合物またはその医薬的に許容される塩。 - ZおよびR1からR8のうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項1に記載の化合物または塩。
- X−Yが、CR9HNR10である、請求項2に記載の化合物または塩。
- R9=R10=Hである、請求項2に記載の化合物または塩。
- R7およびR8のうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項4に記載の化合物または塩。
- R6が、−OHである、請求項4に記載の化合物または塩。
- R3およびR4のうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項4に記載の化合物または塩。
- R1、R5、R6、R7、およびZのうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項4に記載の化合物または塩。
- R9が、Hであり、R10が、アセチルである、請求項2に記載の化合物または塩。
- R7およびR8のうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項9に記載の化合物または塩。
- X−Yが、CH=Nである、請求項2に記載の化合物または塩。
- R1からR6のうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項11に記載の化合物または塩。
- R2からR4のうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項11に記載の化合物または塩。
- R1からR6、R9、R10およびZのうちの少なくとも1つが、−C(O)−O−G、−O−G、または−Gである、請求項1に記載の化合物または塩。
- X−Yが、CR9HNR10である、請求項14に記載の化合物または塩。
- R9およびR10が、Hである、請求項15に記載の化合物または塩。
- Z、R3、およびR4のうちの少なくとも1つが、−O−Gである、請求項15に記載の化合物または塩。
- R1からR6、R9、およびZのうちの少なくとも1つが、−O−Gである、請求項14に記載の化合物または塩。
- R2とR3とが一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、ならびにR3'およびR4のうちの少なくとも1つが、−O−Gである、請求項14に記載の化合物または塩。
- R4およびR4'が、それらが結合している炭素と一緒になって、C=Oを形成する、請求項15に記載の化合物または塩。
- R10が、−Gである、請求項20に記載の化合物または塩。
- R10が、−C(O)O−Gである、請求項15に記載の化合物または塩。
- R10が、アセチルである、請求項15に記載の化合物または塩。
- R1からR6、R9、およびZのうちの少なくとも1つが、−O−Gである、請求項23に記載の化合物または塩。
- R7およびR8のうちの少なくとも1つが、−O−Gである、請求項23に記載の化合物または塩。
- R1からR9、およびZのうちの少なくとも1つが、−OSO3Hである、請求項1に記載の化合物または塩。
- X−Yが、−CHR9NR10である、請求項26に記載の化合物または塩。
- R9=R10=Hである、請求項26または請求項27に記載の化合物または塩。
- R1からR6のうちの少なくとも1つが、−OSO3Hである、請求項28に記載の化合物または塩。
- R2およびR3のうちの少なくとも1つが、−OSO3Hである、請求項28に記載の化合物または塩。
- R3が、−OSO3Hである、請求項28に記載の化合物または塩。
- R9およびZのうちの少なくとも1つが、−OSO3Hである、請求項26または請求項27に記載の化合物または塩。
- X−Yが、CR9HNR10であり、この場合、R9が、Hであり、R10が、−SO3Hである、請求項1に記載の化合物または塩。
- Rnのうちの少なくとも2つおよびその対応するRn+1(この場合、n=1〜5)が、それらが結合している炭素間で二重結合を形成する、請求項33に記載の化合物または塩。
- Rnおよび対応するRn'が、それらが結合している炭素と一緒になって、C=Oを形成する、請求項1に記載の化合物または塩。
- R4およびR4'が、それらが結合している炭素と一緒になって、C=Oを形成する、請求項35に記載の化合物または塩。
- X−Yが、CR9HNR10である、請求項36に記載の化合物または塩。
- R10が、−Gである、請求項36または請求項37に記載の化合物または塩。
- R9およびR10が、Hである、請求項36または請求項37に記載の化合物または塩。
- X−Yが、C(O)NHである、請求項1に記載の化合物または塩。
- X−Yが、CH=Nである、請求項1に記載の化合物または塩。
- R1からR6のうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項41に記載の化合物または塩。
- R2からR4のうちの少なくとも1つが、−OHである、請求項42に記載の化合物または塩。
- R6とR7の間の窒素が、N−オキシドを形成する、請求項42に記載の化合物または塩。
- Rnのうちの少なくとも1つおよびその対応するRn+1(この場合、n=1〜5)が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成し、ならびに各Rn'およびR(n+1)'が、独立して、水素、ヒドロキシ、CH3C(O)−O、−OSO3H、または−O−Gである、請求項1に記載の化合物または塩。
- n=2である、請求項45に記載の化合物または塩。
- R2'=H、ならびにR3'またはR4が、−O−Gである、請求項45に記載の化合物または塩。
- X−Yが、CHR9NR10である、請求項45に記載の化合物または塩。
- R9=R10=Hである、請求項48に記載の化合物または塩。
- 少なくとも2つのRnについて、各々の前記Rnおよびその対応するRn+1(この場合、n=1〜5)が一緒になって、それらが結合している炭素間で二重結合を形成する、請求項45に記載の化合物または塩。
- X−Yが、CHR9NR10である、請求項50に記載の化合物または塩。
- R10が、Hであり、ZまたはR9が、−OSO3Hである、請求項51に記載の化合物またはその塩。
- R9=R10=Hである、請求項50に記載の化合物または塩。
- R9が、Hであり、R10が、−SO3Hである、請求項45に記載の化合物または塩。
- R9が、Hであり、R10が、アセチルである、請求項45に記載の化合物または塩。
- L1およびL2が、低級アルキルおよびアセチルから独立して選択される、請求項56に記載の方法。
- L1が、メチルであり、各L2が、アセチルである、請求項56に記載の方法。
- 化合物7のグルクロニル部分のL1およびL2保護基を除去することにより化合物7を脱保護化し、それにより、M6代謝物を形成することをさらに含む、請求項56に記載の方法。
- 前記カップリング試薬が、BOP、DCCおよびEDCから選択される、請求項56に記載の方法。
- 前記カップリング試薬が、BOPである、請求項56に記載の方法。
- 化合物6と前記カップリング試薬およびDCDQとの前記反応が、アミンの存在下で行われる、請求項56に記載の方法。
- 前記アミンが、ヒューニッヒ塩基である、請求項63に記載の方法。
- 化合物6と前記カップリング試薬およびDCDQとの前記反応が、溶媒中で行われる、請求項63に記載の方法。
- 前記溶媒が、CH2Cl2である、請求項65に記載の方法。
- 前記化合物7が、脱保護化前にカラムクロマトグラフィー精製に付される、請求項60に記載の方法。
- 前記脱保護化が、アルコール中、塩基の存在下で行われる、請求項60に記載の方法。
- 前記塩基が、NaOH、LiOH、およびKOHから選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記アルコールが、低級アルキルアルコールである、請求項68に記載の方法。
- 前記脱保護化が、MeOH/H2O/THF中、LiOH・H2Oで行われる、請求項68に記載の方法。
- 前記MeOH/H2O/THFの割合が、約2.5:1.0:0.5である、請求項71に記載の方法。
- 前記脱保護化が、0℃で1時間行われる、請求項71に記載の方法。
- 前記M6代謝物を精製することをさらに含む、請求項60に記載の方法。
- 前記触媒が、Pd(PPh3)4である、請求項75に記載の方法。
- 前記求核試薬が、モルホリンである、請求項75に記載の方法。
- 前記反応段階が、塩基の存在下で行われる、請求項78に記載の方法。
- 前記塩基が、Et3Nである、請求項79に記載の方法。
- 前記化合物2が、ジフェン酸無水物と過剰のアリルアルコールを触媒の存在下で反応させることにより調製される、請求項78に記載の方法。
- 前記アリルアルコールが、プロプ−2−エン−1−オールである、請求項81に記載の方法。
- 前記触媒が、DMAPである、請求項81に記載の方法。
- 請求項84に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
- 請求項86に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
- 請求項88に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
- 請求項90に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
- 請求項92に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
- 請求項94に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
- 請求項96に記載の化合物または塩を含む医薬組成物。
- 請求項1から55のいずれか一項に記載の化合物または塩と、1つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体とを含む組成物。
- 請求項1に記載の化合物もしくは塩またはその化合物もしくは塩を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、統合失調症、統合失調様障害、統合失調感情障害、妄想障害、物質誘発性精神病性障害、L−DOPA誘発性精神病、アルツハイマー型認知症関連精神病、パーキンソン病関連精神病、レヴィー小体病関連精神病、認知症、記憶障害またはアルツハイマー病関連知能欠陥障害に罹患している患者の治療方法。
- 前記患者が、統合失調症に罹患している、請求項99に記載の方法。
- 請求項1に記載の化合物もしくは塩またはその化合物もしくは塩を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、双極性障害、うつ病、気分発作、不安障害、適応障害または摂食障害に罹患している患者の治療方法。
- 前記双極性障害が、双極I型障害、双極II型障害、または気分循環性障害であり;前記うつ病が、大うつ病、気分変調性障害または物質誘発性気分障害であり;前記気分発作が、大うつ病発作、そう病発作、混合型発作または軽そう病発作であり;前記不安障害が、パニック発作、広場恐怖症、パニック障害、特定恐怖症、社会恐怖症、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、急性ストレス障害、全般性不安障害、分離不安障害または物質誘発性不安障害である、請求項101に記載の方法。
- 症状が、うつ病、双極性障害または気分発作である、請求項102に記載の方法。
- 請求項1に記載の化合物もしくは塩またはその化合物もしくは塩を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、てんかん、睡眠障害、偏頭痛、性的機能不全、薬物嗜癖、アルコール嗜癖、胃腸障害または肥満に罹患している患者の治療方法。
- 請求項1に記載の化合物もしくは塩またはその化合物もしくは塩を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む、外傷、卒中または脊髄損傷に関連した中枢神経系欠損症に罹患している患者の治療方法。
- Z、各Rnおよび各Rn'が、Hであり、X−Yが、CR9HNR10である、請求項1に記載の化合物。
- R9が、Hである、請求項106に記載の化合物。
- R9が、Hであり、R10が、−C(O)−OGである、請求項106に記載の化合物。
- 請求項106から108のいずれか一項に記載の化合物と、1つまたはそれ以上の医薬的に許容される担体とを含む組成物。
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